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UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
Departamento de Ingeniería Química
Wastewater treatment by anammox process: A short-circuit in the natural nitrogen cycle
Memoria presentada por Ana Dapena Mora
Para optar al grado de Doctor por la
Universidad de Santiago de Compostela
Santiago de Compostela, Febrero de 2007
Título:
Wastewater treatment by anammox process: A short-cut in the natural nitrogen
cycle
Serie:
Tesis Doctorales Grupo de Ingeniería Ambiental y Bioprocesos, USC
Reservados todos los derechos, está prohibido, bajo sanciones penales y el resarcimiento civil previsto en las leyes, reproducir, registrar o transmitir esta publicación, íntegra o parcialmente por cualquier sistema de recuperación y por cualquier medio, sea mecánico, electrónico, magnético, electroóptico, por fotocopia o por cualquier otro, sin la autorización previa por escrito del autor.
© Ana Dapena Mora, 2008 Departamento de Ingeniería Química
Universidade de Santiago de Compostela
Imprime: LÁPICES 4 Avda. da Coruña 4
15706 Santiago de Compostela España
Depósito Legal: C 4197-2008 ISBN-13: 978-84-691-7328-2
Impreso en España
UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
Departamento de Ingeniería Química Ramón Méndez Pampín, Catedrático de Ingeniería Química y José Luis Campos Gómez, Profesor Contratado Doctor de Ingeniería Química de la Universidad de Santiago de Compostela, Informan: Que la memoria titulada “Wastewater treatment by anammox process: A short-cut in the natural nitrogen cycle”, que para optar al grado de Doctor de Ingeniería Química, Programa de Doctorado en Ingeniería Química y Ambiental, presenta Doña Ana Dapena Mora, ha sido realizado bajo nuestra inmediata dirección en el Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, firman el presente informe en Santiago de Compostela, febrero de 2007. Ramón Méndez Pampín José Luis Campos Gómez
Esta memoria fue presentada el día 15 de junio de 2007 en el salón de actos de la Escuela Técnica Superior de Ingeniería (ETSE) de la USC ante el tribunal compuesto por: Dr. Iñaki Tejero Monzón de la Universidad de Cantabria Dr. Luís Manuel Ferreira de Melo de la Universidad de Porto (Portugal). Dr. Jesús Colprim Lanceran de la Universidad de Gerona. Dra. Anuska Mosquera Corral de la Universidad de Santiago de Compostela. Dra. Elzbieta Plaza del Royal Institute of Tecnology de Estocolmo. Con la calificación de Sobresaliente Cum Laude y la mención de Doctorado Europeo.
Agradecimientos Quisiera dar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que me han apoyado y acompañado durante el tiempo de realización de este trabajo. En primer lugar, quiero agradecer a Juan M. Lema y Ramón Méndez Pampín la oportunidad que me han dado de trabajar en el grupo de Ingeniería Ambiental y Bioprocesos de la USC. A mis directores de tesis, Ramón Méndez y Jose Luis Campos, por darme la posibilidad de realizar este trabajo, guiarme y ayudarme en todo momento a superar las dificultades. A Anuska Mosquera, que ha colaborado muy directamente en este trabajo, poniendo su experiencia y dedicación a mi disposición siempre que la necesité. A ella y a Luis quiero agradecerles la gran cantidad de horas dedicadas a esta tesis y a las diversas publicaciones. Pero muy especialmente les quiero agradecer todo su apoyo y su amistad durante estos años. Con su espíritu optimista y su buen hacer me han dado fuerzas para seguir en innumerables ocasiones. A la USC y al Ministerio de Educación y Ciencia por la financiación de las bolsas de investigación que me permitieron llevar a cabo esta tesis doctoral, así como la ayuda concedida por el Ministerio para poder realizar una estancia en Holanda. A todos los profesores y compañeros del grupo de Ingeniería Ambiental y Bioprocesos de la USC por ayudarme a avanzar con sus consejos, sugerencias y ayuda. A Rosa y las técnicos de laboratorio por ayudarnos con nuestras gestiones y análisis. Al grupo Anammox, que he visto crecer desde el primer día, y que me han hecho sentir siempre muy bien acompañada. Especialmente quiero agradecer a Belén y a Fernando su cariño y su amistad, que muchas veces han sido un bálsamo para mí. A todos los antiguos compañeros de laboratorio del IIT, a los de la Escuela y a todos los que han ido pasando por aquí durante estos años. Gracias a todos por los estupendos cafés en grata compañía, vuestro afable trato, compañerismo y dedicación al trabajo. A Mike Jetten por brindarme la oportunidad de trabajar con su grupo y a todos los compañeros del departamento de microbiología de la Universidad de
Nijmegen. Sobre todo, gracias Laura, por haberme acogido desde el primer día y hacer que esos meses fuera de casa se pasaran muy rápido. De forma muy especial quisiera agradecer a las que en este camino han estado más cerca de mí y han sido amigas además de compañeras: Gemma, Carmen, Belén, Sonia, Mónica, Elena, Almu… muchas gracias por todo. A mis amigas de Pontevedra: Ale, Nadya, Marta, María Álvarez, María González, Patri y Maru, por haberme sabido conocer y comprender y por haber sido durante tantos años una piña a la que siempre quería volver. A mis compañeras de piso de Santiago: Ana, Rebe, María y Marisol, por haber hecho de nuestra casa un hogar. A mis padres, Manolo y Conchi, por la educación que me han dado y por ser siempre un ejemplo a seguir. A mis hermanos, Alex y Alber, que son mis almas gemelas y un trozo enorme de mí. A mi marido Javi, que es el que realmente ha escuchado todos los días las dificultades que me he ido encontrando mientras hacía este trabajo, y ha sabido, cada día, hacerme sentir que lo tenía todo. A mi hija Sara que, al final, fue la que me hizo sentir un gran deseo de acabar una etapa y empezar otra con ella, y así me dio el empujón para acabar.
“Si realmente fueses un niño, un auténtico niño, en lugar de preocuparte por lo que no puedes hacer, contemplarías la Creación en silencio. Te acostumbrarías a mirar con calma el mundo, la naturaleza, la historia, el cielo.
Si realmente fueses un niño, en este momento estarías cantando aleluya a las cosas que tienes delante. Entonces, libre de las tensiones, de los miedos, y de las preguntas inútiles, aprovecharías este tiempo para esperar, curioso y paciente, el resultado de las cosas en las que tanto amor pusiste"
(Carlos Caretto, ermitaño italiano)
Table of contents Objetivos y Resumen i
Obxectivos e Resumo ix
Objectives and Summary xvii
Notation xxv
Chapter 1. Introduction 1 Nitrogen contamination in wastewaters 1 The nitrogen cycle 2 Conventional nitrogen removal technologies 5
Physicochemical processes 5 Biological processes 6
Nitrification-denitrification 6 Partial nitrification 8 Anammox process 12
Discovery and stoichiometry 12 Thermodynamic and kinetic parameters 13 Biochemistry 14 Microbiology 16 Factors that affect the anammox process 18
Effect of temperature 18 Effect of pH 18 Effect of substrate and product concentrations 19 Effect of oxygen 20 Effect of inhibitors 21
Anammox technology 24 Anammox detection 24 Anammox activity measurements 25 Enrichment and start up of anammox reactors 26 Laboratory reactors 27
Fixed bed reactor 28 Fluidized bed reactor 29 Sequential Batch Reactor (SBR) 30
Table of contents
Gaslift reactor 31 Up flow bed reactor 32
Application perspectives 35 Sharon/anammox combination 35 Pilot plants 37 The CANON process 39
1.8. References 42 Chapter 2. Enrichment of anammox biomass from
municipal activated sludge 51 2.1. Introduction 52 2.2. Objectives 54 2.3. Materials and methods 54
2.3.1. Experimental set-up 54 2.3.1.1. Experiments 1 and 2 55 2.3.1.2. Experiment 3 56 2.3.1.3. Experiment 4 57 2.3.1.4. Experiment 5 58 2.3.1.5. Experiment 6 58
2.3.2. Feeding media 60 2.3.3. Operation strategy 61 2.3.4. Analytical methods 61 2.3.5. Population distribution 62 2.3.6. Retrieval of 16sRNA gene sequences 64
2.4. Results and discussion 65 2.4.1. Enrichment of anammox biomass 65
2.4.1.1. Failed attempts 66 2.4.1.1.1. Experiments 1, 2 and 3 66 2.4.1.1.2. Experiments 5 and 6 69
2.4.1.2. And finally... anammox biomass: Experiment 4 71 2.4.2. Keys for a successful anammox biomass enrichment 75 2.4.3. Looking for anammox populations 79
2.5. Conclusions 82 2.6. References 82
Table of contents
Chapter 3. Stability of the anammox process: improvement of the biomass retention 89 3.1. Introduction 91 3.2. Objectives 93 3.3. Materials and methods 94
3.3.1. Experimental setup 94 3.3.2. Feeding media 97 3.3.3. Inoculum 98 3.3.4. Operational conditions of the reactors 98 3.3.5. Analytical procedures 98 3.3.6. Specific anammox activity assays 98
3.4. Results and discussion 99 3.4.1. Stability of the anammox process in a gaslift reactor and a SBR 99
3.4.1.1. Gaslift 99 3.4.1.2. SBR1 101 3.4.1.3. Discussion 103
3.4.2. Strategies to improve the retention of the anammox biomass 111 3.5. Conclusions 114 3.6. References 115
Chapter 4. Application of anammox activity and inhibition batch tests based on gas production 121 4.1. Introduction 123 4.2. Objectives 125 4.3. Materials and methods 125
4.3.1. Batch tests procedure 125 4.3.2. Performed experiments 125 4.3.3. Calculations 126
4.3.3.1. Accuracy of the method 126 4.3.3.2. Specific Anammox Activity (SAA) 126 4.3.3.3. Activity percentage 127 4.3.3.4. Analytical methods 127
4.4. Results and discussion 128 4.4.1. Establishment of the SAA tests 128
4.4.1.1. Accuracy of the method 128 4.4.1.2. Effect of the initial substrate concentration to biomass
concentration ratio and of initial biomass concentration 129
Table of contents
4.4.1.3. Effect of successive feedings 131 4.4.2. Inhibition tests 131
4.4.2.1. Effects of substrates and product 131 4.4.2.2. Effects of exogenous compounds 132
4.4.2.2.1. Effect of salts 133 4.4.2.2.2. Effect of organic matter, phosphate and sulphide 134 4.4.2.2.3. Effect of flocculant 136 4.4.2.2.4. Effect of allylthiourea and chloramphenicol 137 4.4.2.2.5. Effect of other antibiotics 138
4.5. Conclusions 140 4.6. References 140 Chapter 5. Propionate oxidation by anammox bacteria 145 5.1. Introduction 146 5.2. Objectives 148 5.3. Materials and methods 148
5.3.1. Continuous cultivation experiment with propionate 148 5.3.2. Origin of biomass for the batch test and growth conditions 149 5.3.3. Batch experiments with propionate: 15N labelling studies 149 5.3.4. Analytical procedures 150
5.4. Results 150 5.4.1. Continuous operation 150
5.4.1.1. Consumption of propionate by anammox enriched culture 150 5.4.1.2. Identification of the bacteria responsible for propionate
consumption 153 5.4.2. Batch assays with 15N labelled compounds 155
5.5. Conclusions 162 5.6. References 163
Chapter 6. Long-term effect of hogh salinity on the
anammox process: treatment of an effluent from a fish-canning anaerobic digester 167 6.1. Introduction 169 6.2. Objectives 171 6.3. Materials and methods 171
6.3.1. Anammox reactor 171 6.3.2. Composition of the influent 172
Table of contents
6.3.2.1. Synthetic medium 172 6.3.2.2. Sharon effluent 172
6.3.3. Activity tests 172 6.3.3.1. Specific anammox activity 172 6.3.3.2. Specific denitrifying activity 173 6.3.3.3. Ammonium oxidizing-, nitrite oxidizing- and
heterotrophic-specific activity 174 6.3.4. Analytical methods 174
6.3.4.1. Liquid phase composition 174 6.3.4.2. Biogas composition 174 6.3.4.3. Biomass characterization 174
6.3.4.3.1. Physical parameters 175 6.3.4.3.2. Population distribution 175
6.4. Results and discussion 176 6.4.1. Experiment 1: anammox reactor fed with synthetic water 176
6.4.1.1. Period 1: Increasing NaCl concentrations 176 6.4.1.2. Period 2: Restoring the stability 178 6.4.1.3. Period 3: Increasing the NLR 179
6.4.1.4. Biomass characteristics 180 6.4.2. Experiment 2: anammox reactor fed with sharon effluent 183
6.4.2.1. Operation of the reactor 183 6.4.2.2. Biomass characterization 187
6.5. Conclusions 191 6.6. References 192
Conclusiones 197 Conclusións 201 Conclusions 205 List of publications 209
i
Objetivos y Resumen
El desarrollo sostenible es uno de los principales retos de la sociedad actual.
Nuestro medio ambiente está amenazado prácticamente en todas sus dimensiones: aire, suelo y agua, viéndose implicados todos sus ecosistemas, lo que se traduce en la desaparición diaria de especies animales y vegetales.
Por esta razón, es primordial centrar parte de la investigación científica actual en mejorar las tecnologías disponibles con el fin de minimizar el efecto del ser humano en su entorno. Las acciones a realizar se han de centrar no sólo en los procesos productivos sino también en los procesos de depuración y protección del medio ambiente.
El presente trabajo se centra en la eliminación de compuestos nitrogenados presentes en las aguas residuales. Se pretende no sólo conseguir disminuir la concentración de los contaminantes emitidos al medio sino también mejorar el propio proceso, disminuyendo factores como la energía necesaria para su funcionamiento o la generación de productos secundarios. De esta forma, la contaminación global del proceso se vería notablemente reducida.
La directiva 91/271/EEC de la Unión Europea evidencia la preocupación de los europeos por la protección sus recursos acuáticos, instando a “proteger el medio ambiente de cualquier efecto adverso debido a la descarga de aguas urbanas o residuales no tratadas”. Los requerimientos legales para la descarga de aguas residuales urbanas en zonas especialmente sensibles, como pueden ser los ríos con problemas de eutrofización, han sido endurecidos por la Directiva 98/15/EC en febrero de 1998. El límite total de descarga de nitrógeno para plantas con más de 100.000 habitantes equivalentes es ahora de 10 mg·L-1, con un 70-80 % de reducción mínima en el sistema de tratamiento.
Objetivos y Resumen
ii
En muchas industrias agrícolas y alimentarias se producen efluentes con concentraciones de hasta 2 g N-NH4+·L-1. En el caso de Galicia esta es una cuestión importante a tratar, dado el elevado número de empresas que se dedican a la conserva de pescado y marisco y que generan grandes cantidades de agua con elevada concentración proteica en las unidades de cocción.
La eliminación de nitrógeno de estas aguas hasta niveles de concentración tan bajos como los que se pretenden alcanzar es complicado ya que el amonio no se elimina en las unidades de digestión anaerobia actualmente empleadas, dando lugar a efluentes muy ricos en amonio y pobres en DQO (Demanda Química de Oxígeno) biodegradable.
Por esta razón, frecuentemente la DQO del agua residual no es suficiente para llevar a cabo la eliminación de nitrógeno mediante el proceso de nitrificación-desnitrificación y debe ser añadida en forma de sustancias como metanol. Además de la materia orgánica requerida para llevar a cabo la desnitrificación hay que tener en cuenta el aporte de oxígeno necesario para la nitrificación y el consumo de energía que esto supone. En el presente trabajo se trata de alcanzar dos objetivos básicos: lograr las menores concentraciones posibles de nitrógeno en el efluente y desarrollar una nueva tecnología para optimizar el proceso de depuración.
El proceso ANAMMOX (ANaerobic AMMonium OXidation process) descubierto por Mulder en 1995 surgió como una nueva y prometedora alternativa a los procesos convencionales de eliminación de nitrógeno que puede alcanzar los dos objetivos antes propuestos.
En el proceso anammox, bacterias tipo Planctomycete combinan amonio y nitrito (como aceptor de electrones) transformándolos directamente en nitrógeno gas, en condiciones anóxicas y sin emitir óxido nitroso. El proceso es autotrófico, por lo que no es necesario adicionar materia orgánica. El proceso anammox ha de combinarse con una primera etapa de nitrificación, en la que solamente es necesario nitrificar una parte del amonio a nitrito.
Este proceso permitiría, por tanto, minimizar el impacto medioambiental en varios aspectos: la protección de la capa de ozono mediante la disminución de la emisión de óxidos de nitrógeno, la disminución del efecto invernadero al
Objetivos y Resumen
iii
reducirse la energía necesaria para el proceso, la reducción en el consumo de materias primas como materia orgánica y la reducción de productos secundarios, gracias a la menor productividad de lodos. Asimismo esto redundaría en una disminución de costes del proceso.
Esta tesis doctoral se centra en el estudio de este nuevo proceso. El trabajo realizado está enmarcado dentro del proyecto ICON llevado a cabo a nivel europeo con la colaboración de otras universidades y empresas. El principal objetivo de este proyecto era sentar las bases sobre las que implementar una planta industrial para la eliminación de amonio de aguas residuales de alta carga mediante el proceso anammox. Los objetivos generales del proyecto europeo eran:
- Desarrollar biosensores capaces de controlar y analizar detalladamente la eliminación de nitrógeno mediante el proceso anammox como una parte integrada de un sistema de tratamiento de aguas residuales.
- Entender los factores que afectan a la composición y funcionamiento de las distintas especies implicadas en la comunidad microbiana, utilizando una serie de herramientas de diagnóstico molecular (sondas, chips de ADN) para controlar la dinámica de la comunidad microbiana implicada en las etapas relevantes de conversión de nitrógeno.
- Utilizar la información obtenida para diseñar una planta de tratamiento anammox que elimine el amonio de aguas residuales con alto contenido en nitrógeno.
- Diseñar un sistema de control para optimizar los costes energéticos y la eficiencia de la planta.
Los objetivos concretos correspondientes a la Universidad de Santiago de Compostela, que constituyen parcialmente los de esta tesis doctoral, eran:
- Optimizar el enriquecimiento de biomasa anammox para ser usada en el tratamiento de efluentes industriales.
- Evaluar del efecto sobre la biomasa anammox de las diferentes sustancias que puedan estar contenidas en las aguas susceptibles de ser tratadas mediante este proceso.
Objetivos y Resumen
iv
- Estudiar de la estabilidad a largo plazo de un sistema en el que se combina una unidad de nitrificación parcial de amonio a nitrito (SHARON) con una unidad anammox para la eliminación de nitrógeno de aguas residuales industriales.
Estos objetivos globales se han ido desarrollando en los distintos capítulos de la tesis de la siguiente forma:
Capítulo 1. Se presenta una revisión bibliográfica de los estudios realizados hasta la fecha sobre el proceso anammox, incluyendo aspectos como la estequiometría, parámetros cinéticos y moleculares y bioquímica del proceso, así como el efecto sobre éste de distintos factores como temperatura, pH o inhibidores. También se llevó a cabo una revisión de los distintos microorganismos capaces de llevar a cabo el proceso anammox, descubiertos en diferentes laboratorios y ubicaciones geográficas. En una segunda parte se revisa el estado actual de distintos aspectos tecnológicos como el desarrollo de sistemas de medida de la actividad anammox, los métodos de aislamiento y enriquecimiento de esta biomasa, los distintos tipos de reactores de laboratorio utilizados para llevar a cabo el proceso y finalmente, su posible aplicación a nivel de planta piloto.
Capítulo 2. En esta primera etapa se estudiaron las condiciones idóneas para aislar y desarrollar biomasa anammox a partir de un lodo mixto de depuradora, con el fin de poder aplicar este nuevo proceso en plantas que no dispongan de este tipo de biomasa. La proporción de biomasa anammox presente inicialmente en el lodo de depuradora es muy pequeña, no siendo posible detectar su presencia en el lodo mediante técnicas de identificación moleculares cuando se inició este trabajo. Por esa razón, en este capítulo se han seleccionado distintos tipos de lodos para conocer cual sería el más adecuado para la puesta en marcha de un reactor anammox.
Posteriormente se han desarrollado técnicas analíticas en otros grupos europeos dentro del proyecto ICON cuya aplicación permitiría evaluar con mayor fiabilidad la presencia de biomasa anammox en el inóculo. Al final del capítulo se aplican estas técnicas a los inóculos que se habían utilizado.
Objetivos y Resumen
v
Dado que estos microorganismos tienen una muy baja velocidad de crecimiento, es necesario operar con sistemas que aseguren una retención eficaz de la biomasa. Por esta razón se ha estudiado la viabilidad de llevar a cabo este proceso en reactores gaslift y SBR (Sequential Batch Reactor), así como la optimización de las condiciones necesarias para favorecer el crecimiento de dicha biomasa.
Tras varios intentos, se logró enriquecer biomasa anammox a partir de un lodo recogido en una planta municipal de tratamiento de aguas residuales empleando un SBR. La actividad anammox se empezó a detectar tras 60 días de operación, a partir del consumo observado de cantidades estequiométricas de NO2- y NH4+ en el sistema, y fue confirmada asimismo mediante la técnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). Tras 125 días de operación se alcanzó una Velocidad de Carga de Nitrógeno (VCN) de 1,4 g N·L-1·d-1 y una eficacia de eliminación de nitrógeno del 82 %.
Capítulo 3. En la primera parte de este capítulo se llevó a cabo un estudio de la estabilidad a largo plazo de la operación del proceso anammox en un reactor SBR y en un reactor gaslift. Tras 200 días de operación se lograron alcanzar VCNs de 2,0 g N·L-1d-1 y 0,75 g N·L-1·d-1, respectivamente, con una eficacia de eliminación de nitrito (sustrato limitante) del 99 % en ambos casos. Sin embargo, se observaron episodios ocasionales de flotación de la biomasa que coincidían con los períodos en que la VCN específica superaba la Actividad Específica Anammox (AEA) máxima de la biomasa.
Por esta razón, en una segunda parte del estudio se ha desarrollado una estrategia para contrarrestar la flotación, basada en una nueva distribución del ciclo de operación del SBR con la introducción de un período adicional de mezcla. De esta forma se consiguió aumentar la concentración de biomasa en el sistema de 1,30 a 2,53 g SSV·L-1 en 25 días, al disminuir la concentración de sólidos en el efluente del reactor (de 20-45 a 5-10 mg SSV·L-1) y disminuir el Índice Volumétrico del Lodo (IVL) de 108 a 60 mL·g SSV-1.
Capítulo 4. Antes de poder aplicar este proceso al tratamiento de aguas residuales industriales, es necesario evaluar el efecto que ciertas sustancias presentes en estas aguas puedan tener sobre su eficacia. Por esta razón, en este
Objetivos y Resumen
vi
capítulo se desarrolló una metodología para medir la actividad de la biomasa mediante el seguimiento del incremento de la presión con el tiempo en viales cerrados debido a la producción de biogás.
Se llevó a cabo la puesta a punto del método, la determinación del error cometido en comparación con las medidas de actividad obtenidas siguiendo el consumo de nitrógeno en la fase líquida y la medición de la actividad de la biomasa anammox desarrollada en los reactores gaslift y SBR.
Una vez desarrollada la metodología se realizaron ensayos de inhibición para evaluar el efecto sobre el proceso anammox de distintos compuestos usualmente presentes en las aguas residuales. Los resultados mostraron que se deberá prestar especial atención al control de las concentraciones de sulfuro y nitrito durante la operación de estos sistemas, ya que inhiben la actividad anammox a 0,5 mM y 15 mM, respectivamente. Lo mismo ocurre con el compuesto orgánico testado: una concentración de 25 mM de acetato causa una inhibición de la actividad del 50 %. Los demás compuestos estudiados (NH4+, NO2-, NO3-, NaCl, SO4-2, H2PO4-) no resultaron inhibidores del proceso anammox a las concentraciones en que suelen estar presentes en las aguas residuales.
Otros experimentos realizados mostraron que diversos compuestos que pueden estar presentes en algunas aguas residuales como la aliltiourea y antibióticos como el cloranfenicol, penicilina o ampicilina no tienen ningún efecto sobre la actividad anammox a concentraciones de hasta 1g·L-1. Concentraciones de floculante de hasta 0,5 g·L-1 tampoco afectaron la AEA.
Capítulo 5. El trabajo de este capítulo ha sido realizado durante una estancia en el Departamento de Microbiología de la Universidad de Nijmegen, como parte de un estudio que se estaba llevando a cabo allí acerca del efecto de la materia orgánica sobre el proceso anammox. Los experimentos realizados previamente como parte de ese estudio mostraron que pequeñas concentraciones de algunos compuestos orgánicos estimulaban el proceso anammox, mientras que este era inhibido a concentraciones mayores.
Dado que el propionato es un compuesto frecuentemente generado en la operación de digestores anaerobios, se eligió como componente tipo para estudiar tanto su efecto a largo plazo en un reactor continuo como para estudiar los
Objetivos y Resumen
vii
posibles mecanismos de la reacción en ensayos discontinuos con marcadores.
Los experimentos realizados mostraron que la biomasa anammox podía llevar a cabo la oxidación de propionato paralelamente al proceso anammox, utilizando nitrito y nitrato como aceptores de electrones. Los estudios de las poblaciones bacterianas del reactor utilizando la técnica FISH demostraron que la cantidad relativa de biomasa desnitrificante no aumentaba cuando se incrementaba la concentración de propionato alimentada al reactor. Esto demostraba que era la propia biomasa anammox la que consumía dicho sustrato. Se concluye, por tanto, que la biomasa anammox puede coexistir con biomasa desnitrificante a bajas concentraciones de materia orgánica.
Capítulo 6. Como última etapa de la tesis se ha levado a cabo la aplicación del proceso al tratamiento de aguas residuales de una conservera de productos marinos, con el fin de evaluar su potencial aplicación en este sector.
Para ello se realizó un estudio previo para evaluar el efecto de altas concentraciones de sal en un reactor anammox operando en continuo, ya que las conserveras utilizan agua marina en sus cocederos. En esta etapa, se demostró que el reactor podía operar de forma continua y estable a concentraciones de 15 g NaCl·L-1 y VCN de 0,65 g N·g L-1·d-1, alcanzándose una eficacia de eliminación de nitrito del 99 %.
En una segunda fase, se estudió la operación combinada de un SHARON (Single reactor High Ammonia Removal Over Nitrite) y un SBR anammox tratando el efluente de un digestor anaerobio de una planta conservera de atún. Se alcanzó un valor de eficacia media de eliminación de nitrógeno en el sistema anammox del 68 %, limitado principalmente por la relación no estequiométrica entre el amonio y el nitrito en el influente del reactor sharon.
Los ensayos de actividad y análisis FISH mostraron que la distribución de población bacteriana no sufrió cambios significantes durante el periodo de operación a pesar de la continua entrada de biomasa nitrificante procedente del reactor sharon al reactor anammox. Basándose en estos resultados, se puede concluir que el sistema sharon-anammox puede ser aplicado para el tratamiento de aguas residuales industriales que tengan una alta carga nitrogenada y una alta concentración salina, realizando un control apropiado de la relación NO2-/NH4+.
ix
Obxectivos e Resumo
O desenrolo sostible é un dos principais retos da sociedade actual. O noso
medio ambiente está ameazado practicamente en todas as súas dimensións: aire, chan, auga e ecosistemas correspondentes, traducíndose esta realidade na desaparición diaria de especies animais e vexetais.
Por esta razón, é primordial centrar parte da investigación científica actual en mellorar as tecnoloxías dispoñibles co fin de minimizar o efecto do ser humano no seu entorno. As accións a realizar débense enfocar non só nos procesos productivos senón tamén nos procesos de depuración e protección do medio ambiente.
O presente traballo céntrase na eliminación de nitróxeno no tratamento de augas residuais. Preténdese, ademais de conseguir diminuír a concentración dos contaminantes emitidos ao medio, mellorar o propio proceso, diminuíndo factores como a enerxía necesaria para o seu funcionamento ou a xeración de productos secundarios. Desta forma, a contaminación global do proceso veríase notablemente reducida.
A directiva 91/271/EEC da Unión Europea evidencia a preocupación dos europeos pola protección dos seus recursos acuáticos, instando a “protexer o medio ambiente de calquera efecto adverso debido á descarga de augas urbanas ou residuais non tratadas“. Os requirimentos legais para a descarga de augas residuais urbanas en zonas especialmente sensibles, como poden ser os ríos, que se verían sometidos a problemas de eutrofización, foron endurecidos pola Directiva 98/15/EC en febreiro de 1998. O límite total de descarga de nitróxeno para plantas con máis de 100.000 habitantes equivalentes é agora de 10 mg L-1, cun 70-80 % de reducción mínima no sistema de tratamento.
Obxectivos e Resumo
x
En moitas industrias de productos agrícolas e alimentarios prodúcense efluentes altamente concentrados en nitróxeno amoniacal, que conteñen nalgúns casos ata 2 g N-NH4+·L-1. No caso de Galicia esta é unha cuestión importante a tratar, dado o elevado número de empresas que se dedican á conserva de pescado e marisco e que xeran grandes cantidades de auga con elevada concentración proteica nas unidades de cocción.
A eliminación de nitróxeno destas augas ata niveis de concentración tan baixos como os que se pretenden acadar é complicado xa que o amonio non se elimina nas unidades de dixestión anaerobia actualmente empregados, dando lugar a efluentes moi ricos en amonio e pobres en DQO (Demanda Química de Osíxeno) biodegradable.
Por esta razón, frecuentemente a DQO da auga residual non é suficiente para levar a cabo a eliminación deste nitróxeno mediante un proceso biolóxico convencional de nitrificación-desnitrificación e debe ser engadida en forma de sustancias como metanol. Ademais desta materia orgánica requirida no proceso de desnitrificación hai que ter en conta o consumo de enerxía para o aporte de osíxeno precisado na nitrificación. No presente traballo trátase de alcanzar dous obxectivos básicos: lograr as menores concentracións posibles de nitróxeno no efluente e desenrolar unha nova tecnoloxía para optimizar o proceso de depuración.
O proceso ANAMMOX (ANaerobic AMMonium OXidation process) descuberto por Mulder en 1995 xurdiu como unha nova e prometedora alternativa aos procesos convencionais de eliminación de nitróxeno que pode alcanzar os dous obxectivos antes propostos.
No proceso anammox, bacterias tipo Planctomycete combinan amonio e nitrito (como aceptor de electróns) transformándoos directamente a nitróxeno gas, en condicións anóxicas e sen emitir óxido nitroso. O proceso é autotrófico, polo que non é preciso engadir materia orgánica. O proceso anammox débese combinar cunha primeira etapa de nitrificación, na que soamente é preciso nitrificar unha parte do amonio a nitrito.
Este proceso permitiría, polo tanto, minimizar o impacto medioambiental en varios aspectos: a protección da capa de ozono mediante a diminución da emisión
Obxectivos e Resumo
xi
de óxidos de nitróxeno, a diminución do efecto invernadoiro ó reducirse a enerxía precisa para proceso, a reducción no consumo de materias primas como materia orgánica e reducción da cantidade de productos secundarios, gracias á menor productividade de lamas. Así mesmo isto redundaría nunha diminución de custes do proceso.
Esta tese doutoral céntrase no estudio deste novo proceso. O traballo realizado forma parte do proxecto ICON, un plan de investigación efectuado a nivel europeo coa colaboración doutras universidades e empresas. O principal obxectivo deste proxecto era sentar as bases sobre as que implementar unha planta industrial de demostración para a eliminación de amonio de augas residuais de alta carga mediante o proceso anammox. Os obxectivos xerais do proxecto europeo eran:
- Desenrolar biosensores capaces de controlar e analizar detalladamente a eliminación de nitróxeno mediante o proceso anammox como unha parte integrada dun sistema de tratamento de augas residuais.
- Entender os factores que afectan á composición e funcionamento das distintas especies implicadas na comunidade microbiana, utilizando unha serie de ferramentas de diagnóstico molecular (sondas, chips de ADN) para controlar a dinámica da comunidade microbiana implicada nas etapas relevantes de conversión de nitróxeno.
- Usar a información obtida para deseñar unha planta de tratamento anammox que elimine o amonio de augas residuais con alto contido en nitróxeno.
- Deseñar un sistema de control para optimizar os custes enerxéticos e a eficiencia da planta.
Os obxectivos concretos correspondentes á Universidade de Santiago de Compostela, que constitúen parcialmente os de esta tese doutoral, eran:
- Optimizar o desenrolo de biomasa anammox a empregar no tratamento de efluentes industriais.
- Avaliar o efecto sobre o proceso anammox das diferentes sustancias que poidan estar contidas nas augas susceptibles de ser tratadas mediante este proceso.
Obxectivos e Resumo
xii
- Estudiar a estabilidade a longo prazo dun sistema no que se combina unha unidade de nitrificación parcial de amonio a nitrito (SHARON) cunha unidade anammox para a eliminación de nitróxeno de augas residuais reais.
Estes obxectivos globais fóronse desenrolando nos distintos capítulos da tese da seguinte forma:
Capítulo 1. Preséntase unha revisión bibliográfica dos estudios realizados ata a data sobre o proceso anammox, incluíndo aspectos como a estequiometría, parámetros cinéticos e moleculares e bioquímica do proceso, así como o efecto sobre este de distintos factores como temperatura, pH ou inhibidores. Tamén se referencian os distintos microorganismos capaces de levar a cabo o proceso anammox, descubertos en distintos laboratorios e ubicacións xeográficas. Nunha segunda parte revísase o estado actual de distintos aspectos tecnolóxicos como o desenrolo de sistemas de medida da actividade anammox, os métodos de illamento e enriquecemento desta biomasa, os distintos tipos de reactores de laboratorio empregados para levar a cabo o proceso e finalmente, a súa posible aplicación a nivel de planta piloto.
Capítulo 2. Nesta primeira etapa tratábase de estudiar as condicións idóneas para illar e desenrolar biomasa anammox a partir dunha lama mixta de depuradora, coa fin de poder aplicar este novo proceso nas plantas nas que non se dispoña deste tipo de biomasa. A proporción de biomasa anammox presente inicialmente na lama de depuradora é moi pequena, non sendo posible detectar a súa presencia na lama mediante técnicas de identificación moleculares cando se iniciou este traballo. Por esa razón, neste capítulo se seleccionaron distintos tipos de lamas como inóculo para tratar de extraer algunha conclusión sobre o tipo de entorno e de lama que sería máis adecuado para recoller o inóculo.
Posteriormente desenroláronse técnicas analíticas noutros grupos europeos dentro do proxecto ICON cuxa aplicación permitiría avaliar con maior fiabilidade a presencia de biomasa anammox no inóculo. Ao final do capítulo aplícanse estas técnicas aos inóculos que se tiñan empregado.
Dado que estes microorganismos teñen unha moi baixa velocidade de crecemento, é preciso operar con sistemas que aseguren unha retención eficaz da biomasa. Por esta razón estudiouse a viabilidade de levar a cabo este proceso en
Obxectivos e Resumo
xiii
reactores gaslift e SBR (Sequential Batch Reactor), así como a optimización das condicións necesarias para favorecer o crecemento de dita biomasa.
Despois de varios intentos, logrouse enriquecer biomasa anammox a partir dunha lama recollido nunha planta municipal de tratamento de augas residuais empregando un SBR. A actividade anammox comezou a detectarse tras 60 días de operación, a partir do consumo observado de cantidades estequiométricas de NO2- e NH4+ no sistema, e foi confirmada así mesmo mediante a técnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). Tras 125 días de operación acadouse unha Velocidade de Carga de Nitróxeno (VCN) de 1,4 g N·L-1·d-1 e unha eficacia de eliminación de nitróxeno do 82 %.
Capítulo 3. Na primeira parte de este capítulo levouse a cabo un estudio da estabilidade a longo prazo da operación do proceso anammox nun reactor SBR e nun reactor gaslift. Tras 200 días de operación lograron acadarse VCNs de 2,0 g N·L-1d-1 e 0,75 g N·L-1·d-1 respectivamente, cunha eficacia de eliminación de nitrito (substrato limitante) do 99 % en ambos casos. Nembargantes, observáronse episodios ocasionais de flotación da biomasa que coincidían cos períodos en que a VCN específica superaba a Actividade Específica Anammox (AEA) máxima da biomasa.
Por esta razón, nunha segunda parte do estudio desenrolouse unha estratexia para contrarrestar a flotación, baseada nunha nova distribución do ciclo de operación do SBR coa introducción dun período adicional de mestura. Desta forma conseguiuse aumentar a concentración de biomasa no sistema de 1,30 a 2,53 g SSV·L-1 en 25 días, ao diminuír a concentración de sólidos no efluente do reactor (de 20-45 a 5-10 mg SSV·L-1) e diminuír o Índice Volumétrico de Lama (IVL) de 108 a 60 mL·g SSV-1.
Capítulo 4. Antes de poder aplicar este proceso ao tratamento de augas residuais reais, é preciso avaliar o efecto que certas sustancias presentes nesta auga poidan ter sobre a súa eficacia. Por esta razón, neste capítulo desenroláronse ensaios de actividade en discontinuo a partir doutros que xa se empregaban para medir actividades desnitrificantes. Ditos ensaios están baseados na medición de incrementos de presión co tempo debidos á producción de gas en viais pechados.
Obxectivos e Resumo
xiv
Levouse a cabo a posta a punto do método, a determinación do erro cometido en comparación coas medidas de actividade seguindo o consumo de nitróxeno na fase líquida e a medición da actividade da biomasa anammox desenrolada nos reactores gaslift e SBR.
Unha vez desenrolado o método realizáronse os ensaios de inhibición para avaliar o efecto de distintos compostos, usualmente presentes nas augas residuais. Os resultados mostraron que se deberá prestar especial atención ao control das concentracións de sulfuro e nitrito durante a operación destes sistemas, xa que inhiben a actividade anammox a 0,5 mM e 15 mM, respectivamente. O mesmo ocorre co composto orgánico testado: unha concentración de 25 mM de acetato causa unha inhibición da actividade do 50 %. Os demais compostos estudiados (NH4+, NO2-, NO3-, NaCl, SO4-2, H2PO4-) non resultaron inhibidores do proceso anammox ás concentracións en que adoitan estar presentes nas augas residuais.
Outros experimentos realizados mostraron que diversos compostos que poden estar presentes nalgunhas augas residuais como a aliltiourea, e antibióticos como o cloranfenicol, penicilina o ampicilina non teñen ningún efecto sobre a actividade anammox a concentracións de ata 1g·L-1. Concentracións de floculante de ata 0,5 g·L-1 tampouco afectaron a AEA.
Capítulo 5. O traballo deste capítulo realizouse durante unha estancia no departamento de microbioloxía da Universidade de Nijmegen, como parte dun estudio que se estaba levando a cabo alí sobre o efecto da materia orgánica no proceso anammox. Experimentos realizados previamente como parte dese estudio mostraban que pequenas concentracións dalgúns compostos orgánicos estimulaban o proceso anammox, mentres que este era inhibido a concentracións maiores.
Entre os compostos ensaiados, escolleuse o propionato, producto frecuentemente xerado na operación de dixestores anaerobios, como compoñente tipo para estudiar o seu efecto no proceso nun reactor continuo e en ensaios discontinuos con marcadores para estudiar os posibles mecanismos da reacción.
Os experimentos mostraron que a biomasa anammox podía levar a cabo a oxidación de propionato paralelamente ao proceso anammox, empregando nitrito e nitrato como aceptores de electróns. Estudios das poboacións bacterianas do
Obxectivos e Resumo
xv
reactor empregando a técnica FISH demostraron que a cantidade relativa de biomasa desnitrificante non aumentaba a pesar de aumentar a concentración de propionato alimentada ao reactor. Isto demostraba que era a propia biomasa anammox a que consumía dito substrato. Conclúese, por tanto, que a biomasa anammox pode coexistir con biomasa desnitrificante a baixas concentracións de materia orgánica.
Capítulo 6. Como última etapa da tese levouse a cabo a aplicación do proceso ao tratamento de augas residuais dunha conserveira de productos mariños, coa fin de avaliar a súa potencial aplicación neste sector.
Realizouse un estudio previo para avaliar o efecto de altas concentracións de sal nun reactor anammox operando en continuo, xa que as conserveiras utilizan auga mariña para os cocedoiros. Nesta etapa, mostrouse que o reactor podía operar de forma continua e estable a concentracións de 15 g NaCl·L-1 e VCN de 0,65 g N·g L-1·d-1, acadándose unha eficacia de eliminación de nitrito do 99 %.
Nunha segunda fase, estudiouse a operación combinada dun SHARON (Single reactor High Ammonia Removal Over Nitrite) e un SBR anammox. O sistema trataba o efluente dun dixestor anaerobio dunha planta conserveira de atún. Acadouse un valor de eficacia media de eliminación de nitróxeno no sistema anammox do 68 %, limitado principalmente pola relación non estequiométrica entre o amonio e o nitrito no influente do reactor nitrificante.
Os ensaios de actividade e análises FISH mostraron que a distribución de poboación bacteriana non sufriu cambios significantes durante o período de operación a pesar da continua entrada de biomasa nitrificante procedente do reactor sharon ao reactor anammox. Baseándose nestes resultados, pódese concluír que o sistema sharon-anammox pode ser aplicado para o tratamento de augas residuais industriais que teñan unha alta carga nitroxenada e unha alta concentración salina, realizando un control apropiado da relación NO2-/NH4+.
xvii
Objectives and Summary
Nowadays, sustainable development is one of the main challenges of society. Our environment is being damaged in practically all its dimensions: air, soil, water and all their implicated ecosystems, meaning the daily disappearance of animal and vegetable species.
For this reason, it is essential to focus part of the scientific investigation on improving the available technologies to minimize the effect of the human activities on the environment. Corrective measures must concentrate not only on the productive processes but also on the processes for environmental protection and depuration of effluents components.
The present work is focused on nitrogen removal from wastewater. It is expected not only to decrease the pollutants concentration disposed to the environment but also to improve the process itself by means of a decrease of both energetic requirements and generation of secondary products. In this way, the global process contamination would be noticeably reduced.
The directive 91/271/EEC of the European Union evidences the concern of Europeans for the protection of their aquatic resources, urging to “protect the environment of any adverse effect due to the discharge of non-treated urban wastewaters“. The legal requirements for the urban wastewaters discharge into sensitive zones, as can be rivers exposed to eutrophication problems, have been hardened by the Directive 98/15/EC in February 1998. The total nitrogen discharge limit for Wastewater Treatment Plants (WWTP) with more than 100.000 equivalent inhabitants is now of 10 mg·L-1, with a minimum reduction of 70-80 %.
Objectives and Summary
xviii
Effluents of agro-alimentary industries can contain concentrations of ammonium nitrogen up to 2 g NH4+-N·L-1. In Galicia, this kind of effluents supposes an important pollutant source due to the high number of fish canneries settled down. .
Generally, they are treated by anaerobic digestion leading to the formation of high levels of ammonium due to protein degradation, producing effluents with a low COD/N ratio.
The amount of COD contained in these effluents is usually not enough to carry out the removal of nitrogen by the nitrification-denitrification processes and methanol must be added. Apart from the organic matter required for denitrification, it must be taken into account the high energy consumption related to oxygen supply for nitrification. The present work is focused on achieving two basic objectives: effluents with nitrogen concentrations as low as possible and the development of a more energetically efficient technology.
The ANAMMOX (ANaerobic AMMonium OXidation) process, discovered by Mulder in 1995 supposed a new and promising alternative to the conventional processes of nitrogen removal for effluents with a low COD/N ratio.
In the anammox process, bacteria of the type Planctomycete combine ammonium and nitrite to yield nitrogen gas, in anoxic conditions and without nitrous oxide emission. The process is autotrophic, so it is not necessary the addition of organic matter. Since nitrite is required as electron acceptor, the anammox process must be combined with a previous nitrification stage where half part of the ammonium would be nitrified to nitrite.
This process would permit to minimize the environmental impact in several aspects: the protection of the ozone layer by decreasing the nitrogen oxides emission, the decrease of the greenhouse effect by reducing the energy needed for the process, the reduction in the raw materials (as organic matter) consumption, and reduction of the quantity of sludge generated due to the lower sludge yield. All these factors would also contribute to the decrease of the process costs.
This doctoral thesis is concentrated on the study of the anammox process. The present work was done within the framework of the ICON project carried out with the collaboration of several European universities and companies. The main
Objectives and Summary
xix
objective of this project was to establish the bases for the implementation of an anammox plant at industrial scale to remove ammonium from highly-loaded wastewaters, being the general objectives:
- To develop stable biosensors for monitoring and control of nitrogen removal by the anammox process as an integrated part of a wastewater treatment system;
- To understand the factors that influence the composition and functioning of the nitrifying and denitrifying bacteria in the microbial community. A set of molecular diagnostic tools (probes, DNA chips) will be designed to monitor the dynamics of the microbial community involved in relevant nitrogen conversion steps;
- To use the information obtained about the functioning of the nitrifying and denitrifying community and about the specific anammox bacteria to design an anammox treatment plant for the efficient removal of ammonium-nitrogen from waste with high nitrogen content;
- To design energy-saving and efficiency-optimizing control routines for anammox WWTPs based on the sensors data and detailed knowledge about processes and bacteria;
- To make the sensors, diagnostic tools, control routines, and general knowledge available to the public, either as commercially available items or as international publications and patents.
The specific objectives corresponding to the University of Santiago de Compostela, which constitute partially those of this doctoral thesis, are:
- To optimize the enrichment of anammox biomass to be used in the treatment of industrial effluents.
- To evaluate the effect of different substances, that could be present in wastewaters, on the anammox process.
- To evaluate the long-term stability of a system constituted by a partial nitrification unit (sharon) followed by an anammox unit for the removal of nitrogen from industrial wastewaters.
These objectives have been developed in the different chapters of the thesis in the following way:
Objectives and Summary
xx
Chapter 1. It consists in a bibliographic review of the anammox process, including aspects such as the stoichiometric, kinetic and molecular parameters and biochemistry of the process. The effects of different factors (temperature, pH, inhibitors) and a description of the different microorganisms able to carry out the anammox process are also included. In a second part, the development of systems to measure and detect the anammox activity and the methods used to isolate and enrich the anammox biomass are described. Finally, the application of this process at both lab and pilot scale is showed.
Chapter 2. In this first stage, the suitable conditions to isolate and develop anammox biomass from a WWTP sludge are analyzed, for further application of the process. The proportion of anammox biomass initially present in the WWTP sludge is very low, being not possible to detect its presence by molecular identification techniques when this work was initiated. For that reason, sludges from different plants have been selected as inocula to discern which one was the most adequate to achieve a quick enrichment.
Later, other European groups involved in the ICON project developed analytical techniques which application would permit to evaluate with higher reliability the presence of anammox biomass in the possible inoculum. At the end of the chapter these techniques are applied to the inocula previously employed.
As these microorganisms have a very low growth rate, it is necessary to maintain a high efficiency of biomass retention. For this reason, the viability to carry out this process in SBR (Sequential Batch Reactor) and gaslift reactors, as well as the optimization of the conditions required to favor the biomass growth have been studied.
After several attempts, anammox biomass was enriched from a sludge collected in a municipal WWTP, employing a SBR. Anammox activity was detected after 60 days of operation from the observation of the consumption of stoichiometric quantities of NO2- and NH4+ in the system. This fact was also confirmed by the FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) technique. After 125 days of operation a NLR (Nitrogen Loading Rate) of 1.4 g N·L-1·d-1 and a nitrogen removal efficiency of 82 % were reached.
Objectives and Summary
xxi
Chapter 3. In the first part of this chapter the long-term stability of the anammox process using both SBR and gaslift systems was studied. After 200 days of operation, NLRs of 2.0 g N·L-1d-1 y 0.75 g N·L-1·d-1 were respectively reached, with a nitrite (limiting substrate) efficiency removal of 99 % in both cases. Nevertheless, occasional episodes of biomass flotation were observed, coinciding with the periods when specific NLR exceeded the maximum Specific Anammox Activity (SAA) of the biomass.
Therefore, in a second part of the study, a strategy to counteract flotation, based in a new distribution of the SBR operation cycle was developed, by introducing an additional mixing period. This way, biomass concentration in the system was increased from 1.30 to 2.53 g VSS·L-1 in 25 days, by decreasing the solids concentration in the effluent of the reactor (from 20-45 to 5-10 mgVSS·L-1) and decreasing the SVI from 108 to 60 mL·g VSS-1.
Chapter 4. Before the application of the anammox process to the treatment of industrial wastewaters, it is necessary to evaluate the effect that certain substances present in the water can exert on the biomass activity. For this reason, a methodology to carry out simple anammox batch activity assays was developed. This methodology is based in the measurement of pressure increases with time due to the gas production in closed vials.
The accuracy of 7 ± 4 % for this methodology was determined by means of nitrogen balances. The effects of both initial biomass concentration and initial substrate to initial biomass concentration ratio on the maximum SAA value obtained were also studied, being negligible at the assay ranges.
Inhibition assays were done to evaluate the effect of different compounds, usually present in the wastewaters, on the anammox process. The results showed that special attention must be paid to the control of sulphide and nitrite concentrations during the operation of these systems, because they totally inhibit the anammox activity at 0.5 mM and 15 mM, respectively. The inhibition test realized in presence of acetate showed a decrease of 50 % of the activity for a concentration of 25 mM. Other compounds (NH4+, NO2-, NO3-, NaCl, SO4-2, H2PO4-, allylthiourea, chloramphenicol, penicillin or ampicillin) did not exert a
Objectives and Summary
xxii
strong inhibitory effect at the concentrations at which they are usually present in wastewaters.
Chapter 5. The work of this chapter was realized during a stay in the Department of Microbiology of the Catholic University of Nijmegen, as part of a study carried out to determine the effect of organic matter on the anammox process. Experiments which had been realized previously showed that low concentrations of some organic compounds stimulated the anammox process, while it was inhibited at higher concentrations.
As propionate is a compound frequently generated in the operation of anaerobic digesters, it was chosen to study the effect of the presence of organic matter on the process. The experiment was carried out in a continuous reactor and markers were used to determine the possible mechanisms of reaction.
The results showed that anammox biomass could carry out the propionate oxidation in parallel to the anammox process, using nitrite and nitrate as electron acceptors. The relative quantity of denitrifying biomass did not increase despite increasing the concentration of propionate fed to the reactor, this compound being consumed by the anammox biomass.
Chapter 6. The last stage of the thesis was focused on the application of the process to the treatment of wastewaters from a fish cannery.
As sea water is used in different processes of fish canneries, firstly, the effect of high salt concentrations in a continuous anammox reactor was evaluated. During this stage, the reactor could be stably operated at concentrations up to 15 g NaCl·L-1 and NLR of 0.65 g N·L-1·d-1, reaching a nitrite removal efficiency of 99 %.
In a second stage, the anammox SBR was combined with a SHARON (Single reactor High Ammonia Removal Over Nitrite) system to treat the effluent of an anaerobic digester of a tuna cannery plant. The anammox reactor reached a nitrogen removal efficiency of 68 %, mainly limited by the non-stoichiometric ratio between ammonium and nitrite in the influent coming from the nitrification unit.
Objectives and Summary
xxiii
The activity assays and FISH analysis showed that the bacterial population distribution did not suffer significant changes during the operation period, despite the continuous input of nitrifying biomass coming from the sharon to the anammox reactor. Basing on these results, it can be concluded that the sharon-anammox system can be applied to the treatment of industrial wastewaters containing both high ammonia and salts concentrations, if the NO2--N/NH4+-N ratio of the anammox reactor influent is properly controlled.
xxv
Notation
AAO: Aerobic Ammonium Oxidizers
ANAMMOX: ANaerobic AMMonium OXidation
ANITA: Ammonium NITrification Analyzer
BOD: Biological Oxygen Demand
CANON: Completely Autotrophic Nitrogen removal Over Nitrite
COD: Chemical Oxygen Demand
CRT: Cellular Retention Time
CSTR: Continuous Stirred Tank Reactor
CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
DO: Dissolved Oxygen
EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
EGSB: Expanded Granular Sludge Bed
EPS: ExoPolymeric Substances
FBR: Fluidized Bed Reactor
FISH: Fluorescence In Situ Hybridization
GC: Gas chromatography
HAO: Hydroxyl Amine Oxidoreductase
HRT: Hydraulic Retention Time
IC50: Concentration causing an inhibition of 50 %
ISR: Intergenic Spacer Region
MAP: Magnesium Ammonium Phosphate
NLR: Nitrogen Loading Rate
OLAND: Oxygen-Limited Nitrification and Denitrification
PBS: Phosphate Buffer Solution
Notation
xxvi
PCR: Polymerase Chain Reaction
PLC: Programmable Logic Controller
RB: Reactor Buffer
RBC: Rotating Biological Contactor
S0: Initial substrate concentration
SAA: Specific Anammox Activity
SB: Standard Buffer
SBS: Standard Buffer with Salt
SBR: Sequential Batch Reactor
SDA: Specific Denitrifying Activity
SDS: Sodium Dodecyl Sulphate
SHARON: Single reactor High Ammonia Removal Over Nitrite
SNLR: Specific Nitrogen Loading Rate
SRT: Solids Retention Time
SS: Suspended Solids
SVI: Sludge Volumetric Index
T: Temperature
TEM: Transmission Electron Microscopy
TKN: Total Kjeldahl Nitrogen
TOC: Total Organic Carbon
TSS: Total Suspended Solids
UASB: Up flow Anaerobic Sludge Bed
USB: Up flow Sludge Blanket
VSS: Volatile Suspended Solids
WWTP: Wastewater Treatment Plant
X0: Initial biomass concentration
Chapter 1
Introduction
1.1. Nitrogen contamination in wastewaters
Water is an essential substance for development of life in our planet. Nevertheless, water for consume is a good that starts to be scarce, due to the increase of population and its low availability. Fresh water is concentrated in rivers and lakes, and accounts for a proportion of less than 1 % of the total of the biosphere. Moreover, the percentage of accessible and usable water is very low. For this reason it is necessary not only the global awareness for saving and good use of water, but also to find the most adequate technologies for its recovery and reutilization.
In medium developed societies, 90 % of the available water is employed with industrial, agricultural and domestic purposes (Shaher and Shilo, 1988). The wastewaters that result from these human activities are contaminated mainly with organic carbon, nitrogen, phosphorus and sulphur compounds. High concentrations of these compounds can cause eutrophication and the development of microorganisms that bring about diseases or change the flora and fauna of rivers, lakes and seas, so they must be removed before the discharge of the wastewater to the medium.
Reduction of the wastewaters nitrogen content to an environmentally supportable level is one of the main objectives of the wastewater treatment research for several reasons. Nitrogen, used in the construction of amino acids, is essential for life and, in natural waters, it is often a limiting factor of growth for autotrophic organisms, the first members of the natural food chain. So an increased supply with nitrogen to natural waters can lead to an overgrowth of these organisms.
Furthermore, in untreated wastewaters, nitrogen is usually present as ammonium. As the later is oxidized in the natural self-purification process, high
Chapter 1
2
ammonium loads lead to a significant decrease in oxygen content. For the nitrification of 1 g of ammonium, 4.6 g of dissolved oxygen are needed, threating the survival of the aerobic fauna.
The first product of ammonium oxidation, nitrite, as well as ammonia, which is present in the water as the equilibrium product of ammonium depending on the pH, are toxic for fish and other species. In cases where surface water is used directly in drinking water production by bank filtration, an increased nitrate concentration can be a threat to public health. Once inside the body, nitrate can be partly reduced to the toxic nitrite and thus, in high concentrations, cause health problems.
Between the produced wastewaters we can distinguish between:
• Effluents with low nitrogen content, as could be municipal wastewaters (Table 1.1) (Metcalf and Eddy, 1995).
• High nitrogen loaded effluents, like those coming from sludge digesters or fertilizers industry containing concentrations of ammonia nitrogen (NH4+-N) of 1.0 g·L -1 (Mahne et al., 1996), manure treatment (2.3 g·L -1 (Wiesmann, 1994)) and fish canning industry (0.9 g·L-1 (Soto et al., 1991)) (Table 1.2).
The treatment employed to remove the nitrogen from the wastewater will depend on the group where it is included according to this classification.
Table 1.1. Nitrogen and COD content of a typical municipal wastewater (Metcalf and Eddy, 1995).
Concentration (mg·L-1)
Compound High Medium Low
Chemical Oxygen demand (COD) 1000 500 250
Total nitrogen 85 40 20
Organic 35 15 8
Ammonia 50 25 12
Introduction
3
Table 1.2. Nitrogen content of different kinds of industrial wastewaters.
Industry TKN
(mg·L-1)
Refinery 20-900
Fertilizers industry 1000
Tannery 200
Distillery 100-400
Fish cannery 900
Paper industry 250
Sludge digester 1000
Manure treatment 500-2300
Glass 300-650
Leachate 950-1700
The recognition of the relevance of nitrogen content in waters has been concretized in a number of increasingly strict European regulations. The actual European legislation establishes a maximum total nitrogen concentration in the urban wastewaters of 10 ppm N, and a minimum percentage of reduction of 80 %, what requires the application of new technologies for nitrogen removal, including in some cases postreatment of the produced effluents.
1.2. The nitrogen cycle
The turnover of nitrogen compounds in the biosphere is known as the nitrogen cycle (Figure 1.1). Nitrogen oxidation state is changed by different microorganisms, that carry out catabolic reactions (nitritification, nitratification, denitrification, dissimilatory nitrate reduction and anaerobic ammonium oxidation (anammox)), anabolic reactions (ammonium uptake, assimilatory nitrate reduction and nitrogen fixation), and ammonification (Brock et al., 1997). These relations are shown in Figure 1.1.
The first interest on the N-cycle microbiology was focused in the nitrogen assimilation to form vegetal protein, to improve fertilizer efficiency in agriculture.
Chapter 1
4
Much later, the recognition of nitrification and denitrification as potential wastewater treatments for nutrient removal directed the research to that part of the cycle. Several years later, the role of nitrification and denitrification in the formation of nitrogen oxides was the focus of N-cycle research due to the contribution of those compounds in the atmosphere to ozone destruction and global warming.
Nowadays, the discovery of the anammox process as a completely autotrophic nitrogen removal process have focalized the researchers attention, not only as a powerful tool to fulfill the more stringent European regulation for nitrogen removal (Jetten et al., 2002), but also as the explanation for nitrogen losses in natural systems and important contributor to the nitrogen cycle in marine systems (Schmid et al., 2003).
AmmoniumNH4+
Nitrite
NO2-
NitrateNO3-
Org. N
Vegetalprotein
Org. N
proteinAnimal
Atmospheric
N2
nitrogen
Fixation
Fixa
tion
Faecalmatter
urineurea
Hydro
lisis
Decompositio
n
DENI
TRIFI
CATIO
N
Asimilation
Deco
mpos
ition
NITRIFICATION
Animal feeding
Death a
nd cellul
ar deco
mpositio
n
Assim
ilatio
n
Ray
sCh
emic
alpr
oces
ses
ANAM
MOX
AMMONI
FICATIO
N
NITR
IFICA
TION
Figure 1.1. Scheme of the nitrogen cycle.
Introduction
5
1.3. Conventional nitrogen removal technologies
1.3.1. Physicochemical processes
The nitrogen compound mainly present in wastewaters is NH4+. Physicochemical processes applied for ammonium removal are air stripping, breakpoint chlorination and selective ion exchange (Table 1.3). The last two have the inconvenient of involving technologies with high operational costs and complex control.
Ammonia stripping is widely used because of its simple operation and high efficiency. Moreover, toxic substances do not affect it, as it is the case in biological processes. However, ammonia stripping presents important problems, such as the temperature control, no possibility of nitrite and nitrate removal and, especially, the difficulty to adjust pH in strongly buffered effluents.
Table 1.3. Nitrogen removal from wastewaters by physicochemical processes.
Process Advantages Disadvantages
Air stripping - Simple operation - High removal efficiencies
- Not affected by toxic substances
- Process controlled for selective
ammonia removal
- Sensitive to temperature
- Requires pH control
- Does not eliminate nitrite and
organic nitrogen
Breakpoint chlorination
- Complete oxidation of ammonia
- Low space requirements
- Not sensitive to toxic substances
- Not sensitive to temperature
- Low investment cost
- Generation of chloride, toxic and
corrosive residues
- Sensitive to pH
- High operational costs
- Requires highly qualified operators
Selective
ion exchange
- Aqueous ammonia is recovered
- Nitrogen can be totally removed
- Easy quality control of the generated product
- Subproducts formation
- High concentrations of other cations
reduce the ammonia removal capacity
- High operational and investment costs
- Requires highly qualified operators
Chapter 1
6
1.3.2. Biological processes
The main reason to select a biological process for nitrogen removal is the lower price compared to the physicochemical methods. Van Dongen et al. (2001) estimated a cost of 4.5–11.3 euros per kg N removed with physicochemical techniques and 2.3–4.5 euros per kg N removed using conventional biological processes (nitrification-denitrification).
1.3.2.1. Nitrification-denitrification
The nitrification process consists in the oxidation of ammonium to nitrate under aerobic conditions with nitrite formation as principal intermediate, while the denitrification consists in the reduction of the produced nitrate to atmospheric nitrogen, using organic matter as electron acceptor.
Nitrification is carried out in two consecutive stages:
a) Nitritification: The oxidation of ammonium to nitrite by ammonium-oxidizer bacteria (mainly Nitrosomonas) which produces hydroxylamine as intermediate. The reaction requires oxygen.
NH4+ + 3/2 O2 → NO2- + H2O + 2 H+ -ΔG298= 240-350 kJ·mol-1 [1.1]
b) Nitratification: In this stage, nitrite is oxidized to nitrate by nitrite-oxidizer bacteria (mainly Nitrobacter and Nitrospira).
NO2- + ½ O2 → NO3 - -ΔG298= 65-90 kJ·mol-1 [1.2]
The nitrifying bacteria are autotrophic, so they have a low growing rate. The alkalinity of the wastewaters must be enough to maintain the pH in the optimum interval for nitrification, because 7.13 g of alkalinity as CaCO3 is consumed by 1 g of N-NH4+ oxidized to nitrate.
In the denitrification process, the nitrate present in the wastewaters is reduced to molecular nitrogen in anoxic conditions by the action of bacteria, generally heterotrophic (Pseudomonas, Paraccocus, Alcalígenes, Thiobacillus, Bacillus). The process requires the presence of a source of organic carbon as electron donor and nitrate acts as the last electron acceptor in the respiratory chain substituting the O2 molecule. (Equation 1.3). The denitrification process originates an increase in the medium alkalinity:
Introduction
7
5 CH3COOH + 8 NO3- → 8 HCO3- + 2 CO2 + 6 H2O + 4 N2 [1.3]
Due to the different operation conditions of these processes, two different tanks are needed: one stirred but not aerated, where denitrification is carried out, and other aerated, where ammonium and organic matter are simultaneously oxidized. As the nitrification process causes a pH decrease while the denitrification process increases it, the integration of both processes can reduce the quantity of chemical products needed for pH control.
The nitrification and the denitrification processes can be combined following two possible configurations, showed in Figure 1.2.
Figure 1.2. Scheme of the predenitrification and postdenitrification processes.
• Postdenitrifying configuration. In this configuration, ammonium is firstly oxidized to nitrate, followed by denitrification. In this type of configuration, organic carbon may become limited in the denitrifying zone, since most organic compounds were already oxidized in the aerobic nitrifying compartment. In the absence of sufficient organic carbon, the denitrification process is not complete. Moreover, the high quantity of oxygen needed to oxidize the ammonium and the organic carbon increases notably the plant cost operation. The advantage of this configuration is its simplicity, easy control and that it does not need recycling
COD NH4 +
NitrificationDenitrification
O2
Effluent
NO3-
NH4+
N2
Wastewater COD NH4 +
Nitrific
O2
NO3-
NH4+NH4+
N2A) Predenitrification
CODNH4+
O2
NO3-
COD
B) PostdenitrificationN2
NH4+
O2
NO3-
N2
Wastewater DenitrificationNitrification Effluent
Chapter 1
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between both reactors. As the organic matter is oxidized in the previous aerobic stage, an external addition of organic matter is needed (methanol), implying a higher cost. If the ammonium concentration in the influent is high, there can also exist pH control problems, so it is necessary the addition of chemicals. For these reasons, the postdenitrifying configuration is only employed when the ammonium and the organic matter concentrations are low.
• Predenitrification configuration. To avoid carbon limitation in the denitrifying zone, in most treatment plants, the wastewater is first taken to a stirred denitrifying basin with no air supply and afterwards to a basin with aeration in which nitrification occurs. Nitrate containing wastewater from the aeration basin is recycled and mixed with the organic carbon rich wastewater entering the denitrifying zone. The efficiency depends on the amount and presence of suitable organic substrates in the wastewater.
In this case, the recycling between both reactors permits to employ the alkalinity generated during the denitrification to control the pH in the nitrification. The percentage of nitrogen removal depends on the recycling ratio.
This strategy has several disadvantages such as the simultaneous growth of autotrophic nitrifiers together with heterotrophic biomass, which leads to relatively low nitrification rates and the need for recycling between both reactors.
1.4. Partial nitrification
When nitrogen is removed from wastewater using the traditional processes of nitrification-denitrification, a fundamental parameter to take into account is the ratio COD/N. When the amount of COD available in the effluent is not high enough to complete the denitrification process the addition of COD is necessary, which supposes an increase of costs.
In the nitrification via nitrite scheme, ammonium is partially oxidized to nitrite rather than nitrate (Figure 1.3), reducing not only the oxygen requirements for the oxidation, but also the amount of COD needed for denitrification (Hellinga et al., 1998; van Kempen et al., 2001).
Introduction
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Figure 1.3. Scheme of the partial nitrification process (om = organic matter).
In the conventional nitrification process, at the usual range of concentrations of O2 (2 ppm) and temperature (10 – 20 ºC) of operation of Wastewater Treatment Plants (WWTPs), the nitratification step rate (μmáx = 1.08 d-1) is higher than the nitritification step rate (μmáx = 0.77 d-1). This means that it is not possible to accumulate nitrite by this process, as the final product is going to be nitrate. For this reason, other ways to obtain an effluent mainly composed by nitrite have been investigated. Several of these possible actions are:
1. Addition of inhibitors specific for the nitrite oxidizing bacteria (Santos et al., 1993). But this option is not easy due to the difficulty to find a compound able to inhibit this process without causing inhibition of the ammonia oxidation. Besides, the microorganisms can adapt to the inhibitor after long periods of application and decrease its inhibitory efficiency.
2. Control of the dissolved oxygen concentration at low values to avoid the oxidation of nitrite to nitrate due to lack of oxygen (Garrido et al., 1997). The constant affinity for the oxygen is higher for the nitrite oxidizing bacteria than for the ammonia oxidizing bacteria, which implies better use of oxygen at low concentrations for the last ones.
3. The use of pure cultures of ammonia oxidizing bacteria (Santos et al., 1993). This method is not useful in the practical application because the wastewater will contain different kinds of microorganisms and to maintain the pure culture will not be possible.
4. Another possibility is the control of the pH value and the concentration of ammonia in the liquid media according to the findings of Anthonisen et al. (1976). In this case the adaptation of the bacteria to the operational conditions is again a problem.
O2 O2NH4+ NO2- NO3-
omNO2- NO3-
omN2
Chapter 1
10
5. Selection of the ammonia oxidizing bacteria by control of the operation temperature. This procedure is called SHARON (Single reactor High Ammonia Removal Over Nitrite) (van Dongen et al., 2001). The partial nitrification of ammonium in a sharon reactor (Equation 1.4) is recommended in the cases of wastewaters with ammonium nitrogen concentrations from hundreds to thousands milligrams (Hellinga et al., 1998).
NH4+ + HCO3- + 0.75 O2 → CO2 + 0,5 NH4+ + 0,5 NO2- + 1.5 H2O [1.4]
The sharon system consists essentially in a chemostat without biomass retention, operating at temperatures between 25-40 ºC. At the operational temperature of 35 ºC, the maximum specific growth rate of nitrite oxidizers is approximately only half of that for the ammonium oxidizers (0.5 and 1 d-1, respectively) (Hunik, 1993). Only at temperatures above 25 ºC is it possible for the ammonium oxidizers to effectively outcompete the nitrite oxidizers. The ammonium oxidizers have a shorter minimum Cellular Retention Time (CRT) at temperatures higher than 20 ºC (Figure 1.4). The CRT can be controlled by the hydraulic retention time. Operating with a short hydraulic retention time, the nitrite-oxidizers can be selectively washed out the reactor and nitrite is obtained as the only product (Hellinga et al., 1998).
Temperature (ºC)10 40200 30
0
6
4
2
CR
T min
(d)
NO2- oxid
NH4+ oxid
35
1
Temperature (ºC)10 40200 30
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6
4
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CR
T min
(d)
NO2- oxid
NH4+ oxid
35
1
Figure 1.4. Minimum cellular retention time needed to grow ammonium and nitrite oxidizing bacteria in a sharon reactor as a function of temperature.
The process requires relatively little initial investment because a simple well-mixed tank reactor of modest dimensions without sludge retention is enough
Introduction
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(Hellinga et al., 1998) (Table 1.4). The process does not produce chemical sludge and has a relatively low production of biological sludge. It requires relatively little oxygen because the oxidation is stopped at the nitrite stage, and this means savings in energy and in the added carbon source. The produced effluent can be then denitrified, achieving nitrogen removal efficiencies of 90 % (van Kempen et al., 2001). Compared to the traditional nitrification and denitrification via nitrate, the sharon-denitrification process demands 25 % less aeration energy and 40 % less added carbon..
Table 1.4. Comparison of sharon to other ammonium removal processes.
The effluent of a sharon process can also be introduced into an anammox reactor. In this case, only 50 % of the ammonium must be oxidized to nitrite in the sharon process, as the anammox process needs an influent with ammonium and nitrite in a ratio around 1:1. Van Dongen et al. (2001) have shown that the ammonium/nitrite ratio in the effluent of the sharon process can be regulated by controlling the reactor pH between 6.5 and 7.5. This makes possible to obtain the exact ratio that would be needed for full nitrogen removal combining the sharon and the anammox process.
In the case of sludge digester rejection effluents, about half of the ammonium in the liquor can be converted without any pH control, and this depletes the alkalinity of water. This leads to a pH drop and prevents further nitrification (Jetten et al., 2002). Therefore, in this case, the pH is auto regulated and it is not necessary the addition of chemicals.
5.7 MediumLowNoAirlift reactor
1.5 MediumLowNoSharon-denitrification
2.8 HighYesNoMembrane reactor 6.0 LowNoYesMAP process8.0 HighNoYesStripping with steam6.0 MediumNoYesStripping with air
CostsEuro/kg N
Energyrequirement
Biologicalsludge
production
Chemicalsludge
production
5 MediumLowNoAirlift reactor
1 MediumLowNo
2. HighYesNoMembrane reactor 6 LowNoYesMAP process8 HighNoYesStripping with steam MediumNoYesStripping with air
CostsEuro/kg N
Energyrequirement
Biologicalsludge
production
Chemicalsludge
production
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1.5. Anammox process
1.5.1. Discovery and stoichiometry
For a long time, it was thought that ammonium oxidation could only take place aerobically. In 1977, Broda predicted, using thermodynamic calculations, the existence of chemiolitoautotrophic bacteria capable to oxidize ammonium using nitrite as electron acceptor:
NH4+ + NO2- → N2 + 2 H2O -∆Gº = 335 kJ·(mol NH4+) -1 [1.5]
That prediction would be experimentally confirmed two decades later by Mulder (1992) in a denitrifying pilot plant, treating wastewaters from a yeast plant. That reactor removed an ammonium loading rate of 0.4 g NH4+-N·L-1·d-1 by this process (Mulder et al., 1995). By nitrogen balances, they hypothesized the following stoichiometry and called the process ANAMMOX (ANaerobic AMMonium OXidation):
5 NH4+ +3 NO3- → 4 N2 + 9 H2O + 2 H+ [1.6]
Van de Graaf et al. (1995) proved that the anaerobic ammonium oxidation was a biological process through activity assays with and without sludge and with sterilized sludge. The ammonium removal rate was proportional to the biomass concentration. They also showed, by experiments with tracers that the electron acceptor in the reaction was nitrite and not nitrate as initially thought. Strous et al (1998) optimized the process conditions and found the global equation of the process, based on mass balance over anammox enriched cultures:
NH4+ + 1.31 NO2- + 0.066 HCO3- + 0.13 H+ →
N2 + 0.26 NO3- + 0.066 CH2O0.5N0.15 + 2 H2O
[1.7]
Based on phylogenetic analysis, the first discovered anammox organism branched deep in the Planctomycetes phylum and was named Candidatus “Brocadia anammoxidans” (Kuenen and Jetten, 2001).
