INFORME FINAL GOBIERNO DE C1411E

CONICVT FONDECVT PROYECTO FONDECYT REGULAR

1040977 3 años

NÚMERO PROYECTO DURACIÓN

Marcelo Bustamante Carrasco

2006

AÑO DE EJECUCIÓN

INVESTIGADOR(A) RESPONSABLE RUT

Alonso de Ribera 2850, Facultad de Medicina, Universidad Católica de la Santísima Concepción

71.915.800-5

DIREcCION FONO

mbustamante@ucsc.cl 41 2735435

E-mail PERÍODO QUE INFORMA 15/ Marzo / 2006 15 / Marzo / 2007

DESDE HASTA

CONTENIDO (MARQUE CON UNA X EL CASILLERO QUE CORRESPONDA)

INCLUYE NO INCLUYE

Formulario de Informe FinalX

X Publicaciones

Resumen de Tesis Título/GradoX

X Información acerca de inventos y patentes

Otros (especificar)

Informe Incentivo Coop. Internacional (Si corresponde)

Firma Col nvestiga dores (as)

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Luis eirano

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Firma Investigad

Marcelo B t^^Irrasco

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Fu rna CØirvestlgdures(as)

Fredv Diaz Aedo Aiviro LIancaquto Vri

Mrta Muñoz Roa LUIS Nuñez- Peiran

Laura Crr,os Lerd

LIdr Krsten Leopc.ild

F i rma Investigador(») Irponahie

M celo us rnc' ir ,

30 Ar'; 2007

Otro(s) aspecto(s) que Ud. considere importante(s) en la evaluación del cumplimiento de los objetivos planteados en la propuesta original o en las modificaciones autorizadas por los Consejos. • Lamentablemente, la renuncia de la Dra. Maulén al proyecto no permitió cumplir a cabalidad con el objetivo de medir la expresión de receptores de lipoproteínas por RT-PCR, pero las muestras se encuentran guardadas en RNA-later, lo que permitirá en un futuro próximo realizar, con relativa rapidez, las mediciones pendientes. Tal como se señaló y se demuestra en este informe, la técnica fue estandarizada y queda la etapa de realizar las mediciones en las muestras que se encuentran guardadas. • Se solucionó el problema del bajo número de pacientes en el primer año de proyecto, se reunieron 63 pacientes diabéticos y 34 controles el año 2005, y 78 pacientes diabéticos y 90 controles en el año 2006, cantidad suficiente para realizar todas las mediciones propuestas, gracias a la acción coordinada con los consultorios de atención primaria donde se detectan los pacientes diabéticos. Para ellos, sigue siendo un problema el hecho de que a pesar de estar recién diagnosticados, siempre presentan algún factor de riesgo asociado, dentro de los cuales, la obesidad y dislipidemias son los más comunes. La obtención de muestras de sangre en un volumen superior a los 25 ml es prácticamente imposible a pesar de ofrecer incentivo económico a los pacientes. Esto dificulta la obtención de resultados con células que se encuentran en bajo porcentaje en sangre periférica, como son los monocitos y subpoblaciones de linfocitos. • El investigador responsable realizó una estadía de 1,5 meses en Alemania el año 2006, donde realizó todos los experimentos de medición de citoquinas en sobrenadantes de células de sujetos normales sometidas a estrés oxidativo y concentraciones variables de glucosa. Esto permitió la obtención de gran cantidad de resultados que fueron analizados para las conclusiones correspondientes. Esto se hizo en Alemania, debido a que el Laboratorio de Prof. Bachem cuenta con el sistema BioPlex de BioRad que permite hacer estas mediciones en un paso. • Durante el año 2007, el investigador responsable asistió al Congreso Mundial de PCR cuantitativo, qPCR, organizado por la Universidad Técnica de München, Freising-Weihenstephan en Alemania entre el 26 y el 30 de Marzo, aprovechando esta oportunidad, realizó una corta estadía de investigación en la Universidad de Ulm, con el fin de medir las citoquinas en los sobrenadantes de cultivos de células mononucleares de pacientes y controles sometidas a estrés oxidativo y distintas concentraciones de glucosa. Los resultados se muestran en este informe. • Junto a esto se realizaron correlaciones interesantes entre los resultados obtenidos sobre necrosis y apoptosis y la procedencia de las muestras, se relacionaron los controles (con y sin obesidad) con pacientes diabéticos (con y sin obesidad) y se relacionaron con la edad y sexo de los controles y pacientes. Todo esto basado en un extensivo análisis estadístico que permite obtener los grados de significancias de las mencionadas correlaciones. La complejidad de los datos no permite concluir con facilidad, pero estamos trabajando en ello, de modo de publicar a la brevedad estos interesantes resultados, en particular el hecho que en la mayoría de los casos la apoptosis gatillada por el estrés oxidativo se hace independiente de la concentración de glucosa en pacientes diabéticos, indicando con ello un estado celular preactivado para la inducción de apoptosis en estos pacientes. • Es necesario reconocer que estamos atrasados en las publicaciones, pero en este informe hemos reenviado el manuscrito que estaba preaceptado en Atherosclerosis, considerando todas las sugerencias de los revisores. Esperamos ahora tener éxito. Es más con los datos que ustedes verán a continuación, podrán darse cuenta que tenemos la posibilidad de a lo menos 2 publicaciones mas en revistas ISI. Uno de los

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II. RESULTADOS OBTENIDOS

Describa brevemente los resultados obtenidos en el proyecto en un máximo de cinco páginas, tamaño carta, espacio seguido. Para cada uno de los objetivos específicos, describa o resuma los resultados. Relacione las publicaciones y/o manuscritos enviados a publicación con los objetivos específicos. Incluya en anexos, la información de apoyo que estime pertinente y necesaria para la evaluación.

Resultados

1) Correlación de mediciones por citometría de flujo de necrosis y apoptosis en células mononucleares con la condición del control o paciente del cual provenía la muestra celular.

Figura 1 y 2: Muestran el efecto de glucosa sobre la necrosis de células mononucleares sometidas a estrés oxidativo en controles y pacientes diabéticos con y sin obesidad respectivamente. En general podemos concluir que la glucosa afecta más a las células de sujetos controles que a las de pacientes diabéticos, probablemente a que las altas glicemias en los pacientes diabéticos hayan seleccionado una población de células mononucleares resistentes. La presencia o ausencia de obesidad no altera significativamente el efecto de glucosa y/o estrés oxidativo. Figura 3 y 4: Muestran el efecto de glucosa sobre la apoptosis de células mononucleares sometidas a estrés oxidativo en controles y pacientes diabéticos con y sin obesidad respectivamente. Las conclusiones más importantes son que en sujetos controles la presencia de obesidad aumenta la sensibilidad de las células mononucleares al estrés oxidativo en directa proporción con la elevación de las concentraciones de glucosa. Por otra parte, en pacientes diabéticos tanto obesos como no obesos, la apoptosis ocurre independiente de las concentraciones de glucosa a las cuales fueron sometidas las células, indicando de esta forma un estado preactivado que favorece la acción del estrés oxidativo en la inducción de apoptosis. Figura 5 y 6: Muestran el efecto de glucosa sobre la necrosis de células mononucleares sometidas a estrés oxidativo en controles y pacientes diabéticos menores y mayores de SO años respectivamente. No se observan diferencias demasiado significantes en pacientes diabéticos con respecto a los controles en ambos grupos etanos. Eso sí, las células de los sujetos controles menores de 50 años son más sensibles a los tratamientos utilizados que todos los otros grupos analizados en estas figuras. Figuras 7 y 8: Muestran el efecto de glucosa sobre la apoptosis de células mononucleares sometidas a estrés oxidativo en controles y pacientes diabéticos menores y mayores de 50 años respectivamente. No se observan diferencias demasiado significantes en ambos grupos eta nos de controles, pero en diabéticos, a pesar de no encontrar diferencias significativas de acuerdo a la edad, al igual como fue descrito anteriormente, la apoptosis ocurre en forma independiente de las concentraciones de glucosa y muestran una sensibilidad aumentada al estrés oxidativo. Figura 9: Muestra el efecto de glucosa sobre la necrosis de células mononucleares sometidas a estrés oxidativo en mujeres controles y diabéticas. No se observan diferencias significativas en la necrosis celular entre las controles y las diabéticas. Sólo se observa un leve aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo de las células controles respecto de las diabéticas, indicando que estas últimas serían más resistentes a las condiciones utilizadas. Figura 10: Muestra el efecto de glucosa sobre la apoptosis de células mononucleares sometidas a estrés oxidativo en mujeres controles y diabéticas Al igual que lo observado anteriormente, la apoptosis en células de mujeres diabéticas es independiente de la concentración de glucosa y sólo aumenta en condición de estrés oxidativo.

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Figura 11: Muestra el efecto de glucosa sobre la necrosis de células mononucleares sometidas a estrés oxidativo en hombres controles y diabéticos. No se observan diferencias significativas en la necrosis celular entre los controles y los diabéticos. Sólo se observa un leve aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo de las células controles respecto de las diabéticas, indicando que estas últimas serían más resistentes a las condiciones utilizadas. Figura 12: Muestra el efecto de glucosa sobre la apoptosis de células mononucleares sometidas a estrés oxidativo en hombres controles y diabéticos. Al igual que lo observado en la figura 10, la apoptosis en células de hombres diabéticos es independiente de la concentración de glucosa y sólo aumenta en condición de estrés oxidativo.

Tabla 1: Comparación de diferencias en necrosis y apoptosis medidas por citometría de flujo en células de controles y pacientes diabéticos. Los números en rojo indican significancia.

2) Mediciones de Citoquinas por citometría de flujo.

Figura 13: Cuantificación de células TNFu positivas provenientes de sujetos controles y pacientes diabéticos después de ser sometidas a estrés oxidativo con concentraciones variables de glucosa. Se observa que el porcentaje de células positivas para TNFa en pacientes diabéticos es significativamente mayor que en sujetos controles. Además la producción de TNFa es directamente proporcional a la condición de estrés oxidativo y concentraciones crecientes de glucosa. Figura 14: Cuantificación de células IFNy positivas provenientes de sujetos controles y pacientes diabéticos después de ser sometidas a estrés oxidativo con concentraciones variables de glucosa. Al igual que lo que ocurre para TNF(x, el porcentaje de células IFN'y positivas de pacientes diabéticos es significativamente mayor que en sujetos controles. La conclusión final de estas 2 figuras indica que las células diabéticas producen una mayor cantidad de citoquinas inflamatorias cuando son sometidas a estrés oxidativo y a altas concentraciones de glucosa.

3) Mediciones de citoquinas mediante el sistema BioPlex de BioRad en 3 sobrenadantes de cultivos de linfocitos y/o monocitos normales sometidos a estrés oxidativo y altas concentraciones de glucosa

Figura 15A: Muestra el aumento de IL-2 en linfocitos. La liberación de IL-2 es directamente proporcional con la condición de estrés oxidativo y concentraciones crecientes de glucosa. Figura 15113: Muestra el aumento de IL-4 en linfocitos. La liberación de IL-4 es directamente proporcional con la condición de estrés oxidativo y concentraciones crecientes de glucosa. En monocitos la liberación de esta citoquina es independiente de los estímulos usados. Figura 15C: Muestra el aumento de IL-6 en linfocitos. La liberación de IL-6 es directamente proporcional con la condición de estrés oxidativo y concentraciones crecientes de glucosa. Figura 15D: Muestra la liberación de citoquina IL-8 en monocitos, la cual se eleva en respuesta al estrés oxidativo, pero es independiente de las variaciones de glucosa. Figura 16A: Muestra la liberación de IL-10 en linfocitos y en monocitos, en ambos tipos celulares, la liberación de la citoquina es independiente del estrés oxidativo y de las concentraciones crecientes de glucosa. Figura 168: Muestra la liberación de la citoquina GM-CSF, tanto en monocitos como en linfocitos. Al igual que IL-10, en ambos tipos celulares, la liberación de la citoquina es independiente del estrés oxidativo y de las concentraciones crecientes de glucosa. Figura 16C: Muestra el aumento de IFNy en linfocitos. La liberación de IFNy es directamente proporcional con la condición de estrés oxidativo y concentraciones crecientes de glucosa. Figura 16D: Muestra la liberación de TNFU en monocitos, la cual es directamente proporcional con la condición de estrés oxidativo y concentraciones crecientes de glucosa. Figura 17A: Muestra la liberación de la citoquina IL-lb en monocitos, la cual es independiente del estrés oxidativo y de las concentraciones crecientes de glucosa.

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Figura 17113: Liberación de IL-5 en linfocitos. La liberación de la citoquina es independiente del estrés oxidativo y de las concentraciones crecientes de glucosa. Figura 17C: Liberación aumentada de IL-12 en monocitos, la cual es directamente proporcional con la condición de estrés oxidativo y concentraciones crecientes de glucosa. Figura 17D: Liberación aumentada de IL-13 en linfocitos, la cual es directamente proporcional con la condición de estrés oxidativo y concentraciones crecientes de glucosa. Figura 18A: Liberación de citoquina G-CSF en linfocitos, la liberación de esta citoquina es mayor en condición de estrés oxidativo, pero no varía con las concentraciones crecientes de glucosa. Figura 18113: Liberación de MCP-1 en linfocitos, (fuera de rango para monocitos). En linfocitos, la liberación de la citoquina es independiente del estrés oxidativo y de las concentraciones crecientes de glucosa. Figura 18C: Liberación de MIP-1b en monocitos, la cual es directamente proporcional con la condición de estrés oxidativo y concentraciones crecientes de glucosa. Citoquinas IL-7 e IL-17 quedaron fuera de rango de medición. Estos datos obtenidos en la medición de los 3 sobrenadantes, confirman las tendencias de los resultados informados en el 2006.

4) Mediciones de citoquinas mediante el sistema BioPiex de BioRad en sobrenadantes de cultivos de células mononucleares de sujetos normales y diabéticos sometidos a estrés oxidativo y altas concentraciones de glucosa. (Se debe considerar en este caso que las mediciones se hicieron en sobrenadantes de co-cultivos de linfocitos y monocitos, por lo cual algunos resultados son la mezcla de la respuesta de ambos tipos de células)

Figura 19: Muestra la liberación de la citoquina IL-1. La liberación de esta citoquina responde principalmente a las concentraciones crecientes de glucosa cuando las células están bajo estrés oxidativo. Lo cual se observa también en células de sujetos normales. También es destacable que en los pacientes diabéticos esta citoquina se libera en respuesta a nLDL y a altas concentraciones de glucosa. Figura 20: Liberación de Citoquina IL-2. Esta citoquina se libera tanto en células controles como en diabéticas en respuesta al estrés oxidativo, pero asociado a concentraciones de glucosa por sobre los niveles fisiológicos. En células de diabético esta respuesta es significativamente mayor que en los controles normales. Figura 21: Liberación de Citoquina IL-4. En este caso, la liberación de IL-4 depende de la condición de estrés oxidativo, tanto en las células controles como en las diabéticas, pero también, la liberación aumenta con el aumento de la concentración de glucosa en el medio. Este efecto es significativamente mayor en las células de pacientes diabéticos. Figura 22: Liberación de Citoquina IL-6. En esta caso, la liberación de la citoquina es significativamente mayor en células diabéticas sometidas a estrés oxidativo y aumenta con las concentraciones crecientes de glucosa. Figura 23: Liberación de Citoquina IL-8. Se puede observar que la liberación de esta citoquina es independiente de las concentraciones de glucosa y que se eleva significativamente cuando las células diabéticas son sometidas a estrés oxidativo. Figura 24: Liberación de IL-10. En este caso los resultados no son demasiado concluyentes, solo se observa un discreto aumento de la citoquina en células diabéticas, el cual no es significativo para la condición de estrés oxidativo ni para las concentraciones de glucosa. Figura 25: Liberación de GM-CSF. Los resultados no son demasiado concluyentes, sólo existe un aumento discreto de la citoquina en las células de pacientes diabéticos cuando se encuentran en una alta concentración de glucosa. Esto es independiente de la condición de estrés oxidativo. Figura 26: Liberación de Citoquina IFNy. En este caso, la liberación de IFNy depende de la condición de estrés oxidativo, tanto en las células controles como en las diabéticas, pero también, la liberación aumenta con el aumento de la concentración de glucosa en el medio. Este efecto es significativamente mayor en las células de pacientes diabéticos. Figura 27: Liberación de Citoquina TNFa. En este caso, la liberación de TNFa depende de la condición de estrés oxidativo, tanto en las células controles como en las diabéticas, pero también,

rol

la liberación aumenta con el aumento de la concentración de glucosa en el medio. Este efecto es significativamente mayor en las células de pacientes diabéticos. Figura 28: Liberación de IL-5. En este caso los resultados son muy similares entre controles y diabéticos y no se observan diferencias significativas relacionadas con el estrés oxidativo ni con las concentraciones de glucosa. Figura 29: Liberación de IL-12. En este caso, la liberación de IL-12 depende más que de la condición de estrés oxidativo, del aumento de las concentraciones de glucosa tanto en las células controles como en las diabéticas. Este efecto es significativamente mayor en las células de pacientes diabéticos. Figura 30: Liberación de Citoquina IL-13. En este caso, la liberación de IL-13 depende de la condición de estrés oxidativo, tanto en las células controles como en las diabéticas, pero también, la liberación aumenta con el aumento de la concentración de glucosa en el medio. Este efecto es significativamente mayor en las células de pacientes diabéticos. Figura 31: Liberación de G-CSF. La liberación de esta citoquina aumenta bajo condiciones de estrés oxidativo tanto en controles como en diabéticos, pero es independiente de la concentración de glucosa en el medio. Figura 32: Liberación de MCP-1. La liberación de esta citoquina aumenta bajo condiciones de estrés oxidativo principalmente en células diabéticas, pero es independiente de la concentración de glucosa en el medio. Figura 33: Liberación de MIP-1b. En este caso, la liberación de MIP-1b depende más que de la condición de estrés oxidativo, del aumento de las concentraciones de glucosa en el medio tanto en las células controles como en las diabéticas. Este efecto no es significativamente mayor en las células de pacientes diabéticos. Figura 34: Liberación de IL-7. Los resultados son concluyentes con una disminución de la liberación de la citoquina principalmente en células de pacientes diabéticos y no depende de las concentraciones de glucosa, pero si de la condición de estrés oxidativo. Figura 35: Liberación de Citoquina IL-17. En este caso, la liberación de IL-17 depende de la condición de estrés oxidativo, principalmente en las células diabéticas, pero también, la liberación aumenta con el aumento de la concentración de glucosa en el medio. Este efecto es significativamente mayor en las células de pacientes diabéticos. Figuras 36 - 39: Muestra el trabajo realizado para estandarizar la técnica de medición de la expresión de receptores, tanto en monocitos como en linfocitos, por RT-PCR. Se muestran los protocolos de PCR en tiempo real, las curvas de melting y los geles de agarosa donde se visualizan los productos de PCR. Figura 40 : muestra las curvas de ARN para síntesis de cADN. Figura 41: Muestras la activación de la cascada de las MAPK, p38 y p42144, bajo condiciones de estrés oxidativo y con sus correspondientes controles de carga, estos experimentos fueron exigidos por los revisores del paper enviado a Atherosclerosis. Figura 42: Western Blot para la expresión de BCL-2 y para el clivaje de PARP durante el proceso de apoptosis inducido por estrés oxidativo. Se muestra también el efecto del uso de inhibidores de las cascadas de MAPK, Inh 1: PD 98059, inhibidor de MEK e Inh 2: SB 203580, inhibidor de 38M Se muestra también los controles de carga. El panel C muestra la detección de células

caspasa 3 positivas por citometría de flujo después del tratamiento de las células con lipoproteínas nativas y oxidadas y H202. Figura 43: Muestras la activación de las cascadas de las MAPK, p38 y p42/44, bajo condiciones de estrés oxidativo y con sus correspondientes controles de carga, también muestra el efecto de los inhibidores mencionados en la leyenda de la figura 42, los cuales inhiben la activación de las cascadas de señalización correspondientes. Estos experimentos también fueron exigidos por los revisores del paper enviado a Atherosclerosis.

Tabla 2: Listado de los pacientes utilizados para este estudio, con las correspondientes determinaciones de parámetros de laboratorio. En total, participaron en este estudio 255 individuos.

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Inmunofluorescencia para Linfocitos y/o Monocitos sometidos a estrés oxidativo y a concentraciones altas temporales (2 horas) de glucosa o sorbitol.

Figura 44 - 47: Muestran los gráficos que correlacionan los tratamientos a que se sometió a las células y los porcentajes de apoptosis medidos como células anexina positivas. Las figuras 44 y 45 muestran los efectos en linfocitos y las figuras 46 y 47 en monocitos. Las figuras 44 y 46 muestran los efectos de glucosa y las figuras 45 y 47 los efectos de sorbitol. Se puede concluir que sólo la glucosa produce un aumento en los niveles de apoptosis tanto en linfocitos como en monocitos. En todo caso, este efecto es menor que el obtenido cuando las células permanecen durante 10 horas en presencia de glucosa (objetivo año 2005).

Citometría de flujo para medir la apoptosis y necrosis en células mononucleares de pacientes diabéticos y sujetos controles. Las células se sometieron a estrés oxidativo y a las concentraciones de glucosa indicadas, pero sólo por 2 horas.

Figuras 48 y 49: Efecto de la concentración de glucosa sobre la necrosis de células mononucleares de pacientes diabéticos y sujetos controles respectivamente. Se observa un efecto sinérgico entre las concentraciones de glucosa y las lipoproteínas oxidadas sobre la necrosis, tanto en pacientes diabéticos como en sujetos controles. Este efecto es menor que el observado cuando las células se someten a 10 horas al estímulo de glucosa. Figuras 50 y 51: Efecto de la concentración de glucosa sobre la apoptosis de linfocitos de pacientes diabéticos y sujetos controles respectivamente. Se observa un efecto sinérgico entre las concentraciones de glucosa y las lipoproteínas oxidadas sobre la apoptosis, tanto en pacientes diabéticos como en sujetos controles. Este efecto es menor que el observado cuando las células se someten a 10 horas al estímulo de glucosa.

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III. PRODUCTOS GENERADOS POR EL PROYECTO

En esta sección debe incluir todo documento o material cuyo contenido corresponda substancialmente a los objetivos del proyecto que se informa y en los que se indique el N° del proyecto FONDECYT. Aténgase a los formatos que se incluyen para cada tipo de producto generado. Adjunte copia de los documentos no enviados previamente a FONDECYT. Utilice las hojas adicionales que sean necesarias.

Si Ud. tiene un proyecto de Incentivo a la Cooperación Internacional, destaque con (*) las publicaciones generadas como producto del mismo a continuación de las que corresponden al Regular

1. Artículos en revistas científicas nacionales o extranjeras con Comité Editorial.

Marque con una "X" lo que corresponda. Para trabajos En Prensa! Aceptados! Enviados adjunte copia de carta de aceptación o de envío.

Autor(a)(es/as) Viviana Montecinos, Paula Guzmán, Valeria Barra, Marcelo Villagrán, Carola Mu ñóz-Montesino, Kirsty Sotomayor, Elizabeth Escobar, Alejandro Godoy, Lorena Mardones, Paula Sotomayor, Catherine Guzmán, Osmán Vásquez, Victoria Gallardo, Brigitte van Zundert, María Rosa Bono, Sergio A. Oñate, Marcelo Bustamantei, Juan G. Cárcamo, Coralia I. Rivas, and Juan Carlos Vera

Título (Idioma Original) Vitamin C is an Essential Antioxidant that Enhances Survival of OxidatK'ely Stressed Human Vascular Endothelial Cells in the Presence of a Vat Molar Excess of Glutathione*

Nombre Completo de la Journal of Biological Chemistry (Publicación online) Revista.

Ref. bibliográfica Año:2007 Vol. N° Pág. Ver Anexo

Estado de la publicación a x Publicada El Aceptada El Enviada El En preparación la fecha.* ¡En Prensa Otras fuentes de FONDECYT 1040977 financiamiento, si las hay 1

Autor(a)(es/as) Catherine G. Guzmán, Lorena K. Azócar, Felipe Zúñiga, Carola Muñoz-Montesino,Alejandro Godoy, Osmán Vásquez, Lorena Mardones, Viviana Montecinos, Mafalda Maldonado, Brigitte van Zundert, Nancy Maulén, Luis G. Aguayo, Ximena Romo, Juan Olate, Francisco Nualart, Marcelo Bustamante, L. Felipe Barros, Alejandro M. Reyes, Coralia I. Rivas, Juan Carlos Vera and Juan G. Cárcamo.

Título (Idioma Original) Polarized Distribution of Glucose Transporters in Immortalized Human Brain Microvascular Endothelial Cells

Nombre Completo de la Biochemistry (Ver Anexo) Revista.

Ref. bibliográfica Año: N° Pág.

Estado de la publicación a O Publicada El Aceptada X Enviada E En preparación la fecha.* ¡En Prensa

Otras fuentes de financiamiento, si las hay

IM

Autor(a)(es/as) Marcelo Bustamante, Fredy Díaz, Mirna Muñoz, Hans-Juergen Gross, Valeria Barra, Coralia Rivas, Alvaro Llancaqueo, Luis Nuñez, Laura Campos, Lilian Kirsten, Javier Grandón, Margarita González, Juan Manuel Venegas, Juan Carlos Vera y Max Bachem

Título (Idioma Original) Oxidized lipoproteins induce apoptosis in resting human lymphocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases

Nombre Completo de la Atherosclerosis Revista.

Ref. bibliográfica Año: N° Pág.

Estado de la publicación a E Publicada O Aceptada X Enviada E En preparación la fecha.* ¡En Prensa Otras fuentes de FONDECYT 1020451, SFB 451, Project B3 financiamiento, si las hay

/

Título del Artículo Sinergistic effect of high concentrations of glucose on the oxidative stress induced by oxidized lipoproteins on mononuclear cells from type II diabetic patients.

Autor(es) Bustamante, M., Díaz, F., Muñoz, M., Kirsten, L., Campos, L., Llancaqueo, A., Núñez, L., Venegas, 3., Vera, 3., Rivas, C., Gross, H-J & Bachem, M

Nombre Completo de la Diabetes Revista.

Ref. bibliográfica Año: N° Pág.

Estado de la publicación a O Publicada O Aceptada O Enviada X En preparación la fecha.* ¡En Prensa Otras fuentes de financiamiento, si las hay

2. Otras publicaciones/ productos.

Autor(a)(es/as)

Título (Idioma Original)

Tipo de publicación o El Monografía L} Seminario ¡Taller /Curso producto E Libro E Informe Técnico

E Capítulo de Libro LI Software Marque con una "X" lo que Mapa El Patente corresponda [1] Exposición de Arte

Otro. Especificar:

Editor(es) (Libros o Capítulos de Libros)

Nombre de la Editorial! Organización

Lugar y Fecha de Publicación País:

Fecha:

Ii

3. Presentaciones a Congresos Nacionales e Internacionales. Adjunte copia del resumen o texto de la ponencia y de la tapa de/libro de Resúmenes, si no la ha enviado previamente.

Autor(a)(es/as) Bustamante, M, Muñoz, M, Díaz, F, Venegas, JM, Campos, L, Kirsten, L, Barra, V, Rivas, C y Vera, X.

Título (Idioma Las lipoproteínas de baja densidad y las altas concentraciones de glucosa inducen Original) la liberación de citoquinas inflamatorias desde células mononucleares de pacientes

diabéticos. Nombre del Congreso XLIX Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Chile.

Lugar y Fecha País: Chile Ciudad: Pucón Fecha: 22 - 25 Noviembre 2006

/

4. Tesis y /0 Memorias en ejecución y / 0 terminadas en el marco del proyecto. Adjunte copia del resumen no informado anteriormente y certificación de aprobación, si corresponde.

Título de la Tesis Relación entre factores conductuales y la adherencia a dieto-terapia en pacientes diabéticos tipo II en control en CESFAM-San Pedro de la Paz.

Nombre y Apellidos Alumna: Liliana Véjar Martínez del(de la)/de los(las) Tutor: Dr. Marcelo Bustamante Alumno(a) (os/as) y Tutor(a) Título/ Grado .

Magister_en_ Salud_Publica_basada _en_evidencia Institución, Facultad, Departamento Facultad de Medicina, UCSC

Lugar País: Chile Ciudad: Concepción

Estado de Tesis En Ejecución: X Terminada:

Fecha de Inicio: Octubre 2006 Fecha de Término: Agosto 2007

Título de la Tesis Liberación de citoquinas como respuesta al efecto de exposición a glucosa sobre células mononucleares de sujetos normales y de pacientes diabéticos sometidas a estrés oxidativo representado por lipoproteínas oxidadas

Nombre y Apellidos Alumno: Javier Grandón del(de la)/de los(las) Tutor: Dr. Marcelo Bustamante Alumno(a) (os/as) y Tutor(a) Título/ Grado . . . .. .

Magister_en_Ciencias_ con_mencion_en_Bioquímica Institución, Facultad, . . . . . .

Facultad de Ciencias Biológ i cas, Universidad de Concepción. Departamento

Lugar País: Chile Ciudad: Concepción

Estado de Tesis En Ejecución: X Terminada:

Fecha de Inicio: Julio 2006 Fecha de Término: Julio 2007

IV. DESTAQUE OTROS LOGROS DEL PROYECTO TALES COMO: • Estadías de investigación. • Formación de recursos humanos exceptuando tesistas ya informados. • Actividades de difusión y/o extensión en la temática del proyecto. • Cualquier otro logro no contemplado en los ítem anteriores y que Ud. quiera destacar.

• Estadías de Investigación El investigador responsable del proyecto realizó una estadía de investigación en el Instituto de Química Clínica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ulm, Alemania, donde realizó una serie de experimentos, dentro de los cuales se encuentran algunos ensayos de inmunofluorescencia, repetición de las mediciones de citoquinas y mediciones por citometría de flujo. (18 de Mayo - 01 de Julio 2006)

El investigador responsable, aprovechando que asistió al Congreso Mundial de qPCR en Freising-Weihenstephan organizado por la Universidad Técnica de München, hizo una corta estadía de investigación en fa Universidad de Ulm, donde se midió la concentración de 17 citoquinas provenientes de sobrenadantes de células mononucleares de sujetos controles y pacientes normales (26 de Marzo- 22 Abril, 2007)

El tema del proyecto y los resultados obtenidos ha dado la oportunidad al investigador responsable de dictar varias conferencias, algunas dentro del ámbito interno de la UCSC y también a nivel de universidades regionales y también en otras instancias asociadas a la biomedicina.

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V. RESUMEN

Describa en forma precisa y breve el tópico general del proyecto, sus metas y objetivos y los resultados alcanzados. Utilice un lenguaje apropiado para la comprensión del público no especialista en el tema. Esta información podrá ser difundida. (No debe exceder este espacio en fuente Verdana 9)

El proyecto titulado "Efecto de lipoproteínas de baja densidad modificadas sobre estados de activación de células mononucleares obtenidas de pacientes con diabetes mellitus tipo 2, cultivadas en presencia de altas concentraciones de glucosa e insulina" tenía como objetivo general estudiar el efecto que podría producir la glucosa y/o la insulina sobre células mononucleares de sujetos normales y de pacientes diabéticos, basados en la hipótesis planteada de que "las concentraciones de glucosa y/o insulina modifican la sensibilidad de las células mononucleares de sangre periférica al estrés oxidativo, inducido por lipoproteínas oxidadas". Los resultados alcanzados permiten concluir que la glucosa modifica efectivamente la sensibilidad de las células en cuestión, cuando estas están en una condición de estrés oxidativo, inducido por lipoproteínas oxidadas y peróxido de hidrógeno. Es más, podemos afirmar que las altas concentraciones de glucosa muestran un efecto sinérgico con el estrés oxidativo, sobre la inducción de muerte celular por necrosis y/o apoptosis, la liberación de citoquinas principalmente inflamatorias, la activación de cascadas de transducción y probablemente sobre la expresión de receptores específicos. Las técnicas que se utilizaron incluyeron aislamiento de células desde la sangre de sujetos controles y pacientes diabéticos, cultivos celulares, citometría de flujo, inmunofluorescencia, western blot, sistema BioPlex de BioRad para medir citoquinas y por supuesto RT-PCR para medir la expresión de receptores específicos tanto en linfocitos como en monocitos. La comparación de los parámetros medidos entre las células de sujetos controles y pacientes diabéticos permite concluir, en general, que las células provenientes de estos últimos, son más susceptibles a la inducción de muerte celular, ya sea por apoptosis o necrosis y liberan más citoquinas inflamatorias. Esto estaría indicando un estado preactivado de estas células que las lleva más rápidamente a la muerte celular, lo que podría explicar la inmunodeficiencia asociada a diabetes y la liberación más rápida y en mayor concentración de citoquinas inflamatorias podría explicar en parte la sentencia publicada por algunos autores de que el paciente diabético es un "paciente inflamado crónico". Este estado proinflamatorio sería congruente con los daños tisulares que presentan estos pacientes, especialmente a nivel de vasos sanguíneos tanto centrales como periféricos, lo que explicaría porque los pacientes diabéticos se enferman frecuentemente o mueren debido a complicaciones vasculares provocadas por un proceso aterosclerótico acelerado, ya sea a nivel central como periférico. El título del proyecto indica que se medirían los efectos de insulina, pero esto no fue posible debido a que lamentablemente pensamos que la selección de pacientes y la obtención de muestras sería algo relativamente fácil de realizar, es más, el primer año sólo pudimos acceder a sólo 9 pacientes, los años posteriores pudimos tener acceso a un número significativo de pacientes, pero obtener más de 25 ml de sangre periférica fue muy difícil, a pesar de haber ofrecido incentivos económicos para la obtención de mayor cantidad de sangre de parte de los pacientes. Las células obtenidas de este volumen de muestra sólo alcanzaban para un tipo de experimento y para tener resultados estadísticamente significativos, decidimos avocamos sólo al estudio de los efectos de glucosa. En todo caso, determinamos las concentraciones de insulina circulante en alrededor de 70 pacientes y en todos los casos la insulinemia se encontró dentro de rangos normales (Datos no mostrados). En todos los cultivos se utilizó una concentración de insulina normal de 20 mU/l. No cabe duda que los estudios con concentraciones variables de insulina y glucosa arrojarán resultados muy interesantes, pero por la falta de muestras de pacientes y de tiempo no nos fue posible abordarlos, lo mismo ocurrió con los estudios de las cascadas de transducción de señales a través de western blot, en este caso, normalmente la cantidad de células utilizada en cada experimento no rindió una cantidad de proteínas suficiente para poder realizar los ensayos propuestos. La cuantificación de la expresión de receptores scavenger en monocitos y marcadores de activación en linfocitos T tampoco la pudimos llevar a buen término, aunque la técnica ya ha sido establecida y las muestras están guardadas para hacer las determinaciones en un futuro próximo. La razón de esto, ya ha sido mencionada en párrafos anteriores en este mismo informe. Finalmente los investigadores de este proyecto dieron lo mejor de si, para poder lograr cada uno de los objetivos y lo seguirán haciendo en el marco de una investigación seria y de calidad, que permita publicaciones de buen nivel de impacto.

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