Report on waterborne diseases - OSTI.GOV

ISTISAN 95/33(ISSN 1123-3117)

TSTTSAM--9 5-3 3

ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA'

Rapporto sulle malattie infettive di origine idrica.La reazione di polimerizzazione a catena

per I'identificazione dei virus enteric! nell'acqua

Michele Muscillo, Giuseppina La Rosa

Laboratorio di Igiene Ambientale

Roma1995

Istituto Superiore di SanitaRapporto sulle malattle Infettive di origine idrica. La reazione di polimerizzazione a catena per I'identificazione del virus enterici nell'acqua.Michele Muscillo, Giuseppina La Rosa 1995, ii, 74 p. Rapporti ISTISAN 95/33

Numerose malattie infettive umane sono associate alia presenza di virus enterici nell'acqua da here ed in quelle destinate ad attivitaricreative. I dad epidemiologic! indicano, tra i principal! agent! eziologici il virus di Norwalk, i virus dell'epatite A ed E, i rotavirus e gli enterovirus. La reazione di polimerizzazione a catena (PCR) e sicuramente la tecnica piii rapida e versatile per la loro identificazione in campion! d'acqua.

Parole chiave: Acqua marina, Acqua potabile, Genotipizzazione, Inquinamento dellc acque, Malattie infettive.

Istimto Superiore di SanitaReport on waterborne diseases. The polymerase chain reaction for the identification of enteric viruses in water.Michele Muscillo, Giuseppina La Rosa1995, ii, 74 p. Rapporti ISTISAN 95/33 (in Italian)

A variety of human infectious diseases are associated with the pollution of water by enteric viruses. The epidemiological data on cases associated with drinking and recreational water show Norwalk, hepatitis A and E viruses, rotavirus and enteroviruses as the etiological agents. The polymerase chain reaction (PCR) is certainly the most reliable technique available for the rapid identification of these viruses in water samples.

Key words: Drinking water, Genotyping, Sea water. Water pollution, Waterborne diseases.

© Istituto Superiore di Sanita 1995

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INDICE

1. LE MALATTIE INFETTIVE DI ORIGINS IDRICA

1. 1. Generality sulle malattie derivanti da micror-ganismi trasmessi dall ’ acqua................. 1

1. 2. Generality sui virus enteric! trasmessi comecontaminant! dell' acqua.......................... 7

1. 3. I virus della diarrea.............................. 81. 4. Gli enterovirus................................... 121. 5. I virus dell1 epatite.............................. 181. 6. Virus enteric! animali.......................... ..191. 7. Relazioni genetiche fra i virus enteric!.......... 211. 8. Acque destinate al consumo umano: il rischio

virale................................... .......271. 9. Acque destinate alia balneazione.................. 291. 10 Aspetti normativi riguardanti il controllo

della quality delle acque in Italia.............. 29

2. LA PCR IN MICROBIOLOGIA AMBIENTALE: APPLICAZIONE ALL’ IDENTIFICATIONS DEGLI ENTEROVIRUS NELL’ACQUA. 2

2. 1. Generality....................................... .302. 2. Concetti di base della metodica RT-PCR ap-

plicata all’identificazione degli enterovirus............................................ 31

2. 3. Visualizzazione del prodotto su gel d'agarosio.....332. 4 Clonaggio e sequenziamento dell1 amplicone......... 362. 5. Analisi filogenetiche: vantaggi e limit!........... 392. 6. Considerazioni sulla attendibility delle

analisi virologiche dell'acqua con o senzal'uso delle colture cellular!.................. 41

CONCLUSION I E PROSPETTIVE FUTURE........................ 43BIBLIOGRAFIA ........................................... 45

ii

INDICE DELLE FIGURE E TABELLE

Tabella 1. Classificazione e caratteristicheprincipal! dei virus enteric!............ 3

Tabella 2. Epidemiologia delle malattie di ori-gine idrica.............................. 4

Tabella 3. Comparazione di sequenze di variPicornavlridae.............................. 23

Tabella 4. Regions genomica delle sequenze confront ate nel dendrogramma di Fig. 1.......... 25

Tabella 5. Test RT-PCR per 1'identificazionedegli enterovirus........................... 40

Figura 1. Dendrogramma: rapport! filogenetici deglienterovirus nella regions del 51 NC......... 24

Figura 2. Trascrizione inverse dell'RNA................ 34

Figura 3. Cicli della PCR.............................. 35

Figura 4. Clonaggio del prodotto della PCR............. 38

1

1. LE MALATTIE INFETTIVE DI ORIGINS IDRICA.

1. 1. Generality sulle malattie derivanti da microrganismi trasmessi dall'acqua. I microrganismi enteric! sono sempre stati la causa principals di malattie infettive associate al consume di acqua contaminata da materials fecale. Le epidemie di origins idrica, o tecnicamente waterborne disease, sono probabilmente sottostimate per la mancanza di adeguati programmi di sorveglianza epidemiologies. Soltanto negli Stati Unit! esistono due enti impegnati nella classificazione e definizione delle malattie derivanti dall'acqua destinata al consumo umano. Dal 1971 i "Centers for Disease Control and Prevention" (CDC) e "U.S. Environmental Protection Agency" hanno raccolto dati ed hanno potuto associare all'acqua da bere molte epidemie verificatesi dal 1920 ad oggi negli Stati Unit! ed altrove (es. Canada). Ogni anno, negli USA 210.000 bambini vengono ospedalizzati per gastroenteriti infettive e circa 4-10 milioni (Viral agents... 1990) di bambini muoiono nel mondo a causa di quests malattie. Si stima che divers! milioni di waterborne disease awengono annualmente in Africa, Asia ed America Latina: la diarrea 6 la piu nota causa di malattie e mortality e si calcola che un bambino su cinque muore di questo male ogni anno. II WHO ha stimato che nel 1980, 25.000 persons al giorno (Bull 1990) sono morte per il consumo di acqua contaminata, e che approssimativamente 1'80% di tutte le malattie del mondo sono correlabili con il consumo di acqua contaminata da materials fecale. Nei paesi industrializzati, ove 1'acqua destinata al consumo umano A sottoposta ad adeguati trattamenti, 1'incidenza di tali malattie A estremamente bassa; vi A comunque una crescents preoccupazione per 1'inquinamento del fiumi, delle acque di falda e delle acque costiere. In Europa su una popolazione di 840 milioni di abitanti, circa 70 milioni non hanno acqua distribuita nelle case ed un numero molto piu grande non dispone di impianti per il trattamento delle acque reflue. L'epidemiologia di patogeni responsabili di malattie waterborne A complessa e la potabilizzazione dell'acqua da bere e un adeguato trattamento dei liquami grezzi sono gli unici mezzi per il controllo e prevenzione di malattie derivanti dalla contaminazione microbiologica dell'acqua. I patogeni enteric! sono gli agent! eziologici

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delle malattie infettive derivanti dall'acqua e comprendono batter!, virus e parassiti escreti con le feci umane ed animali; tali microrganismi possono arrivare a contaminare le risorse acquifere superficial! e profonde grazie ad una loro incredibile capacity di sopravvivenza nell'ambiente acquatico. Nel 1908 1'introduzione negli USA (estesa poi al resto del mondo) della clorazione nella disinfezione dell’acqua da bere portd ad un abbattimento immediate del 40% dei casi di tifo che raggiunsero successivamente valori quasi trascurabili fino alia completa eradicazione del morbo. Tutti i patogeni sono inattivati dal cloro e dagli altri disinfettanti usati per la potabilizzazione in tempi piu o meno brevi ad eccezione di parassiti quali giardia e criptosporidio che, per la loro capacity di formare cisti, riescono a soprawivere a lungo.

L1impatto dei microrganismi sulle malattie di origine idrica 6 funzione del tipo di trattamento dell’acqua, della resistenza e della dose minima infettante di ciascun pato- geno. Dai dati rilevati dalle pubblicazioni recensite, che riguardono gli ultimi 20-25 anni, i virus enteric! maggiormente responsabili di epidemic di gastroenteriti di origine idrica sono (Tab. 1): il Norwalk e virus Norwalk-simili, epatite E, epatite A e rotavirus. Altri virus enteric!, come gli enterovirus, sono endemic! e spesso asintomatici per cui e difficile, anche se intuitive, stabilire correla- zioni tra infezioni ed acqua consumata. In Tab. 2 sono stati riportati i dati epidemiologic! di malattie di origine idrica ed i loro agent! eziologici. Quest! dati non riguardano tutti i casi accertati, ma soltanto quelli ove 1’associazione con 1’acqua consumata 6 stata dimostrata mediante analisi (A) della matrice ambientale oppure dedot- ta da evidenze epidemiologiche (EE). In questa stima non e compresa la situazione di alcuni paesi (Africa, America Latina e la maggior parte dell'Asia) ove tali malattie sono endemiche ed esistono pochi dati ufficiali e sporadiche pubblicazioni. Per quanto riguarda i paesi industrializzati, ad eccezione degli USA e del Canada, i dati sono una sottostima della situazione reale, in quanto non esistono adeguati programmi di sorveglianza per questo tipo di problema.

Tabella 1 - Classificazione e caratteristiche principali dei virus enterici1) ENTEROVIRUS poliovirus 1-3

(esRNA) coxsackievirus Acoxsackievirus B echovirus

enterovirus 70 enterovirus 71

2) EPATITE epatite A (ex E72)(ssRNA) epatite E

3) NORWALK Norwalk(ssRNA) Haway

Snow Mountain

4) ROTAVIRUS gruppo A(dsRNA) gruppo B

gruppo C

5) RBOVIRUS reovirus 1-3(dsRNA)

6) ADENOVIRUS adenov. 40-41(dsDNA)

7) CALIC1VIRUS(ssRNA)

8) ASTROVIRUS(ssRNA)

9) CORONAVIRUS(ssRNA)

parallel flaccida, meninglte asettica, gastroenteriti meningite asettica. congiuntiviti emorragiche. parallel miocarditi. oeningoencefaliti, meningite asettica. parallel meningite asettica. congiuntiviti emorragiche parallel, erpangina.

congiuntivite emorragicameningite asettica. parallel flaccida.

epatite itterica o enitterica epatite. gastroenteriti epidemiche acute

diarrea (soprattutto in adult!). vomito (bambini)diarreadiarrea

diarrea, vomito in bambini (winter vomiting disease)" " in adultl (diffusa in Cina)endemica in tutti 1 paesi

associati a varie infezioni perinatal! e dell'infanzia

gastroenteriti epidemiche infantili

diarrea

diarrea

infezioni tratto respiratorio. spesso diarrea-associati

Tabella 2 - Epidemiologia delle malattie di origine idricaReference s Affetti Ambiente

idricoPaese Patogeni A EE

Alexsander. 1992 O.F.H. 77 mare UK Ev.Sa, s,w ♦Birkhead. 1989 Gi rate Vermont Gi s ♦Bloch. 1990 Ha 16 pozzo Georgia (USA) HAV wBockemul, 1985 D 10* Tropic! Ro.N.AD.C.Pb s ♦Bryan, 1974 Ha lago HAV ♦Collin, 1983 G rete Francia ♦D'Angelo, 1979 FC 72 piscina Georgia AD4 w, tD'Antonio, 1985 Or pozzo Texas Cr s.b. ♦Desenclos, 1992 Ha 6 mitili USA HAV 0Dilawari. 1994 He 1273 rete India HEV ♦Divizia. 1993 Ha 13 pozzo Italia HAV b,w +Fewtrell, 1992 G fiume UK Ev 6 ♦Gastroent... 1991 G 12 mitili Haway 0Ohannoum. 1981 Ha rete Libia HAV.Ci.Ba W *Gill. 1983 0 362 mitili UK SRV O.bGrohmann, 1981, G volontari mitili Australia N 0,bGunn. 1982 G 6 mitili Florida N oHawley. 1973 G lago CBSHoffman, 1975 Ft 105 Florida Sa sHopkins. 1984 G 5 pozzo Colorado Ro bHopkins, 1991 Gi 31 F.grezza Colorado G s ♦Ismail. 1988 Ha, Ft.G rete Malesia ♦Janssen. 1974 G mitili

Tabella 2. continueReferenze s Affettl Amblente

ldricoNazione Patogeni A EE

Kappus, 1982 G 103 piscina Ohio N b,w ♦Khan. 1994 G 201 ghlaccio Haway (crociere) N b ♦Kaplan, 1982b G 249 rete USA N b,sKaplan.1982c G 1500 rete Georgia N b ♦Lawson. 1991 G 900 rete Arizona N b ♦Lenaway. 1989 F.H 26 piscina Colorado Ev-like b.w ♦Levine. 1990 Cr 13000 rete USA Cr. s ♦

G 5000 rete N s ♦G grezza ncPs 26G.G1.H piscina Sh.Gi.EV

Llnco. 1980 0 25 oitili Australia N s ♦Lopez. 1980 Gi 103 trattata N. Hampshire Gi s.wMackowiak, 1973 Ha Louisiana HAV V

Mahoney. 1974 G California ♦Martone. 1980 c 34 piscina Georgia AD3 T.w,Molinle. 1986 He 38 rete Chad HEV b ♦Moore. 1993 G 17464 piscina USA Gi.Cr, ♦

1825 piscina Gi.Cr.Ec.P6.Nf w, sMorse. 1986 G 1017 mitili New York N OMultistate___ 1993 G mitili Louisiana on ♦Murphy, 1979 G 2000 ghlaccio Australia N sMurphy, 1983 G 21 pozzo N.Zelanda P1.AD1.5.SRV w ♦

Tabella 2. ContinueReference s Affetti Ambiente

idricoNations Patogeni A EE

Murao. 1991 G 82 mitili Giappone SRV s ♦Naik. 1992 He 79091 rete India HEV b +Navin. 1985 Gi 324 rete Nevada Gi wNestor. 1983 f iume Romania EvNestor, 1989 O.F.H rete. flume Romania Ev.Ad, w *Nolan. 1984 G 6 mitili Oregon Vbp 0Outbreak of..1991, G 100 pozzo Canada N wPanda. 1989 He rete India HEV B,b ♦Samonis, 1994 G 35 mitili Greta Shs 8 ♦Sekine. 1989 G 4860 mitili Giappone SRV 8 +Simchen. 1991 Sh 1216 rete Israle Sh ♦Stehr-Green, 1991 G 44 mitili N. Zelanda Cpb w +Struelens, 1992 Lg 32 rete Belgio Lg 6,W ♦Sutmoller. 1982 G 25 rete Brasile R.Sh bTulchinsky, 1993 Ha.Sh.Sa.Ft rete Israele HAV.Sh.Ft ♦Turner. 1987 FC 77 Oklahoma AD7a T ♦Viral gastr..,1994 G mitili Florida nd OVogt, 1982 D.H.F 3000 rete Vermont Cpb Tr +Yamashita. 1990 piscina Giappone ♦Warner, 1991 G 3000 potto,mitili Texas N b *

Abbreviation!: A, analisi di conferma: Ad, adenovirus; b, siero; CBS. coxsackievirus B5; Ch, colera; Cpb, campilobacter: Cr. criptosporidio & criptosporidiosi; D, diarrea: Ec„ Escherichia coll; EE, evidence epidemiologiche; Ev, enterovirus; MMWW, Morbidity & Mortality Weekly Report;Ev. enterovirus; F. febbre; FC, faringocongiuntiviti; Ft, febbre tifoide; G. gastroenterite; Gi. giardia. giardiasi: H, oal di testa; Ha. epatite A; He epatite E; Lg, Legionella, legionellosi; N, Norwalk; on, indagini in corso; O, ostriche; Ps, Plesiomonas shigelloides; Ro, rotavirus; s, feci; S, sindrome: SRV. small round virus; Sa, salmonella, salmonellosi: T, tampone sacco congiuntivale; Tr. tampone rettale; Shs, shigella Sonney fi shigellosi; PI, poliovirus 1; Ps, Pseudomonas: Nf, Naegleria fowlery: Vbp, vibrio paraemolitlco; Vch, vibrio colera; Vcf. vibrio fluvialis: w. acqua.

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1. 2. Generality sui virus enterici trasmessi come contaminanti dell'acqua.

I virus enterici sono parassiti ultramicroscopici endo- cellulari, dotati di affinita elettiva verso un determinate ospite. Essi sono privi dell'organizzazione necessaria per la replicazione e quindi hanno la necessity di impadronirsi dell'apparato citoplasmatico della cellula eucariotica specializzato per la sintesi di proteine e di acidi nuclei- ci. Per questo motive i virus presenti nell'ambiente acquatico (Melnick 1980) possono derivare soltanto da contaminazioni fecali. I virus escreti con le feci sono classificati come virus enterici e sono caratterizzati dall' ability a infettare principalmente i tessuti del tratto respiratorio e gastrointestinale dell'uomo e dei mammiferi, ma sono capaci di replicarsi altrettanto bene in altri organ! (es. cervello, cuore). Sono noti piu di 100 different! virus enterici divisi in diversi gruppi sulla base di differenze morfologiche, chimiche e antigeniche (Tab. 1).

I virus enterici sono escreti con le feci in numero elevato, stimato intorno a diversi milioni di particelle per grammo di feci. Milioni di metri cubi di liquami, trattati e non, vengono quotidianamente immessi nei fiumi e quindi nei marl. La capacity degli enterovirus di sopravvivere a lungo nei suolo (Dubois 1976; Weilings 1975, Yates 1985) e nelle acque superficial! (Hejkal 1981, Hurst 1986, Labelle 1980, Mahnel 1977, O'Brien 1977, Sobsey 1975, Sobsey 1977) rende potenzialmente possibile la contaminazione virale delle acque destinate al consume umano o a scopi ricreativi.

Le prove epidemiologiche di malattie infettive causate da virus enterici umani trasmessi attraverso l'acqua adibi- ta ad uso ricreativo sono molto limitate ( Melnick 1978) e riguardano principalmente acque di piscine (McLean 1963), laghi e stagni e riferite ad infezioni da adenovirus, (D'Angelo 1979), virus enterovirus-simili (Lenaway 1989), virus di Norwalk (Kappas 1982), virus dell' epatite A (Bryan 1974) e coxsackievirus B5 (Hawley 1973). Correla- zioni tra virus e acque di balneazione sono state effettua- te (D'Alessio 1981) sulle infezioni contratte da bambini da la 15 anni esposti all'acqua di mare e di recente sono stati effettuati studi retrospettivi su bagnanti in ety

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scolastica (Alexander 1992) e su giovani militari in una scuola per palombari nei press! di Lione, in Francia (Garin 1994).

A1 contrario esistono molti dati riguardanti epidemie causate dall'acqua destinata al consume umano come documen- tato nei paragrafi seguenti.

1. 3. I virus della diarrea

La maggiore causa di diarrea e l'infezione del tratto gastrointestinale detta appunto gastroenterite. L'irrita- zione generalizzata della mucosa porta ad un aumento delle secrezioni intestinal! e ipermobilitS delle pareti intestinal! che hanno come conseguenza la liberazione violenta del liquido accumulate. Contemporaneamente si generano stimoli irritativi che attraverso il nervo vago afferente ai "centri midollari del vomito" causano un impulse motorio ai nervi spinali del diaframma e del muscoli addominali. II vomito e la conseguenza combinata della compressione dei muscoli addominali sullo stomaco e dell'apertura dello sfintere esofageo i quail provocano 1' espulsione del contenuto dello stomaco all'esterno. Negli USA 210.000 bambini vengono ospedalizzati ogni anno per gastroenterite infettiva e circa 4-10 milioni di bambini muoiono in tutto il mondo per diarrea (Viral agents ... 1990).

I virus enteric! classificati come "virus della diarrea" sono: rotavirus A, B e C, Norwalk, adenovirus enteric! 40 e 41, astrovirus, calicivirus (Tab. 1). Le sindromi virali gastroenteriche per la violenza e rapid!t& con cui si mani- festano, permettono in genere di risalire facilmente all'agente eziologico ed al suo veicolo di trasmissione.

I rotavirus dell'uomo sono stati identificati per la prima volta nei 1973 grazie al microscopio elettronico e sono responsabili del 30-60% di tutti i casi di diarrea acquosa grave in bambini piccoli e sono un genere apparte- nente alia famiglia Reoviridae. Sono virus aventi un genoma composto da 11 segment! di doppi filament! di RNA rivestlto da diverse subunitA di proteine formanti una struttura icosaedrica. E' un gruppo di virus estremamente eterogeneo. I rotavirus di gruppo A sono la principals causa delle forme gravi di gastroenterite disidratante nei bambini

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piccoli, quelli del gruppo B hanno provocate estese epidemic di diarrea infettiva fra gli adulti in Cina (Fang1989), raentre i rotavirus di gruppo C sembrano essere all'origine di sporadic! episodi di malattia diarroica in bambini, in ogni parte del mondo. Si calcola che, negli USA, 110.000 bambini all * anno vengono ospedalizzati per infezioni da rotavirus e, nei paesi in via di sviluppo, si hanno 125 milioni di casi di diarrea all1 anno, 18 milioni dei quali gravi e di quest! circa 800.000-900.000 si con- cludono con la morte (Blackblow 1991). La capacity dei rotavirus di soprawivere nell'ambiente esterno facilita la diffusione dell'infezione per via persona-persona e oro- fecale. Infatti la mano di un uomo, dopo aver toccato per10 sec. una superficie contaminate artificialmente da rotavirus (circa 2xl04PFU), A in grado di trasferire il 16% e 111,8% della carica virale a distanza di 20 e 60 min. rispettivamente dal contagio (Ansari 1991). Nell' acqua di estuario la loro sopravvivenza a 20° C va da 3 a 14 gg (Hurst 1989), nell1acqua di flume trattata per la potabilizzazione (Sattar 1992) una carica virale di 5xl03 PFU/ml dopo 1 ora di esposizione a 22° C con 0,05 mg/1 e 0,75 mg/1 di cloro libero non subisce significative riduzioni del titolo virale; nell'acqua potabile (Raphael 1985) con cloro libero residue fino a 0,05 mg/1, si ha una sopravvivenza a 4° C di oltre 64 gg dell'intera carica virale inoculata, mentre a 20° C si ha un calo del titolo iniziale (intorno a 104PFU) di appena un fattore 100. Tenuto conto che il DPR 236 prevede per le acque potabili una concentrazione di cloro libero al punto di utenza di 0,2 mg/1, possiamo predire che una contaminazione di origine fecale pud rappresentare un potenziale pericolo per la salute umana se11 tempo di contatto con il disinfettante non 6 stato sufficiente ad inattivare i virus.E' stato stimato che il rischio annuale di contrarre infezioni da rotavirus (che non signifies malattia) con l'assunzione media giornaliera di 2 litri d1acqua potabile, 6 di 3,1 ogni 10 persone (Bull 1990).I rotavirus sono stati isolati nelle feci (Lebaron 1990),

nei liquami (Guttmann-Bass 1987), nelle acque superficial! (Pancorbo 1987) e acque destinate al consumo umano (Hopkins 1984, Guttmann-Bas 1987) o alia coltivazione dei molluschi (Gerba 1978, Guttmann-Bass 1984). Sono noti diversi casi di

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epidemie di origins idrica associate ai rotavirus (Deetz 1984, Hopkins 1984). Quest! virus sono difficilmente isolabili su colture cellular! (spesso danno infezioni persistent! croniche) e finora la microscopia elettronica e stata la tecnica d'elezione per la loro identificazione. II clonaggio di vari segment! genomici di rotavirus (Cooke 1991, Imai 1983, Mackow 1994) ha permesso di sviluppare metodiche PCR (Fielding 1994, Flores 1990, McCaustland 1991) per la loro identificazione ed ha facilitate il riconoscimentO di nuovi ceppi riassortanti di origins animale (Browning 1992, Das 1993) responsabili di diarree nel neonato.

II virus di Norwalk e il prototipo di un gruppo di piccoli virus rotondi (Small Round Viruses), aventi 27 nm di diametro con un singolo filamento di RNA a polarita positiva. Il "Norwalk" virus, e probabilmente il virus Haway e Snow Mountain (nomi di locality dove sono stati isolati la prima volta), possono essere classificati, nonostante la differenza ultrastrutturale, come dei calicivirus. I pochi dati sulla struttura di quest! virus dipen- dono soprattutto dalle difficoltd esistenti per la loro replicazione in vitro. Infatti, mentre e noto che essi possono essere escreti con le feci 6 molto difficile iso- larli su colture cellular! o altri media. In seguito al recente clonaggio molecolare del virus di Norwalk (Jiang1990) 6 ora possibile sviluppare metodiche PCR per il suo rilevamento (Jiang 1992, Khan 1994, Moe 1994). La responsa- bilitd di questo virus nelle epidemie di origins idrica e frequente (Kaplan 1982a, 1982b, 1982c) e largamente documentata in acque di piscina (Kappus 1982), di flume (McAnulty 1993), di rete (Lawson 1991), in ortaggi non cotti lavati con acqua contaminata (Warner 1991), in cubet- ti di ghiaccio usati per raffreddare bevande o aliment! (Khan 1994).

I calicivirus enteric! hanno 27-40 nm di diametro e sono riconoscibili al microscopio elettronico per una loro depressions che li rende simili ad un calice. Come i Norwalk, hanno un singolo filamento di RNA a polarita positiva. Essi sono stati isolati in feci di bambini con gastroenteriti ed in casi sporadic! in Giappone, Inghilterra e Scandinavia (Shaw 1994).

Gli astrovirus sono piccoli virus aventi 28-30 nm di

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diametro e con la caratteristica apparenza di stelle a 5 o 6 punte al microscopic elettronico; il loro genoma consists di un singolo filamento di RNA a polarita positive (Kurtz 1987). La loro organ!zzazione genomica, comunque, non 6 ben nota probabilmente per le difficoltA incontrate a repli- carli su colture cellular!.

I coronavirus sono particelle virali pleomorfiche aventi 80-230 nm di diametro con caratteristiche proiezioni lunghe 20 nm. Principalmente essi causano nei bambini dal 5 al 15% di malattie del tratto respiratorio superiors (raffreddo- re) in tutti i mesi con prevalenza in settembre (Muffson1991). Nel neonato possono infettare il tratto gastroente- rico e provocare enterocoliti necrotizzanti.

Gli adenovirus sono particelle aventi 70-80 nm con un doppio filamento di DNA genomico. Generalmente causano malattie respiratorie ed ocular!. I sierotipi 40 e 41, invece, furono chiamati adenovirus enterici quando fu chiaramente stabilito che essi erano gli agenti eziologici di alcune gastroenteriti infantili acute (Belshe 1991). Essi differiscono dai tipici adenovirus in quanto non possono essere replicati su colture di tessuti, si trovano principalmente nelle feci diarroiche e sono stati identificati in acque inquinate (Puig 1994) mediants PCR. Altri tipi causano malattie respiratorie, come il 7a, (Turner1987) o infezioni agli occhi fra i frequentatori di piscine non trattate adeguatamente con il cloro, come il tipo 3 e 4, (D'Angelo 1979, Martone 1980). L'entita delle informa- zioni sulla struttura genomica di quest! virus ha permesso un notevole sviluppo di metodiche PCR (Brockmann 1990, Montserrat 1994, Puig 1994).

I reovirus appartengono ad uno del sei generi della famiglia Reoviridae . Non 6 ben nota la gamma di patologie umane ad essi attribuibili. E' noto che il reovirus tipo III causa 1'atresia biliare del neonato (Craven 1991), mentre altri non ben caratterizzati sono stati associati ad una variety di malattie umane comprendenti lievi gastroenteriti, infezioni pre- e perinatal!, malassorbimento ed epatiti (Abramowitz 1987). Nel topo e nel ratto sperimen- talmente infettati, essi causano malattie a carico del cervello (Tyler 1987, Weiner 1977) e del cuore (Sherry1988) . Sulla base di criteri immunologic!, i reovirus sono divisi in tre sierotipi, 1, 2 e 3 con riferimento ai

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prototipi umani Lang, Jones e Bearing. II loro genoma 6 caratterizzato da un doppio filamento di RNA equivalence a 10 x 10^ dal ton che in elettroforesi si divide in 10 segment! raggruppabili in tre class! denominate L (=3 segment!), M (=3) e S (=4) corrispondenti rispettivamente a pesi molecolari di circa 2.5, 1.4 e 0.8 x 10^ dalton (Shatkin 1968). Una caratteristica peculiare dei virus segmentati e la loro capacita di generare virioni riassortanti in seguito ad infezioni contemporanee di due o piu ceppi virali (Ramig 1991, Weimer 1977). Tali progenie sono estremamente eterogenee e difficilissime da identificare e classificare mediante i sistemi sierologici tradizionali, le tecniche di microscopia elettronica, o quelle di ibridazione molecolare. Questo fenomeno si accentua quando i virus da identificare provengono da lisati cellular! infettati precedentemente con campion! concentrati di acqua di mare. L1elettroferogramma dell'RNA estratto da tali campioni 6 spesso atipico, significative di presenza di virioni riassortanti (Muscillo 1994b). La soprawlvenza dei reovirus nell’ambiente 6 notevole; studi di laboratorio riportano che in acque superficial!, a temperature tra i 9 e 15° C va oltre i 200 gg (Mahnel 1977). I reovirus sono stati isolati da varie matrici ambientali (Adams 1982, Irving 1981, Matsuura 1984, Melnick 1978, Payment 1984, Payment 1986, Ridinger 1982) compresa l1acqua potabile (Schwartz- brod 1985); a tutt’oggi il loro rilevamento in acque di mare e lacustri e frequence (Aulicino 1992, Aulicino 1993, Muscillo 1994a). Non si conoscono attualmente malattie collegabili con il loro rilevamento nell'ambiente. Diversi segment! genomici dei reovirus sono stati clonati e sequen- ziati (Cashdollar 1982, Cashdollar 1985) per cui e potenzialmente possibile sviluppare metodiche PCR per specifiche identificazioni.

1. 4. Gli enterovirus.

Sono il genere piu studiato della famiglia Picornaviri- dae e comprende poliovirus, coxsackievirus A e B, echovirus, enterovirus 68-71. Alcuni virus furono prowisoriamen- te classificati come enterovirus ed in seguito e stata accertata la loro appartenenza ad altri generi virali. E'

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il caso dell' enterovirus 72 ora epatite A, per cui 6 stato proposto 1'appartenenza ad un genere a parte detto "Eparna- virus" (Belshe 1991), dell'echovirus 10 ora reovirus , dell' echovirus 28 ora rinovirus, dell'echovirus 22 per cui 6 stato proposto un genere a parte distinto sia dagli enterovirus che dall'epatite A (Hyypia 1992). Gli enterovirus, come tutti i Picornavirus, sono caratterizzati morfologicamente da particelle di 28-30 nm di diametro aventi un singolo filamento di RNA a polaritA positive ricoperto da una struttura icosaedrica "nuda" (60 subunitd di 4 polipeptidi ciascuna risultanti dalla scissione di una singola poliproteina precursors). Essi sono tra i piu studiati a causa della facility con cui si possono isolare dalle feci e analizzare in laboratorio. I piu tristemente famosi sono i poliovirus, responsabili di gravi malattie paralitiche per le quali vi sono evidenze in reperti ar- cheologici dell'antico Egitto risalenti a 3700 anni a.c. (Morens 1991). Gia nel 1834, J. Badham pubblicd, per la prima volta, la descrizione della malattia (Morens 1991) ma soltanto in questo secolo i massicci investimenti per 11eradicazione di questo male hanno permesso di fare plena luce sulla sua fisiopatologia e gli agent! eziologici dell'infezione. II danno primario 6 a carico del sistema nervoso centrals con distruzione delle cellule nervose e degenerazione degli assoni con la risultante paralisi degli arti innervati dai nervi affetti. Successivamente si ha l'atrofia del muscoli non piu stimolati dalle cellule nervose. Le infezioni da enterovirus nei paesi temperati avvengono soprattutto durante la stagione estate-autunno, mentre nei paesi tropical! sono endemiche o legate alia stagione delle pioggie. Gli enterovirus sono associati ad un largo spettro di malattie che vanno dalle paralisi flaccide irreversibili a forme di paralisi lievi e transitorie, da disturb! dell'apparato respiratorio sino a miocarditi piu o meno gravi e congiuntiviti emorragiche. Distinte sindromi cliniche possono essere associate indipendentemente a different! tipi di enterovirus. Tali asso- ciazioni non sono sempre prevedibili, per cui un dato virus pud comportarsi differentemente (clinicamente ed epidemio- logicamente) in luoghi divers! e tempi divers!. L'echovirus 9, per esempio, 6 stato associate primariamente alia meningite asettica (Belshe 1991) mentre a volte, in alcune

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epldemle, 6 stato associate a malattie esantematiche. Gli enterovirus hanno period! di incubazione raolto variabili, da 1 a 35 gg, in funzione del tipo di virus, dell'eta del soggetto (piu breve nei bambini, piu lunga negli adulti), delle condizioni fisiopatologiche del soggetto (favoriscono la malattia: lo stress fisico, la malnutrizione, la gravi- danza, 11immunodeficienza, la tonsillectomia, 1'ipercole- sterolemia ecc.). Le infezioni da enterovirus, sia polio che non-poliovirus, sono generalmente asintomatiche. Di queste sono responsabili: poliovirus per il 90%, echovirus per il 5% e coxsackievirus per il 5%; cid rende difficile la correlazione, tra la loro presenza in acque contaminate e circolazione nell'uomo. Mentre in paesi del terzo mondo o in paesi fortemente rural! come la Cina, ove si utilizzano acqua di superficie o di pozzo non trattate (Wang 1989), la poliomielite e tuttora un grosso problema di sanita pubblica (Zheng 1993), nei paesi ove il benessere economico permette standard igienici molto alti e si attuano massicce campagne di vaccinazione antipolio sin dagli anni sessanta, la poliomielite e stata quasi completamente eradicate. La recente comparsa in Finlandia di casi di poliomielite nell' ambito di una comunitd che per motivi religiosi aveva rifiutato la vaccinazione (Oostvogel 1994), dimostra che la circolazione di ceppi selvatici neurovirulenti in una collettivitd vaccinata e una realta inevitabile di cui bisogna tener conto nei programmi di sorveglianza epidemiologica. Infatti, 1'evoluzione continue del virus e un fatto dovuto a mutazioni nucleotidiche e ricombinazioni genomiche che producono ceppi con potenzialita neurovirulenta. E' stata ampiamente dimostrata la potenzialita neuropatogena di revertanti vaccinali neila posizione 480 (Kawakura 1989) e 6203 (Furione 1993) di poliovirus-1, 481 e 2908 di poliovirus-2 (Pollard 1989), 472 per poliovirus-3 (Evans 1985). E1 stato dimostrato in "vitro" che il poliovirus, durante la replicazione, in seguito ad uno slittamento della replicas! da uno stampo all'altro, pud produrre RNA ricombinante (Georgescu 1994, Jarvis 1992) e di conseguenza progenie virali ricombinanti vitali. Generalmente "in vivo" l'infezione di un singolo virus esclude tutti gli altri, ma sono note infezioni miste di enterovirus, frequenti soprattutto nei paesi tropical! (Moore 1993) e ritenute spesso responsabili dell'inefficacia della vaccinazione antipolio con

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virus vivi attenuati. Non A escluso quindi, che attraverso gli scambi internazionali, le modificazioni del comporta- mento sociale, gli attuali flussi migrator! dal terzo mondo, spesso clandestini, sia possibile la reintroduzione nella nostra collettivita di ceppi viral! potenzialmente patogeni.

Le infezioni da non-polio sono sottostimate per numero e gravity in quanto, o sono asintomatiche, per cui 6 difficile collegarle al consume di acqua, o danno sindromi gene- riche [es. respiratorie, gastroenteriche, o eruzioni tipo zooster come nel caso dell'echovirus 6, (Meade 1979), dermatiti papulomatose delle mani nel caso del coxsackievirus A9 (Zhao 1992)] sovrapponibili ad altre malattie e quindi difficilmente attribuibili ad uno specifico agente eziologico. Dati di sorveglianza epidemiologica stimano intorno ai 10-15 milioni le persone colpite dai non-polio ogni anno negli USA (Strikes 1986). I non-polio stanno ricevendo maggiori attenzioni a causa della larga variety di infezioni da essi provocate tra cui meningite asettica (Alexsander 1994, Rice 1995), meningoencefalite e paralisi transitorie (Gear 1994) o permanent! (Melnick 1984) anche in casi ove vi era una documentata esposizione al poliovirus vaccinale (Hayward 1989). Relativamente alia meningite asettica, dal 1982 al 1991, sono stati riportati in USA (Rhode Island) tra gli 8.326 e 14.526 casi/anno che corri- spondono a 4,4 casi ogni 100.000 abitanti (Rice 1995). Mentre infezioni da qualunque sierotipo di poliovirus associate o no alia malattia inducono probabilmente immunity specifica permanente, 11immunity da non-poliovirus non A state ben stabilita. Uno studio del "New York Virus Watch program" riporta che la velocity di reinfezione fra persone supposte immuni sulla base di anticorpi specific! present! nel Siero, e piu alta per i coxsackievirus rispetto agli echovirus; di queste reinfezioni il 50% riguardano bambini sotto i 10 anni. I dati sulla soprawivenza degli enterovirus nelle varie matrici ambientali possono dare una idea della potenziality di quest! virus di contaminare le sor- genti idriche e quindi causare malattie. La resistenza del virus dipende dalla matrice ambientale, dalla consistenza delle contaminazioni organiche che esercitano una azione protettiva sui virus e soprattutto dalla temperatura. Alla temperatura naturale dell'acqua di falda, esperimenti sulla

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soprawivenza di poliovirus 1 ed echovirus 1 (Yeager 1979) hanno dimostrato che essi resistono oltre 30 gg. In acqua minerale a 4° C il poliovirus 1 sopravvive per oltre 1 anno, mentre a temperatura ambiente non sopravvive oltre i 300 gg (Biziagos 1988). Studi sui movimenti del poliovirus 1 nel suolo prima contaminate artificialmente, poi eluito con acqua distillata, hanno rivelato una resistenza a 4° e 20° C di oltre 84 gg (Dubois 1976). Nel terreno saturo d’acqua gli enterovirus resistono per 12 gg a 37° C e 180 gg a 4° C, mentre si disattivano rapidamento nel suolo asciutto (Yeager 1979). Nelle acque superficial! la temperature influisce notevolmente sulla loro soprawivenza. Studi di laboratorio hanno mostrato una soprawivenza di 296 gg per il poliovirus 1 a 18° C e oltre i 550 gg a 4° C (Schwartzbrod 1985). Studi "in situ" cioe in tubi da diali- si, sulla soprawivenza degli enterovirus nell' acqua di flume (Rio Grande, Messico) hanno mostrato che per avere la riduzione di 1/10 della carica infettiva tra 23° e 27° C occorrono 25 h per il poliovirus 1, 19 h per poliovirus 3, e 7 h per coxsackievirus A-13 (O'Brien 1977), mentre tra 4° ed 8°C occorre un tempo quasi doppio. La stabilita nei reflui fognari (Hurst 1989) 6 fortemente influenzata dalla temperature. Il 90% della carica virale viene inattivato dopo 27 gg a 23° C e dopo 198 gg a 2° C. Nell1acqua di mare la soprawivenza degli enterovirus, calcolata in condizioni di campo (Galveston Bay, USA), dipende dalla presenza o meno di sedimento (Labelle 1980a, 1980b): in una zona relativamente non contaminate, occorrono circa 1,4 gg per inattivare il 99% della carica virale (poliovirus 1 ed echovirus 1) e 6 gg per inattivare la stessa carica con 1'aggiunta di sedimento. In una zona fortemente contaminate, il 99% della disattivazione si ha in 1 h mentre l'ad- sorbimento del virus al sedimento pud prolungare indefini- tivamente la soprawivenza del virus. Questa straordinaria capacity del virus si riflette in una notevole quantita di dati sul loro rilevamento nelle matrici piu varie, soprattutto liquami (Gerba 1988, Gershy-Damet 1987, Ghannoum 1981, Gill 1983, Glimaker 1993, Graham 1986), acque potabili (Keswick 1984), di lago (Guttmann-Bass 1984), acque reflue da impianti di depurazione (Keswick 1984, Payment 1986) di flume (Matsuura 1984, Leguyader 1995), piscina (Keswick 1981), di mare ed estuario (Aulicino 1992, Vaughn

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1979, Reynolds 1995) di laghl artificial! da destinare al consume umano (Nestor 1989), acque di superficie (Leguyader 1995). Alcuni studi retrospettivi hanno associate la trasmissione dell’infezione da non-polio alia permanenza del bambini in campeggi estivi (Danes 1983), piscine (Keswick 1981) e colonie marine (Alexander 1992). E' state, inoltre, dimostrata 1'importanza della condizione socio-economica (Jenista 1984) nella diffusions e circolazione di tali malattie. Vi sono, comunque, dati che attestano sufficientemente la correlazione tra la presenza degli enterovirus nell'acqua di superficie (Gershy-Damet 1987) e in quella potabile (Spynu 1988) e le infezioni da essi causate.

Nei paesi industrializzati la trasmissione degli enterovirus attraverso l'acqua potabile 6 una costante sorgente di preoccupazione per le autoritA sanitarie, poiche le condizioni solite in cui viene clorata 11acqua da here (al punto di messa a disposizione dell'utente si dovrebbe avere un valore di 0,2 mg/1 di cloro libero) sono talvolta insufficient! per inattivare completamente gli enterovirus. II parametro utilizzato per l'acqua potabile e che esprime le condizioni necessarie per 1'inattivazione del 99% dei patogeni da parte dei vari disinfettanti 6 il C.T. (Contact Time = prodotto della concentrazione del cloro libero in mg/1 per il tempo di contatto espresso in minuti); a 4-5° C e: E. coll 2,5, polio-1 1,1-2,5, epatite A 1,8, rotavirus human! 0,03, fago MS-2 0,25, giardia lamblia 90-170 e 18 h per il criptosporidio (Yates 1992). Altri AA. (Bull 1990) a 5° C a pH 6-7 in presenza di cloro libero riportano un C.T. di 1,1-2,5 per polio 1 , 0,034-0,05 per 1'E. coli e 0,08- 0,18 per il fago F2. Il rischio annuale di contrarre infezioni da enterovirus assumendo un consumo medio giornaliero di 2/1 di acqua e negli USA: poliovirus-1 1,49/100, poliovirus-3 3,1/100 echovirus-12 1,7/100 (Bull 1990).

Gli enormi investimenti nella lotta contro la poliomielite hanno prodotto numerosi dati sulla struttura genomica della maggior parte degli enterovirus ed hanno permesso lo sviluppo di metodiche PCR in svariati settori clinic! (Abraham 1993, Glimaker 1993, Rotbart 1990a, 1990b, 1990c, 1995) ed ambientali (Abbaszadegan 1993, Abramowitz 1987, Alexsander 1991, Atmar 1993, Kopecka 1993, Lees 1995, Montserrat 1994, Muscillo 1994b, 1995a, 1995b, Reynolds 1995, Straub 1994a, 1994b, 1995, Tsay 1993, 1994, 1995).

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Una recente applicazione di tipo amblentale della PCR riguarda il rllevamento degli enterovirus nell'acqua di falda in prossimitA di terreni trattati con liquami (Straub 1995). In campo clinico, grazie alia PCR, e stato possibile dimostrare la presenza di enterovirus in meningoencefa- liti croniche persistent! nonostante 1'assenza di effetto citopatico sulle colture di cellule (Galvez 1993, Leparc 1994, Rotbart 1990c, 1995, Zoll 1992). Per esempio, in uno studio (Sawyer 1994) condotto su un caso di epidemia di meningite asettica, su 53 campion! sospetti e senza evidente CPE sulle colture cellular!, 35 (66%) erano positivi alia PCR, cioe contenevano RNA enterovirale.

1. 5. I virus dell'epatite

II virus dell'epatite A (HAV) fu identificato per la prima volta nelle feci di un individuo infetto mediante immuno-microscopia elettronica (Feinstone 1973). Le prime prove di malattie umane causate dall'HAV risalgono agli anni 50-60 e furono collegate al consumo di acqua contaminate (Morse 1972, Peczenick 1956) o di mitili crudi o inadeguatamente cotti (Gerba 1978). A causa delle sue propriety (dimension!, forma, struttura genomica) abbastan- za simili agli enterovirus 1'HAV fu classificato prowiso- riamente come enterovirus 72. A differenza di quest! virus l'HAV non si replica nell'intestino, ma soltanto nelle cellule epatiche da cui, success!vamente, attraverso le vie biliari raggiunge le feci e attraverso i capillari sinusoidal!, il sangue. Questa differenza funzionale deriva da una differente struttura genomica (Ticehurst 1983). Studi comparativi delle sequenze genomiche del vari picornavirus clonati, evidenziando 1'enorme distanza genetica tra HAV ed enterovirus, hanno portato a proporre per 1' HAV un nuovo genere, nell1ambito della famiglia Picornaviridae : gli "Eparnavirus". In condizioni sperimentali la soprawivenza dell'HAV dipende da vari fattori, tra cui la matrice ambientale, la temperatura e la presenza di materiale organico. In acqua minerale (Biziagos 1988) a temperatura ambiente l'HAV mantiene parte della sua carica infettante dopo 300 gg dall'inoculo, mentre a 4° C e completamente inalte- rata dopo 360 gg. Una completa inattivazione dell'HAV in acqua potabile si raggiunge in 30' in presenza di 1,5-2,5

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mg H0C1/1 (FrOsner 1991), oppure in 10' a pH 7 in presenza di 0,2-0,4 mg/1 di cloro libero (C.T. = 1.8 mg x min/1) (Yates 1992). L'HAV e responsabile di epidemie di epatite dovute a contaminazioni fecali delle acque destinate al consume umano (Hoffman 1979, Tsay 1995), alia molluschicol- tura (Wanke 1987) e ad uso ricreativo (Herwaldt 1991). L'HAV oltre ad infezioni caratterizzate principalmente da ittero, talvolta anche mortal!, da spesso infezioni anitteriche con un rapporto itteriche/anitteriche di 1:12. L'HAV e endemico in tutti i paesi ed in tutte le stagioni, ma la presenza di anticorpi nel siero in funzione dell'eta ha un andamento differente a seconda che si tratti di paesi del terzo mondo ove le condizioni igieniche sono primitive, o paesi fortemente industrializzati ove gli standard igienici sono molto alti. Nel primo caso la popolazione infantile (4-15 mesi) e la piu esposta, mentre nel secondo caso la popolazione a rischio e quella adulta (oltre 40 anni) (Frtisner 1991) secondo un andamento sigmoidale. La conoscenza della sequenza genomica dell'HAV ha permesso l'applicazione recente di tecniche PCR per la sua identificazione in campioni ambientali (Divizia 1989a, 1993, Horace 1993, Reynolds 1995, Schwab 1995, Tsay 1993, 1994, Yang 1993).

II virus dell'epatite E 6 la forma entericamente trasmessa di epatite non-A non-B (Bradley 1990, Iwarson 1992, Panda 1989). Sono ben documentate varie epidemie di epatite E che hanno permesso di caratterizzare il virus (Tam 1991) e di classificarlo come un calicivirus (Belshe 1991). Sono da sottolineare le epidemie di larghe proper- zioni scoppiate in India per il consumo di acqua di rete contaminata (Dilawari 1994, Naik 1992) una volta da liquami ed un'altra volta dall'immissione di acqua prelevata dal fiume Gange e non adeguatamente trattata. La conoscenza completa della struttura molecolare di questo virus ha permesso lo sviluppo di metodiche PCR (McCaustland 1991). 1

1. 6. Virus enteric! animali.

Una infinita di agenti patogeni hanno origine da deie- zioni animali e possono talvolta creare problem! igienico- sanitari o di diagnosi differenziale con i patogeni di

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origine umana. II loro rilevamento e un chlaro indice di fecalizzazione dell'acqua ed A certamente un potenziale pericolo per la salute umana. La contaminazione dell’acqua pud derivare sia dagli scarichi del reflui zootecnici in corsi d'acqua, che da infiltrazioni nei terreni di virus dilavati dall'acqua piovana da liquami sparsi su terreni agricoli come fertilizzanti (Palmarini 1993).

Gli enterovirus sono escreti principalmente con le feci (ed in misura minore in escreti e secret!) dei suini e dei bovini e danno origine sia ad infezioni subcliniche, che a malattie del sistema nervoso (es. enterovirus tipo-2 e tipo-3). Gli enterovirus suini, nella regions filogenetica- mente conserveta, sono piu strutturalmente simili ai nonpoliovirus umani (lavoro in corso di attuazione) di quanto non lo siano quelli bovini, ma probabilmente non possiedono antigen! in comune con gli enterovirus dell'uomo. Uno dei virus enteric! del suino causa la malattia vescicolare (SVDV) ed e geneticamente ed antigenicamente affine al coxsackievirus B5 umano (Zhang 1993). L'identificazione di SVDV in acque riceventi effluent! zootecnici e un fatto molto serio in quanto tale malattia e soggetta a norms restrittive e quindi richiede 1'identificazione e circo- scrizione del focolaio epidemico. Generalmente gli enterovirus suini sono isolabili su lines cellular! specifiche (linee primarie di reni di maiale) different! da quelli che vengono usati normalmente (di primate es.BGM o di carcinoma umano es. Hep-2) per 1'isolamento di virus enterici umani, ma non e escluso 1'isolamento di enterovirus animal! su tali cellule. II rilevamento di non-poliovirus umani nell'acqua, crea problem! di diagnosi differenziale con enterovirus di suini e virus della malattia vescicolare soprattutto quando si identificano, mediante RT-PCR, virus present! in un concentrato d’acqua non replicato preventivamente su colture cellular!. Mentre non ci sono prove di malattie umane causate da virus animal!, al contrario molti animal! sono suscettibili di infezioni da enterovirus umani (Moore 1982). Tra essi, i primati per il poliovirus, la scimmia ed i topi per i coxsackievirus A e B, la scimmia a livello subclinico per gli echovirus; cid permette di utilizzare quest! animal! come modelli per lo studio di tali malattie.

I reovirus sono stati rilevati associati alia diarrea

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bovina (Kurogi 1976), a malattie respiratorie e intestinal! dei polli e dei tacchini (Lozano 1992, Payment 1988), ad infezioni zoonotiche (Craven 1991) ed in feci suine (Palma- rini 1993). E’ frequents 1'isolamento dall'acqua dei reovirus ma 6 difficile distinguerli da quell! umani.

I rotavirus, necessitano una particolare menzione in quanto a causa dei gi& citati riassortimenti interspecifi- ci, sono capaci di rapid! e significativi cambiamenti genetici. Essi sono stati isolati dalla maggior parte degli animal! da allevamento (Dwyer 1993, Legrottaglie 1993, Lozano 1992, Palmarini 1993), ma la cosa piCi interessante e che recentemente sono stati identifies!! ceppi riassortanti di origine bovina in bambini vaccinati con antisieri bovini in Finlandia (Browning 1992); altri riassortanti di origine bovina sono stati isolati in India e responsabili della "diarrea del neonato" (Das 1993). Comunque non ci sono prove epidemiologiche di malattie umane causate da virus animal! trasmessi attraverso l'acqua. I rotavirus animal! sono difficilmente isolabili su colture cellular! e, analo- gamente a quell! umani, la genotipizzazione tramlte PCR, per la sua altissima sensibilita, 6 ormai la tecnica di identificazione che sta riscuotendo i piu ampi consensi. 1

1. 7. Relazioni genetiche fra i virus enteric!

L'adattamento dei virus all'ospite e la comparsa di nuove specie virali, sono il risultato di un processo evolutivo continue a cui contribuiscono principalmente mutazioni nucleotidiche, ricombinazione e riassortimento di segment! genomici (Stanway 1990, Strauss 1990). Dallo studio delle strutture genomiche dei virus isolati, estra- polando a ritroso verso 1'origine dei virus, si possono fare predizioni sulla velocity con cui awengono i mutamen- ti che portano a nuove specie virali, e quindi a stabilire nuovi criteri tassonomici (Stanway 1990) ed epidemiologic! ( Drebot 1994, Diedrich 1995, Yamazaki 1995) in grado di evidenziare i gruppi di virus in funzione della loro stability, difference genetiche e diffusions geografica. PoichS le mutazioni si accumulano con diverse velocity nelle varie parti del genoma virale a seconda della pressione selettiva a cui esse sono soggette, 6 possibile ottenere risultati

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divers! in funzione delle region! comparate. Nella parte tradotta le divergenze tra virus siraili sono alte a causa della pressione selettiva esercitata principalmente dal sistema immunitario e dalla interazione con i recettori cellular! dell'ospite che modulano il tropismo del virus. La valutazione delle distanze genetiche effettuata nella regione tradotta e molto complessa a causa della degenerazione del codice genetico che obbliga a dare un "peso" diverse ai nucleotidi a seconda che essi occupino la I, II o III posizione nella tripletta. La principale difficoltd comunque, riguarda i virus ambientali per i quali, a causa della loro estrema eterogeneitd, risulta difficile clonare rapidamente sequenze nella zona tradotta. La parte 5'non codificante (5'NC) e la depositaria dell'informazione genetica che controlla 1'interazione con i ribosomi dell'ospite. Nei Picornavirus tale interazione awiene con le stesse modalltd, conseguenza probabilmente della presenza nel 5'NC di sequenze "consensus" altamente conservate, cio6 con percentuali di identita prossime o uguali al 100% (Tab. 3 ). Intercalate a tali sequenze vi sono tratti piu variabili ove le mutazioni possono accumularsi in modo tale da caratterizzare la specie. Nei poliovirus, e stato ampiamente dimostrato che le mutazioni nel 5'NC influenzano la neurovirulenza dei virus (Evans 1985, FrOsner 1991, Kawakura 1989, Pollard 1989, Stanway 1990). I "consensus" hanno praticamente la stessa sequenza in quasi tutti i virus strettamente omologhi (es. enterovirus) e permettono quindi 1'elaborazione di "primer" per reazioni PCR a larga specificity di gruppo. In tali reazioni, la regione bersaglio e delimitata da due consensus che segnano l'inizio e la fine di una regione variabile. Nella tabella i primer da noi usati normalmente per la diagnosi di enterovirus sono stati indicati con le sigle EV-B435 ed EV-H603 (Muscillo 1995b).

E' possibile la quantificazione degli eventi mutazionali mediante comparazione di sequenze nucleotidiche analizzate con sofisticati programmi su computer molto veloci. I risultati della comparazione possono essere visualizzati come in Fig. 1. ove sono rappresentati mediante un grafico ad albero, chiamato "dendrogramma" , i rapporti esistenti fra vari Picornavirus. La regione scelta per la comparazione si trova nella parte non codificante situata all'estre-

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Tabella 3. Comparazione di sequenze di vari Picomaviridae. Dali'allineamento di 740 basi (vedi Tab. 4), sono state riportate soltanto due region! (410-500 e 550-648). Da notare le varie "cassette" di sequenze altamente conservate, specifiche degli enterovirus umani e suini, in corri- spondenza verticals. Le colonne sono costituite da 10 basi allineate. All'interno delle colonne ci sono degli spazi o gap indicati con del puntini, per migliorare gli appaiamen- ti. La visualizzazione grafica 6 riportata in Fig. 1. Le sequenze dei primer usati per 1'amplificazione degli enterovirus sono riportate in cima all'allineamento, in corri- spondenza delle sequenze omologhe. I siti BamHI ed HindiII sono stati introdotti alterando lievemente la sequenza.

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24(1) cxa24cg(2) pol21an(3) pol2cgl(4) pi3137(5) pip03xx(6) polio la(7) poll(8) polios 1(9) cxa21(10) ev70cg(11) ecl2tcg(12) picoxb4(13) cxMs(14) cxa9(15) cxal6(16) cxblg(17) cxb3cg(18) cxb5cga(19) svdmps(20) pisvdv(21) svdg(22) hrv(23) bevvg527(24) hpa(25) echo22(26) fmdvalf(27) emcdcg(28) emcbcg(29) tmecg

Figure 1. Dendrogramma: rapport! filogenetici degli enterovirus nella regione del 5' non tradotto (NC). L 1allinea- mento con Pileup (GCG) delle sequenze comparate, e stato successivamente graficato con Kitsch (Phylip). II signifi- cato evolutive 6 discusso nel testo.

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Tabella 4 - Regions genomica (posizione delle basi) delle sequenze confrontate nel dendrogramma di Fig. 1

SIMB0L0 REGIONS Referenze

1) cxa24cg. 1-740 Virus Genes 6: 149-158 (1992)2) pol21an. 1-747 J. Virol. 57: 515-525 (1986)3) pol2cgl. 1-747 J. Gen. Virol. 71: 43-52 (1990)4) pi3137. 1-742 PNAS 81: 1539-1543(1984)5) pip03xx. 1-746 J. Gen. Virol. 67: 2093-2102 (1986)6) poliola. 1-740 PNAS 78: 4887-4891 (1981)7) poll. 1-742 Nature 291:547-553 (1981).8) poliosl. 1-742 PNAS 79: 5793-5797 (1982)9) cxa21. 1-711 J. Gen. Virol. 70: 2943-2952 (1989)10) ev70cg. 1-726 J. Gen. Virol. 71: 2291-2299 (1990)11) eel2teg. 1-741 X77708, Kraus W., et al Unpublished12) picoxb4. 1-743 J. Gen. Virol. 68: 1835-1848 (1987)13) cxb4s. 1-743 J. Gen. Virol. 68: 1835-1848 (1987)14) cxa9. 1-743 J. Gen. Virol. 70: 3269-3280(1989)15) cxal6. 1-750 U05876, Poyry T. et al., Unpublished16) cxblg. 1-741 Virology 156: 64-73 (1987)17) cxb3cg. 1-741 J. Virol. 64: 1573-1583 (1990)18) cxbScga. 1-743 J. Gen. Virol. 74: 845-853 (1993)19) svdmps. 1-743 Nucleic Acids Res. 21: 3896-3896 (1993)20) pisvdv. 1-742 Virus Res. 16, 255-274 (1990)21) svdg. 1-742 J. Gen. Virol. 70: 919-934 (1989)22) hrv. 1-628 Nucleic Acids Res. 12:7859-7875(1984)23) bewg527. 1-818 J. Gen. Virol. 69: 253-263 (1988)24) hpa. 1-734 J. Virol. 61: 50-59 (1987)25) echo22. 1-709 PNAS 89:8847-8851 (1992)26) fmdvalf. 1-712 X74812, Sosnovtsev,S.V. Unpublished27) emcdcg. 1-828 Virology 170: 282-287 (1989)28) emebeg. 1-826 Virology 170: 282-287 (1989)29) tmecg. 1-1065 Virology 164: 245-255 (1988)Abbreviaxioni: (1) cxa24cg. Coxsackievirus A24: (2) pol21an, poliovirus type 2. (Lancing strain): (3) pol2cgl, Poliovirus type 2 (strain W-2); (4) pi3137„ Poliovirus P3/Leon/37 (type 3); (5) pip03xx. Poliovirus type 3 strain 23127) (6) poliola. poliovirus type 1 (Mahoney strain): (7) poll, Poliovirus type 1 (Mahoney strain): (8) pollosl, poliovirus, strain Sabin 1: (9) cxa21. Coxsackievirus A21: : (10) ev70cg. Entervirus type 70: (11) ecl2tcg. Echovirus type 12. prototype Travis, Unpublished; (12) picoxb4. Coxsackievirus B4: (13) cxb4s. Coxsackievirus B4: (14) cxa9, coxsackievirus A-9; (15) cxal6. Coxsackievirus A16; 16) cxblg. Coxsackievirus Bl; (17) cxb3cg. Coxsackievirus B3: (18) cxbScga. Coxsackievirus B5: (19) svdmps, Swine vesicular disease virus; (20) pisvdv. Swine vesicular disease virus; (21) svdg., Swine vesicular disease virus genome; (22) hrv. human rhinovirus: (23) bewg527, bovine enterovirus (strain VO-5-27); (24) hpa. Hepatitis A virus (wild-type): (25) echo22. echovirus 22 EV22, Harris: (26) fmdval£. foot and mouth disease virus A: (27) emcdcg. encephalomyocardititis virus (strain EMC-D): (28) eocbcg, encephalomyocardititis virus (strainEMC-B); (29) tmecg. Theiler murine encephalomyelitis virus;

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mit& 5' del genome virale (5’NC). II slgnlficato delle varie sigle, i tratti comparati ed i riferimenti bibliogra- ficisono riportati in Tab. 4. La comparazione mediante programma Pileup del GCG (Genetic Computer Group) produce un file di allineamento multiple ed una matrice di distan- zegenetiche relative. La visualizzazione ad albero A stata ottenuta mediante il programma Kitsch del pacchetto PHYLIP (Phylogenetic Inference Programme).

L'albero filogenetico riportato in Fig. 1 schematizza le distanze genetiche di vari Picornavirus nella regione non tradotta. La lunghezza del bracci dai nodi di divergenza dal1'ancestore e indicative, ma non esattamente proper zionale, della omologia delle sequenze appaiate. I vari raggruppamenti detti "cluster" costituiscono gruppi di virus strutturalmente simili. Come e possibile verificare si possono distinguere gruppi di virus umani (cluster) comprendenti i poliovirus [gruppo 2-8], non-poliovirus [gruppo 9-18], 1'epatite [24], 1'echovirus 22 [25], o virus del bestiame appartenenti agli aftovirus [27] o virus murini appartenenti ai cardiovirus [gruppo 27-29]. Collocate tra i non-poliovirus umani 6 il cluster dei virus della malattia vescicolare dei suini [19-21]; si e ipotizzato, sulla base delle omologie genetiche, che esso si sia evoluto dal coxsackievirus B5 umano [18]. E' da sottolineare che 1'evoluzione parallela negli uomini e nei suini di enterovirus, abbia generate in entrambi malattie sia sintomatiche che asintomatiche. Gli enterovirus bovini [23] sembra che si siano evoluti da un ancestrale comune ai rinovirus [22] ed enterovirus umani e suini [gruppo 1-21]. La divergenza relativamente recente tra enterovirus umani [gruppo 1-18] e rinovirus [22] trova riscontro nel fatto che entrambi sono associati a malattie di tipo respiratorio in modo secondario o prevalente. Le enormi differenze strutturali fra il virus dell1epatite A [24] 11echovirus 22 [5] ed enterovirus, indicano una loro divergenza remota. Questa differenza pud essere riflessa nell'efficienza con cui il genoma virale agisce come messaggero nella traduzione in vitro. Infatti, alcune caratteristiche di crescita sulle cellule dell'epatite A [24] e dell1echovirus 22 [5] sono completamente diverse dagli enterovirus: l'HAV e l'echovirus-22, anche se con diverse intensity, non inibiscono completamente la sintesi proteica dell’ospite. Il dendro-

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gramma in Fig. 1 in funzione dei parametri adottati, pud dare risultati divers! ed 6 spesso difficile stabilire la rappresentazione piu vicina alia realty.

1. 8. Acque destinate al consume umano: il rischio virale.

La potabilizzazione dell1acqua non e 1'equivalente della sua sterilizzazione. Infatti, le acque non possono essere trattate in modo tale da rimuovere completamente i microrganismi in essa present!. Quindi, sebbene si tenda ad ottenere acque con un livello minimo di patogeni, occorre tentare di stimare il rischio derivante da una loro proba- bile persistenza nell'ambiente idrico.

La capacity di un virus di contaminare un1acqua 6 la risultante di vari fattori costituiti principalmente dal la carica complessiva immessa nell1ambiente acquatico attraverso i liquami, dalla sua capacity di sopravvivenza e dalla carica virucida naturale della matrice ambientale. I fattori che contribuiscono maggiormente alia stability dei virus nell*ambiente sono il pH neutro, la bassa temperature e la presenza di materiale organico particellato.

In misura approssimata possiamo considerare che la valutazione globale del rischio virale 6 la risultante della durata e del tipo di esposizione ed infine del rapporto dose/effetto,

Occorre quindi valutare la quality e quantity dell'acqua ingerita e la durata dell'esposizione. La quality dell1acqua dipende dall1efficienza del sistema di trattamento e disinfezione che deve, ovviamente, tener conto dei rischi tossicologici. La US EPA generalmente impiega 2 litri/persona-giorno come parametro standard di stima dell'esposizione all'acqua da here. Per la durata dell'esposizione si tiene conto di vari fattori tra cui la concentrazione dei virus, la loro sopravvivenza nell'ambiente acquatico (Tab. 5), la dose minima infettante, la possibility di infezioni multiple, 1'immunity acquisita, (es. in eta infantile), l'eta, la dipendenza stagionale.

Il rischio annuale di contrarre infezioni da enterovirus assumendo un consume medio giornaliero di 2 litri di acqua 6 negli USA: poliovirus-1 1,49/100, poliovirus-3 3,1/100 echovirus-12 1,7/100 (Bull 1990). Alcuni AA. hanno stimato

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tali rischi studiando 11 decorso di un'infezione in sogget- ti volontari inoculati con tipici virus (Bull 1990, Haas 1993, Schiff 1984). Studi sulla dose infettante minima dell1echovirus 12 (ingestione di 100 ml di acqua non clorata contenente 330.000 pfu) hanno dimostrato che la HID50, cio6 la dose minima richiesta per infettare il 50% di volontari sani (149 adulti sani) era di 919 PFU e per una persona la dose minima infettante derivante da calcoli statistic! era di 17 pfu; da sottolineare, inoltre, che non vi erano state significative differenze fra i volontari con presenza di anticorpi nel siero e quelli privi; cid signified che una precedente infezione con lo stesso virus non procure una lunga protezione contro la reinfezione. E' stato stimato che il rischio di contrarre un’infezione da echovirus 6, in seguito ad un'assunzione giornaliera di circa 2 litri di un’acqua contenente 1 particella infettante in 1000 litri, e di 10"3 persone/anno e di 10'1 persone/durata esistenza di un individuo (70 anni). Per quanto riguarda la mortalita, la stima 6 5,8xl0"6 /anno e di 8x10" 5/vita media. Per quanto riguarda I'epatite A invece, il rischio annuale e di 7xl0"3 per il consumo di 2 litri/giorno di un’acqua contenente 1 virus in 10 1, 5xl0"3 per 100 1, di 8xl0"4 per 1 virus in 1000 1, di 8xl0"6 per 1 virus in 10.0000 1 (Bull 1990). Secondo uno studio fatto hell'area di Montreal (Haas 1993), la dose di 0.0006 virus/1 riscontrata nell1acqua porterebbe ad un rischio di 0.24 persona/ anno, cioe equivalents ad un rischio 0.00082 persona/giorno. La mortalita potenziale sarebbe di 3.2xl0"8 -1.9x10* che in un vita media di 70 anni equivarrebbe a 0.008-0.047, cioe 1 persona su 20 rischia di morire per infezioni contratte con 1*acqua da bere.

Secondo un rapporto elaborate dal " Virginia Polytechnic Institute" (Craun 1992), le epidemie causate da patogeni enteric! (291 su 1702) negli USA dal 1981 al 1990 erano dovute per il 33% a sistemi di approwigionamento privati, 43% acqua di rete, 14% ingestions di acqua di balneazione contaminate e 10% piscine private. In tutti quest! casi la ragione principals era la mancanza o 1’inadeguatezza del sistema di disinfezione usato.

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1. 9. Acque destinate alia balneazione: il rischio virale.

La valutazipne del rischio virale in acque di balneazione A estremamemte difficile da effettuare e probabilmente lo studio di cohort! A la via piu indicata. Fra i fattori da considerare, vi sono il volume totale di acqua con il quale si viene a contatto durante la balneazione, la durata totale della stessa e lo stress fisico. I primi dati riguardano le infezioni da enterovirus ed adenovirus fra i frequentatori di piscine risultate non sufficientemente trattate con il cloro (D'Angelo 1979) e di quelle aventi i livelli raccomandati di cloro (Mahnel 1977). La correlazione acqua-infezioni in quest! casi A stata relativamente facile da dimostrare. Per 1'acqua di mare studi epidemiologic! su bambini da 1 a 15 anni di etA (D'Alessio 1981) hanno verificato che il rischio di contrarre infezioni da enterovirus A piu alto tra quelli esposti maggiormente all'acqua di mare. Attraverso lo studio di una coorte di bagnanti, (Alexander 1992) in uno studio retrospettivo condotto su "Blackpool Beach" vicino Londra e riguardante bambini di etA compresa tra i 6 e gli 11 anni di etA, A stato trovato che sintomi tipo vomito, diarrea, dermatiti o febbri erano piu frequenti in bambini che erano stati piu a contatto con 1' acqua (risultata contaminata batteriologi- camente e virologicamente). In uno studio di coorte condotto di recente in Francia su militari (circa 24 anni di etA media) che si addestravano da palombaro (Garin 1994), A stato visto che in 49 ore di esposizione all1acqua non vi era differenza nel rischio di contrarre infezioni tra gli allievi tuffatori e i controlli. E' da sottolineare, comunque, che tra i primi A stata trovata un'alta percentuale di coxsackievirus B4 e B5 sieropositivitA.

1. 10. Aspetti normative riguardanti il controllo della qualitA delle acque in Italia. Il

Il DPR 24 maggio 1988, n236 - Rttuazione della direttiva CEE n. 80/778 concernente la quality delle acque destinate al consumo innano, ax sensi dell'art. 15 della legge 16 aprile 1987, n. 183 - stabilisce in "Awertenza e note" che in alcuni casi relativi a particolari situazioni idrogeolo-

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giche o ad interferenze con insediamenti urban! e necessario tenere sotto controllo alcuni parametri non previsti nell*allegato "Parametri microbiologici" ma che possono costituire fattori di rischio per la popolazione. La ricerca del parametri in questione potra essere effettuata, a giudizio dell'autorita sanitaria competente, mediante metodiche predisposte dall1Istituto Superiore di Sanita. Precise, inoltre, che gli enterovirus devono essere costan- temente assent! nelle acque potabili oltre naturalmente ai batteriofagi anti E.coli, enterobatteri patogeni e gli stafilococchi patogeni.

Piu precise sono le normative riguardanti la balneazione che indicano il valore soglia necessario per emettere un giudizio di balneabilita relative ad una spiag- gia.

II DPR 8 giugno 1982, n.470, concernente l’attuazione della direttiva CEE n. 76/160, relative alia qualita delle acque di balneazione" stabilisce, nella voce llbis dell'Allegato 1, il valore limite di 0 PFU di enterovirus per 10 1 di acqua e lo conferma nel successive DPR 14 maggio 1988, n. 155, coordinate con la legge di conversions 15 luglio, n. 271 recante modifiche al precedents DPR.

Il quadro complesso della problematics e l'esigenza di ottemperare alle normative vigenti, ci hanno portato a sperimentare una nuova strategia diagnostics che e illustrate schematicamente nel capitolo seguente per finalita esclusivamente didattiche; cid nonostante si A cercato di dare, senza cadere nella banalitd, tutte le indicazioni tecniche e bibliografiche necessarie per la riproducibilitd del metodo.

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2. LA PCR IN MICROBIOLOGIA AMBIENTALE: APPLICAZIONE ALL’IDENTIFICAZIONE DEGLI ENTEROVIRUS NELL'ACQUA.

2. 1. Generality.

La "polymerase chain reaction" (PCR) 6 la sintesi enzimatica di un segmento di DNA fiancheggiato da due region! aventi sequenza nota.

La DNA-polimerasi utilizzata nella PCR 6 chiamata con un acronimo "Tag" dal nome del bacillo termofilo Thermus acquaticus da cui e estratto. La scoperta di questo enzima, avvenuta nel 1976 (Sambrook 1989) ha dato seguito ad enormi progress! tecnologici nell'ambito della biologia molecolare di base ed in tutti i campi applicativi. La PCR fu usata per la prima volta nel 1985 per la diagnosi della p-talassemia (Saiki 1985) ed & attualmente uno strumento importante nella ricerca di base ed in molte different! applicazioni cliniche, come per es. la ricerca del virus dell’HIV e del citomegalovirus. Altre important! applicazioni della PCR, in aggiunta a quelle citate precedentemente nel corso della rassegna, riguardano la tipizzazione di E. coli (Knigth 1991), Legionella pneumophila (Bej 1991) , Vibrio vulnificus (Brauns 1991) e di batter! patogeni, non coltivabili, nell’acqua (es. Aeromonas) (Reiman 1993).

La parte strategicamente piu importante di questa tecnologia 6 la progettazione delle sequenze degli oligonucleo- tidi necessari per 1'amplificazione del bersaglio. Lo studio della sequenza nucleotidica della regions genomica comprendente il bersaglio e le sue relazioni genetiche inter- e intra-specifiche, sono fondamentali. Nel paragrafo 1. 7. e stato illustrate, per la prima volta, come si 6 proceduto alia progettazione del primer che stiamo usando da diversi anni per 1'identificazione degli enterovirus nell'acqua.

2. 2. Concetti di base della metodica RT-PCR applicata all1identificazione degli enterovirus

Gli enterovirus hanno un genoma costituito da RNA mono- catenario per cui la PCR non si pud applicare direttamente su questa molecola, ma su una copia di DNA ad essa comple-

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mentare (cDNA). Quindi per questo motive 1'amplificazione di DNA generate da trascrizione inversa di RNA viene chiamata PCR-inversa ed indicate generalmente RT-PCR, acronimo di Reverse Transcribed-PCR.

La trascrizione inversa dell'RNA si effettua mediante 1' use di un enzima virale detto appunto "Trascrittasi inversa" (Fig. 2). Esso e una DNA polimerasi che ha bisogno di uno stampo ssRNA (ss=singolo filamento) e di un piccolo frammento di DNA sintetico, detto primer , complementare ad un tratto prestabilito dell'RNA, che ibridando con esso produce una zona a doppio filamento DNA/RNA; in tal modo si innesca la reazione di sintesi di un filamento di DNA in direzione 5'->3', catalizzata dall'enzima stesso, che tra- scrive 1' RNA procedendo in direzione inversa, cioe 3 '->5'. La miscela di reazione (20 pi), contenente RNA, primer, deossinucleotidi, sail vari e tampone A generalmente condotta a 42°C per 30-45' seguita da un riscaldamento a 95* C per 5' per denaturare 1'enzima. La trascrizione dell'informazione RNA -» DNA produce un singolo filamento di DNA che va dalla fine della regione bersaglio (estremita 3', indicate con V in figura) fino all1estremita 5* dello stampo. La quantity di queste catene dipende da quanto RNA viene utilizzato per questa reazione. Esiste attualmente in commercio un enzima DNA polimerasi ricombinante (rTth= recombinant Thermus thermophilus DNA polymerase) con propriety di trascrittasi inversa e di polimerasi, cioe permette di eseguire in un'unica miscela di reazione, sia la trascrizione che 1'amplificazione del DNA.La reazione di polimerizzazione a catena, detta PCR (polymerase chain reaction) si ottiene aggiungendo alia miscela della precedente reazione, fino ad un volume finale di 100 pi, 1'enzima Tag polimerasi , i necessari tamponi e reagent! ed il primer fiancheggiante l'inizio della regione bersaglio (estremita 5' indicate con V in figura ), detto tecnicamente primer a monte (upstream). II primer a valle (downstream), non si riaggiunge in quanto presente in eccesso nella precedente reazione di trascrizione. Lo schema delle reazioni e riportato in Fig. 3. All'inizio del 1° Ciclo, le strutture secondarie del DNA e degli ibridi RNA/DNA eventualmente present! vengono eliminate scaldando la miscela di reazione a 95° C. Poi raffreddando rapidamente (pochi second!) si permette 1'ibridazione (annealing)

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del primer all1inizio del bersaglio (1° riquadro del 1° ciclo). La soluzione si riscalda rapidamente fine alia temperature prestabilita (55-60°C) per la reazione di estensione enzimatica del primer. Essa 6 catalizzata dalla Taq polimerasi che si attacca preferenzialmente alia zona ove il DNA e a doppio filamento, polimerizza rapidamente i deossinucleotidi attaccandoli ad uno ad uno al primer in direzione 5' -» 3’ usando la catena piu lunga come stampo. Questo enzima resiste ad estese incubazioni a 95° C e raggiunge il suo optimum di attivitA intorno ai 720 C. In genere non si raggiunge mai questo valore, poiche i primer tendono a staccarsi dallo stampo e la reazione si blocca.

Nel 2° ciclo di amplificazione sono in gioco due filament!. Essi si denaturano a 95° C, poi si rinaturano abbas- sando rapidamente la temperatura fino a 42° C. A questa temperatura si ha 1'ibridazione del primer con i singoli filament! complementari di DNA. La rinaturazione dei filament! parental! di DNA, A sfavorita dall’eccesso dei primer . Nella seconda reazione entrambi i primer vengono estesi. Nel 3° ciclo sono present! quattro singoli filamen- ti che diventano 8 dopo amplif icazione; nel 4° ciclo gli 8 filament! diventano 16 e cosi via di seguito. Poiche ad ogni ciclo 1'enzima perde parte della sua attivitA, si precede generalmente fino ad un massimo di 30-35 cicli. Quando occorre aumentare la resa, si aggiunge alia miscela di reazione un'altra aliquota di enzima fresco. La quantity del prodotto finale nella RT-PCR A il risultato di una amplificazione geometrica (2, 4, 8, 16, 32, 64...2n] del tratto compreso tra i due primer. E' possibile partendo da 10~6 pg di DNA ottenere da 0,5 a 1 pg di target DNA lungo fino a 2 kb (Sambrook 1989). Il nostro test di "routine" nel 5' NC parte da RNA estratto da un lisato avente 10*5 TClDso particelle viral! e produce circa 3 pg di cDNA lungo 170 bp in 100 pi di miscela di reazione (Muscillo 1995b). Lo stesso test si sta applicando, in via sperimentale, a sedimenti di virus concentrati da acque superficial!.

2. 3. Visualizzazione del prodotto della PCR su gel d’agarosio.

Alla fine della reazione, la verifica dell'awenuta

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t> e'T'SCX.Qf f to

5’ Vfine

V 3’ RM

TRASCRITTASI INVERSA ▼

primer a valle

42° CV V

DENATURAZIONE 95° C

5' v v 3 mcDNA

3’ 5’

Figura 2. Trascrizione inversa dell'RNA. II primer a valle (< ) cioe quello fiancheggiante la fine della regione da amplificare, ibrida con la molecola di RNA, poi per opera dell'enzima TRASCRITTASI INVERSA, si estende sullo stampo fino all'estremita 5' della molecola. II riscaldamento della soluzione a 95°C denatura 11enzima e separa i due filament! complementer! DNA/RNA.

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a) t>eirscv£f Ixo

firu

3* 5- l filament© cDNAb) «

►c) v/ 5’ 3'

3* 5* 3' S'

ffilamento cDNA

CL) DEN A TURAZIONE 6) IBRIDAZIONE

► primer a monte ESTENSIONE < primer a valle

Figure 3. Cicli della PCR. Nel 1° ciclo solo il primer a monte ( ► ), cio6 quello fiancheggiante l'inizio della regions bersaglio viene esteso. Dal 2° ciclo in poi vengono estesi entrambi i primer (<, ►). A1 3° ciclo il numero di catene sintetizzate totals e di 23.Dopo n cicli avremo 2n singoli filament! di cDNA.

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amplificazione, si ottiene tramite la visualizzazione del cDNA prodotto dalla reazione. A tale scope, si sottopone un'aliquota della miscela di reazione (20-40 pi) ad una separazione elettroforetica in gel d'agarosio al 2% in tampone lx TBE (TBE lx = Tris-borate 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8), in presenza di 0,5 pg/ml di bromuro d'etidio. La corsa elettroforetica viene eseguita paralleiamente ad un marker di pesi molecolari (Muscillo 1994c, 1995b) per poter indi- viduare la banda corrispondente alia regione amplificata. II sistema da noi ottimizzato per 1'identificazione degli enterovirus consents 1'amplificazione di un tratto del genoma virale situato nel 5' non tradotto lungo 167 bp. Nel gel la banda si posiziona tra i frammenti 201-154 del marker IK DNA Ladder (GibcoBRL). II gel illuminate per trasparenza a 312 nm (Spectroline, Spectronics Corp., New York) si fotografa con macchina Polaroid CU-5. La presenza della banda prevista 6 indicativa di presenza di enterovirus (Tab. 5). La miscela di reazione rimasta e sufficients per effettuare 11analisi delle sequenze dell'amplicone. La procedure, fino a questo punto, e attuabile a livello di operator! periferici.

2. 4. Clonaggio e sequenziamento dell'amplicone.

II cDNA da analizzare pud essere estratto direttamente dal gel d'agarosio contenente la banda. In genere e molto comodo effettuare questa operazione subito dopo la corsa elettroforetica, durante 1'osservazione agli UV. La porzio- ne di gel contenente la banda viene ritagliata e trasferita in una provettina. Esistono varie possibility per l’estra- zione e purificazione del cDNA bloccato nell'agar ed attualmente esiste una vasta gamma di valid! kit commercial!.

II cDNA prodotto dalla PCR pud essere clonato in vari modi. In Fig. 4, e riportato uno schema dettagliato della nostra procedure di routine. I primer contengono un sito di restrizione ciascuno, ma diversi 1'uno dall'altro. L'amplicone viene digerito con i corrispondenti enzimi di restrizione (nel nostro test Bamffl e HindiII) i quali generano un DNA con le due estremitd "appiccicose", cioe contenenti ciascuno un breve tratto a singolo filamento (5 basi). Poichd essi non sono complementari tra di loro, il DNA non

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pud chiudersi su se stesso. Parallelamente si effettua la stessa procedura sul vettore plasmidico (digestions con BamHI e Hindi11). II plasmide scelto per l'operazione possiede una regions sintetica (polylinker) con una serie di siti di restrizione unici, clod non present! nel rima- nente della molecola plasmidica. L'enzima DNA-ligase permette 1'inserimento dell'amplicone nel taglio operate nel plasmide generando un plasmide ricombinante. II plasmide viene amplifiesto trasformando cellule batteriche competen- ti. I cloni recanti il plasmide ricombinante vengono propa- gati in brodo di coltura, quindi si estrae il DNA plasmidico da una opportune aliquota di pellet batterico (miniprep). Il clonaggio dell'amplicone presents numerosi vantaggi: 1) potenzia 1'amplificazione gi& operata dalla PCR, aumentando considerevolmente la sensibility del saggio; 2) permette di separare ed identificare miscele di ampliconi che si generano quando nel campione di partenza coesistono piu ceppi virali amplificabili con la stessa coppia di primer 3) consents di create librerie di DNA ricombinante relative a ciascun campione analizzato.Il DNA preparato viene sottoposto ad analisi delle sequen-

ze nucleotidiche.Se il DNA da clonare presents al suo interno siti di re-

strizioni BamHI e HindIII, la digestions con quest! enzimi produrrd ulterior! tagli all'interno della molecola rendendo difficile il clonaggio dell'intero amplicone. In tal caso sarebbe preferibile ricorrere ad altri sistemi di clonaggio (Sureclone ligation kit, Pharmacia, Svezia; TA cloning kit, Invitrogen Corp. San Diego, CA). In molte applicazioni della PCR, si ricorre al sequenziamento diret- to dell'amplicone evitando il clonaggio. La formazione spontanea e frequents di strutture secondarie all'interno del DNA lineare, spesso ostacola il sequenziamento effet- tuato in tal modo, rendendo difficile 1'identificazione del frammento. Una procedura che permette di ovviare a quests difficolta, messa a punto in passato (Muscillo 1995b), si awale dell1uso di palline magnetiche (Dynabeads, Dynal AS, Oslo, Norvegia). In essa si utilizza un primer a valle biotinilato in 5', per cui 1’amplicone generate dalla PCR ha il filamento antisense (cio6 quello la cui sequenza 6 complementare all'RNA) marcato con biotina. Dopo la reazione PCR, si rimuove 11eccesso di reagent! ed alia solu-

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cDNAED---------- CD

1DIGESTIONSENZIMATICA

EcoRISacIKpnlAvalSmalBamHIXbalSailAccIHindiPstlSphIHindll!

T7

1=£>

ligasi+ ATP

Figura 4. Clonaggio direzionale del prodotto della PCR in un vettore plasmidico (pGEM-4z). La digestione enzimatica del DNA e del plasmide preparano le estremitd 5 ’ e 3' complementari. La reazione di clonaggio permette 1'inserimento del DNA nel plasmide (riquadro in basso in grassetto).

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zione di DNA si aggiungono delle palline magnetiche rive- stite di streptavidina le quail legano fortemente il DNA biotinilato. Si denature il DNA in mode da separare i due filament!, quindi mediante un magnete si pellettano le palline e si scarta il sovranatante contenente il filamento di DNA non biotinilato. Soltanto il filamento antisense, biotinilato, rimane attaccato alle palline pronto per essere sequenziato. La presenza di zone di compressione in molti enterovirus (es. la maggior parte del non-poliovirus) richiede spesso l'uso di analoghi delle basi (es. 7 deaza- dGTP e 7 deaza-dATP).

La metodica RT-PCR, a specificity di gruppo, da noi routinariamente utilizzata per la ricerca degli enterovirus, 6 stata testata su numerosi ceppi di riferimento internazionali (Tab. 5) positivi (polio 1-3, coxsackie-B 1-6, coxsackie-A 3,7,9,10, echovirus 1-12), negativi (epatite A e reovirus), vari ceppi ambientali isolati da acque del Mare Tirreno (Aulicino 1992, Muscillo 1994a), Mare Adriatico (manoscritto in preparazione), alcuni enterovirus suini e virus della malattia vescicolare dei suini (vedi nota in calce alia Tab. 5).

2. 5. Analisi filogenetiche: vantaggi e limit!.

A causa dell’enorme eterogeneitA della popolazione virale potenzialmente presente in un campione ambientale, 6 difficile talvolta arrivare all'esatta identificazione di un sierotipo in esame. Sulla base della nostra esperienza in materia, uno dei metodi piu raffinati 6 la ricerca di omologie e identity tra le sequenze genomiche dei campion! e quelle contenute nelle banche dati. A tale scopo si utilizzano programmi specializzati (es. GCG, Intelligene- tics, Phylip, GLORIA ecc.) montati su computer molto efficient! (es Sun Spark station). I risultati ottenuti sotto forma di dendrogrammi, cioe raggruppamenti di membri omologhi, visualizzano la relazione genetica tra virus in esame (Fig. 1) e virus di riferimento.

Nell'ambito della nostra problematic# 1'accuratezza dell’analisi filogenetica 6 funzione del grado di specificity della reazione di amplificazione. Per esempio, una PCR condotta nel 5'NC degli enterovirus amplifies tratti poco

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Tabella 5. - Saggio RT-PCR per 1'identificazione degli enterovirus . E1 un metodo a specificity di gruppo messo a punto recentemente (Muscillo 1995b). I dati riportati in questa tabella, ottenuti utilizzando numerosi virus di riferimento internazionali, sono una ulteriore verifies sperimentale della potenziality del metodo. Tutte le reazioni positive sono state confermate mediante analisi delle sequenze nucleotidiche del prodotto di amplificazione clonato.

Virus tipo VR-ATCC ceppo risultato

COXSACKIEVIRUS A2 162 FI +3 163 J.Ol +7 319 AB-IV +9 186 p.b.(Bozek) +9 1311 Griggs +10 168 M.K. (Kovalik) +11 169 Belgium 1 ♦

COXSACKIEVIRUS B1 28 Conn-5 +1 687 HA. 201468 +2 29 Ohio-1 ♦3 30 Nancy ♦4 184 J.V.B. ♦5 1036 Faulkner *6 155 Schmidt +

ECHOVIRUS1 1038 Faraouk +2 32,froz. Cornelia +3 33 Morrisey +4 34 froz. Pesascek +5 35 froz. Noyce6 36 froz. D'Amori +7 37 Wallace +8 38 Bryson +9 1050 Hill +ii 1052 Gregory ♦12 42 Travis +

ENTEROVIRUS 68 561 Fermon *

POLIOVIRUS1 - Sabin +1 - Mahoney +1 58 Brunhilde ♦2 1003 P-712 ♦2 301 W-2 *3 62 Leon ♦3 300 WM-3 *

EPATITE A2089 HM 175 -2091 HM 175 -

RBOVIRUS1 230 Lang -

ENTEROVIRUS SUINI* *MALATTIA VESCICOLARE SUINI** +

* Ceppi aelvaggi gentilmente messi a disposizione dall'Istituto Zooprofilattice Sperimentale di Brescia:

** RNA gentilmente foraito dall'Istituto Zooprofilattice Sperimentale di Brescia.

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dissimili tra loro. In tale caso la diagnosi A accurata per 1'identlficazione e differenziazione del poliovirus, mentre relativamente ai non-poliovirus A possibile soltanto stabilire il loro gruppo di appartenenza (cluster). Cid dipende dal fatto che i non-polio sono numerosissimi e poco differenziati nel 5'NC. Al contrario, l'analisi filogenetica di tratti genomici derivanti dall1amplificazione di region! specifiche di un determinate virus (es. region! del capside VP1, VP3, VP4 ecc.), A altamente accurata.

Invece, 1’identificazione filogenetica di specie virali aventi minore tendenza a produrre variant!, es. virus dell1epatite A, A altamente accurata qualunque regione si scelga per 1'amplificazione.

2. 6. Considerazioni sulla attendibilitA delle analisi virologiche dell'acqua con o senza l’uso delle colture cellular!.

Esistono due strategic per 1'identificazione del virus nell'acqua:1) uso di colture cellular!: 1'acqua viene prima filtrata mediante dispositivi a membrana (Berman 1980, Divizia 1989b, Aulicino 1994, Garin 1994, Ma 1994a, Paul 1991, Sobsey 1979, 1980, 1984), per ottenere una sospensione concentrata di particelle, poi inoculata su una o piu linee cellular!; se present!, la maggior parte degli enterovirus provoca la comparsa del cosiddetto CPE (Dahling 1986), cioA un effetto citopatico (sfaldamento di lembi di cellule) che testimonia 1' avvenuta infezione del tappeto cellulare. Generalmente si eseguono almeno altre due subcolture per essere certi che tale effetto sia dovuto alia presenza di virus e non ad un semplice effetto tossico di altri contaminant! dell'acqua. Le particelle virali in queste matrici possono essere identificate mediante tecniche tradizionali (sierologia, microscopia elettronica) o mediante PCR. Ma mentre la crescita sulle cellule A un sicuro indice di infettivitA delle particelle isolate, non sempre A vero il contrario, nel senso che esistono virus capaci di dare infezioni persistent! (PI) croniche senza evidente CPE sulle cellule, come succede talvolta per alcuni enterovirus umani responsabili di meningiti asettiche (Calvez 1993,

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Leparc 1994, Muir 1994, Rotbart 1990c, 1995, Sawyer 1994) e quasi sempre in presenza di reovirus (Fenger 1991) e di epatite A virus (FrOsner 1991). In tutti quest! casi i virus si replicano senza distruggere 1'ospite. Sia fattori virali che cellular! sono implicati nel fenomeno. Per esempio e state dimostrato nei reovirus che le proteine espresse dai geni SI ed S4, cioe ol e a3 rispettivamente, giocano un ruolo fondamentale nel mantenere una infezione persistente. Queste proteine sono indispensabili per inibi- re la sintesi di DNA, RNA e delle proteine dell’ospite. Mutazioni nei segmenti SI ed S4 dimostrate in virus isolati in PI probabilmente diminuiscono 1'attivitA inibitoria di ol e o3, permettendo cosi alle cellule di sopravvivere, riprodursi e sopportare una limitata replicazione virale. La presenza di virus in cellule PI e dimostrabile soltanto con la RT-PCR per gli enterovirus e mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide per quanto riguarda i soli reovirus. Per quanto riguarda il virus dell'epatite A, esso non d6 effetto citopatico e quindi e impossibile isolarlo sulla base di questa comoda osservazione, inoltre la contempora- nea presenza di enterovirus ne impedisce la replicazione sulle stesse cellule. L'HAV non da effetto citopatico in quanto 6 incapace di bloccare completamente la sintesi proteica dell'ospite. Probabilmente cid A dovuto alia formazione di particelle difettive durante la replicazione dell'RNA virale; esse rallentano la formazione di particelle virali infettive permettendo alia cellula di sopravvivere. Per isolare l'HAV su colture cellular!, prima dell'inoculo del concentrate, e necessario la preventive neutraliz- zazione, mediante antisieri, degli eventual! enterovirus present! (Divizia 1989a, 1989b). Molto spesso inoltre, la coinfezione casuale delle cellule con reovirus ed enterovirus pud ostacolare 1'amplificazione di quest1ultimi, crean- do seri problem! interpretativi. Vi sono quindi vari aspetti negativi, inaccettabili, in questa strategia;- lunghi tempi di attesa, dell'ordine di mesi,- discrete frequenza di falsi negativi e falsi positivi,- necessita di splittare il campione su diverse linee

cellular!;

e due aspetti, relativamente positivi:- conoscenza della infettivitA degli isolati, necessaria

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per la valutazione del rischio reale ma non dl quello potenziale;

- possibility di isolare grosse quantity di virus per studi e ricerche.

2) analisi diretta dell'acquaII perfezionamento di tecnologie diagnostiche basate

sulla RT-PCR ha reso oggi possibile 1'identificazione dei virus direttamente nel campione d'acqua. II vantaggio della RT-PCR in termini di sensibility e rapidity e dovuto essenzialmente alia sua capacity di identificare sequenze di acidi nucleic! appartenenti a particelle virali integre, indipendentemente dalla loro infettivity (Ma 1994b, Tsay 1995).

Questa capacity della tecnica pud dare una serie notevole di vantaggi tra cui essenzialmente:

- dati sulla presenza di virus nell'acqua in tempi ragionevoli, da 4 a 15 gg; quest! dati potrebbero essere molto utili nell'integrazione di quelli batteriologici;

possibility di identificare virus come 1' epatite A, il cui isolamento sulle cellule & alquanto difficile e costo- so, il Norwalk, 1'epatite E ed alcunl rotavirus per i quali non sono note finora adeguate tecniche di isolamento sulle cellule.

Sotto altri punti di vista, la sensibility della tecnica determine anche un relative svantaggio clod:

- 1'incapacity a distinguere tra particelle infettive e non, consente di stimare il rischio potenziale, non quello reale.

La giusta strategia 6 quindi soltanto una questions di priority. Infatti, la conoscenza in tempo utile anche dei soli rischi potenziali derivanti da una contaminazione fecale dell'acqua, consentirebbe di approntare idonee strategic d'intervento in difesa dell'ambiente e della salute dell'uomo.

CONCLUSION! E PROSPETTIVE FUTURE

Dali'analisi filogenetica di virus noti, 6 possibile ipotizzare che la comparsa nel corso degli anni di una

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vasta gamma di specie viral! sia stata la conseguenza di una serie di adattamenti di un lontano ancestore ad ospiti different! [topo> uomo> bue> uomo> bue> uomo> maiale>?]; questo fenomeno ha permesso la diffusione di virus "impa- rentati" in un immense serbatoio di uomini e animal! a cui si aggiunge l’ambiente acquatico, contenitore e fonte di ricircolo.

II rilevamento e 1'identificazione di virus enteric! in matrici di provenienza ambientale 6 estremamemte difficile. Tecniche diagnostiche molto sensibili basate sulla PCR e l'analisi delle sequenze genomiche dei prodotti generati dalla PCR offrono numerosi vantaggi :a) disponibilita di un sistema alternative di monitoraggio della fecalizzazione di un'acqua;b) tempi di attesa noteveImente ridotti rispetto alle tecniche tradizionali;c) possibility di identificare patogeni non coltivabili su sistemi cellular!;d) epidemiologia molecolare: il controllo dell1evoluzione di una particolare specie virale pud allarmare in tempo utile i sistemi di sorveglianza sanitaria per la prevenzione delle malattie infettive.e) possibility di arricchire con nuove sequenze le banche dati accessibili in rete contribuendo notevolmente a migliorare 1'accuratezza del sistema diagnostico.

Questa tecnologia potrebbe, in future, essere presa in considerazione per la predisposizione di protocolli operative adeguati studiati ad "hoc" per gli operator! periferici, con suddivisione di compiti geografici, con chiare gerarchie istituzionali e scientifiche, che consentano di utilizzare al meglio le risorse, intese in termini di personale, mezzi e competenze, di cui ogni addetto al settore dispone.

RINGRAZIAMENTI

I dati sperimentali relativi alia metodica RT-PCR, provengono da una ricerca parzialmente finanziata dalla convenzione MURST-ISS Prot. MURST 4/15.1-1 de!4/l/93, "Salvaguardia del Mare Adriatico", Progetto esecutivo ISS.

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