7/14/2019 Investigacion de Antibioticos Final

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FACULTAD DE CIENCIASEscuela Acadmico Profesional de Biologa y Microbiologa

Presentado por: Mauricio Mamani LaquiLuisa Cusihuallpa VeraEdwin Paye Laura

Docente: M.Sc. Csar Julio Cceda Quiroz.

INVESTIGACIN DE RESIDUOSANTIBITICOS EN ALIMENTOS DE

ORIGEN ANIMAL POR METODOSMICROBIOLGICOS

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INTRODUCCIN

Los antibiticos se vienen utilizando desde hacetiempo de forma muy extensa en los animalesdestinados, tanto al

Al consumo humano.

Tratamiento y prevencin de enfermedadesinfecciosas.

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INTRODUCCION

Los antibiticos, sulfonamidas y otrosinhibidores, se emplean con xito en

tratamientos teraputicos o profilcticos deanimales domsticos

y tambin se ha difundido su uso comopromotores del crecimiento de reses de abasto(Levetzow, 1980; Gedek und Hofmann, 1983).

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INTRODUCCION

Figura 01: Reses de abasto

Fuente: UNPP 2011

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INTRODUCCION

Sin desconocer las caractersticaspositivas de los quimioterpicos,

se han detectado algunos efectos negativos queparcialmente se presentan en pacientes tratados,

pero ejercen esta accin en mucho mayorgrado, cuando se encuentrancomo residuos en los alimentos.

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INTRODUCCION

El paulatino aumento de bacterias resistentes aantibiticos presentes en el hombre, losanimales y la naturaleza,

se pueden atribuir en gran medida al usoindebido de antibiticos

en tratamientos, o como promotores delcrecimiento en alimentacin animal.

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INTRODUCCIN

La mastitis bovina es considerada laenfermedad infecciosa del ganado lechero demayor impacto econmico.

Debido a una disminucin en la produccin deleche y deterioro en la calidad (Ceron-Muoz,2002).

Se estima que entre el 15% y el 20% de lasvacas de un rodeo lechero estn afectadaspor alguna forma de mastitis.

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Figura 02: Aplicacin de Antibiticos; mastitis

bovina.

Fuente: UNPP 2011

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INTRODUCCIN

Una gran variedad de microorganismos han sidoinvolucrados como causales de mastitis bovina(Gonzalez, 1980).

Agentes causantes de Mastitis:

Streptococcus agalactiae.

Stpahylococcus aureus.

Cndida albicans.

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INTRODUCCIN

Siendo S. aureus el principal agente infecciosopor su prevalencia y patogenicidad,ocasionando ms del 80% de las infecciones(Gonzalez, 1980).

La mayora de las drogas antimicrobianas

utilizadas son -lactmicos, aminoglucsidos ymacrlidos (Owens. 1997).

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Figura 03: Aplicacin de Antibiticos.

Fuente: Blog manejo de animales 2010.

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Figura 04: Aplicacin de Antibiticos.

Fuente: IPCC, 2003.

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INTRODUCCIN

Despus de su utilizacin debe respetarse untiempo de espera o periodo de supresin antesdel sacrificio,

Emplear los alimentos procedentes del animalcon el fin de evitar que permanezcan residuos de

antibiticos aplicados.

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FUNDAMENTO TERICO

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FUNDAMENTO TEORICO

La administracin de estas sustancias con finesterapeuticos es en muchos casos necesaria, perocuando se utilizan

en forma fraudulenta e indiscriminada y abusiva sinatender los principios de las buenas practicasveterinarias,

puede suponer un grave riesgo para la salud delos consumidores, sobre todo para la poblacininfantil ( Kaneene, et al., 1986; McEwen, etal.,1991)

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FUNDAMENTO TERICO

Los riesgos de los residuos de antibiticos en laleche sobre la poblacin humana se centranfundamentalmente en (Pascual, 2000) :

Reacciones de hipersensibilidad.

Efectos txicos.

Aparicin de cepas resistentes.

Alteraciones de la flora intestinal.

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FUNDAMENTO TEORICO

Los residuos mas problemticos presentes en laleche, son los que derivan de frmacosantibacterianos, hormonas promotoras decrecimiento y

ciertos pesticidas, metales pesados y productos

qumicos (McEwen y Mc Nab, 1997).

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FUNDAMENTO TEORICO

En los mamferos la leche constituye una vanatural de eliminacin,

Por lo tanto la utilizacin de cualquiermedicamento veterinario, debe estar siempreligada a conceptos bsicos:

el respeto de tiempo o periodo de retiro y laaparicin de residuos, en los productosobtenido de animales tratados.(Parra, 2003)

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FUNDAMENTO TEORICO

Figura 05: Puntos criticos para la aparicion de antibioticos en la leche ( Tomado

de Magarios, H.,2000).

Fuente: Biblioteca

Virtual Unisucre

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FUNDAMENTO TERICO

Los antibiticos betalactmicos son una ampliaclase de antibiticos incluyendo derivados de:

Penicilina Cefalosporinas Monobactams Carbacefem

Carbapenems

Presencia de anillo -lactmico en su estructuramolecular.

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Figura 06: Ejemplos de -lactamicos, estructura

qumica de algunos antibiticos.

Fuente: ACR. 2004

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FUNDAMENTO TERICO

Los Antibioticos se pueden clasificar segn suaccin y estructura qumica (Velzquez 2000).

Los residuos de antibiticos se pueden clasificarsu cintica puede ser (Zurich y San Martn,1994) :

GRUPO 1. GRUPO 2. GRUPO 3.

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Fuente: Velzquez. Farmacologa Bsica y Clnica. Pedro LorenzoFernndez 18va edicin

CLASIFICACIN

POR SU ESPECTRO DE

ACCIN

Antibiticos de espectro reducido

Antibiticos de amplio espectro Antibiticos de espectro medio o especial

POR SU MODO DEACCIN

Grupo I: antibiticos bactericidas

Grupo II: antibitico bacteriostticos

POR SU ESTRUCTURA QUMICA

Cuadro 01: Clasificacin de los Antibiticos

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FUNDAMENTO TERICO

Clasificacin de R. de Antibiticos: GRUPO 1.

Antibiticos hidrosolubles de rpida absorcin. Estos antibiticos se eliminan con gran rapidez.

Penicilinas naturales (bencilpenicilina sdica ypotsica),

Penicilinas semisintticas (ampicilina,amoxicilina, cloxacilina),

Cefalosporinas,

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FUNDAMENTO TERICO

Clasificacin de R. de Antibiticos: GRUPO 2.

Antibiticos de absorcin rpida o de moderadavelocidad.

Eritromicina,

Tilosina, Espiramicina,

Sulfametazina

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FUNDAMENTO TERICO

Clasificacin de R. de Antibiticos: GRUPO 2.

La absorcin no supera el 70%. La

macromolcula del antibitico o del vehculodetermina la condicin.

Se incluyen tambin:

Penicilina Procaina, Penicilina Benzatina. Las tetraciclinas, especialmente las de larga

accin pertenecen a este grupo.

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FUNDAMENTO TERICO

Clasificacin de R. de Antibiticos: GRUPO 3.

Corresponden a antibiticos de absorcin lenta y,

a menudo, incompleta.

Sulfas de duracin larga como sulfadoxina yaminoglicsidos.

Esta clasificacin permite incorporar los nuevosantibiticos de uso en veterinaria.

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FUNDAMENTO TERICO

Las Penicilinas son el grupo ms antiguo deantibiticos.

Son bactericidas que inhiben la formacin de lapared celular.

Acta sobre gran numero de Gram positivas yalgunas Gram negativas.

Los efectos colaterales de las penicilinas sonpoco frecuentes (Quintana, 2003).

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FUNDAMENTO TERICO

La expresin " res iduos de medicamentosveterinarios"comprende:

Los productos originales y sus metabolitos encualquier porcin comestible del producto animal,as como los residuos de impurezas relacionadascon el medicamento veterinario correspondiente.

Comisin del Codex Alimentarius: manual deprocedimiento. 1997. Deposito de documentos de la FAO.definiciones para los fines del codex alimentarius

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FUNDAMENTO TEORICO

Frmacos implicados en reacciones adversas enhumanos segn Jawetz, et al.(1992) y Sanchez(1995) son:

Penicilina Cloramfenicol Eritromicina

SulfametazinaAminoglicosidos ( estreptomicina, neomicina,

kanamicina, gentamicina) Tetraciclinas

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Fuente: Susceptilidad de Bacterias Acido Lcticas (BAL) frente a

diversos antibiticos 2007

Cuadro 02: Niveles de tolerancia segnrecomendaciones OMS y FDA (2005).

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FUNDAMENTO TEORICO

Tabla 01: Termoestabilidad de algunos antibiticos ( Magarios,H.,2000).

Fuente: Biblioteca virtual Unisucre

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FUNDAMENTO TEORICO

De hecho, segn Vallejo (1993), los principalesproblemas que se presentan al procesar la lechecon residuos de antibiticos, son:

Formacin de una cuajada inadecuada durante laelaboracin del queso, la cual induce una maduracinanormal.

Disminucin de la produccin de acidez durante el

proceso de elaboracin de productos fermentados.

Disminucin del crecimiento del cultivo lctico, cuando sepropagan en leche en polvo reconstituida.

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Figura 07: Justificacin del control de residuos

Fuente: Fernndez, Teresa. 2007

Cul es justificacin del controlde residuos en leches?

Residuosy

Salud pblica

Residuosy

Industria lctea

Residuosy

Productor

Resistencias Microbianas. Alergias. Toxicidad. Efectos sobre la flora intestinal.

Inhibicin bacteriana:

Efectos sobre las caractersticasorganolpticas del producto.Enmascaramiento de loscontroles microbiolgicos:Fallan los controles.

Termorresistencia:Superan las barreras trmicas(pasteurizacin, UHT, etc)

Sanciones.

Pago por calidad. Descarte de leche. Contaminacin

EFECTOSTOXICOLOLGICOS

EFECTOSTECNOLGICOECONMICOS

EFECTOSECONMICOS

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FUNDAMENTO TERICO

El control de los residuos de antibiticos serealiza en tres fases:

Cribado ConfirmacinPostcribado

En las dos primeras se pueden utilizartcnicas del tipo microbiolgicas.

Mediantecromatografalquida de alta

resolucin(HPLC).

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Figura 06: Mtodos aplicativos para el control de

residuos de antibiticos.

Fuente: Fernndez, Teresa. 2007

MICROBIOLGICAS Inhibicin microbiana: Post-cribado

HPTLC (Cromatografa de capa fina)

Inmuno-ennzimticos:

Inmunolgicos (ELISA, RIA, etc.)Enzimticos (Pezym)

De unin a receptores:

Receptores microbiolgicos (Charm).

Receptores proteicos (Beta-Star Snap)

HPLC/UVHPLC/DADHPLC/FLUOHPLC/MS-MSGS

GS/MS

Fases para el control deresiduos de antibiticos

Tcnicas de

Cribado

Tcnicas de

confirmacin

Tcnicas de

Post-cribado

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OBJETIVOS

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OBJETIVOS

Investigar la presencia de residuos deantibiticos en la leche mediante mtodosmicrobiolgicos.

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METODOS

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METODOS

Entre las pruebas de rutina estn: Tcnicas bacteriolgicas, inmunolgicas y de

radio inmuno ensayo (RIA).

Las pruebas bacteriolgicas estn basadas enla inhibicin del crecimiento de algunos deestos organismos:

Bacillus stearothermophilus, Streptococcusthermophilus, Bacillus subtilis y Micrococcus luteus(Sarcina lutea).

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MTODOS (Pascual, 2000)

TCNICAS DE CRIBADO Tcnica de cribado de residuos de antibiticos de las

cuatro placas.

Preparacin de placas de ensayo de B. subt i l is .Preparacin de placas de M. luteus.

Tcnicas de cribado de residuos de antibiticos enleche.

Inhibicin de B. stearothermophi lusen placa.

TCNICAS DE POST-CRIBADO.

T i d ib d d id d

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Tcnicas de cribado de residuos deantibiticos en leche (Pascual, 2000).

Tratamiento trmico: Bao Mara 80C x 10min.Para eliminar efecto inhibidor de compuestos naturales de la leche.

Inoculacin B. stearothermophilus

Incubar: 64C x 3hrsLectura: halos de inhibicinSe considera positivo cuando la zona de inhibicin tenga

al menos 2 mm de anchura.

Leche fresca

Impregnar muestra en un disco de papelfiltro de 12,7 mm de dimetro

Impregnar bencilpenilina 0.0067 UI/mlotro disco

Colocar discos sobre superficie delmedio por duplicado y en posicionesopuestas

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MTODOS (Harrigan, 1979)

MTODO DE LA DETECCIN DEANTIBITICOS EN LA LECHE:

Mtodo del disco.

Mtodo de la reduccin del colorante TTC.

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Mtodo de Disco (Harrigan, 1979).

CONTROL:Leche libre de antibiticos conpenicilina; 0.05 unidades/ml

MUESTRA BIOLGICA:Leche fresca

Impregnar disco de 12.7 mm Impregnar disco de 12.7 mm

Inoculacin:B. subtilis en fase exponencial

15 ml de agar nutritivo1 ml de caldo nutritivo + B. subtilis

Disco control Disco con muestra

Incubar: 64C x 3hrsLectura: halos de inhibicinSe considera positivo cuando la zona de inhibicin tenga

al menos 2 mm de anchura.

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Figura 08: Resultado de disco (Harrigan, 1979).

Imagen referencial

POSITIVO

NEGATIVO

Mtodo de Reduccin de colorantes

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Procedimiento:

Pipetear 10 mL de la muestra de leche en untubo estril y cubrir con tapa estril. Usar unapipeta diferente para cada muestra de leche.

En cada uno de los otros 2 tubos, pipetear 10mL de leche libre de sustancias inhibitorias. Taparambos tubos.

Mtodo de Reduccin de colorantes(Harrigan, 1979).

Mtodo de Reduccin de colorantes

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Preparar un tubo conteniendo 10 mL de lechey un termmetro como control de temperatura.

Colocar todos los tubos en un bao de aguacaliente a 80 C durante 10 minutos o a 85 C

durante 5 minutos.

Mtodo de Reduccin de colorantes(Harrigan, 1979).

Mtodo de Reduccin de colorantes

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Enfriar a 37 C y adicionar aspticamente 1 mL

de cultivo de Streptococcus thermoph i lusocultivo de yogurt diluido (1:1) en lechedescremada estril a cada uno de los tubos deprueba, excepto al tubo control de temperatura.

Mtodo de Reduccin de colorantes(Harrigan, 1979).

Mtodo de Reduccin de colorantes

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Mezclar bien, invirtiendo los tubos e incubarlosen bao de agua a 37 C durante 2 horas.

Pipetear 1 mL de solucin TTC al 1% a cadatubos de prueba y al tubo control que contienen

leche libre de sustancias inhibidoras.

Mtodo de Reduccin de colorantes(Harrigan, 1979).

Mtodo de Reduccin de colorantes

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Al otro tubo control leche libre de sustancias

inhibidoras, adicionar 1 mL de agua destiladaestril. Invertir los tubos 2 veces para mezclare incubar a 37 C durante 30 minutosadicionales.

Mtodo de Reduccin de colorantes(Harrigan, 1979).

Mtodo de Reduccin de colorantes

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Examinar los tubos y comparar la inhibicinproducida en las muestras con los tuboscontrol.

Mtodo de Reduccin de colorantes(Harrigan, 1979).

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Mtodo de Reduccin de colorantes

(Harrigan, 1979).

Mtodo de Reduccin de colorantes

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Mtodo de Reduccin de colorantes(Harrigan, 1979).

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Figura 09: Resultado del Mtodo de Reduccin de

colorantes (Harrigan, 1979).

POSITIVO NEGATIVO

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MTODOS (NTP, 202)

NTP 202.170 1998 LECHE Y PRODUCTOS LCTEOS. Leche

cruda. Determinacin de antibiticos Beta-

lactmicos en productos lcteos lquidos.Ensayos cualitativos por reaccin de color

NTP 202.176 1998 LECHE Y PRODUCTOS LCTEOS. Leche

cruda. Antibiticos Beta-Lactmicos en leche.Ensayo cualitativo de campo mediante discoscon Bacillus subtilis

Mtodo de Disco

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Mtodo de Disco(NTP 202.176 1998).

CONTROL:Leche libre deantibiticos, diluir lapenicilina hasta obtener0.05 y 0.01 unidades/ml

Concentracin0.05 unidades/ml

Concentracin0.01 unidades/ml

Disco de pulgadas

Disco de pulgadas

Impregnar elDisco

MUESTRA BIOLGICA:Leche fresca

Disco de pulgadas

Inoculacin:B. subtilis en fase exponencial

Fundir el medio de agar , enfriar a55C hasta 60C y agregar 0,2mLde la suspensin de esporas en100 ml de medio de cultivo

Incubar: 37C x 2.5 a 3hrs

Lectura: halos de inhibicin

Examinar para determinar zonas de inhibicin.

Colocar los discos en lasplacas con Agar inoculado

MEDIO INOCULADO

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Halo deinhibicin

Figura 10: Mtodos aplicativos para el control de

residuos de antibiticos.

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