Department of Biomedical Sciences University of Padua
Biologia e biochimica della macchina mitocondriale
Rosario Rizzuto
4° Convegno Malattie Mitocondriali Tivoli, 23 maggio 2014
Peter D. Mitchell (1920-1992)
Nobel Prize in Chemistry 1978
Il funzionamento
Le proteine (ed i geni) della respirazione mitocondriale
42 (7 mt) 5 11 (1) 13 (3)
14 (2)
1. Una molteplicità di geni, su due genomi diversi
2. Una presentazione variabile (per organo/i coinvolti ed età di insorgenza)
3. Un ampio spettro di gravità e decorso
Mitochondrial disorders are a group of heterogeneous diseases,
commonly defined by a lack of cellular energy due to OXPHOS defects
Zeviani_Brain_2004_review
Mitochondrial Respiratory Chain
MELAS (Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stoke-like episodes)
Leigh syndrome LHON (Leber’s hereditary optic neuropathy)
MERRF (Myoclonic epilepsy and ragged red fibers)
NARP (Neurophaty, ataxia and retinitis pigmentosa)
CPEO (Chronic progressive external ophtalmoplegia)
KSS (Keans-Sayre syndrome)
Perché i difetti mitocondriali provocano morte cellulare e
disfunzione d’organo? (Dove risiede la specificità delle
diverse mutazioni?)
La disfunzione mitocondriale induce morte cellulare per necrosi o apoptosi
Crisi energetica
Quali segnali ricevono i mitocondri, e come li traducono?
Il Ca2+ è il più comune secondo messaggero delle cellule
Il sistema di accumulo del Ca2+ nei mitocondri
∆Ψ = -180mV
I contatti RE/mitocondri: sedi previlegiate della segnalazione cellulare
Il Ca2+ mitocondriale stimola il rilascio di cofattori dell’apoptosi
APOPTOSI
Ill Ca2+ mitocondriale regola il metabolismo
Il ruolo del Ca2+ nei mitocondri
Rizzuto_Nature Reviews_2012
I mitocondri regolano l’autofagia
Ca2+ mitocondriale ed autofagia: Un nuovo elemento nella patogenesi
delle malattie mitocondriali
Subject Date of
birth Familiarity
Complex I residual activity
Affected gene
Mutation Hetero-plasmy
Reference
Patient 13-12-1975 MELAS 60% ND5 13514A>G (D393G)
25-30% (Corona et al., 2001)
MELAS (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes)
Experimental model: skin primary fibroblasts derived from patient with point mutation in complex I subunit
Zeviani_Brain_2004_review
Mitochondrial Respiratory Chain
Patient
Brandt_Annu.Rev.Biochem:_2006
45 subunits, 7 encoded by mtDNA Structure of Complex I
0
5
10
15
20
25
30
35
40
[Ca2+
] mt u
M
control
cont…
0
5
10
15
20
25
30
35
40
[Ca2+
] mt u
M
patient 2
patie…
0
5
10
15
20
25
30
35
40
[Ca2+
] mt u
M
patient 1
patie…
Mutazioni diverse nello stesso complesso hanno effetti diversi sui livelli di calcio mitocondriale
Ca2+
I fibroblasti di pazienti mutati in ND5 hanno aumentata autofagia a riposo • Immunofluorescenza di LC3
Ctrl Pat
BA
SAL
ST
AR
VAT
ION
** ** **
0
5
10
15
20
25
30
35
voxe
ls
autophagosome volume Ctrl
Pat
**
**
**
0
20
40
60
80
Aver
age
n.ob
ject
s/ce
ll
puncta per cell Ctrl
Pat
starvation - - + +
starvation - - + +
0
Ctr
l Pa
t
BASALE DIGIUNO BASALE +
CLOROCHINA DIGIUNO +
CLOROCHINA
**
**
**
** **
** **
0
20
40
60
80
100
120
140
Aver
age
n.ob
ject
s/ce
ll
puncta per cell
CtrlPat
starvation - - + + - + - + chloroquine - - - - + + + +
**
**
**
** **
** **
0
10
20
30
40
50
60
70
voxe
ls
autophagosome volume
Ctrl
Pat
starvation - - + + - + - + chloroquine - - - - + + + +
L’aumento degli autofagosomi non è dovuto a blocco del flusso
Chloroquine = 50 µM in DMEM or starvation’s saline for 1h
LC3
p-AMPK
β-tub
AMPK
starvation - - + +
Ctrl Pat
**
**
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
a.u.
p-AMPK
starvation - - + +
Il meccanismo dipende dalla deprivazione energetica (AMPK)
p-Akt
β-tub
Akt
p-mTOR
mTOR
p-S6
S6
Ctrl Pat starvation - - + +
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
a.u.
p-mTOR
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
a.u.
p-S6
starvation - - + + starvation - - + +
n. exp = 3 ** P< 0.001
n. exp = 3
Starvation = serum and glucose deprivation for 4h
Qual’è il segnale?
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6[C
a2+] cy
t uM
Histamine
10 s 0
50
100
150
200
250
300
350
400
[Ca2+
] ER u
M
EGTA
Histamine Ca2+
5 s
0
10
20
30
40
50
60
[Ca2+
] mt u
M
Histamine
10 s
0
50
100
150
200
250
[Ca2+
] mt u
M
Ctrl
Pat
Ca2+ free
Ca2+
0.5 s
I mitocondri hanno un difetto nell’accumulo di calcio
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0
50
100
150
200
250
300
350
400
**
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
**
0
2
4
6
8
10
12
uM/s
speed
**
0
50
100
150
200
250
[Ca2+
] mt u
M
peak
Citoplasma Reticolo Endoplasmatico
Mitocondria
Mitocondri in cellule permeabilizzate
Difetto di accumulo mitocondriale del Ca2+
Morfologia
I contatti RE – mitocondri
Il canale (MCU)
I suoi regolatori
MICU1 MICU2 MCUR1 EMRE
∆Ψ = -180mV
Potenziale di membrana
Nessuna differenza nel potenziale o nella forma dei mitocondri
Ctrl Pat
O=oligomycin R=rotenone F=FCCP
Ctrl Pat
n. exp = 3
n. exp = 3 n.cells=60
MICU1
MCU
EMRE
MCUR1
MICU2
β-Tub
Ctrl Pat
n. exp = 3
Le proteine del complesso MCU
E’ cambiata la composizione molecolare dei sistemi di trasporto
Vi è una differente espressione dei regolatori di
MCU (MICU)
… ed una alterazione dei contatti con il RE
Probe costruito da Tito Calì
**
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Aver
age
n.pu
ncta
/cel
l
Ctrl Pat
- MFN
2 +
MFN
2
MFN
- - + +
MFN1
MFN2
SigmaR1
β-Tub
grp75
Ctrl Pat
PACS-2
C’è una relazione tra l’alterazione del segnale Ca2+ nei fibroblasti di paziente e l’aumento di autofagia?
La correzione molecolare dell’alterazione del segnale Ca2+ riduce l’autofagia
**
**
**
**
*
**
0
10
20
30
40
50
60
70
80
[Ca2+
] mt u
M
0
10
20
30
40
50
60
70
80
[Ca2+
] mt u
m
Ctrl
Ctrl STARV
Ctrl + MCU
Ctrl STARV + MCU
Pat
Pat STARV
Pat + MCU
Pat STARV + MCU
Histamine
10 s
Histamine
starvation - - + + - + - + MCU - - - - + + + +
p-AMPK
β-tub
AMPK
MCU
MCU - + + - starvation - - + +
- + + - - - + +
Ctrl Pat
Conclusioni
Gli studi cellulari su fibroblasti di pazienti rivelano differenti profili di segnalazione mitocondriale Si rilevano difetti nell’accumulo di Ca2+ in seguito a stimolazione cellulare, che possono essere attribuiti ad alterazioni del sistema di trasporto dello ione e dei contatti con il RE Queste alterazioni della segnalazione mitocondriale correlano con una stimolazione dell’autofagia La correzione molecolare (sovraespressione di MCU) ripristina i segnali Ca2+ e inibisce l’autofagia
Collaboratori Ildiko Szabo, Enrico Teardo (electrophysiology) Stefano Moro, Davide Sabbadin (protein modelling) Tullio Pozzan, Ilaria Drago, Marco Mongillo, Tania Zaglia, Fabio Di Lisa, Andrea Carpi (heart) Jim Surmeier, Marisa Brini (neurons) Giuseppe Zanotti, Laura Cendron (protein structure) Paolo Bonaldo, Paola Braghetta, Francesco Argenton, Enrico Moro (transgenics)
Dipartimento di Scienze Biomediche Università di Padova
Diego De Stefani Cristina Mammucari Giorgia Pallafacchina Anna Raffaello Alessandra Braga Gaia Gherardi Veronica Granatiero Angela Paggio Marco Pacifici Maria Patron Elisa Penna Anne Picard Anna Terrin Anna Tosatto Denis Vecellio Lauren Wright Ilaria Zamparo