Detecção por imunocitoquímica de

VEGF no pénis do rato

Cristina Resende

Diana Cruz T6

Objectivo

Mapear a localização preferencial do VEGF (vascular endothelial growth factor) no pénis do rato

Insere-se num projecto de investigação do que tem como objectivo mapear e comparar a localização do factor de crescimento no pénis em diversos grupos de risco.

Histologia do pénisComponentes principais: Uretra 3 corpos cilíndricos de

tecido eréctil

2 Corpos cavernosos - na parte dorsal

Corpo esponjoso – anteriormente; a revestir a uretra

Fig. 1: Corte transversal de pénis humano

Os corpos cavernosos são envolvidos por uma camada resistente de tecido conjuntivo denso - a túnica albugínea.

O tecido eréctil que compõe os corpos cavernosos e o corpo esponjoso tem uma grande quantidade de espaços cavernosos separados por trabéculas de fibras de tecido conjuntivo e células musculares lisas.

Fig. 2: Corte transversal de pénis humano (maior ampliação)

Óxido nítrico – Essencial ao fenómeno de erecção

• Molécula sinalizadora parácrina

• Sintetizado a partir do aminoácido arginina

• Difunde-se directamente através da membrana plasmática das células alvo

• Molécula extremamente instável, com um tempo de semi-vida curto (alguns segundos)

Fisiologia da erecção (I)

Fisiologia da erecção (II)

Fig. 3 Papel do óxido nítrico no relaxamento do músculo liso

Epidemiologia da disfunção eréctil

estudos epidemiológicos demonstram uma associação entre o envelhecimento e a disfunção eréctil

declínio da actividade sexual e da função eréctil com o envelhecimento

Estima-se que a percentagem de homens sem disfunção eréctil diminui de 60 para 33% entre os 40 e 70 anos de idade.

Disfunção eréctil não é necessariamente

uma consequência inevitável da idade

associada a patologias concomitantes

principal causa da disfunção eréctil

relacionada com a idade

doença aterosclerótica

das artérias penianas

Factores de risco vascular como hipertensão, hipercolesterolemia, tabaco e diabetes associados a maior probabilidade de disfunção eréctil

Outros factores de risco:

declínio da produção hormonal, nomeadamente de androgénios

Factores psicológicos

Efeitos laterais de fármacos utilizados na terapêutica de patologias concomitantes

Importância do estudo

Última década grande preocupação nesta área

Crescimento populacionalAumento da esperança média de vida

Acréscimo importante na prevalência de diversas patologias, incluindo a disfunção eréctil

Compreensão mais aprofundada dos mecanismos fisiopatológicos da disfunção eréctil com vista à orientação de novas linhas terapêuticas

Alterações estruturais e ultrastruturais nos componentes fibroelásticos das:

trabéculas penianas,

músculo liso cavernoso

endotélio

inadequada expansão sinusoidal

rigidez do pénis erecto

Farmacologia para melhorar a erecção peniana

Medicamentos de acção periférica de actuação predominantemente vasoactiva como os inibidores da fosfodiesterase tipo 5

Viagra

Angiogénese terapêutica

desordens do fluxo arterial relaxamento do músculo liso cavernoso disfunção venooclusiva

Disfunção endotelial1 dos factores responsáveis pela disfunção eréctil

Traduz-se em:

Alvo farmacológico válido na prevenção da disfunção eréctil

Neovascularização cavernosa é controlada por factores de crescimento angiogénicos que promovem a proliferação e migração de células endoteliais e musculares lisas

VEGF um dos factores mais importantes, que ainda estimula a produção de óxido nítrico

VEGF

Família de proteínas que actuam sobre células endoteliais, estimulando a angiogénese

Parente distante do factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)

Compreende 5 membros: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D

e factor de crescimento da placenta (codificados por genes distintos)

Produzido em vários tipos de células vasculares (endoteliais, musculares lisas e fibroblastos)

A administração intracavernosa de VEGF em modelo animal estimula a expressão da síntase de óxido nítrico endotelial, sendo a presença deste necessária para a angiogénese

regeneração de células endoteliais delineando as trabéculas cavernosas

Melhoramento da erecção peniana(numa situação de oclusão arterial aguda)

Utilização de modelos animais O estudo da expressão de VEGF no animal experimental

parece fundamental na regulação destes mecanismos

Possibilidade de manipulação biológica, química e genética, simulando nestes animais os factores de risco para a disfunção eréctil, o que permite o seu estudo in vivo

Extrapolações têm que ser cuidadosas

Célula com antigénio

Anticorpo primário

Anticorpo secundário conjugado com uma enzima

Produto da reacção

Imunocitoquímica

Protocolo Imunocitoquímica:

1º Dia Desparafinar em xilol e hidratar em etanol e água

Inibir a peroxidase endógena à temperatura ambiente (TA).

Recuperação antigénica em tampão de citrato

Enxugar lâminas e isolar cortes com Dako pen.

Adicionar tampão de incubação (5% NGS em PBS)

Adicionar Anticorpo primário (1/100) “overnight” a 4ºC

Protocolo Imunocitoquímica:

2º DiaAdicionar Ab secundário (1/100) a TA

Adicionar complexo Avidina-Biotina (ABC) a TA.

Preparar DAB a 30% H202 e adicionar aos cortes.

Parar reacção com H2O e corar com hematoxilina

Desidratar e montar com Entellan

Resultados

Fig. 4 Corte de pénis de rato (AT= 40x)

Fig. 5 Corte de pénis de rato (AT= 40x)

Fig. 6 Corte de pénis de rato (AT= 40x)

Fig. 7 Corte de pénis de rato – corpo cavernoso (AT= 200x)

Discussão dos resultados

Os corpos cavernosos apresentam marcação preferencial no tecido conjuntivo (sem definição específica). Este tecido apresenta as condições necessárias para a formação de vasos.

O tecido muscular liso não apresenta marcação acentuada

O endotélio apresenta alguma marcação.

Uretra com marcação, mas no lúmen contaminação (deficiência de lavagem)

Perspectivas futuras

Estudos experimentais Fisiopatologia da erecção Mecanismos de actuação terapêutica

Agradecimentos

Dr. Pedro Vendeira Dr. Jorge Ferreira Dra. Delminda Neves

Serviço de Biologia Celular e Molecular

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http://www.vh.org/adult/provider/anatomy/MicroscopicAnatomy/MicroscopicAnatomy.html