This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution 4.0 International License. Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschung in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht: Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz. Zur Chemie des Ingenols, I Ingenol und einige seiner Derivate On the Chemistry of Ingenol, I Ingenol and Some of its Derivatives H. J. Opferkuch, W. Adolf, B. Sorg, S. Kusumoto+ und E. Hecker* Institut für Biochemie, Deutsches Krebsforschungszentrum, Im Neuenheimer Feld 280, D-6900 Heidelberg Z. Naturforsch. 86b, 878-887 (1981); eingegangen am 2. März 1981 Cocarcinogens, Diterpene Esters, Euphorbiaceae, Tumor Promoters The tetracyclic polyfunctional diterpene ingenol (1) is the prototype of many di- terpenoid parent alcohols of the ingenane type. Esters of these parent alcohols occur - partly together with esters of polyfunctional diterpene parent alcohols of the tigliane and daphnane type - as irritant, cocarcinogenic and antineoplastic principles in species of the family Euphorbiaceae (Spurge). Preparation of 1 from latex of Euphorbia ingens E.May as well as of some functional derivatives of 1 are described. Von vielen Spezies aus der Familie der Wolfs- milchgewächse (Euphorbiaceen) werden unterschied- liche toxische und therapeutische Wirkungen be- richtet (vgl. z.B. I.e. [1, 2]). In den letzten Jahren konnten aus zahlreichen Arten dieser Pflanzen- familie Ester von neuartigen polyfunktionellen Diterpenen isoliert und als deren irritierende, co- carcinogene [3] oder auch antileukämogene [4] Wirkprinzipien identifiziert werden. Es handelt sich dabei um Derivate der (hypothetischen) Diterpene Tiglian, Ingenan oder Daphnan [5]. So wird bei- spielsweise die irritierende und die cocarcinogene Wirkung [6] des Latex von E. ingens E. Mey von verschiedenen Estern der tetrazyklischen, poly- funktionellen Diterpene Ingenol [7] (1) und 16- Hydroxyingenol [8] verursacht [9]. Die im Latex von E. ingens außerdem vorkommenden Ester des makrozyklischen polyfunktionellen Diterpens Ingol [10-12] zeigen dagegen keine irritierende und/oder cocarcinogene Wirkung. Der Latex der in Südafrika in großen Beständen vorkommenden baumartigen Euphorbia ingens, aber auch die Latices anderer, großer Euphorbia- arten, wurden bereits während des 2. Weltkriegs auf ihre Brauchbarkeit zur Gewinnung von Kautschuk untersucht [13]. Dabei konnten in den Milchsäften die biologisch inaktiven Triterpene Euphol [13] und + Gegenwärtige Anschrift: Dr. S. Kusumoto, Faculty of Science, Osaka University, Toyonaka, Osaka 560, Japan. * Sonderdruckanforderungen an Prof. Dr. E. Hecker. 0340-5087/81/0700-0878/$ 01.00/0 Euphorbol [14] nachgewiesen werden. Aufgrund der stark irritierenden Wirkung, deren Ursache damals unbekannt war, wurde diese Rohstoffquelle jedoch wieder aufgegeben [6]. Neuerdings haben die Latices von bestimmten Euphorbiaarten als biologische Ressourcen für niedermolekulare Kohlenwasser- stoffe, wie Benzin oder Dieselöl, erneut Interesse gewonnen [15]. Außer in E. ingens kommen das Ingenanderivat 1 und höher oxygenierte Derivate davon als Grund- alkohole irritierender Wirkstoffe auch in zahlreichen anderen Euphorbiaceen vor [3]. Im Hinblick auf die Klärung der Struktur/Wirkungsbeziehungen im Be- reich der irritierenden und cocarcinogenen Wirkung in der Ingenanreihe [3], aber auch im Hinblick auf gewerbehygienische Schutzmaßnahmen bei techno- logischer Nutzung von Euphorbiaarten erschien es von Interesse, sich mit der Chemie des Ingenols (1) als dem Prototyp der polyfunktionellen Grundalko- hole des Ingenantyps näher zu befassen. 1 ist aus Latex von E. ingens E. Mey relativ leicht und in größeren Mengen zugänglich. Ein Teil der Ergeb- nisse ist in Dissertationen erarbeitet worden [16,17]. 1. Ingenol (1) aus Latex von Euphorbia ingens 1, bzw. leicht isolierbare Derivate davon, lassen sich aus dem Acetonextrakt des Milchsaftes von Euphorbia ingens gewinnen. Dazu wird der Aceton- extrakt einer O'Keeffe-Verteilung unterworfen, der- art, daß sich die diterpenoiden Inhaltsstoffe in der hydrophilen Phase anreichern. Durch Filtration der hydrophilen Anteile an Kieselgel lassen sich daraus als Gesamtfraktion die Ingenol-3-acylate des Latex
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This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.
Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.
Zur Chemie des Ingenols, I Ingenol und einige seiner Derivate
On the Chemistry of Ingenol, I Ingenol and Some of its Derivatives
H. J. Opferkuch, W. Adolf, B. Sorg, S. Kusumoto+ und E. Hecker* Institut für Biochemie, Deutsches Krebsforschungszentrum, Im Neuenheimer Feld 280, D-6900 Heidelberg
Z. Naturforsch. 86b, 878-887 (1981); eingegangen am 2. März 1981
The tetracyclic polyfunctional diterpene ingenol (1) is the prototype of many di-terpenoid parent alcohols of the ingenane type. Esters of these parent alcohols occur -partly together with esters of polyfunctional diterpene parent alcohols of the tigliane and daphnane type - as irritant, cocarcinogenic and antineoplastic principles in species of the family Euphorbiaceae (Spurge). Preparation of 1 from latex of Euphorbia ingens E.May as well as of some functional derivatives of 1 are described.
Von vielen Spezies aus der Familie der Wolfs-milchgewächse (Euphorbiaceen) werden unterschied-liche toxische und therapeutische Wirkungen be-richtet (vgl. z.B. I.e. [1, 2]). In den letzten Jahren konnten aus zahlreichen Arten dieser Pflanzen-familie Ester von neuartigen polyfunktionellen Diterpenen isoliert und als deren irritierende, co-carcinogene [3] oder auch antileukämogene [4] Wirkprinzipien identifiziert werden. Es handelt sich dabei um Derivate der (hypothetischen) Diterpene Tiglian, Ingenan oder Daphnan [5]. So wird bei-spielsweise die irritierende und die cocarcinogene Wirkung [6] des Latex von E. ingens E. Mey von verschiedenen Estern der tetrazyklischen, poly-funktionellen Diterpene Ingenol [7] (1) und 16-Hydroxyingenol [8] verursacht [9]. Die im Latex von E. ingens außerdem vorkommenden Ester des makrozyklischen polyfunktionellen Diterpens Ingol [10-12] zeigen dagegen keine irritierende und/oder cocarcinogene Wirkung.
Der Latex der in Südafrika in großen Beständen vorkommenden baumartigen Euphorbia ingens, aber auch die Latices anderer, großer Euphorbia-arten, wurden bereits während des 2. Weltkriegs auf ihre Brauchbarkeit zur Gewinnung von Kautschuk untersucht [13]. Dabei konnten in den Milchsäften die biologisch inaktiven Triterpene Euphol [13] und
+ Gegenwärtige Anschrift: Dr. S. Kusumoto, Faculty of Science, Osaka University, Toyonaka, Osaka 560, Japan.
* Sonderdruckanforderungen an Prof. Dr. E. Hecker. 0340-5087/81/0700-0878/$ 01.00/0
Euphorbol [14] nachgewiesen werden. Aufgrund der stark irritierenden Wirkung, deren Ursache damals unbekannt war, wurde diese Rohstoffquelle jedoch wieder aufgegeben [6]. Neuerdings haben die Latices von bestimmten Euphorbiaarten als biologische Ressourcen für niedermolekulare Kohlenwasser-stoffe, wie Benzin oder Dieselöl, erneut Interesse gewonnen [15].
Außer in E. ingens kommen das Ingenanderivat 1 und höher oxygenierte Derivate davon als Grund-alkohole irritierender Wirkstoffe auch in zahlreichen anderen Euphorbiaceen vor [3]. Im Hinblick auf die Klärung der Struktur/Wirkungsbeziehungen im Be-reich der irritierenden und cocarcinogenen Wirkung in der Ingenanreihe [3], aber auch im Hinblick auf gewerbehygienische Schutzmaßnahmen bei techno-logischer Nutzung von Euphorbiaarten erschien es von Interesse, sich mit der Chemie des Ingenols (1) als dem Prototyp der polyfunktionellen Grundalko-hole des Ingenantyps näher zu befassen. 1 ist aus Latex von E. ingens E. Mey relativ leicht und in größeren Mengen zugänglich. Ein Teil der Ergeb-nisse ist in Dissertationen erarbeitet worden [16,17].
1. Ingenol (1) aus Latex von Euphorbia ingens 1, bzw. leicht isolierbare Derivate davon, lassen
sich aus dem Acetonextrakt des Milchsaftes von Euphorbia ingens gewinnen. Dazu wird der Aceton-extrakt einer O'Keeffe-Verteilung unterworfen, der-art, daß sich die diterpenoiden Inhaltsstoffe in der hydrophilen Phase anreichern. Durch Filtration der hydrophilen Anteile an Kieselgel lassen sich daraus als Gesamtfraktion die Ingenol-3-acylate des Latex
abtrennen. Diese Fraktion (B) wird durch Acetonjp-Toluolsulfonsäure-Hydrat zu den Ingenol-3-acylat-5.20-acetoniden umgesetzt. Aus dem Gemisch erhält man durch nachfolgende Methylat-Behandlung das kristallisierbare Ingenol-5.20-acetonid (4).
Die Fraktion A, die bei der Filtration ebenfalls anfällt und die höhere Ester von 1 enthält (z.B. Ingenol-3.20-diacylate), wird mit Methylat verseift. Das dabei freigesetzte 1 wird entweder mit Acetan-hydrid/Pyridin in das kristallisierbare Ingenol-3.5.20-triacetat (2) oder mit Aceton/p-Toluolsulfon-säure-Hydrat in Ingenol-3.4:5.20-diacetonid (5) überführt. 2 wird durch Umkristallisieren abge-trennt. Das harzige 5 kann einfach gewonnen wer-den, da es sich aufgrund seines hohen Et-Werts chromatographisch leicht von Begleitsubstanzen abtrennen läßt. Diese Eigenschaft ermöglicht auch einen sicheren dünnschichtchromatographischen Schnelltest komplexer Gemische auf 1.
Für die Darstellung von reinem 1 geht man am besten vom Triacetat 2 aus. Andererseits ist das aus dem Trennungsgang direkt gewonnene 4 für die meisten Partialsynthesen ein gut geeignetes Aus-gangsprodukt. Dünnschichtchromatographisch rei-nes Ingenol war bisher nur als nicht kristallisieren-des, harziges Produkt zu erhalten. Es läßt sich durch „Verschäumen" in ein trockenes Pulver verwandeln (vgl. experimenteller Teil).
Partialstrukturen von 1 wurden aus den Massen-, NMR-, IR- und UV-Spektren von Ingenol und sei-nen Derivaten abgeleitet [9, 17]. Die vollständige Struktur und die Stereochemie von 1 konnten durch Röntgen Strukturanalyse des Triacetats 2 aufgeklärt werden [7]. In der Raumstruktur von 1 steht die vom Dreiring gebildete Ebene nahezu senkrecht auf der Ebene des Cyclopentens. 1 enthält acht Asym-metriezentren mit den Chiralitäten 3 S , 4 R , 5 R , 8 R , 10S, 11R, 13R und 14R. In Analogie zur eingeführ-ten Darstellungsweise der strukturverwandten Tiglianderivate [18] wird 14-H a-Konfiguration zu-gewiesen. Der hypothetische gesättigte tetrazykli-sche Grundkohlenwasserstoff, von dem sich 1 ab-leitet, wird als Ingenan [7] oder rational als (2R)-1.1.4|.7 f.9c-Pentamethyl-(l ac.5a^9ac)-dodeca-hydro-2r.8ac-methano-cyclopenta[a]cyclopropa[e]-cyclodecen bezeichnet (vgl. Strukturformel). Inge-nan kann formal auch als ein abeo-ll(9->10/?)-Tiglian aufgefaßt werden (vgl. Strukturformel). Die entsprechende Wagner-Meerwein-Umlagerung eines geeigneten Ingenolderivates wurde realisiert [16] und es wurde darüber kurz berichtet [19]. Bezogen
auf Ingenan ist Ingenol (1, CA Reg. number: 30220-46-3) das 3ß.4.5ß.20-Tetrahydroxy-1.6-inge-nadien-9-on.
2. Funktionelle Derivate des Ingenols 2.1. Derivate der Hydroxylgruppen
2.1.1. A c y l d e r i v a t e Ingenol (1) bildet mit Acetanhydrid/Pyridin bei
Raumtemperatur das leicht kristallisierbare Ingenol -3.5.20-triacetat (2, CA Reg. number: 30220-45-2). Dieses läßt sich mit Acetanhydrid/p-Toluolsulfon-säure-Hydrat zu Ingenol-3.4.5.20-tetraacetat (6) umsetzen. Mit Benzoylchlorid/Pyridin bildet 1 das 3.5.20-Tribenzoat 7. Setzt man 1 mit Benzolboron-säure in Benzol um, so bildet sich innerhalb kurzer Zeit Ingenol-3.4:5.20-bisphenylboronat (8).
Im NMR-Spektrum von 7 (Abb. 1) erscheinen das scharfe Singulett von 3-H bei <5 = 5,36 und das breite Singulett von 5-H bei Ö = 5,86 ppm. Wie ent-sprechende Doppelresonanzexperimente zeigen, ist das Signal von 5-H durch weitreichende Kopplun-gen mit 7-H und 8-H verbreitert. Dieser Sachverhalt kann auch an zahlreichen anderen Ingenolderivaten beobachtet und bei der Zuordnung von Stellungs-isomeren herangezogen werden (vgl. Tab. I).
2.1.2. I s o p r o p y l i d e n - D e r i v a t e Nach dem Dreidingmodell erscheint aufgrund der
Glykolstruktur des polyfunktionellen 1 die Bildung der drei Isopropylidenderivate Ingenol-3.4-acetonid (3), Ingenol-5.20-acetonid (4) und Ingenol-3.4:5.20-diacetonid (5) möglich. 5 wird bei der Reaktion von 1 mit Aceton/p-Toluolsulfonsäure-Hydrat gebildet. Wird 1 mit Aceton/Phosphorpentoxid umgesetzt, so erhält man 5 zusammen mit einer durch präparative Schichtchromatographie nicht ohne weiteres ab-trennbaren gelbgefärbten Verunreinigung. Die Dar-stellung des 5.20-Monoacetonids 4 gelingt mit Aceton/p-Toluolsulfonsäure-Hydrat aus 1, am be-quemsten jedoch aus der Ingenol-3-acylate enthal-tenden Fraktion des Trennungsgangs des Aceton-extrakts von E. ingens-Latex mit nachfolgender Abspaltung der 3-O-Acylgruppen (s.o.). Das zu 4 isomere 3.4-Monoacetonid 3 kann in mäßiger Aus-beute bei der sauren Methanolyse des 5.20-Mono-acetonids 4 oder des Diacetonids 5 erhalten werden. Am besten wird 3 jedoch durch Behandlung des Diacetonids 5 mit wasserfreiem Zinkbromid in Methanol/Methylenchlorid dargestellt.
Tab. I. 1 H-NMR-Daten von Ingenol (1) und einigen seiner Derivate (in CDCI3, ppm-Werte, bezogen auf Tetra-methylsilan).
Als Vergleichssubstanz ist das 3-Acetat 9 des 5.20-Acetonids 4 für die Strukturaufklärung der natürlich vorkommenden Ingenolester von großer Bedeutung. Im NMR-Spektrum dieser Verbindung erscheint das Signal von 3-H als scharfes Singulett bei <5 = 5.52 ppm. Chemische Verschiebung und Signalform erlauben somit eine eindeutige Zuord-
nung von 3-H und 5-H in den NMR-Spektren (s. Tab. I).
2.1.3. Ether Die primäre Hydroxylgruppe 20 läßt sich selektiv
verethern. So sind der Ingenol-20-(£-butyldimethyl-silyl)ether (10) und der Ingenol-20-tritylether (11)
17
Ingenan
17
1: R 1 = R 2 = R 3 = R 4 = H (Ingenol) 2: R 1 = R 2 = R 4 = COCH3; R 3 = H 8: R 1 = R 2 = H ; R 3 , R 4 = Acetonidgruppe 4: R1 , R 2 = Acetonidgruppe; R 3 = R4 = H 5: R1 , R 2 = Acetonidgruppe;
R3 , R 4 = Acetonidgruppe 6: R 1 = R 2 = R 3 = R 4 = COCH3 7: R1 = R 2 = R 4 = Benzoyl; R 3 = H 8: R1 , R 2 = ; B - C 6 H 5 ; R 3 , R 4 = 5 B-C6H5 9: R ! ,R 2 = Acetonidgruppe; R 3 = H ; R 4 = COCH3
10: R 1 = -Si-*-BuMe2; R 2 = R 3 = R4 = H 11: R 1 = -C(C6H5)3; R 2 = R 3 = R4 = H 12: R 1 = -C(C6H5)3 ; R 2 = R 3 = H ; R4 = CH3 13: R 1 = -C(C6H5)3 ; R 2 = R 3 = R 4 = CH3
17
14: Ri = R 2 = R 4 = COCH3; R 3 = R 5 = H 15: R 1 = R 2 = R 4 = R 5 = Benzoyl-; R 3 = H
17 17
18: d1 '2 hydriert
in guten Ausbeuten darzustellen. Aus 11 wurden außerdem der 3-Monomethylether 12 und der 3.4.5-Trimethylether 13 gewonnen.
2.2. Derivate der Carbonylgruppe 2.2.1. Versuch einer Hydrazonbi ldung
Auch bei Anwendung scharfer Bedingungen ge-lang es nicht, die Carbonylgruppe im 3.5.20-Tri-acetat 2 in das Hydrazon zu überführen. Ihre starke sterische Hinderung ist im Dreidingmodell er-kennbar.
2.2.2. Redukt ion der Carbonylgruppe Während 2 oder andere Derivate von 1 unter den
üblichen Bedingungen mit Natriumborhydrid nicht reduziert werden, führt die Reaktion mit Lithium-aluminiumhydrid zum Erfolg. Zur Charakterisierung wird das Reaktionsprodukt mit Acetanhydrid/Pyri-din zum 3.5.20-Triacetat 14 umgesetzt. Unter schär-feren Bedingungen kann auch die bei der Reduktion neu entstandene 9-Hydroxylgruppe acyliert werden,
wie das Beispiel des 3.5.9.20-Tetrabenzoats 15 zeigt. Zur Stereochemie der neuen Hydroxylgruppe siehe [16, 19, 20].
2.3. Derivate der Doppelbindung Die katalytische Hydrierung von 2 mit Palla-
dium/Aktivkohle verläuft stufenweise. Nach weni-gen Minuten sind die Hydrierungsprodukte 16 und dessen 20-Desoxyprodukt 17 entstanden. 17 und eine dazu epimere Verbindung wurden von D. Uemura et al. bei der Hydrierung von 2 bzw. von 20-Desoxyingenol-3.5-diacetat erhalten [21]. Wird die Hydrierung erst nach mehreren Stunden abge-brochen, kann neben 16 und 17 ein weiteres Produkt 18 isoliert werden, das auch bei separater Hydrie-rung von 17 entsteht.
Experimenteller Teil Die Schmelzpunkte wurden an getrockneten Sub-
stanzen auf dem Mikroskop-Heiztisch 350 (Leitz, Wetzlar) bestimmt. Die UV-Spektren wurden mit einem Beckman-Spektralphotometer DK 2 aufge-nommen, die IR-Spektren mit dem Perkin-Elmer-Spektralphotometer 521, die Massenspektren mit den Geräten der Firmen MAT, Bremen (CH-4) und VarianMAT, Bremen (MAT 711). 60 MHz 1 H-NMR -Spektren wurden mit einem Spektrometer der Firma Japan Electron Optics Lab. C. Ltd (C 60 HL), die 90 iH-NMR- und die 13C-NMR- Spektren mit Spek-trometern der Firma Bruker Physik, Karlsruhe (HX 90 und WH 90) aufgenommen. Als innerer Standard diente stets Tetramethylsilan (TMS). Chromatogramme wurden mit Vanillin/Schwefel-säure (V/S) angesprüht und bis zur gewünschten Farbentwicklung auf ca. 110 °C erhitzt. Alle durch präparative Schichtchromatographie (PSC) isolier-ten Substanzen wurden mit Essigester vom Kiesel-gel eluiert. Das Kieselgel zur Säulenchromatogra-phie und zur Filtration in einer Nutsche wurde mit 13% Wasser desaktiviert. Die am häufigsten ver-wendeten Lösungsmittel Ether und Petrolether 60-70 °C sind mit E und PE abgekürzt. Zur multi-plikativen Verteilung wurden Batterien bzw. Ver-teilungselemente der Fa. E. Bühler, Laborgeräte-bau - Glastechnik - Umwelttechnik, Im Schelmen 11, D-7400 Tübingen-Weilheim, benutzt.
Allgemeine Aufarbeitungsvorschrift A: Der Ansatz 'wurde mit einer zur Neutralisation ausreichenden Menge Phosphatpuffer (pH ca. 7) versetzt und an-schließend mit Essigester extrahiert. Nach Trocknen des Essigesterextrakts (Na2S04) engte man am Rotations verdampf er ein.
Allgemeine Aufarbeitungsvorschrift B: Der Ansatz wurde wie bei A mit Phosphatpuffer (pH ca. 7) ver-setzt, 1-2 h (bei rasch hydrolysierenden Reagenzien
entsprechend kürzer) gerührt und dann mit Essig-ester extrahiert. Der Essigester wurde mit ca. 1 M Salzsäure, bei Ansätzen, die Acetanhydrid enthiel-ten zusätzlich mit 5-proz. Natriumhydrogencarbo-natlösung, und danach mit Phosphatpuffer (pH ca. 7) gewaschen, getrocknet (Na2S04) und schließlich am Rotations Verdampfer eindestilliert.
Sofern Verbindungen oder Gemische nicht kristal-lin, sondern als Harze anfallen, verfährt man wie folgt: die Substanz wird im Kölbchen in wenig eines möglichst leicht flüchtigen Lösungsmittels gelöst. Danach wird das Kölbchen mit Hilfe einer Ölpumpe rasch evakuiert. Der VerdampfungsVorgang wird zweckmäßigerweise mit Hilfe eines Föns beschleu-nigt. Auf diese Weise bläht sich das Harz in der Regel zu einem trockenen „Schaum" auf, der pul-verisiert werden kann. Zur Aufnahme des IR-, UV-oder NMR-Spektrums muß der Schaum vollkom-men lösungsmittelfrei gemacht werden. Dazu beläßt man ihn über Nacht im Vakuum-Exsikkator, der mit Phosphorpentoxid beschickt ist. Zur Aufnahme eines NMR-Spektrums genügt es meistens auch, wenn man den Schaum ca. 5-mal mit Tetrachlor-methan zur Trockene bringt.
1. Gewinnung von Ingenol (1) bzw. partialsynthetisch dargestellter Derivate aus dem Latex von Euphorbia ingens
Ca. 10 1 E. ingens-Latex wurden über Nacht mit 401 Aceton geschüttelt. Die dabei entstandene Suspension wurde durch Faltenfilter filtriert. Der DC-Test des so gewonnenen ersten Extrakts zeigte mehrere starke Flecken (E/PE = 4/1). Derjenige mit dem größten Rf-Wert färbte sich mit V/S rotviolett, alle anderen braun. Das Aceton wurde am Rota-tionsverdampfer abdestilliert, bis eine tiefbraune Lösung verblieb, die heftig schäumte und die nur sehr langsam destillierte. Zu diesem Zeitpunkt setzte man gesättigte Kochsalzlösung zu und schüttelte viermal mit je 1 1 Essigester aus. Die Essigester-phase war blaßgelb, die Wasserphase tief braun. Die Essigesterphase wurde am Rotationsverdampfer so-weit es ging eingeengt, und danach wurde der Kol-ben über Nacht unter dem Vakuum einer Ölpumpe belassen. Es resultierten ca. 580 g eines braunen, viskosen Harzes. Der Rückstand der ersten Extrak-tion wurde ein zweites Mal mit 301 Aceton ge-schüttelt. Nach dem Eindestillieren des Acetons verblieben 3100 g weißes, klumpenförmiges Mate-rial, dessen DC einen starken rot-violetten Fleck und nur noch sehr dünne braune Flecken aufwies. Der erste und zweite Extrakt wurden getrennt ver-teilt (s.u.), die hydrophilen Anteile der O'Keeffe-Verteilungen aber später vereinigt.
O'Keeffe- Verteilung der Extrakte System: PE/Methanol/Wasser = 15/10/0,5; 11 Ele-
mente mit je 300/300 ml Fassungsvermögen. Zugabe in 50-g-Portionen. Man löste den Trockenrückstand des Extrakts in Essigester und teilte in aliquote
Mengen. Um die Substanz in die Verteilungsbatterie zu überführen, destillierte man den Essigester ab und ließ den gesamten Inhalt desjenigen Elements zufließen, das mit frischer Substanz beschickt wer-den sollte. Nach kräftigem Durchschütteln wurde der Kolbeninhalt wieder in das leere Verteilungs-element zurückgeschüttet. Die hydrophoben An-teile der Verteilung wurden verworfen, die hydro-philen dagegen vereinigt und weiter verarbeitet. Im beschriebenen Beispiel resultierten 200 g hydrophile Anteile als viskoses Harz. DC (E/PE = 4/1): Rf-Bereich um 0,6 (rotviolett); 7?/-Bereich um 0,5 (braun); i?/-Bereich um 0,2 (braun).
Filtration der hydrophilen Anteile an Kieselgel 200 g hydrophile Anteile wurden in 400 ml
Methylenchlorid gelöst und auf eine mit Kieselgel gefüllte Glasfilternutsche ( 0 19 cm; Füllhöhe 14cm) gegeben. Danach wurden ca. 6 1 E/PE = 1,5/1 mäßig schnell durchgesaugt. Nach Verdampfen des Lö-sungsmittels verblieben 150 g eines viskosen Harzes, dessen DC (E/PE = 4/1) im wesentlichen nur die Substanzen mit den Rf-Werten im Bereich 0,6 0,5 anzeigte (Fraktion A). Nach dem Durchsaugen der 61 E/PE wurde mit 121 Essigester eluiert. Das Essigestereluat wurde zur Trockene gebracht, wobei 40 g eines viskosen Harzes verblieben, dessen DC (E/PE = 4/1) praktisch nur einen Fleck mit dem i?/-Wert 0,2 anzeigte (Fraktion B).
Verseifung der Fraktion A, Darstellung des Triacetats 2 oder des 3.4:5.20-Diacetonids 5
Fraktion A wurde mit 2 1 0,1 M Natriummethylat Methanol versetzt, 48 h sich selbst überlassen, danach mit ca. 4 M Salzsäure vorsichtig neutrali-siert und dann am Rotationsverdampfer zur Trok-kene destilliert. Man digerierte den Trockenrück-stand kräftig mit einem Gemisch aus Methylen-chlorid, Essigester und Aceton. Die gebildete Suspension wurde filtriert, der Trockenrückstand des Filtrats in möglichst wenig Essigester gelöst und auf einer Kieselgelsäule mit Essigester chromato-graphiert (oder durch eine Nutsche filtriert). Man isolierte die Fraktion (ca. 70 g), die den Bf-Wert (0,15 in Essigester) des Ingenols (1) besaß. Dieses Gemisch wurde mit Pyridin/Acetanhydrid acetyliert und danach mit E/PE = 1/1 auf einer Kieselgelsäule chromatographiert. Isoliert wurde nur die Fraktion, die den i^-Wert des 3.5.20-Triacetats 2 (0,37 in E/PE = 4/1) aufwies (ca. 22 g). Diese Fraktion konnte aus E/PE kristallisiert werden, wobei sich 7,5 g 3.5.20-Triacetat 2 abschieden.
Ingenol (1) kann während des gesamten Tren-nungsgangs in den verschiedensten Fraktionen leicht als Diacetonid 5 nachgewiesen werden. Dazu ver-setzt man eine Probe, in der 1 identifiziert werden soll, mit saurem Aceton (10 mg p-Toluolsulfonsäure-Hydrat/ml Aceton p.a.) und testet nach etwa 1 h in E/PE = 4/1 aus. Das eventuell gebildete 5 läßt sich einfach erkennen, da sein i2/-Wert (0,65 in
E/PE = 4/1) in der Regel viel größer ist, als der aller anderen Gemischkomponenten.
Um das Diacetonid 5 präparativ darzustellen, be-folgt man die analytische Vorschrift, arbeitet auf und trennt wie bei der Darstellung von 5 beschrie-ben.
Weiterverarbeitung der Fraktion B, Darstellung des 5.20-Monoacetonids 4
Die folgende Vorschrift wird nur befolgt, wenn 4 dargestellt werden soll. Anderenfalls behandelt man Fraktion B analog wie Fraktion A, ohne jedoch A und B zu vereinigen und erhält dann das Triacetat 2 oder das Diacetonid 5.
40 g der Fraktion B wurden ca. 60 h mit 300 ml Aceton p.a. versetzt, das 5 mg p-Toluolsulfonsäure-Hydrat pro ml enthielt. Die Lösung wurde danach mit Natriummethylat/Methanol neutralisiert, weit-gehend eindestilliert und danach gemäß Vorschrift A aufgearbeitet. Der Trockenrückstand wurde in 1 1 0,1 M Natriummethylat/Methanol gelöst, 70 h sich selbst überlassen, dann mit 1 M Salzsäure neutrali-siert, weitgehend eindestilliert und schließlich ge-mäß Vorschrift A aufgearbeitet. Mit Hilfe einer Kieselgelsäule (Eluent: E/PE = 1/1) wurde die Fraktion (13,2 g) isoliert, die den Rf-Wert des Acetonids 4 aufwies (0,18 in E/PE = 1/1). Die Frak-tion konnte aus Essigester kristallisiert werden und ergab 11,1 g farblose Nadeln.
a) Darstellung aus dem 3.5.20-Triacetat 2: 100 mg (0,21 mmol) 3.5.20-Triacetat 2 wurden mit 10 ml 0,1 M Natriummethylat/Methanol so lange umge-setzt, bis dünnschichtchromatographisch kein Aus-gangsprodukt mehr nachzuweisen war. Der Ansatz wurde dann gemäß der Vorschrift A aufgearbeitet. Den verbleibenden Rückstand nahm man in Essig-ester auf und chromatographierte über eine Kiesel-gelsäule (ca. 1 ,5x20 cm; Eluent: Essigester). Es ließen sich 52 mg (0,15 mmol, 71% d.Th.) DC reines 1 gewinnen, die nicht kristallisierten.
b) Darstellung aus dem 5.20-Monoacetonid 4: 800 mg (2,06 mmol) 5.20-Monoacetonid 4 wurden mit 80 ml einer Lösung von 0,34 ml 70-proz. Per-chlorsäure in 100 ml Methanol versetzt. Nach ca. 1 h wurde mit ca. 0,1 M Natriummethylat/Methanol neutralisiert und am Rotationsverdampfer weit-gehend eingeengt. Danach wurde gemäß Vorschrift A aufgearbeitet. Die Trennung des Reaktionsgemischs erfolgte wie in a) beschrieben. Es ließen sich ca. 470mg (1,35mmol, 66% d.Th.) DC reines 1 eluieren. Aus früher eluierenden Fraktionen konnte unreines Ausgangsprodukt 4 und unreines 3.4-Acetonid 3 (entstand bei der Reaktion) gewonnen werden. -Rf-Wert 0,25 (in Essigester, olivbraun mit V/S). -IR (KBr): 3420 (OH), 1705 cm-i (C=0) . - UV (Methanol): A(e) = 196,5 (12070), Amax(e) = 291 nm (220). - iH-NMR (90 MHz, CDCI3): ö = 6,0 (m, 7-H),
200 mg (0,57 mmol) 1 wurden in 10 ml Pyridin gelöst und mit 2 ml (17,4 mmol) Benzoylchlorid versetzt. Nach dem Stehen über Nacht wurde ge-mäß Vorschrift B aufgearbeitet, über eine Kieselgel-säule chromatographiert und anschließend kristalli-siert. Die Ausbeute betrug 340 mg (0,52 mmol, 90% d.Th.). - Schmp. 170-172 °C (aus E/PE). - Rf-Wert 0,6 (in E/PE = 4/1, olivbraun mit V/S). - IR (CH2C12): 1717 cm - 1 (C=0) . - UV (Methanol): A(e) = 195 (126000), Amax(fi) = 230 (24800), 267 (2600), 273
3.4:5.20-Bisphenylboronat des Ingenols (8) 30 mg (0,086 mmol) 1 wurden in 2 ml Benzol ge-
löst und mit 22 mg (0,18 mmol) Benzolboronsäure versetzt. Man engte danach ein und trennte durch PSC im System E/PE = 1/4 (4 x entwickeln). Die Substanzzone wurde sehr breit. Es konnten 42 mg (0,081 mmol, 94% d. Th.) harziges 8 eluiert werden.-i?/-Wert: auf Kieselgel stark schwänzend, olivbraun mit V/S. - iH-NMR (90 MHz, CDCI3): 0 = 6,12 (m, 7-H), 5,98 (m, 1-H), 5,42 (s, 3-H), 4,5 (mc, 5-H, 20-H2), 4,1 (m, 8-H), 2,0 (m, 19-H3), 1,22 und 1,08 (s, s, I6-H3 und 17-Hg), 0,88 (d, Jn,i8 = 8 Hz, I8-H3), 7,9-7,0 ppm (m, 10 H, Aromaten-H). - MS: m/e = 520 (M+).
a) Es wurden 100 mg (0,29 mmol) 1 mit 10 ml Acetonp. a. und 100 mgp-Toluolsulfonsäure-Hydrat versetzt. Die Lösung blieb so lange sich selbst über-lassen, bis dünnschichtchromatographisch kein 1 mehr nachzuweisen war. Danach wurde gemäß Vor-schrift A aufgearbeitet und mittels PSC im System E/PE = 1/4 (3 X entwickeln) getrennt. Es konnten 87 mg (0,20 mmol, 70% d.Th.) harziges 5 eluiert werden.
b) Es wurden 100 mg (0,29 mmol) 1 in 10 ml Aceton p.a. gelöst und mit einer Spatelspitze Phos-phorpentoxid versetzt. Sobald dünnschichtchro-matographisch kein 1 mehr nachzuweisen war, wurde abdekantiert, gemäß Vorschrift A aufgearbei-tet und weiter verfahren wie unter a) beschrieben. Es resultierten 103 mg eines gelbes Harzes. Die spektroskopischen Daten stammen von der nach a) synthetisierten Substanz.
360 mg (1,03 mmol) 1 wurden mit 10 ml Aceton p.a. versetzt, das 0,47 mg p-Toluolsulfonsäure-Hydrat pro ml enthielt. Nach 8 min wurde gemäß Vorschrift A aufgearbeitet und mittels PSC im
System E/PE = 2/1 getrennt. Es konnten 319 mg 0,82 mmol, 80% d.Th.) 4 eluiert werden, die aus Essigester kristallisierten. - Schmp. 200 °C. - 7?/-Wert 0,27 (in E/PE = 2/1, braun mit V/S). -IR (KBr): 3510, 3380 (OH), 1710 cm-i (C=0) . -UV (Methanol): Amax (e) = 292 nm (230). - 1H-NMR (60 MHz, CDCla): <5 = 5,90 (m, 1-H), 5,78 (m, 7-H), zwischen 4,3 und 3,9 (m, 3-H, 8-H, 20-H2), 3,90 (m, 5-H), 1,85 (m, 19-H3), 1,12 und 1,04 (s, s, 16 und I7-H3), 0,95 (d, ,/ii,i8 = 7 Hz, I8-H3), D20-aus-tauschbare Protonen bei 3,72 und 3,05; 1,40 und 1,32 ppm (s, s, Acetonid-H3). - MS: m/e = 388 (M+).
40 mg (0,1 mmol) 4 wurden in 2,5 ml Pyridin gelöst und mit 0,5 ml (5,3 mmol) Acetanhydrid ver-setzt. Nach dem Stehen über Nacht wurde gemäß Vorschrift B aufgearbeitet und durch PSC im System E/PE = 2/1 getrennt. Es konnten 35 mg (0,08 mmol, 81% d.Th.) 9 erhalten werden. - Rf-Wert 0,36 (in E/PE = 1/1, braun mit V/S). -iH-NMR (60 MHz, CDCI3): <5 = 6,05 (m, 1-H), 5,8 (m, 7-H), 5,52 (s, 3-H), 4,3-4,0 (m, 5-H, 8-H, 20-H2), 1,8 (m, 19-Ha), 1,1 und 1,04 (s, s, I6-H3 und 17-H3), 1,0 (d, «7ii,i8 = 7Hz, I8-H3), D20-austauschbares Proton bei 3,15; 1,43 und 1,40 ppm (s, s, Acetonid-H3). - MS: m/e = 430 (M+).
a) 115 mg (0,27 mmol) Diacetonid 5 wurden in 11ml Methanol gelöst, das 0,34 ml 70-proz. Per-chlorsäure pro 100 ml enthielt. Nach 45 min wurde gemäß Vorschrift A aufgearbeitet und durch PSC im System E/PE = 4/1 getrennt. Es konnten ge-wonnen werden: 19 mg (0,044 mmol, 17% d.Th.) Ausgangsprodukt (Rf-Wert 0,65), 3 mg 0,008 mmol, 3% d.Th.) 5.20-Acetonid 5 (72/-Wert 0,42), 19 mg (0,049 mmol, 18% d.Th.) 3.4-Acetonid 3 (Rf-Wert 0,15) und 32 mg (0,082 mol, 31% d.Th.) Ingenol 1 (7?/-Wert 0,03).
b) 580 mg (1,36 mmol) Diacetonid 5 wurden in 58 ml eines Gemisches aus 100 ml Dichlormethan p. a. und 20 ml Methanol p. a. gelöst und danach mit 13,05 g (58 mmol) wasserfreiem Zinkbromid ver-setzt. Nach 3,5 h fügte man 400 ml Dichlormethan zu, extrahierte 3-mal mit je 150 ml Wasser und zu-letzt mit Phosphatpuffer (pH ca. 7). Die organische Phase wurde getrocknet (Natriumsulfat) und ein-destilliert. Durch PSC im System Essigester/PE = 2/1 konnten 369 mg (0,95 mmol, 70% d.Th.) harzi-ges 3 gewonnen werden. - Rf-Wert 0,15 (in E/PE = 4/1, olivbraun mit V/S). - IR (KBr): 3460 (OH), 1715 cm-i (C=0) . - UV (Methanol): Am&x(e) = 293 nm (400). - iH-NMR (90 MHz, CDCI3): <5 = 6,20 (m, 7-H), 5,83 (m, 1-H), 4,82 (s, 3-H), 4,15 (s, 20-H2), ca. 4,1 (m, 5-H, 8-H), 1,85 (m, 19-H3), 1,14 und 1,04 (s, s, I6-H3 und I7-H3), D20-austauschbare Proto-
nen um 4,1 und 3,3; 1,54 ppm (s, 6 H, Acetonid-Hs). - MS: m/e = 388,2249 (M+, 388,2250 berechnet für C23H320ö).
85 mg (0,24 mmol) 1 wurden in 2 ml N.N-Di-methylformamid gelöst und mit 140 mg (2,1 mmol) Imidazol p.a. sowie 190 mg (1,27 mmol) t-Butyl-dimethylsilylchlorid versetzt. Nach 45 min wurde Puffer (pH ca. 7) und dann Essigester zugesetzt. Der Essigester wurde zweimal mit Wasser extra-hiert, getrocknet und im Vakuum abdestilliert. Die Trennung erfolgte durch PSC im System E/PE = 3/1. Es konnten 83 mg (0,18 mmol, 75% d.Th.) 10 erhalten werden. - 7^-Wert 0,47 (in E/PE = 4/1, braun mit V/S). - UV (Methanol): /max(£) = 291 nm (240). - iH-NMR (90 MHz, CDC13): <5 = 6,0 (m, 7-H), 5,9 (m, 1-H), 4,33 (s, 3-H), 4,2 (s, 20-H2), ca. 4,2 (m, verdeckt, 8-H), 3,85 (m, 5-H), 1,85 (m, I9-H3), 1,23 und 1,15 (s, s, I6-H3 und 17-H3), DaO-austauschbare Protonen bei 4,4, 4,1, 3,05; 0,9 (s, 9 H, Butyl), 0,1 ppm (s, 6 H, SiMe2). - MS: m/e = 462 (M+).
Bei einer wie oben durchgeführten Methylierung in N.N-Dimethylformamid entsteht eine Substanz mit m/e = 632 (M+ für 13).
Versuch der Hydrazonbildung 10 mg (0,021 mmol) Ingenol-3.5.20-triacetat (2)
wurden mit 10 mg (0,05 mmol) (2.4-Dinitrophenyl)-hydrazin in 1ml Chloroform/Eisessig = 1/1 gelöst und 60 h am Rückfluß gekocht. Durch DC ließ sich nur das Ausgangsprodukt 2 nachweisen.
Versuch zur Reduktion des Ingenol-3.5.20-tribenzoats (7) mit Natriumborhydrid
10 mg (0,015 mmol) Ingenol-3.5.20-tribenzoat (7) wurden in 1 ml Tetrahydrofuran und 0,1 ml 2-Pro-panol gelöst und mit 10 mg (0,26 mmol) Natrium-borhydrid versetzt. Nach 24 h ließ sich durch DC nur unverändertes 7 nachweisen.
wurden in 10 ml wasserfreiem Diethylether gelöst und mit 500 mg (13,2 mmol) Lithiumaluminium-hydrid in 25 ml Diethylether versetzt. Nach 2-stdg. Kochen am Rückfluß wurde gemäß Vorschrift A aufgearbeitet und danach mit 3 ml Pyridin und 5 ml (52,6 mmol) Acetanhydrid versetzt. 15 h später wurde gemäß Vorschrift B aufgearbeitet und durch PSC im System E/PE = 2/1 getrennt. Es konnten 55 mg (0,12 mmol, 34% d.Th.) 14 gewonnen wer-den. - Ä/-Wert 0,2 (in E/PE = 2/1, graublau mit V/S). - IR (KBr): 1735 cm-i (C=0) . - UV (Metha-nol) : A(e) = 196,5 nm (15000). - *H-NMR (60 MHz, CDCI3): <5 = 6,44 (m, 7-H), 6,01 (m, 1-H), 5,54 (m, 5-H), 4,98 (s, 3-H), 4,43 ±0,20 (AB-System, JAB=12HZ , 20-Ha), 3,42 (m, 9-H), 3,35 (m, 8-H), 1,76 (m, I9-H3), 1,29 und 1,10 (s, s, I6-H3 und 17-Hs), ca. 1,18 (verdeckt, I8-H3), 0,9 (m, 14-H), 2,2, 2,1, 2,0 ppm (s, s, s, je 3 H, Acetyl-H3). - MS: m/e = 476 (M+).
400 mg (0,84 mmol) Ingenol-3.5.20-triacetat (2) wurden analog wie bei der Darstellung von 14 redu-ziert. Zum aufgearbeiteten Reaktionsansatz gab man 20 ml Pyridin und 5 ml (43,6 mmol) Benzoyl -chlorid. Nach 12 h Raumtemperatur und weiteren 12 h bei 100 °C wurde gemäß Vorschrift B aufge-arbeitet und durch PSC im System E/PE = 9/1 (4 x entwickeln) getrennt. Es ließen sich 390 mg
Hydrierung des Ingenol-3.5.20-triacetats (2) a) 15 mg (0,032 mmol) 2 wurden in einer vor-
hydrierten Suspension von 30 mg 10-proz. Palla-dium/Aktivkohle in 20 ml Essigester gelöst und bei 25 °C und Atmosphärendruck hydriert. Nach 5 min wurde abgesaugt. Das DC des Filtrats zeigte zwei etwa gleich starke Flecken: Rf-Wert 0,37 und 0,62 (in E/PE = 4/1, blau und orange mit V/S).
b) 250 mg (0,53 mmol) 2 winden in einer vor-hydrierten Suspension von 500 mg 10-proz. Palla-dium/Aktivkohle in 30 ml Essigester 60 h hydriert. Nach dem Absaugen des Katalysators wurde durch PSC im System E/PE = 4/1 getrennt. Es konnten drei Substanzen isoliert werden: 16 (i?/-Wert 0,37, blau mit V/S), 17 (Rf-Wevt 0,62, orange mit V/S) und 18 [Rf-Wert 0,68, rot mit V/S).
Hydrierung von 17 zu 18 15 mg (0,036 mmol) 17 wurden wie bei der Hydrie-
rung (b) von 2 beschrieben behandelt. Es läßt sich danach eine Substanz mit dem dünnschichtchro-matographischen Verhalten von 18 nachweisen.
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