UNIVERSIDAD DE ORIENTENUCLEO BOLIVARESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUDDEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLOGICAS CATEDRA: BIOQUIMICA

PRATICA 2 SALADO (SALTING AOT) DE PROTEINAS, SU APLICACIN EN LA SEPARACION Y DETERMINACION DE ALBMINA Y GLOBULINAS EN SUERO O PLASMA SANGUINEO.

Grupo del Mircoles ADocente: Bachilleres:Lic. Zulay Castillo Ramrez, Mary C.I: 20.934.375

Ciudad Bolvar, Mayo del 2013.Introduccin.

Las protenas son macromolculas complejas desde los puntos de vista fsico y funcional, que desempea mltiples funciones de importancia crucial. Estn sujetas a cambios fsicos y funciones que reflejan el siglo de vida de los organismos en los cuales residen. Las protenas son compuestos constituidos por aminocidos unidos por enlaces peptdicos. Son molculas de elevado peso molecular. Segn su composicin las protenas se dividen en: Simples y Conjugadas, se producen por hidrlisis de aminocidos y otros componentes orgnicos e inorgnicos. Existen millones de protenas en nuestro cuerpo que efectan funciones especficas, como la de trasporte de gases catalticos, de proteccin, etc.

Estas se pueden clasificar de acuerdo a su solubilidad en Albminas, Globulinas, Histonas, Protaminas y Escleroprotenas. En la presente prctica se utilizan para estudio Albmina y Globulinas, en cuanto a la Albmina se puede acotar que pueden precipitarse de sus soluciones con altas concentraciones de sales proceso que se denomina salinizacin.Para estudiar una protena es necesario separarla utilizando diferentes mtodos que se basan en las diferentes solubilidades de las protenas ocasionadas por el PH (precipitacin isoelctrica), la polaridad (precipitacin con etanol o acetona) o la concentracin salina (mediante la adicin de sulfato de amonio). (Harper, 2007)Las sales neutras ejercen efectos pronunciados sobre la solubilidad de las protenas globulares. A baja concentracin, las sales incrementan la solubilidad de muchas protenas, fenmeno que recibe el nombre de salting in. Por otra parte, a medida que la fuerza inica aumenta, la solubilidad de una protena comienza a disminuir y por lo tanto la protena puede ser casi completamente precipitada de su disolucin, efecto llamado salting out.Se considera importante describir a la albmina, por ser sta la protena a separar durante la actividad prctica por el mtodo antes mencionado. Es un tipo de protena simple, compuesta de carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno y un pequeo porcentaje de azufre. La albmina es coagulable por el calor, los cidos minerales, el alcohol y el ter, y es soluble en agua y en disoluciones diluidas de sal. Est presente en tejidos animales tales como la clara de huevo, la leche y el msculo, adems de encontrarse en el plasma sanguneo.

ResultadosSe presenta una tabla de datos la cual contiene los resultados obtenidos durante la precipitacin de protenas por medio del mtodo de Salting Out, realizado en la prctica del laboratorio para la cuantificacin de las protenas.TABLA N 1.Tubos1234567

Volumen en:Mlmlmlmlmlmlml

Solucin X1 protenas totales2

Solucin X2 albumina2

Estndar de protenas 8mg/ml0,250,50,751

NaCl 0,9%1,751,51,2512

Reactivo de biuret4444444

mg de protenas 2mg4mg6mg8mg

Fuente: gua de laboratorio de bioqumica.1. Curva de calibracin utilizando la lectura de los tubos 3 al 6 en absorbancia contra mg de protena contenidos en cada uno de los mismos. Para calcular los mg de protenas en los tubos 3, 4, 5 y 6 se parte del estndar de protenas a concentracin 8mg/ml, en el que se halla 8mg de protenas en 1ml de solucin, as el clculo se realiza mediante una simple regla de tres utilizando los ml de solucin para cada uno de los tubos, presentados en la tabla anterior. El procedimiento se desarrolla a continuacin:

Tubo N 3 estndar de protenas = 0,25 ml8 mg de protenas1 mlX0,25 ml

X= 8mg protenas x 0,25ml1mlX = 2 mg de protenas

Tubo n 4: estndar de protenas = 0,50 ml.8 mg de protenas1 mlX0,50 mlX= 8mg protenas x 0,50ml1mlX = 4 mg de protenas

Tubo n 5: estndar de protenas = 0,75 ml.8 mg de protenas1 mlX0,75 mlX= 8mg protenas x 0,75ml1mlX = 6 mg de protenas

Tubo n 6: estndar de protenas = 1 ml.8 mg de protenas1 mlX1 mlX= 8mg protenas x 1ml1mlX = 8 mg de protenas

Conjuntamente con los resultados obtenidos en el laboratorio, expresados en la tabla n 2, y los calculados se procede a realizar la grfica de la curva de calibracin.TABLA N 2TubosAbsorbanciaMg de protenas

X10,5306,543*

X20,3934,974*

30,2182

40,3164

50,4866

60,8108

Fuente: fotocolormetro utilizado durante la practica en el laboratorio de bioqumica.*Los valores de mg de protenas de los tubos X1 y X2 se obtuvieron mediante extrapolacin de la Curva de Calibracin.GRFICO N1: Curva de calibracin.

Partiendo de estos resultados se proceder a comparar, por medio de la relacin entre la absorbancia y la concentracin de protenas totales, el valor de la absorbancia de los tubos problemas y as de esta manera determinar la cantidad de protenas contenidas en la muestra lo que a su vez nos llevara a conocer la cantidad total en un ml de suero humano, adems de establecer una relacin entre la cantidad de albmina y globulinas contenidas en la muestra de suero problema.2. Cantidad de protenas totales en la solucin X1 en base a la curva de calibracin. Una vez realizada la extrapolacin de los mg de protena de X1, basndose en la tabla n 2, su absorbancia corresponde a 0,530 por lo que 6,54 corresponde a los mg de protena en dicho tubo de ensayo. Primeramente para obtener la cantidad de protenas totales en el tubo X1, es necesario calcular dicha cantidad en la muestra inicial de 10 ml compuesta por 0.5ml de plasma o suero y 9,5 ml de NaSO4, de la cual solo se utiliz 2ml de esta solucin. Los clculos son los siguientes: 2 ml de solucin6,543 mg de protenas10 ml de solucin XX = (10 ml de solucin) x (6,543 mg de protenas)(2 ml de solucin)X = 32.715 mg de protenas

Posteriormente se tiene que calcular los 0,5 ml que haban sido aadidos de plasma o suero sanguneo para poder obtener el porcentaje de protenas presentes en su totalidad.0,5 ml de suero32.715 mg de protenas 100 ml de suero X

X = (100 ml de suero) x (32.7 mg de protenas)(0,5 ml de suero)X = 6.543 mg de protenas

El resultado se expresa en gr/dl por lo que se realiza una conversin de unidades para la obtencin de lo requerido:

3. Cantidad de albumina en la solucin X2.De la misma manera que con la solucin X1, se calcula los mg de protenas mediante la extrapolacin de la misma en la curva de calibracin. La absorbancia de X2 es de 0,393 por lo que el valor de su concentracin es de 4,974mg. Se calcula la cantidad de albmina en la muestra inicial de 10 ml de los cuales se extrajo 4ml de solucin. 4 ml de solucin4.974 mg de albmina10 ml de solucin XX = (10 ml de solucin) x (4,974 mg de albmina)(4 ml de solucin)X = 12,435 mg de albmina

Posteriormente, al aadirse los 0,5ml de plasma, se tiene que:0,5 ml de suero12,435 mg de albmina100 ml de suero XX = (100 ml de suero) x (12,435 mg de albmina)(0,5 ml de suero)X = 2.487 mg de albmina

Se expresa el valor en gr/dl de la siguiente manera:

4. Cantidad de globulinas precipitadas por diferencia.La cantidad de protenas totales en el suero equivale a la sumatoria de las cantidades de albumina y globulinas en la muestra; el primer dato es conocido y la cantidad de protenas totales tambin, por lo que se despeja las globulinas de la ecuacin formada y dar el resultado deseado.Protenas totales = albmina + globulinas.Globulinas = protenas totales albmina.Globulinas = 6,540 gr/dl 2,487 gr/dl.Globulinas = 4,053 gr/dl

5. Relacin albumina/globulina (A/G)

Albmina/Globulinas = 2,487 gr/dl = 0.613 gr/dl 4,053gr/dl Porcentaje de albmina:6,543 gr/dl de protenas totales 100%2,487 gr/dl de albmina XX = (2,487 gr/dl de albmina) x (100%)(6,543 gr/dl de protenas totales)X = 38.01%

Porcentaje de globulinas:6,543 gr/dl de protenas totales 100% 4,053 gr/dl de globulinas XX = (4,053 gr/dl de globulinas) x (100%)(6,543 gr/dl de protenas totales)X = 61,94 %

Porcentaje de protenas totales:Protenas totales = 61,94% + 38,01%Protenas totales 100%

A continuacin se presenta un cuadro comparativo de los valores normales en relacin con los valores obtenidos de protenas presentes en el suero sanguneo o plasma humano.ProtenasValores normalesValores obtenidosApreciacin

Totales6,0 - 8,46,543Dentro del Rango

Albminas3,5 - 5,52,487Muy Bajo

Globulinas2,5 - 3,694,053Alto

Albminas/Globulinas1,3 1,70,613 Muy Bajo

Discusin de los resultados.Despus de la realizacin de la prctica de laboratorio y la obtencin de los resultados pudimos lograr el estudio de las protenas que componen el plasma sanguneo, como lo son la albumina y las globulinas. A altas fuerzas inicas, la solubilidad de las protenas disminuye, este fenmeno es conocido como salting out. Este fenmeno se da bsicamente por la competencia que establece la sal Na2SO4 con la protena por el agua, logrando sacar la capa de solvatacin quedando las cargas de las protenas libres, trayendo como consecuencia que estas se atrajeran y se aglomeran logrando la precipitacin de las globulinas; esto tambin, es debido a que la sal estaba en una concentracin saturada. Culminada esta etapa se extrajo cierta cantidad de protenas para determinar el total que posea la solucin inicial, mientras que se tomaba otra cantidad para llevar al centrifugado y observar el componente de albmina que posea. En este ltimo se le aadi ter dietlico como solvente orgnico para provocar a precipitacin de los componentes de la solucin. Notoriamente se observ cmo qued precipitada las globulinas entre la albumina que se encontraba por debajo de ella y el ter que estaba por encima. A travs del mtodo colormetro de Biuret se cuantific las protenas totales y de albumina presentes en la muestra, en el que mientras ms oscura la coloracin de la muestra mayor la concentracin de protenas. La centrifugacin y el bao de mara sirvieron de catalizadores de la reaccin. El fotocolormetro permite cuantificar en funcin de la longitud de onda la reciprocidad que existe entre los valores de una misma magnitud fotomtrica en relacin a dos haces de radiaciones; arroj los valores de la absorbancia que se usaron como punto de partida para realizar la grfica, que, con valores ya determinados y a partir de una serie de ecuaciones matemticas se logr determinar los gr % de albmina y protena y los valores porcentuales de estas y las globulinas.Se pueden considerar valores correspondientes aproximados de un Proteinograma para determinar el total normal de albmina y globulinas. El proteinograma es un examen que busca hacer una cuantificacin aproximada de los tipos de protena en la parte lquida (suero) de una muestra de sangre. Correspondiente a esto los valores regulares son:ProtenasValores normalesValores obtenidosApreciacin

Totales6,0 - 8,46,543Dentro del Rango

Albminas3,5 - 5,52,487Muy Bajo

Globulinas2,5 - 3,694,053Alto

Albminas/Globulinas1,3 1,70,613 Muy Bajo

En los resultados obtenidos en el laboratorio observamos que el porcentaje de albmina presente en la solucin de protenas totales es de un 38,01%.Segn Harper Bioqumica Ilustrada La albmina (69 kDa) es la protena principal del plasma humano (3,4 a 4,7 g/dL) y constituye aproximadamente 60% de la protena plasmtica total. Alrededor de 40% de la albmina est presente en el plasma y el otro 60% existe en el espacio extracelular. (pg. 614)La albmina presente en la solucin estudiada es menor en una diferencia de 22% en relacin al 60% que debe existir en el plasma humano. Demostrando que hay una deficiencia de albmina con respecto a la cantidad de globulina, que en valores normales es de 38% y en concordancia a la muestra estudiada se tiene un porcentaje de 61,94% para la globulina. Podemos entender que existe mayor cantidad de globulina y una deficiencia de albmina, es decir, los valores no corresponden a un patrn normal de relacin albmina-globulina.Luego de decir esto podemos deducir que los valores de protenas totales, albumina y globulinas obtenidos en el laboratorio se encuentran alterados ya que compararlo con los valores normales notamos que no se encuentran entre ellos, por lo que determinamos que a la persona que se le tomo la muestra presenta algn tipo de patologa. Al considerar estos valores se puede inferir que el individuo en cuestin presenta patologa relacionado con el aumento y la disminucin de los valores de protenas totales en el plasma. Se han descrito algunas causas que den origen a dicha disminucin, dentro de las cuales tenemos:

Disminucin de la sntesis. Malnutricin, Ayuno Malabsorcin alimentaria Enfermedad heptica crnica avanzada. Distribucin anormal o dilucin. Hiperhidratacin Aumento de permeabilidad capilar como en septicemia, quemados. Excrecin anormal o degradacin. Sndrome nefrtico Quemados Hemorragias Enteropatas con prdidas proteicas.

La importancia de la albmina en la nutricin se debe a que es una protena que puede ser fcilmente metabolizada; una de sus funciones importantes es la de servir como transportadora de diferentes molculas en el torrente sanguneo, tanto orgnicas como inorgnicas; as como tambin es la principal responsable de que se mantenga la presin onctica, es decir la presin osmtica coloide y, al disminuir estos valores ocasiona edemas.Existen patologas o sntomas que llevan una relacin con un bajo nmero de albmina. Por ejemplo el plasma de aquellos pacientes que padecen alguna enfermedad heptica muestra un declive en la relacin albmina-globulinas, es decir, una relacin de albmina-globulina disminuida, ya que dicha protena es sintetizada en el hgado. De igual forma hay una sntesis menguada en forma relativamente temprana en condiciones de malnutricin proteica como es el kwashiorkor, que es una enfermedad que se produce en nios por la ausencia de nutrientes, como las protenas en la dieta. Por su parte las Globulinas son un grupo de protenas insolubles en agua que se encuentran en todos los animales y vegetales. Tomando en consideracin los valores obtenidos en la prctica podemos destacar que un nivel de la globulina que est por encima de 3.96 g/dl suele deberse fundamentalmente a un problema de deshidratacin, esta elevacin de las Globulinas en general se observa en estados de defensa contra agentes infecciosos.. Las consecuencias de un aumento de las globulinas en sangre puede ocasionar enfermedades como mieloma mltiple, enfermedad inflamatoria crnica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES), hiperinmunizacin, infeccin aguda, macroglobulinemia de Waldenstrom y, as mismo enfermedad heptica crnica, adems tienen una serie de riesgos como sangrado excesivo, desmayo o sensacin de mareo, hematoma (acumulacin de sangre debajo de la piel), infeccin, etc.La albmina y las globulinas regulan el contenido de agua dentro de la clula y en los lquidos intercelulares. La fraccin globulina gamma es rica en anticuerpos , base de la comunidad contra determinadas enfermedades infecciosas como sarampin. ejercen presin osmtica, con lo que son parte importante en la distribucin del agua entre el plasma y los lquidos tisulares. Y hay que recordar que las proteinas plasmaticas son importantes amortiguadores del ph de la sangre y de las clulas corporales dentro de una pequea variacin.

Conclusin.

Durante el desarrollo de la prctica realizada se procedi aplicar los principales mtodos que se usan en el laboratorio para precipitar y separar protenas, as como mtodos especiales para cuantificarlas y de esa forma saber en qu cantidades se encuentran presentes en una solucin determinada, en especial la solucin usada en la experiencia de laboratorio, el plasma o suero humano a travs del cual se estudiaron sus protenas ms importantes, la albmina, las globulinas y la relacin que existe entre ellas. El plasma est constituido por una serie de protenas, como la Albmina y Globulina que desempean funciones vitales en el organismo. La purificacin de estas, puede ser lograda mediante la utilizacin de una serie de tcnicas de separacin, tales como el Salting-Out que permite el precipitado de protenas, de esta forma se puede estimar cuantitativamente las protenas totales y albmina presentes en la muestra.A travs de la separacin de las protenas, por medio de la curva de calibracin se pudo observar que durante el experimento realizado, se obtuvieron valores anormales con respecto a los estndares, esto puede ser debido a la presencia de alguna patologa en el organismo, como tambin un error experimental; para estar seguro de ello, se debera en tal caso realizar de nuevo todo el proceso para luego as dar un diagnstico seguro en caso de que lo amerite.

Biografa.

David, N y M,M (2009) Lehninger Principios de la Bioqumica. 5ta edicin, (Barcelona) 5ta Edicin, Editorial OMEGA.

Munray, R., Granner, D., Mayes, P., Rodwell, V (1996) Bioqumica de Harper, (Mxico, D.F) 14ta Edicin. Editorial Manual Moderno.

John W. Baynes y Marek H. Dominiczak (2011) Bioqumica Medica. (Barcelona) 3era Edicin. Editorial El sevier.

John W. Suttie. (1976). Fundamentos de Bioqumica (Trad. Por Ing. Jorge R. Estriada) Universidad de Wisconsin.

Enciclopdia Microsoft Encarta 98 (1993-1997) Microsoft Corporation. Reservados todos los derechos.

Diccionario Mosby Medicina Enfermera y Ciencias de la Salud: quinta adicin, 2000 Harcourt