11412004-Fitri Audia-laporan KP

i

Program Studi Rekayasa Pertanian

Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati

Institut Teknologi Bandung

2015

Laporan Kerja Praktik (BA3002)

Uji Keseragaman Genetik Tetua Hibrida Timun Cu1044 Berdasarkan

Penanda Simple Sequence Repeat (SSR)

PT. BISI International Tbk.

Disusun oleh :

Fitri Audia

11412004

ii

ABSTRAK

Uji keseragaman secara genetik dilakukan untuk melengkapi pengujian keseragaman

secara morfologi yang kadang tidak akurat karena adanya faktor lingkungan yang turut

berpengaruh terhadap morfologi tanaman. Dalam pengujian keseragaman genetik tetua

hibrida Timun Harmony Plus berdasarkan Simple Sequence Repeat (SSR) yang dilakukan di

Lab. Molecular Breeding, PT. BISI International Tbk., sebanyak 34 sampel dari empat

generasi tetua hibrida, yaitu Cu1044 An, Cu1044 An-1, Cu1044 Bn dan Cu1044 Bn-1, diuji

dengan menggunakan primer CSCJT 14, CSCJT 35, CSCJT 71, CSCJT 315, CSCJT 323,

CSCJT 390, CSCJT 598, CSCJT 661, CSCJT 619, CSCJT 674, CSCJT 799, CSN 061, SSR

00019, SSR 00670, SSR 03514, SSR 04805, SSR 5865, SSR 11343, SSR 18530, dan SSR

23148. Setelah melalui tahapan isolasi DNA, Amplifikasi DNA, dan analisis Fragmen DNA,

diperoleh hasil persentase keseragaman genetik sebanyak 95,19% untuk Galur Cu1044 An,

96,75% untuk Galur Cu1044 Bn, 96,8% untuk Galur Cu1044 An-1, dan 97,05% untuk Galur

Bn-1.

Kata kunci : Keseragaman genetik, Timun Timun Cu1044, SSR

iii

LEMBAR PENGESAHAN KERJA PRAKTIK

Judul laporan : Uji Keseragaman Genetik Tetua Hibrida Timun Harmony Plus

Berdasarkan Penanda Molekuler Simple Sequence Repeat (SSR)

Nama penyusun : Fitri Audia

NIM penyusun : 11412004

Disetujui oleh,

Kepala Departemen Bioteknologi Pembimbing Kerja Praktik

PT. BISI International Tbk.

Dr. Rudy Lukman, Ph.D. Rerin Santiana, S.Si.

NIK. 20600138 NIK. 21001046

Mengetahui,

Ketua Program Studi Koordinator Kerja Praktik

Rekayasa Pertanian

Dr. Ramadhani Eka Putra, Ph.D. Dr. Ramadhani Eka Putra, Ph.D.

NIP. 197709000912100 NIP. 1977090009121044

iv

KATA PENGANTAR

Puji syukur saya ucapkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya

sehingga rangkaian kerja praktik ini dapat diselesaikan. Tak lupa, saya ucapkan banyak

terima kasih kepada pihak PT. BISI International Tbk. yang telah memberikan saya

kesempatan untuk menambah wawasan sekaligus memenuhi kewajiban saya untuk

menuntaskan mata kuliah Kerja Praktik; kepada Koordinator Mata Kuliah Kerja Praktik;

kepada keluarga tercinta yang selalu memberikan dukungan; serta kepada rekan-rekan

seperjuangan, mahasiswa Rekayasa Pertanian Institut Teknologi Bandung 2012 yang selalu

memberikan motivasi untuk mengeluarkan kinerja yang optimal dalam melaksanakan kerja

praktik ini.

Kerja praktik merupakan sarana bagi mahasiswa Rekayasa Pertanian untuk menggali

wawasan mengenai dunia kerja yang berkaitan dengan bidang pertanian sekaligus memupuk

jiwa profesionalitas sehingga setelah lulus sebagai Sarjana Rekayasa Pertanian, mahasiswa

tersebut dapat menjadi sumber daya manusia yang lebih kompeten dan kompetitif dalam

menghadapi pesatnya perkembangan teknologi didunia pertanian. Melalui laporan kerja

praktik yang berjudul “Uji Keseragaman Genetik Tetua Hibrida Timun Cu1044

Berdasarkan Penanda Simple Sequence Repeat (SSR)” ini, saya berharap dapat memberikan

wawasan mengenai pengaplikasian teori yang telah didapatkan dari proses perkuliahan

mengenai pemuliaan molekuler (Molecular Breeding). Semoga laporan kerja praktik ini

dapat berguna bagi semua pihak.

Kediri, Juli 2015

Penyusun

v

DAFTAR ISI

ABSTRAK .............................................................................................................................................. ii

LEMBAR PENGESAHAN KERJA PRAKTIK .................................................................................... iii

KATA PENGANTAR ........................................................................................................................... iv

DAFTAR ISI ........................................................................................................................................... v

DAFTAR TABEL ................................................................................................................................. vii

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................................................... viii

DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................................................... xi

BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang Kegiatan ..................................................................................................... 1

1.2 Tujuan Kegiatan ................................................................................................................... 1

1.3 Manfaat Kegiatan ................................................................................................................. 2

BAB II GAMBARAN UMUM PERUSAHAAN ................................................................................... 3

BAB III TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................................................... 5

3.1 Timun F1 Cu1044 ................................................................................................................. 5

3.2 Penanda Simple sequence repeat (SSR) ............................................................................... 5

3.3 Pengujian Keseragaman Genetik ........................................................................................ 6

BAB IV METODOLOGI ....................................................................................................................... 7

4.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan Kegiatan ........................................................................ 7

4.2 Sampel Penelitian dan Primer SSR ..................................................................................... 8

4.3 Pelaksanaan Kegiatan .......................................................................................................... 9

4.3.1 Persiapan alat dan bahan ................................................................................................. 9

4.3.2 Pengambilan sampel ....................................................................................................... 10

4.3.3 Isolasi DNA .................................................................................................................... 100

4.3.4 Penentuan Konsentrasi DNA ......................................................................................... 11

4.3.5 Amplifikasi DNA ............................................................................................................. 12

4.3.6 Visualisasi hasil amplifikasi ........................................................................................... 12

4.3.7 Analisa Fragmen SSR ..................................................................................................... 13

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................................ 15

5.1 Isolasi DNA Genom ............................................................................................................. 16

5.2 Amplifikasi DNA Genom dan Elektroforesis Amplikon ................................................. 18

5.3 Analisis Fragmen SSR ........................................................................................................ 19

vi

5.4 Keseragaman Genetik Sampel ........................................................................................... 21

BAB IV KESIMPULAN ...................................................................................................................... 23

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................................................... 24

LAMPIRAN .......................................................................................................................................... 26

vii

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Timeline Kerja Praktik ...................................................................................................... 7

Tabel 2. Perhitungan persentase keseragaman genetik ............................................................... 22

viii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Lambang Perusahaan.................................................................................................... 3

Gambar 2. Struktur Organisasi Departemen Bioteknologi .......................................................... 4

Gambar 3. Bahan penelitian ............................................................................................................ 9

Gambar 4. Contoh sampel daun muda ......................................................................................... 10

Gambar 5. Pencampuran Loading dye dan hasil isolasi DNA pada plate Elisa ........................ 11

Gambar 5. Proses Elektroforesis ................................................................................................... 11

Gambar 6. Kuantifikasi DNA ........................................................................................................ 12

Gambar 7. Program amplifikasi pada mesin PCR ...................................................................... 12

Gambar 8. KAPA Universal DNA Ladder Kits ........................................................................... 13

Gambar 9. (a) 96 Well plate PCR yang telah ditutup septa dan dimasukkan dalam tray ........ 14

Gambar 9. (b) Letak tray dalam mesin Applied Biosystem .......................................................... 14

Gambar 10. (a) Elektroferogram primer CSCJT 661 ................................................................. 15

Gambar 10. (b) Elektroferogram primer SSR 4805 .................................................................... 15

Gambar 11. (a) Tiga fasa yang terbentuk setelah sentrifugasi ................................................... 17

Gambar 11. (b) Pelet DNA ............................................................................................................. 17

Gambar 12. (a) Genetic Analyzer 3500 XL dan Internal Line Size Standard .......................... 19

Gambar 13. Elektroforegram menunjukkan pola Offtype .......................................................... 20

Gambar 14. Perbandingan hasil visualisasi elektroforesis dan Genetic analyzer 3500 XL ..... 21

ix

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran A. Daftar primer yang dimultipleks ....................................................................... 27

Lampiran B. Hasil kuantifikasi DNA ........................................................................................ 28

Lampiran C. Visualisasi amplifikasi dengan elektroforesis ................................................. 29

Lampiran D. Perhitungan Persentase Keseragaman Genetik ............................................. 30

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Kegiatan

Kegiatan usaha pertanian tidak terlepas dari industri pembenihan tanaman.

Semakin hari, Industri ini terus berkembang mengikuti perkembangan teknologi yang juga

terjadi di berbagai bidang. Beberapa perusahaan benih telah menerapkan teknologi

pemuliaan tanaman untuk mengembangkan produknya, salah satunya PT. BISI

International Tbk yang bergerak di bidang pembenihan tanaman pangan dan holtikultura.

Uji keseragaman tetua hibrida Timun F1 Cu1044 merupakan salah satu upaya PT.

BISI International Tbk dalam mempertahankan kepuasan dan kepercayaan konsumen.

Melalui kegiatan ini, PT. BISI International Tbk dapat melakukan evaluasi terhadap

varietas baru yang dihasilkan dari program pemuliaan dan memastikan bahwa benih

hibrida yang telah dipasarkan dapat memberikan hasil panen yang sesuai dengan harapan

konsumen. Selain itu, kegiatan ini merupakan salah satu langkah yang harus ditempuh

dalam mendapatkan hak Perlindungan Varietas Tanaman untuk Timun Cu1044 serta

Galur Cu1044 A dan Cu1044 B selaku tetua dari varietas tersebut.

Uji keseragaman genetik dilakukan untuk melengkapi pengujian keseragaman

secara morfologi yang kadang tidak akurat karena adanya faktor lingkungan yang turut

mempengaruhi morfologi tanaman. Dalam hal ini, pengujian keseragaman genetik tetua

hibrida merupakan hal yang sangat penting, karena keseragaman genetik tetua hibrida

akan menentukan keseragaman genetik F1 yang dihasilkan dari persilangan kedua tetua.

Tetua yang tidak seragam secara genetik cenderung akan menghasilkan keturunan F1 yang

lebih beragam. Penanda Simple Sequence Repeat (SSR) yang telah digunakan oleh Lab.

Molecular Breeding, PT. BISI International Tbk Merupakan penanda yang paling tepat

karena bersifat highly polymorphic dan codominant.

1.2 Tujuan Kegiatan

Kegiatan ini bertujuan untuk menentukan persentase keseragaman genetik dari

empat galur tetua Timun Cu1044 yang terdiri dari Cu1044 An (betina), Cu1044 An-1

(betina generasi sebelumnya), Cu1044 Bn (jantan) dan Cu1044 Bn-1 (jantan generasi

sebelumnya) menggunakan penanda SSR.

2

1.3 Manfaat Kegiatan

Manfaat yang didapatkan oleh peserta kerja praktik dan perusahaan dari

kegiatan ini adalah sebagai berikut.

1. Peserta Kerja Praktik dapat menyelesaikan Mata Kuliah Kerja Praktik yang

menjadi syarat kelulusan bagi Mahasiswa Rekayasa Pertanian Institut

Teknologi Bandung.

2. Peserta Kerja Praktik memperoleh pengalaman mengenai dunia kerja.

3. Peserta Kerja Praktik memperoleh wawasan mengenai pengaplikasian

penanda molekuler dalam bidang pemuliaan tanaman.

4. Perusahaan mengetahui persentase keseragaman genetik untuk tetua hibrida

salah satu produk komersial.

3

BAB II

GAMBARAN UMUM PERUSAHAAN

PT. BISI International Tbk, merupakan perusahan benih yang memproduksi,

mengembangkan, dan menjual benih tanaman pangan dan hortikultura, dengan merek

dagang "CAP KAPAL TERBANG". Perusahaan ini berdiri sejak tahun 1983, dan telah

memiliki pabrik serta laboratorium yang modern sehingga mampu menghasilkan produk

benih yang berkualitas, beradaptasi luas, tahan hama penyakit dan berproduksi tinggi. Pada

tahun 2005, perusahaan ini mulai mengembangkan program ekspor ke beberapa negara

seperti China, Fiilipina, Jepang, Vietnam dan Malaysia, yang kemudian dikembangkan lagi

pemasarannya ke India pada tahun 2008 (PT. BISI International Tbk, 2015).

Gambar 1. Lambang perusahaan (PT. BISI International Tbk, 2015)

PT. BISI International Tbk memiliki beberapa departemen yang terdiri dari

Departemen Produksi, Departemen Pemasaran, Departemen keuangan, Departeman HRD,

Departemen Quality Kontrol (QC), Departemen Penelitian dan Pengembangan Produk

(R&D), dan Departemen Bioteknologi (PT. BISI International Tbk, 2013). Dari bagian

tersebut, Departemen Bioteknologi merupakan salah satu sarana yang dibentuk perusahaan

untuk melakukan penelitian dan pengembangan benih tanaman berbasis bioteknologi.

Departemen ini memiliki lima laboratorium, yaitu Lab. Proteksi Tanaman, Lab. Molecular

Breeding, Lab. Fisiologi Tanaman, Lab. Kultur Jaringan, dan Lab. Genetic engineering.

Berikut Struktur Organisasi Departemen Bioteknologi, PT. BISI International Tbk

4

Gambar 2. Struktur Organisasi Departemen Bioteknologi (PT. BISI International Tbk, 2015)

Laboratorium Molecular Breeding berfungsi sebagai tempat penelitian dan

pengembangan tanaman berbasis penanda molekuler. Obyek penelitian di Laboratorium ini

diantaranya adalah tanaman, organisme pengganggu tanaman, organisme yang bermanfaat

bagi tanaman, dsb. Laboratorium ini dilengkapi dengan berbagai fasilitas yang tersebar di

ruang isolasi DNA, ruang PCR, ruang elektroforesis dan visualisasi DNA, ruang Genetic

Analyzer, dan ruang Bioinformatika.

Kegiatan di Laboratorium ini terbagi menjadi kegiatan yang bersifat proyek dan

pelayanan. Proyek pengembangan yang di lakukan di Laboratorium Molecular Breeding

diantaranya adalah pengembangan DNA fingerprinting untuk varietas komersial,

pengembangan Marker Asissted Selection untuk program pemuliaan tanaman dan identifikasi

keragaman genetik pathogen yang menyerang tanaman, dsb. Kegiatan pelayanan (service)

yang dilakukan oleh Laboratorium Molecular Breeding ditujukan untuk memberikan

pelayanan bagi departemen atau sub departemen lain untuk kegiatan yang berkaitan dengan

analisis biomolekuler seperti genetic verification untuk mengidentifikasi keberadaan offtype

atau kasus pemalsuan benih, uji kemurnian dan keseragaman genetik benih, dsb.

Kepala Departemen Bioteknologi

Koordinator Lab. Proteksi

Tanaman

Staf Lab. Proteksi tanaman

Asisten Lab. Proteksi

Tanaman

Koordinator Lab. Fisiologi

Tanaman

Staf Lab. Fisiologi

Tanaman

Asisten Lab. Fisiologi

Tanaman

Koordinator Lab. Molecular

Breeding

Staf Lab. Mol. Breeding

Asisten Lab. Molecular Breeding

Koordinator Lab. Kultur

Jaringan

Staf Lab. Kultur Jaringan

Asisten Lab. Kultur Jaringan

Koordinator Lab. Genetic Engineering

Staf Lab. Gen. Engineering

Asisten Lab. Genetic

Engineering

5

BAB III

TINJAUAN PUSTAKA

3.1 Timun Cu1044

Timun Cu1044 adalah salah satu varietas timun hibrida yang diproduksi oleh

perusahaan benih PT. BISI International Tbk. Benih ini mulai dipasarkan pada bulan Juli

2014. Buah Timun Cu1044 umumnya memiliki warna kulit yang hijau gelap dengan

panjang 25 cm, diameter 5 cm dan berat 300 gr/ buah. Buah ini memiliki rasa yang manis

mulai dari ujung hingga pangkal buah sehingga tidak ada bagian yang pahit. Buah Timun

Cu1044 dapat dipanen setelah berumur ± 34 hari (Hariyanto, 2015).

Tanaman Timun Cu1044 memiliki gen ketahanan terhadap serangan Virus CMV

dan SqMV. Hal tersebut memungkinkan Timun Cu1044 masih dapat ditanam di saat

musim hujan. Tanaman Cu1044 memiliki potensi hasil sebanyak 5-6 kg dengan

kebutuhan benih 750-800 gr/ Ha dan jarak tanam 70 x 60 cm (Hariyanto, 2015).

3.2 Penanda SSR

Penanda SSR adalah sekuen DNA pendek berulang dimana setiap unit ulangan

membentuk motif tertentu yang terdiri dari satu sampai enam nukleotida (misalnya motif

GAG dengan pengulangan 8 kali : GAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAG). Panjang

pengulangan bervariasi antar individu/varietas dan diwariskan pada keturunannya. Hal ini

menyebabkan SSR dapat digunakan sebagai penanda genetik (Adato et al., 1995).

Daerah yang berulang tersebut dapat diamplifikasi menggunakan PCR dengan

bantuan primer. Primer tersebut merupakan urutan nukleotida terkonservasi yang

merupakan komplementer dari sekuen yang mengapit lokus SSR. Urutan nukleotida ini

berbeda untuk setiap spesies. Hal ini menjadikan primer tersebut bersifat spesifik

(Treuren, 2000).

Penanda SSR dapat digunakan untuk melakukan fingerprinting, pemetaan gen dan

analisis genetik (Crouch et al, 1998). Di bidang pertanian, penanda ini banyak digunakan

untuk karakterisasi dan pemetaan genetik tanaman seperti jagung, padi, anggur, kedelai,

gandum, dan tomat (Gupta et al., 1996). Menurut Zhao et al (1993), SSR menjadi alat

bantu yang akurat untuk membedakan genotipe, evaluasi kemurnian benih, dan seleksi

karakter yang diinginkan. Beberapa keunggulan SSR sebagai penanda genetik

diantaranya (1) penanda SSR terdistribusi secara melimpah dan merata dalam genom dan

memiliki viabilitas yang tinggi (banyak alel dalam lokus), lokasi genom dapat diketahui;

6

(2) penanda SSR bersifat kodominan; (2) adanya variasi jumlah pengulangan

antarindividu membuat penanda ini bersidat polimorfik (memiliki heterogenitas yang

tinggi); (3) SSR berasosiasi secara spesifik dengan sifat-sifat kuantitatif seperti rasa buah,

ukuran buah dan tinggi tanaman. Oleh karena itu, penanda ini sangat cocok untuk

membantu program pemuliaan dengan metode analisis QTL Mapping (Joshi et al., 2009).

3.3 Pengujian Keseragaman Genetik

Uji keseragaman merupakan salah satu bagian dari Uji BUSS (Baru, Unik,

Seragam dan Stabil) yang ekivalen dengan DUS Test yang disyaratkan oleh Perserikatan

Internasional bagi Perlindungan Varietas Tanaman Baru (Sa’diyah et al., 2012). Uji ini

bertujuan untuk menjamin bahwa varietas tanaman yang akan dilindungi memiliki

karakter yang konsisten sehingga setiap tanaman yang berasal dari benih varietas tersebut

adalah truetype, yakni memiliki karakter yang sesuai dengan karakter yang didaftarkan

pada saat pengajuan PVT. Dalam pelaksanaannya, terdapat beberapa karakter kualitatif

dan kuantitatif yang perlu diamati dan jumlah sampel minimal yang harus dipenuhi

sesuai dengan jenis tanaman yang diuji. Hal tersebut mengacu kepada standard pengujian

keseragaman yang telah ditetapkan oleh Departeman Pertanian (Daradjat et al., 2004).

Uji keseragaman genetik dilakukan dengan melakukan pengujian terhadap

serangkaian karakter suatu kelompok individu yang diperoleh dari profiling suatu seri

potongan berkas DNA atau tingkat ekspresi gen (baik transkrip, protein atau metabolit).

Berdasarkan hasil pengujian tersebut, dapat dievaluasi keseragaman genetik dari semua

individu yang kemudian dapat dikonversi menjadi persentase keseragaman genetik untuk

menentukan tingkat keseragaman genetik dari kelompok individu yang diuji. Uji ini

memiliki beberapa keunggulan diantaranya (1) dapat menguji keseragaman karakter

kuantitatif yang sulit diuji dengan pengujian morfologi, (2) pengujian dapat dilakukan

sejak tanaman masih muda sehingga hasil pengujian dapat diperoleh lebih cepat, (3) hasil

pengujian bebas dari kemungkinan pengaruh lingkungan (Sa’diyah et al., 2012).

Pengujian keseragaman genetik dilakukan dengan bantuan penanda molekuler.

Penanda yang ideal bersifat polimorfik, dapat mendeteksi perbedaan genetik, dan tersebar

pada seluruh genom (Agarwal et al., 2008). Beberapa penanda molekuler yang telah

digunakan dalam uji keseragaman genetik diantaranya adalah RAPD (Zhao et al., 1999)

dan SSR (Fenge et al., 2005).

7

BAB IV

METODOLOGI

4.1 Waktu dan Tempat pelaksanaan Kegiatan

Rangkaian kegiatan uji keseragaman genetik tetua hibrida Timun Cu1044 berdasarkan

penanda SSR berlangsung saat pelaksanaan kegiatan Kerja Praktik pada tanggal 01 Juni-

11 Juli 2015 di Laboratorium Molecular Breeding, PT. BISI International Tbk dengan jam

kerja pukul 07.30-15.30 WIB untuk hari Senin-Jumat dan pukul 07.30-13.00 WIB untuk

hari Sabtu. Rincian pelaksanaan kegiatan adalah sebagai berikut.

TIMELINE KERJA PRAKTIK

JUNI 2015

1

Pengenalan,

pengarahan

kegiatan KP

2

Libur

3

Persiapan alat

dan bahan

4 5 6 7

Libur

Latihan Isolasi DNA, Perhitungan Konsentrasi

DNA, Amplifikasi DNA

8

Pengambilan

sampel

9 10 11 12 13 14

Libur

Isolasi DNA Galur An, Galur Bn, Galur An-1, Galur Bn-1, F1

15

Kuantifikasi

DNA, Pool

DNA

untukSkrining

Primer

16

Pool DNA

untuk

pengujian

sampel,

Amplifikasi

DNA dengan

CSCJT 661

dan SSR

11343

17

Visualisasi

hasil

amplifikasi

CSCJT 661

dan SSR

11343

Amplifikasi

DNA dengan

SSR 03514

dan

SSR 04805

18

Visualisasi

hasil

amplifikasi

SSR 03514,

SSR 04805;

Denaturasi

multi-plex

CSCJT 661 &

SSR 11343,

SSR 03514 &

SSR 04805

19

Genetic

Analyzer

multiplex

CSCJT 661 &

SSR 11343,

SSR 03514 &

SSR 04805

Amplifikasi

DNA dengan

CSCJT 315 &

SSR 00670

20

Visualisasi

hasil

amplifikasi

CSCJT 315,

SSR 00670

Amplifikasi

DNA

dengan

CSCJT 799

& SSR

18530

21

Libur

22

Denaturasi

multiplex

CSCJT 315 &

SSR 00670

dan CSCJT

23

Genetic

Analyzer

CSCJT 315 &

SSR 00670,

CSCJT 799 &

24

Amplifikasi

DNA dengan

CSCJT 598,

CSCJT 323,

Visualisasi

25

Pengamatan

morfologi;

Amplifikasi

DNA dengan

CSN 061,

26

Visualisasi

hasil

amplifikasi

Denaturasi

multiplex

27

Denaturasi

multiplex

CSN 061 &

CSCJT 71

28

Libur

8

799 & SSR

18530

18530 hasil

amplifikasi

CSCJT 71 CSCJT 598 &

CSCJT 323

29

Genetic

analyzer

multiplex

CSCJT 598 &

CSCJT 323,

CSN 061 &

CSCJT 71

Amplifikasi

DNA dengan

CSCJT 14

& CSCJT 614

30

Visualisasi

hasil

amplifikasi

CSCJT 14 &

CSCJT 674

Amplifikasi

DNA dengan

SSR 23148,

SSR 05865

JULI 2015

1

Visualisasi

hasil

amplifikasi

SSR 23148,

SSR 05865

Denaturasi

multiplex

CSCJT 14 &

CSCJT 674,

SSR 23148,

& SSR 05865

2

Genetic

Analyzer

multiplex

CSCJT 14 &

CSCJT 674,

SSR 23148 &

SSR 05865

Amplifikasi

DNA dgn

CSCJT 35 &

CSCJT 390

3

Visualisasi

hasil

amplifikasi

CSCJT 35 &

CSCJT 390

Amplifikasi

DNA dgn

CSCJT 674 &

SSR 00019

4

Visualisasi

hasil

amplifikasi

CSCJT 674

& SSR 19

Denaturasi

multiplex

CSCJT 35 &

CSCJT 390,

CSCJT 674

& SSR 19

5

Libur

6

Genetic analyzer multiplex

CSCJT 35 & CSCJT 390,

CSCJT 674 & SSR 19

Analisis hasil

7 8

9

10

Revisi

Laporan

11

Revisi Laporan

Penandatanganan

Lembar Pengesahan

Pembuatan Laporan

Tabel 1. Timeline Kerja Praktik

4.2 Sampel Penelitian dan Primer SSR

Sampel yang digunakan pada kegiatan ini adalah 4 galur tetua Timun Cu1044

yang masing-masing terdiri dari 34 individu untuk galur Cu1044 An (betina), Cu1044 An-1

(betina generasi sebelumnya), Cu1044 Bn (jantan), Cu1044 Bn-1 (jantan generasi

sebelumnya), beserta 10 individu F1 Cu1044 sebagai pembanding. Tanaman

9

dibudidayakan secara konvensional didalam green house B07 Farm Kencong, PT. BISI

International Tbk dengan jarak tanaman 10 x 10 Cm dan sistem irigasi tetes (drip).

Sebanyak 20 pasang primer SSR digunakan pada uji keseragaman ini. Primer

tersebut diantaranya adalah CSCJT 14, CSCJT 35, CSCJT 71, CSCJT 315, CSCJT 323,

CSCJT 390, CSCJT 598, CSCJT 661, CSCJT 619, CSCJT 674, CSCJT 799, CSN 061,

SSR 00019, SSR 00670, SSR 03514, SSR 04805, SSR 5865, SSR 11343, SSR 18530,

dan SSR 23148.

Gambar 3. Bahan penelitian (Dokumentasi pribadi, 2015)

4.3 Pelaksanaan Kegiatan

4.3.1 Persiapan Larutan Bahan Kimia

Pembuatan 200 ml CTAB 2%. 4 gram CTAB, 16.36 gram NaCl, 1.66 gram

EDTA, 3.15 gram Tris-HCl dicampurkan dan dilarutkan dalam 200 ml ddH2O.

Setelah tercampur, ditambahkan 2 ml 2-bethamercaptoethanol kedalam

campuran.

Pembuatan 500 ml Chloroform Isoamyl Alcohol. 480 ml Chloroform

dicampurkan dengan 20 ml Isoamyl Alcohol.

Pembuatan 100 ml Buffer TE pH 8.0. 157.64 mg Tris-HCl dilarutkan dalam 60

ml ddH2O, kemudian 40 ml NaOH ditambahkan kedalam larutan tersebut.

10

Pembuatan 100 ml Loading dye 0,6x. 25 mg Bromphenolblue dicampurkan

dengan 4 gram Sukrosa dan dilarutkan dalam 10 ml ddH2O. Kemudian larutan

tersebut diencerkan dengan menambahkan 90 ml ddH2O.

Pembuatan 1L TBE 1x. 108 gram Tris base, 55 gram Boric acid, 40 ml EDTA

0,5M pH 8.0, dicampurkan dan ditambahkan ddH2O hingga 1L. Sebanyak 100 ml

larutan tersebut diambil dan dicampurkan dengan 900 ml ddH2O.

Pembuatan 500 ml gel agarosa1.5%.7.5 gr agarose dicampurkan dengan 500 ml

TBE 1x dan dipanaskan dalam microwave sampai mendidih lalu didinginkan

sampai hangat kuku sambil di aduk menggunakan stirrer. Setelah hangat kuku,

larutan ditambah 5 µl Ethidium bromide dan didiamkan selama 3 menit. Larutan

dituangkan kedalam cetakan pembentuk well dan didiamkan selama ±30 menir.

4.3.2 Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan pada saat tanaman berumur 10 hari setelah

pindah tanam dari persemaian. Sampel yang diambil berupa satu helai daun muda

yang terletak paling dekat dengan ujung batang masing-masing tanaman. Daun

digunting, dilipat dan dimasukkan kedalam plastik ber-klep yang telah dinamai sesuai

nomor sampel dan dikumpulkan sesuai nama galur.

Gambar 4. Contoh sampel daun timun

4.3.3 Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan dengan metode CTAB. Sampel daun ditambah dengan

nitrogen cair dan digerus halus diatas mortar. Sampel yang telah halus dimasukkan

kedalam microtube 2 ml yang sebelumnya telah diisi dengan 600 µl CTAB 2% dan 10

µl bethamercaptoethanol, divortex 5-10 detik, dan diinkubasi didalam waterbath

60oC selama 30 menit. Sampel yang telah diinkubasi, didinginkan didalam lemari

pendingin selama 5 menit dan ditambah dengan 600 µl Chloroform isoamyl. Setelah

11

itu, sampel divortex, kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan

12.000 rpm dan suhu 4oC. 400 µl supernatan yang diperoleh dari proses sentrifugasi

diambil dan dimasukkan kedalam microtube 1,5 ml yang sebelumnya telah diisi

dengan 10 µl Rnase, kemudian diinkubasi suhu ruang selama 10 menit, ditambah

dengan 400 µl Isopropanol dingin, dan dibolak-balik hingga larutan bercampur.

Larutan diinkubasi didalam freezer selama 10 menit, kemudian di sentrifugasi selama

15 menit dengan kecepatan 12 rpm dan suhu 4oC. Setelah di sentrifugasi, supernatan

dibuang dan pelet dicuci dengan 200 µl Etanol 70%. Larutan di sentrifugasi kembali

selama 5 menit dengan kecepatan 12 rpm dan suhu 4oC. Supernatan dibuang dengan

micropipet. Sisa etanol pada pelet dihilangkan dengan pengeringan dalam oven 60oC.

Setelah pengeringan, pelet ditambah dengan 50 ml TE 1X pH 8 dan disimpan disuhu -

20oC hingga saatnya digunakan.

4.3.4 Penentuan Konsentrasi DNA Genom

Konsentrasi DNA ditentukan berdasarkan perbandingan intensitas cahaya dan

ketebalan pita antara sampel dengan Lambda DNA. Sebanyak 2 µl hasil isolasi DNA

dicampur dengan 18 µl loading dye 0,6x pada plate Elisa. Kemudian campuran

diaduk dengan mikropipet menggunakan metode up and down. Setelah itu, sebanyak

10 µl Lambda DNA diletakkan didalam well pertama pada gel agarosa yang telah

diletakkan didalam wadah elektroforesis berisi larutan TBE 1X, disusul dengan 10 µl

dari setiap campuran sampel DNA hasil isolasi pada well kedua dst. Setelah semua

sampel hasil isolasi diletakkan didalam well, wadah elektroforesis ditutup. Tegangan

dan waktu pada power supply (PowerPac Basic Biorad USA) diatur menjadi 150 Volt

dan 30 menit, kemudian tombol Run ditekan.

Gambar 5.(a) Pencampuran loading dye dan DNA dalam plate elisa, (b) proses Elektroforesis

(Dokumentasi pribadi, 2015)

Gel agarosa yang telah dielektroforesis diangkat dan diletakkan dalam DNA

Gel Logic 200 Imaging System (KODAK MI, USA). Alat ini tersambung dengan

A B

12

komputer sehingga hasil capturing dapat dilihat pada monitor. Melalui hasil

visualisasi ini, kuantifikasi DNA dapat dilakukan. Perhitungan konsentrasi dilakukan

secara kualitatif dengan membandingkan ketebalan dan intensitas cahaya pita yang

dipendarkan sampel Lambda DNA.

Gambar 6. Kuantifikasi DNA (Dokumentasi pribadi, 2015)

4.3.5 Amplifikasi DNA

Proses amplifikasi DNA dilakukan dengan bantuan mesin thermal cycler

GeneAmp PCR System 9700. Sebanyak 2,5 µl DNA genom dengan konsentrasi 10

ng/µl, dimasukkan kedalam microtube 0,2 ml dan dicampurkan dengan 6,25 µl

KAPA2G Fast Ready Mix PCR Kits with dye, 0,25 µl MgCl2 100mM, 0,5 µl Primer

Forward dan 0,5 µl Primer Reverse, 2 µl ddH2O. Kemudian microtube divortex,

disentrifugasi selama 15 detik dengan kecepatan 12000 rpm dan ditata pada tray PCR.

Tray berisi sampel dimasukkan kedalam mesin. Mesin PCR dijalankan dengan

program amplifikasi sebagai berikut.

Gambar 7. Program amplifikasi (Dokumentasi pribadi, 2015)

4.3.6 Visualisasi hasil amplifikasi

Amplikon di-running pada gel agarosa 1,5%. KAPA Universal DNA Ladder

Kit dengan konsentrasi 100 ng/µl digunakan sebagai pembanding untuk menentukan

jumlah pasangan basa DNA pada amplikon. Sebanyak 5 µl KAPA Universal DNA

Lambda DNA (100 ng/ µl)

Sampel 1 (10 ng/ µl)




13

Ladder Kit diletakkan didalam well pertama pada gel agarosa yang telah diletakkan

didalam wadah elektroforesis berisi TBE 1X, disusul dengan 5 µl dari setiap produk

PCR pada well kedua dst. Setelah semua amplikon diletakkan didalam well, wadah

elektroforesis ditutup. Tegangan dan waktu pada power supply (Biorad, USA) diatur

menjadi 150 Volt dan 30 menit, kemudian tombol Run ditekan.

Gambar 8. KAPA Universal DNA Ladder Kit (KAPABIOSYSTEMS, 2015)

Gel agarosa yang telah melalui proses elektroforesis diangkat dan diletakkan

dalam DNA Gel Logic 200 Imaging System (KODAK MI, USA). Alat ini tersambung

dengan komputer sehingga hasil capturing dari alat visualisasi DNA dapat dilihat

pada monitor. Melalui hasil visualisasi ini, keberhasilan amplifikasi akan terlihat.

Keberhasilan proses amplifikasi ditandai dengan munculnya pita DNA dengan ukuran

pasang basa yang sesuai dengan primer yang digunakan.

4.3.7 Analisis Fragmen SSR Menggunakan Genetic Analyzer 3500 XL

Amplikon diencerkan dengan ddH2O sesuai dengan ketebalan pita amplikon.

Dilakukan multipleks amplikon pada dua primer yang memiliki ukuran yang berbeda

cukup jauh (daftar multipleks tersaji dalam lampiran A). Sebanyak masing-masing

1µl hasil pengenceran amplikon dari dua primer yang akan dimultipleks dimasukkan

14

kedalam microtube 0,2 ml yang telah diisi dengan campuran 3,8 µl Formamide dan

0,2 µl GeneScan 500LIZ. size standard. Selanjutnya divortex dan disentrifugasi

dengan kecepatan 12000 rpm selama 15 detik. Sampel kemudian didenaturasi pada

thermal cycler Gene Amp PCR System 9700 dengan suhu 950 selama 5 menit. Seluruh

sampel yang telah didenaturasi dipindahkan kedalam 96 well plate PCR, ditutup

dengan septa, dan diletakkan didalam tray. Kemudian, Tray tersebut dimasukkan

kedalam mesin Applied Biosystems 3500 Xl Genetic Analyzers. Selanjutnya,mesin

diatur untuk program fragment analysis.

Gambar 9. 96 Well plate PCR yang telah ditutup septa dan dimasukkan dalam tray (a), letak tray

pada mesin Applied Biosystems (Dokumentasi Pribadi, 2015)

Analisis selanjutnya dilakukan dengan menggunakan software Gene Mapper

versi 4.1. Ukuran alel (pasang basa) dari setiap sampel dibandingkan dengan tanaman

kontrol yang diperoleh dari Tim Breeder Farm Kencong. Jika ukuran alel sampel

sesuai ukuran alel tanaman kontrol, maka individu tersebut adalah true type.

A B

15

BAB V

HASIL DAN PEMBAHASAN

Uji keseragaman genetik tetua hibrida dilakukan untuk memastikan bahwa F1 yang

dihasilkan dari persilangan keduanya memiliki keseragaman genetik yang tinggi (Zhang,

2005). Jika hasil pengujian menyatakan bahwa salah satu atau kedua tetua hibrida memiliki

keseragaman genetik yang rendah, maka kecil kemungkinan F1 dari persilangan kedua tetua

tersebut untuk memiliki keseragaman genetik yang tinggi. Pada pengujian ini, keseragaman

genetik tetua hibrida ditentukan berdasarkan keseragaman ukuran alel SSR dari 34 sampel

masing-masing tetua yang diuji. Hal tersebut berkaitan dengan keberadaan individu offtype,

yaitu individu yang memiliki karakter menyimpang (ukuran alel SSR tidak sama dengan

tanaman kontrol). Jika ditemukan individu offtype, maka dapat disimpulkan bahwa galur

tersebut tidak seragam atau persentase keseragaman genetik galur tersebut tidak mencapai

100%. Semakin banyak individu offtype yang terdeteksi, maka persentase keseragaman

genetik galur tersebut akan semakin rendah.

Pengujian keseragaman genetik tetua hibrida Cu1044 dilakukan dengan bantuan 20

pasang primer SSR. Primer yang digunakan adalah CSCJT 14, CSCJT 35, CSCJT 71, CSCJT

315, CSCJT 323, CSCJT 390, CSCJT 598, CSCJT 661, CSCJT 619, CSCJT 674, CSCJT

799, CSN 061, SSR 00019, SSR 00670, SSR 03514, SSR 04805, SSR 5865, SSR 11343,

SSR 18530, dan SSR 23148. Primer tersebut dipilih karena dapat membedakan fragmen SSR

pada setiap galur (polimorfik).

Gambar 10. (a) Elektroferogram primer CSCJT 661, (b) Elektroferogram primer CSCJT 004805

(Dokumentasi Pribadi, 2015)

A B

Cu1044 Bn-1

Cu1044 Bn

F1 Cu1044

Cu1044 An-1

Cu1044 An

16

Berdasarkan gambar 10 (a) dan (b), dapat diketahui bahwa primer CSCJT 661 dan

primer CSCJT 004805 menunjukkan pola yang berbeda untuk individu Cu1044 A dan

Cu1044 B. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa kedua primer tersebut bersifat

polimorfik. Warna alel yang tertera pada elektroferogram berasal dari fluorescent dye yang

ditambahkan saat pembuatan primer. Melalui pewarnaan ini, ukuran alel dari setiap sampel

yang diuji dapat divisualisasi sehingga ukuran alel dapat ditentukan.Terdapat beberapa jenis

fluorescent dye berdasarkan warna yang tervisualisasi, yaitu 6-FAM (biru), HEX/TET

(hijau), NED (kuning), PET (merah) dan LIZ (orange). Penggunaan jenis fluorescent dye

yang berbeda untuk multipleks primer dapat memudahkan dalam membedakan hasil analisis

ukuran alel, terutama jika kedua primer mengamplifikasi sekuen DNA dengan ukuran alel

yang berdekatan (Glenn, 2001).

Terdapat beberapa tahapan yang dilakukan didalam kegiatan uji keseragaman genetik

tetua Timun Cu1044 berdasarkan Penanda SSR. Tahapan tersebut terdiri dari isolasi DNA,

amplifikasi DNA, dan analisis fragmen SSR (Sa’diyah et al., 2012).

5.1 Isolasi DNA Genom

Pada kegiatan isolasi DNA, sampel daun dari setiap individu digerus dalam nitrogen

cair untuk menghancurkan sel atau jaringan (Elias, 2004). Sampel yang telah halus

ditambahkan kedalam larutan yang mengandung campuran CTAB, NaCl, EDTA, Tris-Cl dan

bethamercaptoethanol. CTAB dapat melarutkan lipid pada membran sel, hal tersebut dapat

memicu terjadinya destabilisasi membran sel yang kemudian dapat menyebabkan pelisisan

membran sel (Doyle dan Doyle, 1997). Larutan NaCl berfungsi untuk menghilangkan

polisakarida, sementara bethamercaptoethanol berfungsi untuk menghilangkan kandungan

senyawa polifenol dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan

senyawa tersebut (Maliyakal, 1992). Senyawa polifenol perlu dihilangkan karena dapat

menghambat reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat amplifikasi (Porebskiet et al., 1997).

Penambahan EDTA berfungsi untuk menginaktivasi enzim Dnase yang dapat mendenaturasi

DNA dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang menjadi kofaktor enzim

DNAse (Doyle dan Doyle, 1997). Sebagai buffer, Tris-Cl berfungsi untuk menjaga struktur

DNA selama proses penghancuran (Doyle dan Doyle, 1997). Penambahan

bethamercaptoethanol dengan pemanasan dapat mendenaturasi protein yang mengontaminasi

DNA (Kasem et al, 2008).

Setelah dipanaskan, Cloroform isoamyl ditambahkan untuk mendenaturasi protein

yang masih menempel pada kromosom (Healey et al, 2014). Protein akan kehilangan

17

kelarutan dan mengalami presipitasi. Setelah melalui proses sentrifugasi, terbentuk tiga fasa

yaitu fasa organik yang berisi lipid, fasa interfase yang berisi protein, dan fase cair yang

berisi DNA dan RNA (Healey et al, 2014). Untuk menghilangkan RNA, ditambahkan larutan

RNAse (Henry, 2001). Pemberian Isopropanol dingin bertujuan untuk menurunkan kelarutan

asam nukleat dalam air sehingga DNA akan terpresipitasi dan membentuk endapan struktur

fiber setelah sentrifugasi (Healey et al, 2014).

Gambar 11. (a) Tiga Fasa yang terbentuk setelah sentrifugasi,

(b) Pelet DNA (Dokumentasi Pribadi, 2015)

Penambahan etanol dilakukan untuk menghilangkan residu-residu garam yang kurang

larut dalam isopropanol sehingga ikut mengendap bersama DNA (borges et al, 2009).

Pengeringan pelet dalam oven bertujuan untuk menguapkan residu etanol yang masih tersisa.

Setelah pengeringan, ditambahkan buffer TE untuk menjaga kualitas DNA selama

penyimpanan (Healey et al, 2014).

Proses kuantifikasi DNA dilakukan untuk menentukan konsentrasi DNA pada hasil

isolasi. Hal ini dibutuhkan untuk keperluan pengenceran DNA saat persiapan amplifikasi.

Dengan mengetahui konsentrasi dari sampel DNA, dapat diketahui jumlah buffer TE yang

harus ditambahkan agar sampel DNA tersebut memiliki konsentrasi yang sesuai untuk proses

amplifikasi. Salah satu metode kuantifikasi DNA adalah metode kuantifikasi secara kualitatif

dengan menggunakan Lambda DNA yang memiliki konsentrasi tertentu sebagai pembanding.

Metode ini dilaksanakan dengan melakukan elektroforesis (Sa’diyah et al., 2012). Pada

proses elektroforesis, digunakan loading dye 0.6 x sebagai pewarna dan pemberat agar

keberadaan DNA dapat teramati dalam sinar ultraviolet (Manz, et al.2004). Hasil kuantifikasi

DNA dari setiap sampel yang diuji tertera pada lampiran B.

A B

18

5.2 Amplifikasi DNA genom dan elektroforesis amplikon

Amplifikasi DNA genom dari tiap sampel dilakukan dengan metode Polymerase

Chain Reaction (PCR). Metode ini merupakan metode amplifikasi dengan memanfaatkan

pengontrolan suhu (Weising et al., 2005). Beberapa komponen dan reagen yang dibutuhkan

dalam reaksi PCR diantaranya adalah sampel DNA, Taq DNA Polymerase, dNTPmix, MgCl2,

buffer PCR, primer forward dan primer reverse (Retroningrum, 1997). Taq DNA polymerase

merupakan enzim yang membantu dalam proses pembentukan untai DNA baru.

Deoksiribonukleotide Tri Phosphate (dNTP) merupakan nukleotida yang mengandung

triphosphate groups (building blocks/ basa-basa yang digunakan DNA Polimerase untuk

mensintesis untai DNA). larutan MgCl2 merupakan kofaktor bagi enzim DNA polimerase

guna mengoptimumkan kerja enzim. Buffer PCR berfungsi dalam menciptakan kondisi pH

yang sesuai bagi enzim DNA polimerase guna mengoptimumkan kerja enzim. Primer

forward merupakan urutan basa komplementer dari sekuen pengapit SSR diujung 5’

sementara primer reverse adalah urutan basa komplementer dari sekuen pengapit SSR

diujung 3’. Pada pengujian ini, digunakan KAPA2G Fast Ready Mix PCR Kit with dye yang

mengandung KAPA2G Fast DNA Polymerase (0,5 U per 25 µl reaksi), dNTPs (0,2 mM dari

setiap dNTPs untuk 1X reaksi), MgCl2 (1,5 mM untuk 1X reaksi), buffer, dan dye sehingga

amplikon dapat langsung divisualisasi dengan elektroforesis tanpa menambahkan loading dye

(KAPABIOSYSTEM, 2015).

Metode PCR merupakan reaksi berulang antara 25-50 siklus dimana setiap siklus

terdiri dari 3 proses, yaitu proses denaturasi, proses annealing, dan proses elongasi

(Retroningrum, 1997). Proses Denaturasi merupakan proses pemisahan untai ganda DNA

menjadi untai tunggal. Proses Annealing merupakan proses penempelan primer pada sekuen

pengapit SSR yang memiliki urutan basa yang komplementer dengan primer tersebut. Proses

elongasi atau pemanjangan, merupakan tahapan sintesis sekuen SSR. Pada kegiatan ini,

proses denaturasi terjadi pada suhu 940C, proses annealing terjadi pada suhu 55

0C, dan

proses elongasi terrjadi pada suhu 720C.

Visualisasi hasil amplifikasi dilakukan dengan metode elektroforesis. Jika proses

amplifikasi berhasil, maka akan muncul pita DNA dengan ukuran pasang basa yang sesuai

dengan primer yang digunakan. Kegiatan ini bertujuan untuk memastikan bahwa fragmen

SSR telah teramplifikasi sebelum analisis fragmen dengan menggunakan mesin Genetic

Analyzers dilakukan. Hal tersebut dapat meminimalisasi pengulangan pada proses analisis

fragmen yang memerlukan biaya lebih tinggi.

19

Prinsip dasar elektroforesis adalah perpindahan suatu molekul oleh gaya gerak listrik

menuju kutub listrik yang berlawanan dengan muatannya (Berg, et.al., 2007). Pada

elektroforesis gel, saat listrik mengalir kedalam larutan TBE 1X, gel agarosa akan

meneruskan aliran tersebut. Fragmen DNA akan bergerak sesuai ukurannya melewati matriks

gel menuju kutub positif karena ada muatan negatif pada rangka gula fosfat yang dimilikinya

(Muladno, 2002). Keberadaan Ethidium bromide dalam gel dapat membuat DNA berpendar

dalam sinar ultraviolet sehingga DNA dapat divisualisasi dengan alat Gel Logic 200 Imaging

System (Muladno, 2002). Contoh hasil visualisasi amplikon tertera pada lampiran C.

5.3 Analisa Fragmen SSR

Pada pengujian ini, dilakukan multipleks primer terhadap 20 primer yang digunakan.

Multipleks primer (penggabungan dua atau lebih amplikon dari primer yang berbeda),

merupakan salah satu fitur dari mesin Applied Biosystems 3500 Xl Genetic Analyzers

(Applied Biosystem, 2011). Dengan multipleks primer, analisis fragmen SSR dari dua primer

dapat dilakukan dalam satu proses sehingga waktu dan biaya yang dikeluarkan lebih efisien.

Untuk mempermudah pengamatan, multipleks dilakukan terhadap dua primer yang

mengamplifikasi sekuen SSR dengan ukuran alel yang berbeda cukup jauh.

Analisis fragmen SSR dilakukan dengan menggunakan mesin Genetic Analyzers 3500

Xl. Instrumen ini merupakan elektroforesis kapiler berbasis fluorescence yang dapat

digunakan dalam melakukan analisis fragmen atau sequencing DNA (Applied Biosystems,

2011). Dalam pelaksanaan analisis fragmen, dibutuhkan internal lane size standard.

Perangkat ini memiliki fungsi yang sama dengan ladder pada elektroforesis gel, yaitu untuk

menentukkan ukuran alel (pasang basa) pada sampel yang diuji. Pada pengujian ini, Internal

lane size standard yang digunakan adalah GeneScan 500 LIZ.

Gambar 12. Genetic Analyzers 3500 XL dan Internal Line Size Standard (Dokumentasi pribadi, 2015)

20

Berdasarkan hasil analisis fragmen DNA, diperoleh bahwa tujuh belas primer

menunjukan hasil monomorfik (seragam) untuk seluruh sampel dari keempat tetua, yaitu

primer CSCJT 14, CSCJT 35, CSCJT 71, CSCJT 315, CSCJT 323, CSCJT 390, CSCJT 598,

CSCJT 661, CSCJT 619, CSCJT 674, CSCJT 799, CSN 061, SSR 00019, SSR 03514, SSR

5865, SSR 11343, dan SSR 23148; satu primer menunjukan hasil polimorfik (tidak seragam)

untuk sampel tetua Cu1044 Bn dan Cu1044 Bn-1, yaitu primer SSR 00670; dan dua primer

menunjukan hasil polimorfik untuk sampel tetua Cu1044 A dan Cu1004 An-1, yaitu primer

SSR 04805, dan CSCJT 18530. Dengan kata lain, terdapat 3 primer yang mendeteksi

keberadaan individu Off Type pada salah satu tetua.

Gambar 13. Elekroforegram menunjukan pola Off Type Galur Bn dan Bn-1 setelah diamplifikasi

menggunakan primer SSR 00670

Penggunaan mesin Genetic Analyzers 3500 Xl untuk kegiatan analisis fragmen DNA

dapat memberikan hasil yang lebih akurat dibandingkan dengan analisis fragmen DNA

menggunakan elektroforesis gel. Hal ini didasarkan pada kemampuan instrumen Genetic

Analyzers 3500 XL dalam merepresentasikan ukuran alel secara detail hingga satu pasang

basa. Hal ini dapat dilihat melalui ilustrasi sebagai berikut.

21

Gambar 14. Perbandingan hasil visualisasi fragmen SSR menggunakan elektroforesis (atas) dan mesin

genetic analyzers 3500 Xl (bawah) Sampel Cu1044Bn no. 3, 4, 5 (Dokumentasi pribadi, 2015)

Berdasarkan gambar 14, dapat diketahui bahwa hasil visualisasi fragmen SSR

menggunakan Instrumen Genetic Analyzers 3500 Xl lebih detail dalam menginterprestasikan

ukuran alel SSR dari sampel yang diuji dibandingkan dengan elektroforesis gel. Pada hasil

visualisasi fragmen SSR menggunakan elektroforesis gel, terlihat bahwa fragmen SSR dari

seluruh sampel yang diuji memiliki ukuran alel ±150 pasang basa. Perbedaan ukuran alel

SSR dari sampel 3, 4, dan 5 yang terdeteksi oleh Instrumen Genetic Analyzers tidak terlihat

jelas pada hasil visualisasi fragmen menggunakan elektroforesis gel. Hal ini dikarenakan

perbedaan tersebut tidak terlalu jauh (hanya berkisar ±10 pasang basa) sehingga saat

membandingkan sampel dengan ladder untuk menentukan ukuran fragmen secara kualitatif,

perbedaan tersebut tidak terlihat jelas.

5.4 Keseragaman Genetik Sampel

Perhitungan persentase keseragaman genetik dilakukan dengan menghitung

persentase jumlah individu true type pada masing-masing galur dari setiap primer (r) dan

menghitung rata-rata persetase jumlah individu true type pada masing-masing galur dari

seluruh primer (R). Berdasarkan perhitungan tersebut, diperoleh bahwa persentase

Sampel : Cu1044 Bn Primer : SSR 00067

22

keseragaman genetik untuk setiap galur adalah sebagai berikut. (Data individu true type

tertera pada lampiran D)

No Primer r Galur An (%) r Galur Bn (%) r Galur An-1 (%) r Galur Bn-1 (%)

1 CSCJT 14 100 100 100 100

2 CSCJT 71 100 100 100 100

3 CSCJT 315 100 100 100 100

4 CSCJT 323 100 100 100 100

5 CSCJT 661 100 100 100 100

6 CSCJT 799 100 100 100 100

7 SSR 00670 100 35 100 41

8 SSR 004805 53 100 68 100

9 SSR 11343 100 100 100 100

10 SSR 18530 50 100 68 100

11 CSCJT 35 100 100 100 100

12 CSCJT 390 100 100 100 100

13 CSCJT 598 100 100 100 100

14 CSCJT 619 100 100 100 100

15 CSCJT 674 100 100 100 100

16 CSN 061 100 100 100 100

17 SSR 00019 100 100 100 100

18 SSR 3514 100 100 100 100

19 SSR 5865 100 100 100 100

20 SSR 23148 100 100 100 100

R 95.19 96.75 96.8 97.05

Tabel 2. Perhitungan Persentase Keseragaman Genetik

Hasil perhitungan persentase keseragaman genetik keempat galur menunjukkan

bahwa tidak ada galur yang memiliki persentase keseragaman genetik 100%. Namun, nilai

persentase seluruh galur lebih dari 95 %, dimana pada uji keseragaman morfologi nilai

tersebut sudah mewakili tingkat keseragaman yang tinggi (Panduan Pengujian Individual

Timun, Departeman Pertanian, PVT/PPI/22/1). Meskipun dianggap sudah lebih akurat, hasil

uji keseragaman genetik tetap perlu dibandingkan dengan hasil uji keseragaman morfologi

untuk mendapatkan hasil akhir yang relevan.

23

BAB IV

KESIMPULAN

Berdasarkan pengujian dengan menggunakan primer CSCJT 14, CSCJT 35,

CSCJT 71, CSCJT 315, CSCJT 323, CSCJT 390, CSCJT 598, CSCJT 661, CSCJT

619, CSCJT 674, CSCJT 799, CSN 061, SSR 00019, SSR 00670, SSR 03514, SSR

04805, SSR 5865, SSR 11343, SSR 18530, dan SSR 23148; persentase keseragaman

genetik empat generasi tetua hibrida Timun Cu1044 adalah 95,19% untuk Galur

Cu1044 An, 96,75% untuk Galur Cu1044 Bn, 96,8% untuk Galur Cu1044 An-1, dan

97,05% untuk Galur Bn-1.

24

DAFTAR PUSTAKA

Adato, A., D. Sharon, U. Lavi, J. Hillel, and S. Gazit, 1995. Application of DNA Fingerprints

for Identification and Genetic Analyses of Mango Genotypes, J. Am. Soc. Hort. Sci.,

120:2, 259264

Borges, A., Rosa, M. S., Recchia, G. H., Silva, J. R. Q., Bressan, E. A., Veasey., E. A. 2009.

CTAB Methods for DNA Extraction of Sweetpotato for Microsatelite Analysis. Sci.

Agric., v.66, n.4, p.529-534.

Applied biosystem, 2011. Spesification sheet :Applied Biosystems 3500xL Genetic

Analyzers. https://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/applied_markets_

marketing/documents/generaldocuments/cms_096535.pdf. Diakses pada tanggal 7

Juni 2015, pukul 12.35

Berg, M.J., Tymoczko, J.L., Stryer, L. 2007. Biochemistry Sixth Ed. United States : San

Fransisco

Blair, M.W., O. Panaud, and S.R. McCouch. 1999. Inter-simple sequence repeat (ISSR)

amplification for analysis of microsatellite motif frequecy and fingerprinting in rice

(Oryza sativa L.) Theor. Appl. Genet. 98: 780-792

Campbell, N.A., Reece, J.B., Mitchell, L.G. 2002. Biologi. Alih bahasa lestari, R. et al.

safitri, A., Simarmata, L., Hardani, H.W. (eds). Jakarta :Erlangga

Crouch, J. H., D. Vuylsteke, and R. Ortiz, 1998. Perspectives on the Application of

Biotechnology to Assist the Genetic Enhancement of Plantain and Banana (Musa

spp.), Electron. J. Biotech., 1:1

Daradjat, A.A., N. Yunani, Indrastuti A. Rumanti, Y. Widyastuti, I.W. Mulsanti, and L.

Murdiani. 2004. Report on the Simulation of DUS Test (Distinct, Uniform and Stable)

of Improved Variety Fatmawati. Sukamandi : Balitpa Sukamandi and Pusat PVT

Doyle, J. J., Doyle, J. L. 1987. A Rapid DNA Isolation Procedure for Small Quantities of

Fresh Leaf Tissue. Phytochemical Bulletin, v. 19, p. 11-15.

Elias, M., Muhlen G.S., McKey, D., Roa, A. C., Tohme, J. 2004. Genetic diversity of

traditional South American Landraces of Cassava Manihot esculenta Crantz : An

Analysis Using Microsatellite. Economic Botany, v. 58, p. 242-256

Fengge, W., Zhao, J., Dai, J., Guo, J., Wang, L., Yi, H., Yang, G. 2005. International

Working Group On Biochemical And Molecular Techniques And DNA Profiling In

Particular : Assesement Of The Uniformity Of Chinese Maize Varieties By A Set Of

SSR Markers. Geneva : UPOV

Glenn, C.T. 2001.Directly tagging PCR primers with fluorescent dyes.Columbia : University

of South Carolina

Gupta, P.K., H.S. Balyan, P.C. Sharma, and B. Ramesh. 1996. Microsatellites in plans: A

new class of molecular markers. Curr. Sci. 70:45-54

Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry R. J. 2014. Protocol : A Simple Method for

Extracting Next Generation Sequencing Quality Genomic DNA from Recalcitrant

Plant Species. http://www.plantmethods.com/content/10/1/21. Diakses pada 10 Juli

2015, pukul 21:02

Joshi, S. P., P. K. Ranjekar, and V. S. Gupta. 1999. Molecular Markers in Plant Genome

Analysis. Current Sci., 77:2, 230-239

https://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/applied_markets_

http://www.plantmethods.com/content/10/1/21

25

KAPABIOSYSTEMS, 2015. Technical Data Sheet : KAPA2G Fast Ready Mix PCR Kit

(Versi 3.10). http://www.kapabiosystems.com/terms-of-use. Diakses pada tanggal 7

Juni 2015, pukul 12.24

KAPABIOSYSTEMS, 2015. Technical Data Sheet : KAPA Universal Ladder (versi 1.10).

Massachusset : Boston

Kasem, S., Rice, N., Henry, R.J. 2008. DNA Extraction from Plant Tissue. In Plant

Genotyping II : SNP Technology, p. 219-271

Kwon, Y.S., Lee, J.M., Yi, G.B., Yi, S.I., Kim, K.M., Soh, E.H., Bae, K.M., Park, E.K.,

Song, I.H., Kim, B.D., 2005. Use of SSR marker to complement tests of

Distinctiveness, Uniformity and Stability (DUS) of pepper (Capsicum annum)

varieties.Molecules and Cells 19: 428–435

Hariyanto, 2015. Hijau Harmony yang Tidak Pahit dan Tahan Virus.

http://www.tanindo.com/index.php?option=com_content&view=article&id=623:hija

u-harmony-yang-tidak-pahit-dan-tahan-virus&catid=643:hijau-harmony-yang-tidak-

pahit-dan-tahan-virus&Itemid=170. Diakses pada tanggal 16 Juni 2015, pukul 12.05

Maliyakal, J.E. 1992. An Efficient Method for Isolation of RNA and DNA from Plant

Containing Polyphenolics. Nucleic Acids Res, 20 : 2381

Manz, A., Nicole, P., Dimitri, I. 2004. Bioanalitical Chemistry.London : Imperial College

Press

Moeljopawiro, S. 2007. Marka Simple sequence repeat Sebagai Alternatif Uji Buss Dalam

Perlindungan Varietas Tanamam Padi. Zuriat. 18 (2):129-138

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor : Pustaka Wirausaha Muda

dan USESE Foundation

Porebski, S., Bailey, L. G., Baum, B. R. 1997. Modification of a CTAB DNA extraction

protocol for plants containing high polysaccharides without using nitrogen and

phenol. Plant Mol Bio, 15 : 8-15

PT. BISI International Tbk http://www.bisi.co.id. Diakses pada tanggal 22 Juni 2015, Pukul

12.25

PT. BISI International Tbk http://www.tanindo.com/index.php?option=com_content&view=

section&layout=blog&id=2&itemid=10. Diakses pada tanggal 11 Juli 2015, pukul

08.34

Sa’diyah, I., Lukman, R., Purwantoro, A., Basunanda, P. 2012. Pengujian Kelayakan

Penanda Genetik SSR dan RAPD untuk Uji Keseragaman Empat Galur Tertua

Hibrida Mentimun (Cucumis sativus L.). Kediri : PT. BISI International Tbk

Smýkal, P., Horacek, J., Dostalova, R, Hybl, M. 2008. Variety Discrimination in Pea (Pisum

sativum L.) by Molecular, Biochemical and Morphological Markers. J Appl. Genet.

49: 155-166

Treuren, R. V. 2000. Genetic Marker.www.plant. wageningen-ur.nl/about/Biodiversity/cgn/

research/molgen. Diakses pada tanggal 13 Juni 2015 pukul 20.56

Zhang, H.Y.2005. The Study Progress Of The Regularity Degree Of Crop Agronomic Traits.

Hunan Agric. Sci. 4 : 33-36

Zhao, X & G. Kochert. 1993. Phylogenetic distribution and genetic mapping of a (GGC)n mi

crosatellite from Rice (Oryza sativa L.). Plant Mol. Biol. 21: 607614

http://www.kapabiosystems.com/terms-of-use

http://www.bisi.co.id/

http://www.tanindo.com/index.php?option=com_content&view

26

LAMPIRAN (Beberapa data tidak dilampirkan untuk melindungi privasi perusahaan)

27

Lampiran A. Daftar primer yang dimultipleks (ukuran alel tidak ditampilkan)

No Nama Primer Forward (5'-3') Reverse (5'-3')

1 SSR 11343 HEX-TTCCACGTTACATTGGACGA AGAATTCATGGCCTGCAGAT

CSCJT 661 6FAM-AATTCCATGGACATCCAGCCGAAG CAGTGAAAGGCACTAAAGCGGAAG

2 SSR 03514 6FAM-TCCGCAGTTCACAACTTGAC GGGCTTCTGTTTTCATTTCG

SSR 04805 TET-CCACGAAATACAGATCAGCAAC CACGTTACATTGGACGAGAGAT

3 CSCJT 315 TET-TCGATCTTGTAGAAAGCAAGGA CAAGCAAATTCCCATTCACC

SSR 00670 TET-GAATTTAGGCATAGAGAGAAAGTGG CCCTAAACAGAAGACTTTGCTAC

4 CSCJT 799 6FAM-TCCCAAACATAGAATGCGATAATA CTGTCTGTTTTTCGATCTTGTAGA

SSR 18530 6FAM-AACAAAGAACTAAGCAATTCCAGG CTTAGGAGAAGCCAAGACACTAGG

5 CSCJT 598 HEX-GGGTCATACCCAAAAGGGAGA TCTTGCTTTAGCCGACAACTCA

CSCJT 323 HEX-TAGAAAGGAAGGGATGTGATTAGG ACAGGTGGTTAGAGGTTAGAGCTG

6 CSN 061 6FAM-ACTTCAATCTCATATACTGTG TACCACTGGGATCCTAA

CSCJT 71 TET-ATTCTCGTGAACCATCACCC ACTTTTGCCACTTGGCACTT

7 CSCJT 14 6FAM-TCTCAAACCAAGAATTGGGG TCCATGGAAGCAGATCTTAAAAA

CSCJT 614 TET-TAGGGTCCCCTTCCCTCATA GGGTACCCAAAAGCAAGTGA

8 SSR 23148 6FAM-TCATGTCAAGCGAAGGAAGA TACTGTCCGAACGTGTTCCA

SSR 05865 6FAM-AGCCAAGACAATTCACAGCC TTTCCTATCGGGTCTTCGTG

9 CSCJT 35 HEX-TGCCGTTTGGATCACATAGA CAATACGCACAAAAAGCGAA

CSCJT 390 HEX-AGACAGGGAAATCGCAGAGA GGTTAAAGGACGTCGGGATT

10 CSCJT 674 6FAM-CCACAGTCCCACACACAAAG GGCGTTTTGTGAAGACAGATT

SSR 00019 TET-GTGGGGTTGCTTTTGGATAA CAATGGTTGCTTTGCTTCAA

28

Lampiran B. Hasil kuantifikasi DNA

1. Galur Cu1044 An sampel 1-10 (Sampel lain tidak ditampilkan)

2. Galur Cu1044 Bn sampel 1-10 (Sampel lain tidak ditampilkan)

Konsentrasi DNA (ng)

No An Bn An-1 Bn-1 F1

1 130 10 100 50 10

2 30 10 100 100 50

3 50 50 50 100 10

4 50 100 100 50 30

5 100 30 30 50 30

6 100 150 100 30 10

7 100 10 100 30 10

8 100 50 100 10 100

9 150 150 30 30 10

10 100 30 100 10 10

11 30 100 100 100

12 100 150 100 100

13 50 50 100 130

14 50 150 100 100

15 50 150 100 50

16 50 150 100 100

17 130 150 10 50

18 50 100 50 10

19 100 150 100 130

20 50 100 100 150

21 150 100 130 10

22 50 100 130 10

23 10 150 10 50

24 100 150 10 100

25 100 100 10 100

26 10 150 10 100

27 100 100 150 50

28 100 50 150 10

29 10 100 150 10

30 10 100 150 100

31 100 50 150 100

32 50 10 150 10

33 50 100 150 50

34 100 10 150 50

Sampel 1

Sampel 2

Sampel 3

Sampel 4

Sampel 5

Sampel 6

Sampel 7

Sampel 8

Sampel 9

Sampel 10

Sampel 1

Sampel 2

Sampel 3

Sampel 4

Sampel 5

Sampel 6

Sampel 7

Sampel 8

Lamda DNA

Sampel 11

Sampel 10

Sampel 9

Lamda DNA

Sampel 11

29

Lampiran C. Visualisasi amplifikasi dengan elektroforesis

Primer SSR 18530 (primer dan sampel lainnya tidak ditampilkan)

Ukuran alel : An = 218 bp

Bn-1 = 195 & 203

30

Lampiran D. Data individu true type (ukuran alel tidak ditampilkan)

Nama Primer Nomor IndividuTrue Type Jml

Galur Cu1044 An

CSCJT 14 Semua individu (1-34) 34






SSR 00670 Semua individu (1-34) 34

SSR 004805 2, 4, 7, 10, 12, 13,15, 16, 18, 24, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 34 18


SSR 18530 2, 5, 12, 13, 14, 18,22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 32,34 17






CSN 061 Semua individu (1-34) 34





Galur Cu1044 Bn







SSR 00670 4, 6, 7, 8, 11, 14, 19, 24, 26, 29, 31, 34 12














31

Galur Cu1044 An-1








SSR 04805 1, 2, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 24, 25, 27, 30, 33, 34 23


SSR 18530 1, 2, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 34 23











Galur Cu1044 Bn-1







SSR 00670 3, 4, 6, 11, 12, 14, 17, 23, 25, 27, 31, 32, 33, 34 14














Date post:	12-Nov-2023
Category:	Documents
Upload:	independent
View:	1 times
Download:	0 times

11412004-Fitri Audia-laporan KP

Documents