Post on 15-Oct-2021
transcript
Identification of a DNA Binding Region inGerE from Bacillus subtilis
中興大學生化所 李彥樑
DINENE L. CRATER AND CHARLES P. MORAN, JR.
Journal of Bacteriology 183:4183-4189 2001
LuxR-FixJ family 的分類
BvgA, ComA, DctR, DegU, EvgA, FimZ, FixJ, GacA, GlpR, NarL, NarP, NodW, RcsB, UhpA etc.
以 Phosphorylation 機制調控
CarR, EchR, EsaR, ExpR, LasR, LuxR, MalT, PhzR, RhlR, TraR, YenR etc.
經 Inducer誘導
GerE, SalA, SyrF, SyrG etc.
與旁兩者不同
LuxR-FixJ family
?依啟動機制不同分為三個 subfamily。
•LuxR-FixJ family 為 Bacterial regulatory protein family,成員如: FixJ, MalT, GerE etc.,以 binding DNA 來達成 regulating,功能多為 activating expression。
•因啟動機制不同而N-端序列也有所差異。•大部分成員具有類似結構:
GerE 所屬 protein family - LuxR-FixJ
具有 putative helix turn helix (HTH) motif
N C
Receiver domain DNA binding domain
GerE protein from Bacillus subtilis
•序列長度為 74 a.a.,分子量約為8.5 kD,為 LuxR-FixJ family 中最小者。•序列中 Basic a.a. 佔了17.57 %, pI = 9.16,at pH 7 charge +1.87,為 basic
protein。• GerE 為 LuxR-FixJ family C-端 DNA binding domain 的典型結構。
LuxR-FixJ family
GerE 1 MKGAEFGPKPLLTKREREVFELLVQDKTTKEIAEQLFISEKTVRNHISNTMQKLGVKGRSQAVIELIRLGELEI 74
Putative DNA binding HTH motif
Receiver domain DNA binding domain
N C
• GerE 於 Bacillus subtilis 影響 SigK-associated RNA polymerase-dependent transcription ,以調控 sporulation coat gene。
• GerE 以 Dimer 型態與 DNA 作用。
GerE 所結合的 DNA sequence
TACATATAGGCTTTTGCCTACATACTTTATGTATATCCGAAAACGGATGTATGAAA
sigK promoter
5‘3‘
sigK : … ATATAGGCttTT…
cotX : … AAATAGGgttCT…
cotG : … tTTTAGGCttTT…
cotD : … tAAgGGGTacaT…
cotC1: … GTTTGGGCcgaT…
12 bp
RWWTRGGYNNYYR → G or A
W → A or TN → G, A, T, C Y → T or C
Consensus sequence
Transcriptional Start Site
實際上 consensus sequence 所呈現的方式
實驗動機
• 已知 N-端 receiver domain 不具 DNA binding 能力,但會影響DNA binding affinity。
• 其他 DNA binding protein (Cro and Lambda repressors)會以HTH motif 與 DNA 結合,LuxR-FixJ family 的 putative HTH motif 還未有分生實驗證實。
• 有實驗指出在 sigma factor 的 putative HTH motif 點突變,會導致 DNA binding affinity 變化。
以 GerE 為最簡單模式來觀察 putative HTH motif,進而辨認出最具影響力的胺基酸。
LuxR-FixJ family 的 putative HTH motif 與 DNA 的關連性?
sigKUPforward primer
reverse primersigK250-REV
5’3’
PCR
pKW19
sigK promoter
inserts intopCR2.1-TOPO226-bp sigK
promoter
實驗
1.準備 sigK promoter (from K. Wade)
pKW19 為 Wild-type sigK promoter plasmid,之後的 muatant 都以此 plasmid 為源頭。
實驗
以psigK+2A為例
pKW19Wild-type sigK promoter
plasmid
Dpn ISite-directed PCR mutagenesis
sigK promoterTACATATAGGCTTTTGCCTACATACTTT
Transcriptional Start Site
+2 +3 +4 +5
ATAA
psigK+2ApsigK+3TpsigK+4ApsigK+5A
2. Single base pair substitution
..TATTTCC..Reverse primer
Digest parental DNA..ATAAAGG..Forward primer
psigK+2A
pKW19置換 base
pKW19psigK+2ApsigK+3TpsigK+4ApsigK+5A PCR
sigK250-REVsigKUP
3 .製備 radioactive-labeled DNA
實驗
DNase I Footprinting Assay
226-bp sigKpromoter
32
P
以 T4 polynucleotide kinase 將 [?-32P]ATP的放射線磷酸根轉移至 forward primer 的 5‘端
與 GerE 結合
觀察 binding 的變化
實驗
GerE1 MKGAEFGPKPLLTKREREVFELLVQDKTTKEIAEQLFISEKTVRNHISNTMQKLGVKGRSQAVIELIRLGELEI 74
T42A R44A
σ 70 TDYTLEEVGKQFDVTRERIRQIEAKALRKLR 599σA RTRTLEEVGKVFGVTRERIRQIEAKALRKLR 358GerE QDKTTKEIAEQLFISEKTVRNHISNTMQKLG 55NarL QGLPNKMIARRLDITESTVKVHVKHMLKKMK 199FixJ AGLPNKSIAYDLAISPROVEVHRANVMAKMK 185MalT SGYSNEQIAGELEVAATTIKTHIRNLYQKLG 879UhpA QGMAVKEIAAELGLSPKTVHVHRANLMEKLG 181LuxR EGKSSWDISKILGCSKRTVTFHLTNAQMKLN 226
Helix HelixTurn
Single Alanine Substitution in GerE
實驗
240-bp gerEcoding sequence
Site-directed PCR mutagenesis
以 PCR 方式將gerE sequence 放大
pGerE-EX
Incerts intopET-26b(+)
240-bp gerE
pGerE-T42ApGerE-R44A
1.準備 gerE plasmid (from J. Brannigan)
5’3’
實驗
pGerE-EXpGerE-T42ApGerE-R44A
600 nm O.D.= 0.8In L.B. medium IPTG induce
Contains Chloramphenicol& Kanamycin
Add rifampinTransform into BL21(DE3)(pLysS)
純化
HighTrapheparin column
Run SDS-PAGE withCoomassie blue staining分析純度
Wild-type GerET42A GerER44A GerE
2. GerE protein overexpression
將菌液以lysis buffer 回溶
以 31000 g 離心取上清液
實驗
Mixture in10 mM HEPES [pH 7.5] 50 mM NaCl
1 mM EDTA [pH 8.0]1 mM DTT10 % glycerolPoly(dI-dC)
DNase I digestion
STOP buffer 酒精沈澱
DNA fragments
Run PAGE with 7 M Urea
•Wild-type•Mutant
GerE sigKpromotor
+•Wild-type•Mutant
DNase I Footprinting
Results
TACATATAGGCTTTTGCCTACATACTTTTGTG
Mutation sigK promoter 對 binding 的影響
Wild-type GerE 對 sigK +2A 的binding affinity ,由對WT sigK的 7 pM 變為 35 pM,下降5倍。
+1 +25Wild-type
+19+5
TACATATTGGCTTTTGCCTACATACTTTTGTG
Results
+6 +25
Mutation sigK promoter 對 binding 的影響
• sigK+3T 不僅使 GerE binding affinity下降5倍,binding起始位置也由+1變為+6。
• sigK+5A 造成的affinity 變化不到5倍影響最小。
Wild-type
+19
+3T
TACATATAGACTTTTGCCTACATACTTTTGTG
+1 +25+19+5
Results
ATATAGGCTTTT
Transcriptional Start Site
+3 +5
RWWTRGGYNNYYR → G or AW → A or TN → G, A, T, C Y → T or C
Strong effectSmall effect
sigK promoter 的變化會影響 binding affinity,甚至binding position 也改變,可知此處的 base 與 GerE 有直接的關連。
Summary of mutation sigK的影響
Results
T42A-GerE以350 pM即可保護WT sigK,對 sigK+4A 則需700 pM ,如同Wild-type GerE,對WT sigK 與 sigK+4A 有binding affinity 差別。
Mutant GerE 對 DNA binding 的影響
R44的序列相對位置,為 FixJ 及σ70 recognition residue 所在,實驗結果為 DNA binding affinity 下降。
關於R44A
Results
+18 、+15 band 為 T42A-GerE特有
• T42A-GerE縮小了 DNA binding 範圍,少了10 bp。• sigK+3T promoter 造成 wild-type GerE binding 能力減弱,
T42A-GerE 不受影響,可知WT GerE 和 T42A-GerE 對DNA 的作用方式不同。
T42A-GerE 對 sigK +3T 與WT sigK 都需700 pM才能保護。
Mutant GerE 對 DNA binding 的影響
結論
位於 putative HTH motif 的 T42 產生改變後,造成 protein 與DNA interaction 的極大差異,可知在 GerE或其他 LuxR-FixJfamily 成員的 HTH motif 及其鄰近的胺基酸,與該蛋白質辨識及結合特定的 DNA 序列息息相關。
正面
N
N’C C’
S8L74Q5 L74
T42A 為何不受sigK+3T 影響
側面
N
N’C C’
•T42A 不會破壞 Dimer 的構型(Protein-protein interaction) 。
•T42A 造成的 binding 位向改變,使的 sigK+3T 影響程度降低。Complex
V. M. -A. Ducros et alJournal of Molecular Biology 2001
V. M. -A. Ducros et al
Jounal of molecular Biology 2001
GerE 結構Cartoon 圖
N
N’C C’
V. M. -A. Ducros et al
S8L74
Q5
L74
Journal of Molecular Biology 2001
Denature
AnnealMutagenic primers
PCR withPfu DNA polymerase
+ Dpn I
圖片取自 Weaver molecular biology
Site-directed PCR mutagenesis 原理:利用特殊設計的 primers 來產生完整又具有突變的 plasmid。
圖片取自 Gene VII