Post on 27-Jul-2020
transcript
Recherche d’une thérapie de la maladie de Lesch-Nyhan:
Identification de molécules «HPRT like» issue d’un
criblage virtuel et à haut débit
HGPRT
Nouveau concept
Maladie de LN
SFEIM, Vendredi 17 juin 2016 F. Augé, C. Petitgas, M.C. Burgevin, L. Mockel, A. Olivier-Bandini, J.F. Gibert, F. Chesney, O. Curet, B. Daignan-Fornier, B. Pinson, M. Ledroit, I. Ceballos-Picot.
Métabolisme des purines Maladies neurologiques
Une collaboration public-privé…
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Institut de Biochime et Génétique Moléculaire
Dr. Daignan Fornier Dr. Pinson
• Expertise du métabolisme des purines
• Expertise dans le développement des tests sur levures
Open Innovation Access Platform
Laboratoire de Biochimie Métabolique. Dr. Ceballos-Picot
• Experte Française de la maladie de Lesch-Nyhan (L-N)
• Recherche translationnelle à partir de cellules de patients
Recherche amont • Criblage haut débit • Développement de tests in-vitro • Validation de hits • Optimisation des leads
Sponsoring (Dr. Cheng Seng) • Développement des tests in-vivo • Prise en charge du projet après
validation du concept.
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… pour lutter contre une maladie rare.
allopurinol
Origine génétique (maladie rare, 1/250000) • Première description par les docteurs Lesch et Nyhan en 1964
• Maladie causée par une mutation sur le gène HPRT1 (chromosome X)
• Les hommes sont affectés, les femmes sont porteuses
• HGPRT est une enzyme ubiquitaire exprimée par tous les organismes
Syndrome • Hyperuricémie (goutte et lithiases rénales)
• Troubles neuro-comportementaux (dystonie, désordres cognitifs,
automutilation)
Diagnostic et prise en charge • En France le diagnostic est réalisé par les centres de référence
« maladie héréditaire du métabolisme ».
• L’hyperuricémie est traitée par l’allopurinol
• Pas de médication efficace pour les troubles neurologiques
• La prise en charge se fait par immobilisation physique des patients sur
une chaise et le port de gouttières pour empêcher l’automutilation
Corrélation entre phénotype et génotype* • L’ensemble des symptômes est rencontré chez les patients ayant une
perte complète de l’activité de l’enzyme HGPRT.
• Le spectre des symptômes est fonction de l’activité résiduelle de HGPRT
• Une activité de 10% est suffisante pour éviter les automutilations.
*Rong Fu, Irene Ceballos-Picot et al; Brain (2014) 137; 1282-1303
Zoom sur les mutations du gène HPRT1
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Phénotype HRH
Phénotype HND
Phénotype LND
PDB structure = 1BZY
Source : Irène Ceballos-Picot et al. OJRD (2015) 10;7
• Des mutations nombreuses (sup 600) et non localisées
sur la protéine.
• HGPRT n’est pas une cible thérapeutique possible.
HGPRT est une enzyme de la voie de recyclage des purines
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Recyclage
Dégradation
Synthèse
de novo
Source : KEGG pathway database : http://www.genome.jp/kegg/pathway.html
HGPRT APRT
Un concept innovant visant à modifier la sélectivité de l’APRT
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Allopurinol XO
XO = Xanthine Oxydase
Normal
LND
APRT+AMS = APRT + Allosteric Modulator of Selectivity
= HGprt-like activity
Aprt + AMS
Substrat APRT ?
Développement d’un test sur levures et criblage
Benoit Pinson et Bertrand Daignan-Fornier
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• Principe du test
o Knockdown des enzymes clés de la
voie de recyclage des purines chez la
levure o Pas de croissance des levures
o Expression de l’APRT humaine dans
les levures o Les levures croissent sous adénine (Voie 1)
o Les levures ne peuvent croître sous
hypoxanthine sauf si modulation allostérique
(voie 2)
• Le criblage
o Librairie Prestwick (1300 cpds).
o 7 jours et 14 jours de croissance
Voie 1 Voie 2
2µL d’adenine
8 composés testés
par plaque
Milieu SD casa W
+ Hypoxanthine
+ levure
(ade2Δ hpt1Δ apt1Δ + hAPRT)
Aucun hit identifié
Développement d’un test biochimique et premier criblage
8
4633 composés testés (100µM) : criblage virtuel & prestwick
Hypoxanthine Guanine Adenine
HGprt
PRPP/Mg2+
HGprt
PRPP/Mg2+
Aprt
PRPP/Mg2+
IMP Inosine monophosphate
GMP Guanosine monophosphate
AMP Adenosine monophosphate
Kit de détection basé sur la
polarisation de fluorescence
0.001 0.01 0.1 1 10 100 10000
100
200
300
2µg/ml antibody2nM tracer-AF633
IMP x 5
AMP x 1
GMP x 2.5
PRPP x1250
D-ribose-5-phosphateadenineguaninehypoxanthine
[product, µM]
m
P
APRT, 0.2µg/ml, 1hTris0.1M, MgCl2 1.2mM, PRPP 10µM
0.0 0.5 1.0 1.5 2.00
50
100
150
200
Vmax
Km
adenine
191.7
0.1179
hypoxanthine
2.227
~ 1.498e-016
guanine
-3.018
0.0004551
hypoxanthine
guanine
adenine
[substrate, µM]
m
P
Bonne détection de AMP, IMP et GMP. Aprt sélectif de l’adénine vs hypoxanthine et
guanine
Hypoxanthine
IMP Inosine monophosphate
Aprt
PRPP/Mg2+
Concept
Chimiothèque
Modulation
allostérique
9
A
B
C
D
36 + 766
molécules
455 + 642
molécules
582
molécules
152
molécules
• Identification de 4 poches allostériques potentielles
• Criblage virtuel effectué pour identifié des molécules pouvant se fixer sur ces
poches
• Le résultat des criblages sur les 4 poches donne la liste de molécules à cribler
Représentation schématique de l’approche
Une librairie de 2633 molécules proposée pour le criblage bas débit
Le criblage virtuel: principe
Criblage haut débit sur le test biochimique
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• Criblage primaire sur ~500.000 composés (12,5µM)
• Durée : 3 semaines
• Sélection de 860 composés (activité sup 20%)
• Re-testés en dose- réponse, contre-screen, QC.
Bilan des criblages biochimiques
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positiv
e
subs
trate
dire
ct in
tera
ction
nega
tive
0
50
100
IMP
/ A
MP
analo
g f
orm
ation
compound + hypoxanthine
or compound alone
compound + APRT
compound + APRT-hypoxanthine
positiv
e
subs
trate
dire
ct in
tera
ction
nega
tive
0
50
100
IMP
/ A
MP
analo
g f
orm
ation
compound + hypoxanthine
or compound alone
compound + hypoxanthine
or compound alone
compound + APRTcompound + APRT
compound + APRT-hypoxanthinecompound + APRT-hypoxanthine
1er criblage: (4633 composés)
• Positif = 0
• Substrats = 16
• Interaction directe = 10
2nd criblage (500 000 composés)
• Positif = 0
• Substrats = 284
• Interaction directe = 187
Différents profils possibles
• Les produits positifs dans le test biochimique peuvent être: • Soit des modulateurs allostériques (molécules recherchées)
• Soit des substrats (positif dans un test identique, sans d’hypoxanthine)
• Soit directement interagir avec le kit de détection (positif dans un test identique, sans enzyme)
2 contre-screens sont nécessaires
Profil recherché
Parmi les composés, une famille est intéressante
12
+Azaserine 1µM
normal +Azaserine 1µM +molécule X 10µM
Molécule X 10µM
• Plusieurs composés induisent la survie de
fibroblastes LN placés dans un milieu de culture
bloquant la biosynthèse de novo des purines.
• Ces composés pourraient activer une voie de
production d’IMP (GMP) induisant une survie des
cellules de patients.
• C’est l’effet que nous cherchions, mais il ne passe
pas par un modulateur allostérique de l’APRT.
Azaserine = inhibiteur irréversible de glutamine phosphoribosyl
pyrophosphate amidotransferase et FGAR amidotransferase
EC50=0,5µM
Bilan
• Partenariat public-privé pour lutter contre une maladie rare.
• Nos recherches ont montré que l’hypothèse initiale d’une réorientation de la
sélectivité de l’APRT par un modulateur allostérique de type petite molécule n’était
pas valide.
• Mais ces résultats ouvrent un second axe de recherche pouvant conduire à
l’identification de molécules présentant l’effet fonctionnel recherché in fine, mais
utilisant un autre mécanisme.
• Les résultats sont repris par les partenaires académiques afin de poursuivre la
recherche sur cette nouvelle hypothèse.
• Il reste beaucoup de travail avant de valider l’intérêt des molécules identifiées
dans le traitement de la maladie de Lesch-Nyhan • Confirmer que ces molécules restaurent les concentrations d’IMP, GMP, ATP (…) dans les cellules
des patients
• Valider l’effet observé sur la différenciation d’iPSC en neurones
• Valider le lien causal entre production d’IMP et troubles neurologiques (système dopaminergique)
• …
13
Merci
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SANOFI Unité de Sciences Translationnelles • Vincent Mikol
• Anne Olivier-Bandini
• Franck Augé
• Marie-Claude Burgevin
• Françoise Chesney
• Jean-François Gibert
• Patrick Avenet
• Olivier Curet
Access Platform • Walter Englaro
• Eamonn Rooney
• Julia Frappier
Hôpital Universitaire Necker-EM
Université Paris Descartes Laboratoire de Biochimie métabolomique
et protéomique • Irène Ceballos-Picot
• Morgan Ledroit
• Julie Cahu
• Céline Petitgas
• Lionel Mockel
Université Bordeaux Segalen Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires (IBGC), CNRS UMR 5095 • Bertrand Daignan-Fornier
• Benoit Pinson
Ma.M.E.A – Centre de référence maladies
métaboliques • Pascale de Lonlay
• Anaïs Brassier