REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD EXPERIEMTAL DE CIENCIAS DIVISION DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS
MAESTRIA DE MICROBIOLOGIA
COMPORTAMIENTO DEL VIRUS DEL SÍNDROME DEL TAURA EN CAMARONES (Litopenaeus vannamei) CULTIVADOS CON AGUA DEL LAGO DE MARACAIBO
DURANTE UN CICLO DE PRODUCCIÓN
TRABAJO PRESENTADO ANTE LA DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS DE LA FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS PARA OPTAR AL
GRADO DE MAGISTER SCIENTIARUM EN MICROBIOLOGÍA
Autor: Ing. Agr. María Isabel Montiel Villalobos C.I.V.- 15.009.544
Tutora: Dra. Zoraida Medina
Maracaibo, marzo 2011
DEDICATORIA
A mi familia en especial a
mis padres, hermanos y sobrinos,
quienes me apoyaron en
todo momento con su palabra
de aliento y llenando de alegría
todos los días de mi vida
AGRADECIMIENTOS
A Dios y la Virgen, por estar presentes en todos los momentos y circunstancias de
mi vida abriéndome las puertas que debo seguir para ser la persona que soy hoy en
día.
A mis padres y hermanos, a mi tutora, a mi cotutor, al personal del Standard Sea
Food, y a todas aquellas personas que colaboraron con una montaña o un granito de
arena en la realización de esta investigación; guiándome con su apoyo, consejo y
paciencia; colaborando de esta manera en mi formación y crecimiento tanto personal
como profesional
A los Laboratorios de Sanidad Acuícola (LASA) y de Anatomía Patología,
pertenecientes al Instituto Tecnológico de Sonora (ITSON) por su apoyo y formarme
académicamente para la realización de esta investigación.
A la Unidad Técnica Fitosanitaria (UTF), al Laboratorio de Anatomía Patológica de la
Policlínica Veterinaria y al Laboratorio de Referencias Virológicas de la Facultad de
Medicina, todos pertenecientes a la Universidad del Zulia; gracias por su colaboración
Al FONACIT, por el financiamiento otorgado a través de su programa de becas de
Formación de Talento Humano de Alto Nivel.
A todos mis más sinceros agradecimientos !
ÍNDICE DE CONTENIDO
Dedicatoria……………………………………………………………………………….. 4
Agradecimiento………………………………………………………………………….. 5
Índice General…………………………………………………………………………… 6
Índice de Tablas…………………………………………………………………………. 7
Índice de Gráficos……………………………………………………………………….. 8
Resumen…………………………………………………………………………………. 10
Abstract…………………………………………………………………………………... 11
Introducción……………………………………………………………………………… 12
Metodología……………………………………………………………………………… 20
Resultados y Discusión………………………………………………………………… 27
Conclusiones…………………………………………………………………………….. 44
Recomendaciones………………………………………………………………………. 45
Referencias Bibliográficas……………………………………………………………… 46
Anexos……………………………………………………………………………………. 53
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1.- Distribución de los animales por Muestreo……………………………….. 20
Tabla 2.- Proporción de animales infectados / no infectados según la zona de
muestreo dentro de las PP mediante el diagnóstico histológico…………………… 27
Tabla 3.- Proporción de animales infectados / no infectados según la zona de
muestreo dentro de las PP mediante el diagnóstico molecular……………………. 28
Tabla 4.- Proporción de animales infectados / no infectados por TSV en cada
una de las fases de la enfermedad en relación a la época de muestreo
empleando el diagnóstico molecular…………………………………………………
31
Tabla 5.- Proporción de animales infectados / no infectados según la época de
muestreo dentro de las PP empleando el diagnóstico histológico………………… 32
Tabla 6.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las fases
de la enfermedad según la época de muestreo empleando el diagnóstico
histológico………………………………………………………………………………...
33
Tabla 7.- Proporción de animales infectados según la zona de muestreo dentro
de las PP mediante el diagnóstico histológico……………………………………….. 34
Tabla 8.- Identificación de las diferentes fases de una infección causada por
TSV……………………………………………………………………………………….. 40
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1.- Proporción de animales infectados según la zona de muestreo
dentro de las PP empleando el diagnóstico histológico……………………………..
29
Gráfico 2.- Proporción de animales Infectados según la época de muestreo
dentro de las PP empleando el diagnóstico histológico……………………………..
33
Gráfico 3.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las
fases de la enfermedad según la época de muestreo empleando el diagnóstico
histológico, Piscina “A…………………………………………………………………...
35
Gráfico 4.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las
fases de la enfermedad según la zona dentro de la PP empleando el
diagnóstico histológico, Piscina “A”……………………………………………………
35
Gráfico 5.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las
fases de la enfermedad según la época de muestreo empleando el diagnóstico
por histológico, Piscina “C”……………………………………………………………..
36
Gráfico 6.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las
fases de la enfermedad según la zona de muestreo empleando el diagnóstico
histológico, Piscina “C…………………………………………………………………..
37
Gráfico 7.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las
fases de la enfermedad según la época de muestreo empleando el diagnóstico
histológico, Piscina “D…………………………………………………………………..
38
Gráfico 8.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las
fases de la enfermedad según la zona de muestreo empleando el diagnóstico
histológico, Piscina “D…………………………………………………………………..
38
Gráfico 9.- Prevalencia del TSV en cada época de muestreo empleando el
diagnóstico histológico………………………………………………………………….. 42
Gráfico10.- Prevalencia del TSV en cada época de muestreo empleando el
diagnóstico molecular…………………………………………………………………...
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Montiel-Villalobos, María I. COMPORTAMIENTO DEL VIRUS DEL SÍNDROME DEL TAURA EN CAMARONES (Litopenaeus vannamei) CULTIVADOS CON AGUA DEL LAGO DE MARACAIBO DURANTE UN CICLO DE PRODUCCIÓN. Trabajo de Grado presentado ante la División de Estudios para Graduados de la Facultad Experimental de Ciencias para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología. La Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela. 2011. 56p.
RESUMEN
El cultivo de camarones (Litopenaeus vannamei), es considerada una alternativa de producción para los países en vías de desarrollo, debido a los ingresos que esta actividad puede generar; pero el crecimiento tan vertiginoso de la misma trajo consigo consecuencias irreparables, que provocó la aparición de problemas causados por distintos agentes (bacterias, hongos, parásitos y virus); estos últimos reportan pérdidas muy importantes (90%). En Venezuela a mediados del 2004 nuestras zonas productoras se vieron afectadas por la presencia del Virus del Síndrome del Taura (TSV), se piensa que el establecimiento de este ha impedido el desarrollo adecuado de esta actividad en el país. Por lo que estimar su prevalencia es fundamental, para aplicar los correctivos que sean necesarios, esta se determino a través de dos métodos de diagnóstico (Molecular e Histológico), en 240 muestras de camarones provenientes de piscinas de producción (PP) que utilizan el Lago de Maracaibo para cubrir sus requerimientos de agua. Los resultados indicaron que el TSV esta presente en la zona estudiada con prevalencias que van del 5 al 40% aproximadamente, el mismo se identifico desde la realización del primer muestreo (30 días de ser colocadas la post-larvas en las PP), se tiene que la mayor proporción de individuos infectados se ubico a las salidas de las PP, siendo esta la zona con mayor concentración del virus. La PP mas enferma fue la “A”; la misma es la primera en recibir el agua, con lo que podemos inferir que esta juega un papel fundamental en el establecimiento y diseminación del virus. En el análisis de las muestras se identificaron las diferentes fases de una infección causada por TSV, la distribución de cada una de ellas fue variable en relación, a la época de muestreo y a posición dentro PP, por lo que se recomienda tratarlas individuamente. Palabras Clave: comportamiento, TSV, camarones, métodos de diagnóstico, histología, PCR, Lago de Maracaibo.
Correo electrónico: [email protected]
Montiel-Villalobos, María I: TAURA SYNDROME VIRUS BEHAVIOR ON CULTIVATED SHRIMP (Litopenaeus vannamei) WITH WATER IN LAKE MARACAIBO DURING A PRODUCTION CYCLE. Degree Thesis submitted to the Division of Graduate Studies, Faculty Experimental of Sciense, La Universidad del Zulia, eligibility for the Title of Magister Scientiarum in Microbiology. Maracaibo, Venezuela, 2011. 56p.
ABSTRACT
The cultivation of shrimp (Litopenaeus vannamei), is considered a production alternative for developing countries, due to revenues that this activity can generate; But such rapid growth brought the same irreparable consequences, which led to the emergence of problems caused by different agents (bacteria, fungi, parasites and virus), the latter reported major losses (90%). In Venezuela in mid-2004 our production areas were affected by the presence of Taura Syndrome Virus (TSV), there is thought that the establishment of this one has prevented the suitable development of this activity in the country. For what to estimate his prevalence is fundamental, to apply the corrections that are necessary, this was determined by two diagnostic methods (Molecular and Histological), in 240 samples of shrimp from pools of production (PP) using the Maracaibo Lake to cover their water requirements. The results indicated that TSV is present in the study area with prevalence ranging from 5 to 40% approximately, it was identified since the realization of the first sampling (30 days of being placed post-larvae in the PP), had that the major proportion of infected individuals is located to the exits of the PP, being this the zone with major concentration of the virus. The sicker PP was the "A"; the same one is the first to receive the water, with what we can infer that this one plays a fundamental paper in the establishment and dissemination of the virus. In the analysis of the samples there were identified the different phases of an infection caused by TSV, the distribution of each one of them was variable in relation,To the epoch of sampling and to position inside PP, so it is recommended to treat individually. Keywords: behavior, TSV, shrimp, methods of diagnosis, histology, PCR, Lake Maracaibo. Email: [email protected]
11
Comportamiento del Virus del Síndrome del Taura en camarones (Litopenaeus vannamei) cultivados con agua del Lago de Maracaibo durante un ciclo de producción. Realizado por Ing. Agr. María Isabel Montiel V. 2011
INTRODUCCIÓN
Al tratar de definir el término acuicultura, muchos de los investigadores tienen una
definición diferente, que va desde la más sencilla hasta la más compleja, sin embargo,
todas emplean la misma base o idea central: la cría de organismos acuáticos (peces,
moluscos, crustáceos y plantas) en confinamiento, implicando la intervención humana
en el proceso, con lo que se mejora el nivel de producción para la obtención de
beneficios económicos y sociales (FAO, 2008). Adicionalmente, la acuicultura ha sido
considerada como una actividad multidisciplinaria, ya que depende de conocimientos
específicos de biología pesquera, fisiología, genética, botánica, zoología, ecología,
patologías, así como de química de suelos y aguas para lograr su adecuado desarrollo
y control (Juárez y Palomo, 1985). A partir de estas premisas podríamos definir a la
camaronicultura como una actividad productiva, multidisciplinaria, en la cual se crían
camarones en confinamiento con el objetivo principal de producir un beneficio
económico, social y alimentario.
La producción camaronícola a nivel mundial tiene un gran auge, siendo ésta la única
industria primaria que ha logrado un crecimiento constante desde sus inicios en la
década de los setenta (Josupeit y Lem, 2000), La misma ha tomando importancia
mundial debido principalmente, a que la pesquería industrial y artesanal son
sumamente costosas, haciéndolas poco atractivas para los pescadores artesanales e
industriales (Álvarez, 1998). Y si adicionalmente consideramos que para el año 1993 ya
se reportaba una sobreexplotación de las zonas de producción, con lo cual estas
estaban llegando a su limite de extracción, la acuicultura surge como una nueva
alternativa para suplir la demanda de productos de origen pesquero a una población
que crece exponencialmente día tras día (García, 1993). Además, considerando que la
demanda mundial de productos pesqueros, y más específicamente del camarón, es de
aproximadamente el 20% de todas las exportaciones pesqueras, la camaronicultura
representa una alternativa de producción para países en vías de desarrollo (Brock,
1997).
INTRODUCCIÓN 12
Comportamiento del Virus del Síndrome del Taura en camarones (Litopenaeus vannamei) cultivados con agua del Lago de Maracaibo durante un ciclo de producción. Realizado por Ing. Agr. María Isabel Montiel V. 2011
La camaronicultura en Latinoamérica aún no se ha establecido completamente,
aunque la misma ofrece una tasa interna de retorno muy alta; se requiere de elevados
costo de producción, y si los insumos no son utilizados racionalmente, no se garantiza
cubrir los gastos de instalaciones, materia prima, personal, alimento, entre otros
(Cervigon,1983). Sin embargo, no hay duda de que puede llegar a establecerse como
una industria sólida y proveer el camarón de mejor calidad que pueda ser puesto en el
mercado, además de hacerlo de una forma sostenible tanto social como
medioambientalmente; ya que la misma a sido catalogada como actividad conciliadora
con el medio ambiente porque en ella pueden ser utilizados suelos de baja
permeabilidad y con alto contenido de sales, los cuales, bajo otras condiciones no
podrían ser incorporados en algún tipo de actividad agrícola (Alpuche y col., 2005).
En Venezuela, las primeras prácticas a nivel experimental que se dieron con la
producción de camarones fueron en el año 1974, pero no fue hasta los ochentas que se
logró la domesticación y desove de las especies (Cervigon, 1983). De esta manera, en
los años noventa se da inicio a un crecimiento pausado pero constante de la industria
camaronera venezolana, con un futuro promisorio debido a las características
biogeografías y condiciones ambientales favorables del país, por lo que ya para
mediados del año 2000 la industria se desarrollaba de manera sostenible; y si se
compara la producción de camarón en Latinoamérica con la industria camaronícola
Venezolana esta superaría la producción de otros países establecidos y reconocidos
como grandes productores (Aguirre, 2001).
En los últimos años la camaronicultura ha logrado un desarrollo importante, a pesar
de los problemas biológicos, tecnológicos y económicos que han impedido su óptimo
desarrollo (FAO, 2006). A escala global, la industria del camarón ha experimentado
pérdidas devastadoras ocasionadas por la aparición de enfermedades, que en su
mayoría son de índole viral (Pendini, 1984; Rodríguez, 1998). La presencia de
enfermedades bacterianas, micóticas y protozoarias entre otras, son fácilmente
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Comportamiento del Virus del Síndrome del Taura en camarones (Litopenaeus vannamei) cultivados con agua del Lago de Maracaibo durante un ciclo de producción. Realizado por Ing. Agr. María Isabel Montiel V. 2011
controlables con adecuadas medidas de bioseguridad (Lotz, 1997; Lightner, 2005); ya
que en la mayoría de los ocasiones son causadas por agentes que forman parte de la
microflora normal de ecosistemas en las piscinas de producción, que bajo condiciones
de estrés del hospedador se vuelven patógenas, cuando se afectar el equilibrio natural
de estos (Guzmán y col., 2004; Gómez, 2006; Gullian y Rodríguez, 2002).
Caso contrario sucede con las enfermedades virales ya que cuando éstas se
establecen su diseminación es abrumadora y si no se maneja adecuadamente pueden
llegar a reportarse mortalidades de hasta el 100% (Brock, 1997; Alvares, 1998;
Morales, 2004). Por esta razón las enfermedades de origen viral se consideran como
uno de los mayores problemas de la industria, hasta la fecha se han identificado más de
20 tipos de virus que afectan la producción camaronícola a nivel mundial (Lightner y
Redman, 1998; Aguirre, 2001); a las enfermedades virales se le atribuyen perdidas
estimadas en billones de dólares y el colapso de grandes industrias productoras como
es el caso de Taiwán en 1987, China en 1992, Ecuador en 1994 y 1999 y Venezuela en
el 2004, entre otras (Chávez y Montoya, 2004; Conroy, 2005).
El TSV fue identificado por primera vez en la región del río Taura del Ecuador, de allí
su nombre “Virus o Síndrome del Taura” (TSV) (Morales, 2004; Brock y Main, 1994), y
hasta 1996 se pensó que la distribución del virus se limitaba a las zonas productoras de
América (Lightner, 1996); esta teoría fue rechazada cuando el virus fue aislado por
primera vez en Taiwán, donde causó grandes pérdidas económicas (Yu y Song, 2000);
se estima que las pérdidas o mortalidades causadas por este virus son acumulativas y
van desde un 40% pudiendo llegar alrededor del 95% (OIE, 2009). El TSV es un virus
de ARN que se replica en el citoplasma de la célula huésped, el tamaño promedio de
una partícula de TSV es 30 - 32nm (Pantoja y Lightner, 2008; Morales, 2004) de
morfología icosaédrica; clasificado dentro del género Dicistroviridae y se ubica entre los
virus que no tienen familia asignada, (ICTV, 2008; Mayo, 2005).
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Esta infección viral es típica de la fase de engorde y ocurre aproximadamente entre
los 14 y 40 días después de que son introducidas las postlarvas (PLs) en los estanques
o piscinas de producción (OIE, 2009; Lightner y Pantoja, 2005, Morales, 2004); en
campo puede ser identificada por una coloración rojiza de los apéndices y del cuerpo en
general, también se muestra zonas de melanización y necrosis en el exoesqueleto
además de dificultad para endurecerlo, pérdida del apetito y debilitamiento que conlleva
a una muerte segura (Lightner y Pantoja, 2005; Conroy, 2007; Morales, 2004). Esta
sintomatología puede ser confundida con una vibriosis la cual es una enfermedad de
origen bacteriano (Lightner y Pantoja, 2005). Razón por la se tiene que confirmar la
presencia o ausencia de cualquier patógeno a través de los distintos métodos de
diagnóstico existente, la utilización de uno o el conjunto de ellos dependerá de
diferentes factores como sensibilidad, especificad, experiencia requerida y costo (Vélez
y Bonami, 2006), mientras para el caso especifico de los virus dependería del que se
desea identificar (Lightner, 2005).
El cuerpo del camarón (exoesqueleto) por sí solo ya crea una barrera física que
impide la entrada de patógenos, ya sean los que tratan de penetrar a través de la
superficie externa, o los que intentan hacerlo a través del intestino anterior y posterior
(Jiravanichpaisal y Miyazaki, 1997; Alday - Sanz y col., 2002; Lightner y Pantoja, 2005);
cuando se supera esta barrera inicial y se da la exposición inicial la respuesta celular es
variada, que en el caso especifico de una infección por TSV las reacciones celulares se
traducen en infiltraciones hemocitarias y en la formación de esferoides en el órgano
linfoide, el cual tiene como función principal limpiar la hemolinfa de las partículas virales
circulantes (Hasson y col., 1999a). En este punto el desarrollo de una infección por TSV
es inevitable ya que se dispersaran las partículas virales a través del hemoceloma
(cavidad que contiene al hemolinfa) del camarón.
Durante los estadios previos a la ecdisis (la cual ocurre aproximadamente cada 15
días). Las células del epitelio cuticular son altamente activas siendo un blanco ideal
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para el desarrollo del virus, el TSV comienza a replicarse a expensas de las funciones
normales de estas células; en este punto nos encontramos en la etapa aguda de una
infección por TSV, esta se manifestara con mayor intensidad en los estadios críticos de
la ecdisis, muchos de los camarones mueren durante esta etapa; los que sobreviven a
la muda entran en la fase crónica o de transición de la enfermedad y generalmente
exhiben lesiones melanizadas en la cutícula, los camarones afectados en estas fases
pueden sufrir otro episodio agudo de la enfermedad durante la siguiente muda o bien
puede que lleguen a mudar normalmente y recuperarse. Durante la etapa crónica de la
infección los camarones pueden ser portadores del virus pero se ignora por cuanto
tiempo, se creer que la persistencia del virus podría llegar a ser de hasta 12 meses
(Hasson, 1999b; Pantoja y Lightner, 2008).
Mediante el diagnóstico histológico se pueden identificar las diferentes fases de una
infección por TSV: Fase aguda: en ella visualizaran áreas multifocales de necrosis en el
epitelio cuticular y en la superficie general del cuerpo, los apéndices, las branquias y en
la parte caudal-anterior del tubo digestivo, las células del tejido conectivo subcuticular y
las fibras basales del músculo estriado adyacentes al a este están ocasionalmente
afectadas. En algunos casos graves de la fase aguda del TSV, el epitelio de la glándula
antenal también está destruido, generalmente se evidencian numerosos focos de
células afectadas que muestran una aumentada eosinofilia en el citoplasma y núcleos
picnóticos y cariorréticos, a menudo estas lesiones son muy en la fase aguda. Los
restos citoplasmáticos de las células necróticas presentaran por lo general cuerpos
esféricos (1–20μm de diámetro) cuya tinción varía de eosinófila a débilmente basófila,
estas estructuras, junto con los núcleos picnóticos y cariorréticos, son consideras como
patognomónica para la enfermedad, y es utilizada para la identificación cuando no hay
necrosis concurrente de las células parenquimales de los túbulos del órgano linfoide.
Por otra parte la ausencia de infiltración hemocítica y de otros signos de una respuesta
inflamatoria importante del hospedador distingue la fase aguda del TSV de la fase de
transición. (Morales, 2004; OIE, 2009; Hasson y col., 1999a; Lightner y Pantoja, 2005).
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Fase de transición o de recuperación:
En la fase de transición del TSV, las
lesiones cuticulares disminuyen tanto en cantidad como en gravedad, y son
reemplazadas por una abundante infiltración e acumulación de hemocitos en los lugares
de necrosis. Las masas de hemocitos pueden melanizarse dando lugar a manchas
negras irregulares que caracterizan la fase de transición de la enfermedad (OIE, 2009).
El órgano linfoide en esta fase de una infección por TSV, presentara esferoides tipo B,
así mismo se puede evidenciar una mayor destrucción celular con los que se supone
una mayor replicación viral (Hasson y col., 1999a).
Fase crónica
; en esta fase los animales no manifiestan síntomas generales, e
histológicamente el único signo de infección es la presencia de numerosos esferoides
Tipo C en el órgano linfoide, que pueden permanecer asociados al cuerpo principal del
órgano linfoides, o que pueden independizarse y convertirse en los esferoides
prominentes (OIE, 2009; Hasson y col., 1999a).
La utilización de métodos de detección moleculares ha facilitado el estudio de los
virus, con ellos se han logrado identificar la secuencia del TSV, con lo que se ha
conseguido definir las diferentes variantes de este (Côte y col., 2008), así como facilitar
los diagnósticos confirmatorios, disminuyendo el tiempo de respuesta. Además con la
utilización de estos métodos también se pueden identificar las diferentes fases de una
infección causada por TSV ya sea a través de la utilización de sistemas de diagnósticos
comerciales (IQ2000 TSV), o el uso de primer preparados (Aguado y col., 2008; Cuéllar,
2008).
En Venezuela los principales problemas de enfermedades identificadas en camarón
eran los causados por protozoos epibiontes, hongos, bacterias filamentosas,
gregarinas, rickettsias, bacteria del genero vibrio, parásitos metazoos y algunos virus
como es el caso de Baculovirus penaei (BVP) y el virus de la Necrosis Infecciosa
Hipodérmica y Hemocítica (IHHNV). A finales del año 2004, se identificó la presencia
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del TSV en las zonas de producción, este virus había sido reportado en otras zonas a
nivel mundial pero no en Venezuela (Conroy, 2005). Muchos factores influyen en la
diseminación de una enfermedad viral como: el movimiento de organismo acuáticos
(vivos o muertos), el tráfico de organismos (reproductores o postlarvas) sin la adecuada
certificación sanitaria, aguas contaminadas, presencia en especies silvestres, entre
otros (Chávez y Montoya, 2004).
Luego de la confirmación de la presencia del TSV, se implementaron medidas de
bioseguridad con la finalidad de evitar más diseminación, algunas de estas medidas
fueron: 1) la prohibición del movimiento de animales dentro y fuera del país, y 2) la
importación de larvas. Actualmente, no se llevan reportes acerca del estatus sanitario
de las zonas de producción Venezolanas, sin embargo, los productores afirman que sus
problemas de altas mortalidades con bajos porcentajes de supervivencia, baja talla y
peso al momento de la cosecha, se deben en gran medida a esté desconocimiento, y
por esta razón consideran que la industria no se está desarrollando adecuadamente
(Conroy, 2007).
Por todas estas razones, es necesario evaluar la presencia del TSV en zonas de
producción venezolanas, lo cual permitirá conocer la prevalencia del virus, con lo cual
se puede inferir posteriormente sobre la situación sanitaria de las granjas camaroneras
que utilizan el agua proveniente del Lago de Maracaibo, para realizar su actividad, y
establecer algunas pautas sobre lo que está sucediendo en la industria camaronera
Venezolana, la cual no ha logrado recuperarse de lo sucedido en el año 2004 con la
entrada y establecimiento del TSV en el país.
INTRODUCCIÓN 18
Comportamiento del Virus del Síndrome del Taura en camarones (Litopenaeus vannamei) cultivados con agua del Lago de Maracaibo durante un ciclo de producción. Realizado por Ing. Agr. María Isabel Montiel V. 2011
Objetivo general:
Evaluar el efecto de la presencia del Virus del Síndrome del Taura durante el
crecimiento de camarones (L. vannamei) en un ciclo de producción.
Objetivos específicos:
• Determinar la zona con mayor nivel de Virus del Síndrome del Taura en las
piscinas de producción.
• Determinar el comportamiento del Virus del Síndrome de Taura dentro de la
piscina de producción durante un ciclo.
• Establecer las diferentes fases de infección del Virus del Síndrome del Taura
mediante el diagnóstico histopatológico en camarones (L. vannamei) durante un
ciclo de producción.
• Determinar la prevalencia del Virus del Síndrome del Taura en camarones (L.
vannamei) durante un ciclo de producción.
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Comportamiento del Virus del Síndrome del Taura en camarones (Litopenaeus vannamei) cultivados con agua del Lago de Maracaibo durante un ciclo de producción. Realizado por Ing. Agr. María Isabel Montiel V. 2011
METODOLOGÍA
Población de Estudio
La población objeto de estudio estuvo compuesta por camarones (L. vannamei) de
una población cultivada con aguas del Lago de Maracaibo, específicamente en una
granja situada en la costa occidental, Municipio La Cañada de Urdaneta en el estado
Zulia. Los muestreos se realizaron durante un ciclo de producción, pasados 30 días de
la siembra de las postlarvas (PLs) en las piscinas de producción (PP) hasta la cosecha,
la cual ocurrió aproximadamente a los 120 días.
Colección, fijación y preservación de las muestras
Se empleó una atarraya para recolectar los animales en cada una de las zonas
seleccionadas dentro de las PP (Anexo 1). La muestra estuvo constituida por 240
organismos seleccionados aleatoriamente dentro de las PP. Los muestreos se iniciaron
pasados 30 días de la siembra de las PLs. Se realizaron cuatro muestreos, separados
entre sí por 30 días aproximadamente y se evaluaron cuatro piscinas, en ellas se
establecieron tres zonas de muestreo: 1) compuerta de entrada a la PP, 2) parte media
de la PP, y 3) salida de la PP (Anexo 2). Se colectaron 60 individuos por muestro,
distribuidos como lo indica la (Tabla 1).
Tabla 1.- Distribución de los animales por Muestreo.
Posición dentro de la piscina de producción (PP)
Piscina de Producción Entrada Medio Salida
A 5 5 5
B 5 5 5
C 5 5 5 Total D 5 5 5 60
METODOLOGÍA 20
Comportamiento del Virus del Síndrome del Taura en camarones (Litopenaeus vannamei) cultivados con agua del Lago de Maracaibo durante un ciclo de producción. Realizado por Ing. Agr. María Isabel Montiel V. 2011
Los camarones extraídos de cada una de las PP se colocaron en cestas plásticas
que facilitaban el manejo de las muestras, de allí se seleccionaron aleatoriamente los
cinco animales que conformaron esa zona de muestreo, estos se colocaron en una
cubeta con suficiente agua (proveniente de la misma piscina). Se procuró generar el
menor estrés posible a los animales, este procedimiento se repitió en cada una de las
zonas dentro de la PP y en cada una de las piscinas seleccionadas.
Para fijación de las muestras empleadas en el diagnóstico molecular se utilizaron los
pleópodos de los animales ya seleccionados, separados en dos grupos: 1) el “pool” de
la posición correspondiente a cada punto en la PP: el cual estaba constituido por
pleópodos de los cinco animales colectados en esa zona; y 2) muestras individuales:
conformada por pleópodos de cada individuo. Todas las muestras fueron colocadas en
viales con etanol al 95% los cuales se organizaron en cajas plásticas debidamente
identificadas, y se conservaron el laboratorio en un lugar limpio y fresco hasta el
momento de su procesamiento (Anexo 3).
Luego de la fijación de las muestras que fueron empleadas para el diagnóstico
molecular, se procedió a fijar el material que se utilizaría en el diagnóstico histológico,
utilizando como solución fijadora (Davidson), la cual debe ser preparada con
anterioridad utilizando: 330 ml de etanol al 95%, 220 ml de Formalina al 36%, 115 ml
de Acido Acético Glacial y 335 ml de agua destilada (Bel y Lightner, 1998).
Para realizar un fijado adecuado, se utilizó una cantidad de solución fijadora
equivalente al 10% del peso del animal y se inyectó en diferentes puntos del cuerpo.
Iniciando por el área lateral, directamente en el hepatopáncreas (en sus laterales y en
su parte anterior y posterior); todo signo de vida debe cesar, luego se inyecta la
solución fijadora en diferentes puntos de la región abdominal, el tejido muscular debe
hacer un cambio en la coloración como si hubiese sido cocido el camarón, para asegura
un fijado adecuado; Se debe tener especial cuidado con el hepatopáncreas y la región
METODOLOGÍA 21
Comportamiento del Virus del Síndrome del Taura en camarones (Litopenaeus vannamei) cultivados con agua del Lago de Maracaibo durante un ciclo de producción. Realizado por Ing. Agr. María Isabel Montiel V. 2011
cefalotorácica. Luego de inyectar la solución fijadora, se cortó la cutícula con unas
tijeras de disección desde el sexto somite abdominal hasta la base del rostrum, con
especial cuidado de no cortar profundamente en el tejido subyacente. Esta incisión se
realizó en la región del cefalotórax justo en la línea media-dorsal; cuando los camarones
tuvieron un peso mayor de 12 gramos se cortó además en forma transversal sobre la
unión del abdomen y el cefalotórax. Posteriormente cada camarón fue debidamente
identificado antes de ser colocado en un envase contenedor, estos envases poseían la
cantidad necesaria de la solución fijadora para cubrir los camarones, transcurrido un
período de 24 horas se transfirieron a una solución de etanol al 70% (Bel y Lightner,
1998). Estos envases plásticos se conservaron en cajas de cartón el laboratorio en un
lugar limpio y fresco hasta su procesamiento (Anexo 4).
Procesamiento de las Muestras
Este se realizo a través de dos técnicas diferentes: a) diagnóstico molecular, y b)
diagnóstico histológico. Es importante resaltar que el diagnóstico molecular se realizó
inicialmente sobre cada “pool”, y en los que resultaron positivos se aplicó la
identificación de cada uno de los animales que conforman dicho “pool” para de esta
manera identificar así a los individuos enfermos.
a) Diagnóstico molecular: se utilizó el kit comercial “IQ2000 TSV” para la
determinación del TSV, de la casa comercial Farming IntelliGene, (2008), el diagnóstico
molecular del TSV por RT-PCR se completó tras la realización de las siguientes etapas
(Anexo 5).
Extracción del ARN: se colocó la muestra (pleópodos) en tubos de 1.5ml con 500ul
de solución de extracción. La muestra en el tubo fue macerada con un dispositivo
desechable y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Posteriormente, se
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adicionaron 100ul de cloroformo y se mezcló en vortex por 20 segundos. Se dejó a
temperatura ambiente durante 3 minutos y luego se centrifugó a 12000rpm durante 15
minutos. Seguidamente se transfirieron 200ul de la fase acuosa superior a un tubo
nuevo de 0.5ul conteniendo 200ul de isopropanol. Se mezcló con en vortex por 3
segundos y luego se centrifugó a 12000 rpm durante 10 minutos. El pellet se lavó con
0.5ml de etanol 75% y luego se centrifugó a 9000rpm durante 5 minutos para aislar el
ARN del pellet. Posteriormente, se desechó el etanol y se dejó secar el pellet a
temperatura ambiente durante 10 minutos. Finalmente, el pellet se disolvió en 500ul de
DEPCddH2
O. Esta fue la solución stock, la cual fue dividida en alícuotas de trabajo
(100ul c/u aproximadamente).
Amplificación por RT-PCR:
se aplicaron dos recetas y perfiles térmicos para la
amplificación del TSV.
- Receta y perfil térmico 1 (RT-PCR): Por cada muestra se preparó un coctel con un
volumen total de 8ul, constituidos por 7ul de la mezcla Pre RT-PCR, 0.5ul de la
ADN polimerasa IQzyme y 0.5ul de la mezcla de RT enzima, todos los reactivos
incluidos en el kit “IQ2000TSV”. Posteriormente, se añadieron 2ul del ARN extraído,
el cual se amplificó bajo el siguiente perfil térmico: 1 ciclo 42°C (30 min); 1 ciclo
94°C (2min); 15 ciclos 94°C (20seg), 62°C (20seg), 72°C (30seg); 1 ciclo 72°C
(30seg); 1 ciclo 20°C (30seg); ciclo final de tiempo indefinido a -4°C.
- Receta y perfil térmico 2 (PCR anidado): El coctel para esta receta fue preparado
con 14ul de la mezcla Pre Nested PCR y 1ul de la ADN polimerasa IQzyme,
obteniendo un volumen total de 15ul y amplificando bajo el siguiente perfil térmico:
30 ciclos 94°C (20seg), 62°C (20seg), 72°C (30seg); 1 ciclo de 72°C (30seg); 1 ciclo
de 20°C (30seg); ciclo final de tiempo indefinido a -4°C.
METODOLOGÍA 23
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Finalmente, los tubos con los productos amplificados fueron colocados en una
gradilla sobre hielo, añadiendo a cada tubo 5ul de 6X LoadingDye y mezclando
suavemente.
Visualización en geles de agarosa 2%:
Los geles fueron preparados mezclando
0.3gr de agarosa normal con 30ml de buffer TBE 1X. En cada pozo del gel se cargaron
de 5 a 10ul aproximadamente de cada producto amplificado y en el último pozo se
cargaron 5ul del marcador de peso molecular. Las condiciones de corrida fueron 100-
150 voltios durante 15 minutos. Posteriormente, se tiñó el gel sumergiéndolo en 500ml
aproximadamente de una solución 10mg/ml de Bromuro de Etidio, y se dejó a oscuras
completamente por 10 minutos a temperatura ambiente. El gel se transfirió a un envase
plástico con agua destilada para lavarlo durante 10 minutos y finalmente fue colocado
sobre el transiluminador UV para visualizar los productos amplificados.
b) Diagnóstico histológico: se empleó la metodología descrita por Bell y Lightner,
1988 en el Manual para Histología del Camarón Penaeido normal, siguiendo los pasos
(Anexo 6 y 7).
Preparación para el embebido: los camarones preservados en etanol 70%, fueron
colocados en una tabla de plástico. Se removió el 80% de los apéndices de la cabeza, y
luego se corto transversalmente entre la unión del cefalotórax y el abdomen.
Seguidamente, el cefalotórax fue cortado longitudinalmente justo al lado de la línea
media, y a la porción de cefalotórax que quedó fuera de la línea media se le extrajo la
región branquioestegal (branquias) a través de un corte diagonal. Del abdomen se
cortaron los segmentos abdominales (# 1, 3 y 6) y se removieron las terminaciones
distales (urópodos). El segmento # 6 fue cortado longitudinalmente, de la misma
manera que el cefalotórax. Las porciones de tejidos no excedieron a ¼ pulgada de
espesor en su dimensión más ancha para garantizar el cierre total del “casette de
embedido”.
METODOLOGÍA 24
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Embebido en Parafina:
según la metodología descrita por Bel y Lightner, 1998; las
cajas de embebido se procesaron con un Histoquinette, cargado con las siguientes
soluciones: etanol al 70% (por duplicado 1 hora cada baño), etanol 80% (por duplicado
1 hora c/u), etanol al 95% (por duplicado 1 hora c/u), etanol al 100% (por duplicado 1
hora c/u), agente clarificador [xileno] (por duplicado 1 hora cada uno), y Parafina
[ParaplastTissueEmbeddingMedium, de la casa comercial McCormick] (por duplicado 1
hora cada uno); totalizando 12 horas de procesamiento.
Formación de Bloques:
luego que los tejidos son sacados del procesador se colocan
en moldes, los tejidos se orientan dependiendo de cómo se requiera en corte del tejido
(vertical u horizontal), para la realización de este paso empleo una pinza, un baño de
maría para derretir la parafina, y un molde cuadrado para formar los bloques.
Corte de los tejidos:
se realizaron con un micrótomo marca Leica número RM
2125TR. Se ajustó el grosor del corte a 3.5micras, se inició con el desbastado del
bloque y cuando el listón comenzó a salir completo, se conservó colocándolo en el porta
objeto y distendiéndolo con ayuda del baño de maría (a temperatura media). Cuando el
corte era seleccionado se mantuvo en el porta objeto y este colocó en la plancha
caliente por un período de media hora; esto secara y fijara el tejido para posteriormente
realizar la tinción de las laminillas.
Tinción:
Se empleó la tinción estándar según H&E Mayer-Bennet, con los siguientes
períodos de tinción:
- Hemo De – 5 min
- Hemo De – 5 min
- EtOH al 100% - 10 inmersiones
- EtOH al 100% - 10 inmersiones
- EtOH 95% - 10 inmersiones
METODOLOGÍA 25
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- EtOH 95% - 10 inmersiones
- EtOH 80% - 10 inmersiones
- EtOH 80% - 10 inmersiones
- EtOH 50% - 10 inmersiones
- Agua destilada – 6 lavadas (con cambio de agua por cada enjuague)
- Hematoxilina – de 4 a 6 minutos
- Enjuague al chorro de agua – de 4 a 6 minutos
- Floxina/eosina – 2 minutos
- EtOH al 95% - 10 inmersiones
- EtOH al 95% - 10 inmersiones
- EtOH al 100% - 10 inmersiones
- EtOH al 100% - 10 inmersiones
- Hemo De – 10 inmersiones
- Hemo De – 10 inmersiones
- Hemo De – 10 inmersiones
- Hemo De – 10 inmersiones
- Cubierta con Permount® (Fisher Scientific)
- Etiquetas
Los datos obtenidos de las muestras procesadas, se transformaron a frecuencias y
analizados mediante una prueba de Chi-cuadrado, para determinar así las diferencias
existentes entre ellos, mediante el programa SigmaPlot versión 11.0.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos mediante el diagnóstico histológico y molecular sugieren
que la definición de un área o punto de muestro es fundamental para toda investigación
realizada en camarones, tal como lo sugiere Morales (2004). Menciona que la definición
del área se realiza dependiendo del diagnóstico requerido: 1) Conocer la presencia o
ausencia de una enfermedad (mediante un muestreo dirigido sobre animales enfermos
en las salida de la Piscina de Producción) y/o 2) Un monitoreo de sanidad (mediante un
muestreo aleatorio en distintos zonas de la Piscina de Pkkroducción, considerando una
prevalencia mínima y un nivel de confianza definido).
En la Tabla 2 se observa que el diagnóstico histológico presenta una diferencia
estadísticamente significativa (p<0,001), en la proporción de animales infectados y no
infectados entre las zonas de muestreo; mientras que en el diagnóstico molecular solo
se consiguieron animales enfermos a la salida de la PP (Tabla 3).
Tabla 2.- Proporción de animales infectados / no infectados según la zona de
muestreo dentro de las PP mediante el diagnóstico histológico.
Condición Zona dentro de la PP X P 2 Piscina de Producción Entrada Medio Salida
Infectados 30 45 70 32,620 <0,001 A
No Infectados 70 55 30 Infectados 15 20 10
3,922 0,141* B No Infectados 85 80 90
Infectados 40 20 60 33,333 <0,001 C
No Infectados 60 80 40 Infectados 15 0 20 28,800 <0,001 D No Infectados 85 100 80
*El poder de la pruebas realizada (0.394) es inferior a la potencia deseada de 0.800, indicando que las probabilidades de detectar una diferencia, cuando realmente existe, son menores y los resultados deben ser interpretados con cautela.
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Tabla 3.- Proporción de animales infectados / no infectados según la zona de
muestreo dentro de las PP mediante el diagnóstico molecular.
Condición Zona dentro de en la PP Piscina de Producción Entrada Medio Salida
Infectados 0 0 6,67 A No Infectados 100 100 93,33
Infectados 0 0 3,33 B No Infectados 100 100 96,67
Infectados 0 0 8,33 C No Infectados 100 100 91,67
Infectados 0 0 0 D No Infectados 100 100 100
Esta distribución desigual de animales infectados y no infectados detectados en
ambos métodos sugieren que la salida de la PP es el lugar idóneo para muestrear,
cuando se sospeche de la presencia del TSV, estos resultados coinciden con lo
reportado por Conroy (2007) que menciona que toda situación de estrés dentro de la PP
va a contribuir al debilitamiento general de los organismos, el cual va a permitir que
estos sean fácilmente arrastrado con ayuda del movimiento natural de las aguas a la
compuerta de salida de las PP.
Esta información debe ser considerada en los manejos dentro de las granjas
producción para modificar algunas de sus prácticas, como por ejemplo, la de los
recambios de aguas de fondo, basados en la creencia que el patógeno que mas afecta
a los camarones son las bacterias del género vibrio, apoyados en el hecho de utilizar
organismos libres de patógenos (SPF) y resistentes a TSV. Los trabajadores
responsables de las granjas de producción consideran que un recambio de agua de
fondo ayudaría a disminuir la carga bacteriana presente en el ecosistema y así la
enfermedad de manera temporal. En el caso de las infecciones virales esta práctica no
es adecuada debido a que disemina el virus a otras granjas productoras vecinas (Lotz,
1997; Chávez y Montoya, 2004), corriendo el riesgo de causar una epizootia como la
que paralizó la industria camaronera de Venezuela en el año 2004 (Conroy, 2005).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 29
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En el Gráfico 1 se logra observar como se concentran los animales infectados en
las compuertas de salida de las distintas PP estudiadas, y como ya se menciono, este
fenómeno podría estar asociado al movimiento típico de las aguas.
Gráfico 1.- Proporción de animales infectados según la zona de muestreo dentro de
las PP empleando el diagnóstico histológico.
Enfocándonos en la proporción de animales infectados en cada una de las PP
estudiadas; la piscina “A” muestra el mayor porcentaje (70%) de animales infectados; y
según la distribución de las piscinas con relación a la entrada de agua, en esta granja
de producción, ella seria la primera en recibirla. Si la calidad de esta no es la adecuada,
todo el ecosistema podría verse afectado, ya que en ocasiones el agua funciona como
el mejor vehículo diseminador de los agentes patógenos (Lotz, 1997; Lightner, 2005).
Así mismo se observa que ha medida que las piscinas se alejan del punto de
entrada de agua, la proporción animales infectados disminuye. Lo cual podría estar
asociado a que la calidad del agua tendería a ir mejorando a medida de que las piscinas
se alejan de la fuente de entrada, debido a la sedimentación natural de las partículas a
lo largo del recorrido por el canal. Esto no se cumple en la piscina “C” y podría estar
asociado a una mala desinfección de la piscina luego de ser cosechada, o a
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condiciones muy especificas dentro ella que deben ser definidas en posteriores
investigaciones; ya que según los registros históricos de la granja esta piscina en
repetidas oportunidades ha presentado problemas de altas mortalidades.
Al comparar los resultados del diagnóstico histológico y el molecular, se puede
afirmar que el histológico mostró mayor sensibilidad que el molecular en la detección
del TSV, esto difiere de lo reportado por Lightner, (2005) ya que considera que ambas
técnicas proporcionan el mismo grado de sensibilidad en cuanto a la detección de este
virus. Además, si tomamos en cuenta que el sistema de detección IQ2000 (Farming
IntelliGene, 2008); de TSV indica que existe un limite de carga viral para funcionar
adecuadamente, el cual está asociado al tipo de órgano utilizado del camarón (Nunan y
col., 2004),
Por esta razón consideramos que el análisis molecular por sí solo no mostro
resultados concluyente; es decir deberían ser confirmados utilizando otro método de
detección como en este caso, del diagnóstico histológico. Esto pudiera explicar el hecho
de que parte de las muestras analizadas quedaron por debajo del límite que requiere el
sistema para detectar la carga viral; debido a que algunas de las muestras que
resultaron negativas utilizando el diagnóstico molecular, al ser analizadas mediante en
diagnóstico histológico mostraron cambios característicos de la presencia del TSV en
branquias, epitelio cuticular, músculo así como esferoides en el órgano linfoide;
coincidiendo con lo reportado por Lightner, (1996); Hasson y col., (1999a); Morales,
(2004); Pantoja y Lightner, (2008); OIE, (2009).
Para establecer el comportamiento del TSV en las piscinas y durante el ciclo de
producción los resultados se muestran en la Tabla 4 y 5. En ellas se observa que el
virus se detectó desde el primer muestreo, a través de los dos métodos de diagnóstico
empleados. Estos resultados coinciden con lo reportado por Morales, (2004), quien
estimó que la aparición de una infección causada por TSV podría ocurrir entre los 14 y
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40 días después de colocar las PLs en las PP. Durante los diferentes muestreos se
observaron signos clínicos característicos de una infección por TSV, tales como: a)
incremento en la tasa de mortalidad, b) anorexia, c) coloración roja del telson, urópodos
y pleópodos, d) áreas necróticas en el exoesqueleto coincidiendo con lo reportado por
la OIE, (2009); Hasson y col., (1999b); pero según Lightner y Pantoja, (2005) estos
signos clínicos son fácilmente confundibles con una vibriosis; la cual ésta fue
confirmada mediante simultáneos análisis de laboratorio (Oroño, 2009; Gil, 2009),
definiéndose una infección mixta causada por bacterias del género vibrio y virus TSV.
Tabla 4.- Proporción de animales infectados / no infectados por TSV en cada una de las
fases de la enfermedad en relación a la época de muestreo empleando el diagnóstico
molecular.
Época de muestreo Sanos Fases de Infección
PP Infección Muy Ligera
infección Ligera
Infección Moderada
Infección Severa
Treinta 93,33 0 0 0 6,67*
A Sesenta 100 0 0 0 0 Noventa 100 0 0 0 0
Ciento veinte 100 0 0 0 0 Treinta 96,67 0 0 0 3,33*
B Sesenta 100 0 0 0 0 Noventa 100 0 0 0 0
Ciento veinte 100 0 0 0 0 Treinta 91,67 0 0 8,33* 0
C Sesenta 100 0 0 0 0 Noventa 100 0 0 0 0
Ciento veinte 100 0 0 0 0 Treinta 100 0 0 0 0
D Sesenta 100 0 0 0 0 Noventa 100 0 0 0 0
Ciento veinte 100 0 0 0 0 * Estos resultados se ubicaron solo en las salidas de las Piscinas de Producción
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Tabla 5.- Proporción de animales infectados / no infectados según la época de
muestreo dentro de las PP empleando el diagnóstico histológico.
En la Tabla 5 se evidencian las diferencias significativas (p<0,001) entre la
proporción de animales infectados en cada uno de los muestreos, observándose que en
las piscinas “B” y “C” tal proporción fue mayor en el muestreo realizados a los 30 días.
La tendencia general de las PP fue una presencia elevada del TSV, la cual va
disminuye progresivamente entre los 60 y 90 días, aumentando nuevamente a los 120
días (Gráfico 2). Tal comportamiento pudiera sugerir una reinfección por el TSV, sin
embargo, éste es el ciclo normal de la enfermedad, es decir cuando un organismo se
encuentra infestado en fase crónica o de transición y entra en muda, pueden recaer en
una infección en fase aguda y morir siendo así fuente de inoculo para organismos que
estén sanos por medio del canibalismo o superar la enfermedad (Pantoja y Lightner,
2008; Hasson y col., 1999b).
Condición de los Animales
Días de siembra de las PLs en las PP X P 2 Piscina de
Producción Treinta Sesenta Noventa Ciento veinte
Infectados 30 50 20 50 28,800 <0,001 A
No Infectados 70 50 80 50 Infectados 50 0 10 10 102,165 <0,001 B No Infectados 50 100 90 90 Infectados 70 30 20 50
60,358 <0,001 C No Infectados 30 70 80 50
Infectados 10 0 10 30 43,429 <0,001 D No Infectados 90 100 90 70
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Gráfico 2.- Proporción de animales Infectados según la época de muestreo dentro de
las PP empleando el diagnóstico histológico.
Tabla 6.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las fases de la
enfermedad según la época de muestreo empleando el diagnóstico histológico.
Época de muestreo
Fases de Infección X P 2 PP Sano Agudo Transición Crónico Treinta 30 30 30 10
105,619 <0,001 A Sesenta 50 10 20 20 Noventa 80 0 0 20
Ciento veinte 50 10 10 30 Treinta 50 0 10 40
-- -- B Sesenta 100 0 0 0 Noventa 90 0 0 10
Ciento veinte 90 0 0 10 Treinta 30 40 30 0
144,224 <0,001 C Sesenta 70 10 10 10 Noventa 80 10 0 10
Ciento veinte 50 0 30 20 Treinta 90 5 0 5
62,276 <0,001 D Sesenta 100 0 0 0 Noventa 90 10 0 0
Ciento veinte 70 10 10 0 -- No se realizó ninguna prueba debido a que al menos uno de los valores esperados en la tabla de contingencia es menor que 1 y más del 20% de los valores esperados en la tabla de contingencia es menor que 5, por lo que en esta situación la prueba de Chi-cuadrado puede ser inadecuada.
Piscinas de Producción
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Tabla 7.- Proporción de animales infectados según la zona de muestreo dentro de
las PP mediante el diagnóstico histológico.
Con base en el estudio del comportamiento del TSV, fueron analizadas las fases de
infección establecidas por medio del diagnóstico histológico, en el se observaron
diferencias significativas (p< 0,001), tanto en la proporción de animales infectados en
cada una de las épocas de muestreos (Tabla 6), como en cada una de las zonas
estudiadas (entrada, medio y salida) dentro de la PP (Tabla 7).
Piscina “A”: Durante los muestreos, se observó que la mayor proporción de
animales presentes en las fases aguda y de transición de una infección por TSV se
ubicó a los 30 días, mientras que a los 60 días tal proporción cambió hacia animales en
una fase de infección crónica y de transición; mientras que para los 90 y 120 la fase de
infección por TSV predominante fue la crónica (Gráfico 3).
Si analizamos la distribución del TSV en las diferentes zonas estudiadas dentro de
las PP se observa que la entrada de la PP fue donde se concentró la mayor proporción
Zona de muestreo dentro de la PP
Fases de Infección X P 2 Piscina de Producción Sano Agudo Transición Crónico
Entrada 70 0 15 15 80,390 <0,001 A Medio 55 5 10 30
Salida 30 35 20 15 Entrada 85 0 0 15
-- -- B Medio 80 0 5 15 Salida 90 0 0 10
Entrada 60 5 15 20 61,083 <0,001 C Medio 80 15 5 0
Salida 40 20 30 10 Entrada 85 15 0 0
49,953** <0,001 D Medio 100 0 0 0 Salida 80 5 10 5
-- No se realizó ninguna prueba a que al menos uno de los valores esperados en la tabla de contingencia es menor que 1 y más del 20% de los valores esperados en la tabla de contingencia es menor que 5, por lo que en esta situación la prueba de Chi-cuadrado puede ser bastante inadecuada. ** Estos resultados deben ser interpretados con cautela dado que más del 20% de los valores esperados en la tabla de contingencias menor que 5, y la prueba de Chi-cuadrado puede ser inadecuada
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de animales en fase crónica y en transición, mientras que en la media fueron más
frecuentes los animales en poseían la infección en su fase crónica, y en cuanto a la
salida en la salida se concentraron los animales infectados en fase aguda (Gráfico 4).
Gráfico 3.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las fases de
la enfermedad según la época de muestreo empleando el diagnóstico histológico,
Piscina “A”.
Gráfico 4.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las fases de la
enfermedad según la zona dentro de la Piscina de Producción (PP) empleando el
diagnóstico histológico, Piscina “A”.
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Zona dentro de la PP
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Piscina “C”: La mayor proporción de animales infectados por TSV se observó a la
30 días, los mismos presentaban la enfermedad en la fase aguda, a que a los 60 días la
distribución de ellas fue homogénea, mientras que a los 90 días la proporción cambia a
animales infectados en fases aguda y crónica, en cuanto al ultimo muestreo se tiene
que las fase de infección predominante es la de transición (Gráfico 5).
Al analizar la zona de muestreo dentro de la PP, se observa que tanto la entrada
como la parte media concentran animales en la fase crónica de la enfermedad y en
cuanto a la salida la mayor proporción es de animales en fase aguda de una infección
causada por TSV (Gráfico 6).
Gráfico 5.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las fases de
la enfermedad según la época de muestreo empleando el diagnóstico por histológico,
Piscina “C”.
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Gráfico 6.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las fases de
la enfermedad según la zona de muestreo dentro de la Piscina de Producción (PP)
empleando el diagnóstico histológico, piscina “C”.
Piscina “D”: en cuanto a la realización de los muestreos se tiene que la mayor
proporción de animales infectados por TSV se concentro a los 90 y 120 días, a los 90
días se observo una mayor proporción de animales en una fase aguda, mientras que a
los 120 días tal proporción estuvo compartida por animales tanto en a fase aguda como
de de transición (Gráfico 7).
Según la ubicación por zona dentro de la PP se observa que en la entrada se
concentró la mayor proporción de animales infectados en fase aguda, mientras que en
la zona media y en la salida se observaron principalmente animales en fase crónica de
la infección por TSV (Gráfico 8).
Zona dentro de la PP
Prop
orci
ón d
e an
imal
es
infe
ctad
os
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Gráfico 7.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las fases de la
enfermedad según la época de muestreo empleando el diagnóstico histológico, Piscina
“D”.
Gráfico 8.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las fases de la
enfermedad según la zona de muestreo dentro de la Piscina de Producción (PP)
empleando el diagnóstico histológico, Piscina “D”.
Época de Muestreo
Prop
orci
ón d
e an
imal
es in
fect
ados
Pr
opor
ción
de
anim
ales
in
fect
ados
Zona dentro de la PP
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Los resultados expuestos anteriormente sugieren que la distribución de los animales
enfermos en cada una de las PP es variable, por lo que definir un área o punto de
muestro es fundamental al momento de iniciar cualquier investigación con relación al
TSV (Morales, 2004).
Los resultados igualmente resaltan la importancia de que cada PP debe ser
monitoreada individualmente ya que las interacciones entre los diferentes factores (pH,
salinidad, temperatura, microbiota, etc) determinan cambios que pueden romper el
equilibrio, permitiendo el desarrollo de enfermedades (Guillian y Rodríguez, 2002;
Guzmán y col., 2004; Gómez, 2006).
Es importante destacar que en la Piscina de Producción “D” se observó la menor
proporción de animales infectados, sugiriendo que la posición de dicha piscina dentro
del sistema de distribución del agua fue un factor clave para favorecer una infección
posterior. Por lo tanto, el establecimiento de prácticas para la desinfección de las aguas
en los canales de distribución podría ayudar a la exclusión de los patógenos que entran
por esta vía (Lotz, 1997; Chávez y Montoya, 2004; OIE, 2009).
La realización del estudio histológico en los camarones enfermos analizados en esta
investigación se logró identificar las diferentes fases de una infección causada por el
TSV. El órgano linfoide representó una estructura anatómica esencial para el
establecimiento de dichas fases, este forma tres tipos de esferoides denominados: Tipo
A, Tipo B y Tipo C (Tabla 8), cada uno de ellos muestra características únicas que los
relacionan estrechamente con cada una de las fases de infección causada por TSV
(Hasson y col., 1999a); así mismo durante la realización del análisis histológico, se
evidenciaron áreas multifocales de necrosis en el epitelio cuticular, así como presencia
de núcleos picnóticos y cariorréticos, en distintos órganos coincidiendo con los
reportado por Morales, (2004); OIE, (2009); Hasson y col., (1999a); Lightner y Pantoja,
(2005).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 40
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Tabla 8.- Identificación de las diferentes fases de una infección causada por TSV
Según la bibliografía Identificados en el presente estudio
Órgano Linfoide Normal
Imagen tomada de: Bell y Lightner, (1998)
Órgano Linfoide Normal
Simbología: Lum: Lumen Smc: Matriz Estromal Cnf: Tejido Conectivo Fibroso End: Células Endoteliales Sin: Senos Hemales
Esferoides Tipo A, en el Órgano Linfoide
Imagen tomada de: Hasson y col., (1999a)
Esferoides Tipo A, en el Órgano Linfoide
Observe como los túbulos del órgano linfoide forman una masa homogénea, no se evidencian inclusiones
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Esferoides Tipo B, en el Órgano Linfoide
Imagen tomada de: Hasson y col., (1999a)
Esferoides Tipo B, en el Órgano Linfoide
.- Las flecha gruesa señala áreas de vacuolización .- Las flechas delgadas señalan inclusiones.
Esferoides Tipo C, en el Órgano Linfoide
Imagen Tomada de: Hasson y col., (1999a).
Esferoides Tipo C, en el Órgano Linfoide
.- La flecha gruesa señala núcleos condensados. .- La flecha delgada destaca algunas inclusiones.
Branquias infectadas por TSV
Tomado de: Hasson y col., (1995)
Branquias infectadas por TSV
La flecha indica Inclusiones
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 42
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Enfocándonos al estudio de las prevalencias del TSV estimadas mediante los dos
métodos de diagnósticos empleados: a) histología (Gráfico 9), y b) PCR (Gráfico 10),
donde se evidencia la presencia del TSV desde el primer muestreo; lo que podría
sugerir que el virus está presente de forma endémica en la granja estudiada. La OIE
(2009) establece que la prevalencia de una infección por TSV puede variar de 0 al
100%. En este trabajo el intervalo estimado para la prevalencia del TSV se estableció
del 5 al 48.33% por época de muestreo para los dos métodos diagnósticos utilizados. El
intervalo de prevalencia máxima fue de 18 a 48.33% encontrado a los 30 días de
muestreo para el método molecular e histológico, respectivamente. Se demuestra una
vez más que el diagnóstico histológico representa un método que evidencia
tempranamente la presencia del TSV así como el mayor número de animales enfermos.
Gráfico 9.- Prevalencia del TSV en cada época de muestreo empleando el
diagnóstico histológico.
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Gráfico10.- Prevalencia del TSV en cada época de muestreo empleando el
diagnóstico molecular
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CONCLUSIONES
La mejor zona de muestreo para establecer la presencia del TSV es la ubicada en la
salida de las Piscinas de Producción.
El TSV tiene un comportamiento variable durante un ciclo de 120 días, estando sus
máximos entre los 30 y 120 días con menores proporciones a los 60 y 90 días.
Durante el ciclo de 120 días de crecimiento y engorde del camarón no se logró
establecer de manera precisa la fase de infección (agua, transición y crónica) del TSV
debido al comportamiento variable durante los días de muestreo y las zonas estudiadas.
La prevalencia del TSV en la granja de producción estudiada fue de 18.33% y
48.33% para los métodos molecular e histológico, respectivamente.
El TSV es endémico en la granja de producción estudiada.
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RECOMENDACIONES
Realizar un estudio ampliado en las zonas productoras del país, incluyendo
muestreos en individuos silvestres que permita definir el estatus sanitario de las
mismas, estableciendo la presencia y asociaciones de las enfermedades causadas por
los distintos agentes (virus, bacterias, hongos, protozoos, etc).
Concientizar a la industria camaronera Venezolana en la implementación de
prácticas que permitan la exclusión de patógenos, como son: desinfección y
reutilización de las aguas, aplicación de cero recambios de agua; para de esta manera
evitar la entrada de patógenos provenientes de organismos silvestres o de agua
contaminada.
Establecer convenios entre el Sector Privado, el Gobierno Nacional y la Academia,
en los cuales se promuevan la capacitación de profesionales que luego puedan ser
incorporados en la investigación, para así darle soluciones a los problemas sanitarios
que tanto afectan a la producción camaronera del país.
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ANEXOS Anexo 1.- Zonas de muestreo dentro de las piscinas de producción.
Anexo 2.- Colección de los animales dentro de las piscinas de producción.
ANEXOS 54
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Anexo 3.- Preservación de las muestras para el diagnóstico molecular.
Anexo 4.- Preservación de las muestras para el diagnóstico histológico.
ANEXOS 55
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Anexo 5.- Diagrama del proceso del diagnóstico molecular.
Anexo 6.- Preparación para el embebido en parafina y formación de los bloques