Il laboratorio

di

Genetica forense

Dott.ssa Stefania Ceccardi

Obiettivi:

1. Perché è utile l’analisi del DNA ed attuali metodiche

2. Quali sono i reperti che consentono l’analisi del DNA a fini di identificazione personale

Brief History of Forensic DNA Typing In April 1953 Watson and Crick published a model of the DNA helix in a one page letter to ‘Nature’. It began with the now famous under statement: “We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest”.

1984 Alec Jefferies and colleagues develop genetic fingerprinting - using DNA to positively identify individuals.

1986 The polymerase chain reaction (PCR) is first described in scientific literature. PCR enabled scientists to rapidly multiply small areas of DNA.

1987 In the UK forensic investigators use DNA testing to help solve the ‘Black Pad’ murders and to identify the killer as Colin Pitchfork, who later confessed to the crimes. This marks the first case in which DNA evidence is used to determine the identity of a murderer and it also involved a mass screen.  In addition this also marks the first case in which a prime suspect was exonerated due to DNA evidence.

1994 Dublin laboratory began using DNA technology. The first case involving DNA evidence is heard in the Irish courts.  DPP V Mark Lawlor.

1995  PCR and DNA fingerprinting play a starring role in the O.J. Simpson murder trial. The Forensic Science Service starts the UK National DNA database. 

1998 The FBI launches its national database. 

2003 The Irish Attorney General requested the Law Reform Commission to consider the establishment of a National DNA Database. 

2007 Legislation dealing with the establishment of a database before Dáil Éireann.

2010 New Criminal Justice (Forensic Evidence and DNA Database System) Bill 2010  published by the Minster for Justice, Equality and Law Reform, Mr. Dermot Ahern T.D.

Perchè il DNA?Perchè il DNA?•Profilo unico ed individuale (eccetto i Profilo unico ed individuale (eccetto i gemelli monozigoti)gemelli monozigoti)

•Presente in tutti i tessuti (ossa, formazioni Presente in tutti i tessuti (ossa, formazioni pilifere, sangue, saliva e altri fluidi e tessuti)pilifere, sangue, saliva e altri fluidi e tessuti)

•Ereditarietà (Paternità, Maternità, Ereditarietà (Paternità, Maternità,

resti scheletrici)resti scheletrici)

cellule bianche del sangue

spermatozoicellule della mucosa buccale

Transfer

GENOTIPO FENOTIPO

Il termine deriva dal greco e significa molte forme

Un sistema si dice polimorfico quando ammette almeno due forme possibili (alleli) e la frequenza dell’allele secondo per incidenza e’ superiore a 0,01

POLIMORFISMO

DNA in the Cell

Target Region for PCRTarget Region for PCR

chromosome

cell nucleus

Double stranded DNA molecule

Individual nucleotides

ATTIVITA’ DEL GENETISTA FORENSE

RICERCA E RACCOLTA DELLE TRACCE

RICOSTRUZIONE DEL FATTO (FORMA E POSIZIONE DELLE TRACCE)

DETERMINAZIONE DELLA NATURA DELLE TRACCE

DETERMINAZIONE DEL SESSO E DELL’ORIGINE DEL DNA (tracce, altro)

CATENA DI CUSTODIA, QUESTIONI TECNICO-GIURIDICHE

ATTIVITA’ DEL GENETISTA FORENSE

RICERCA E RACCOLTA DELLE TRACCE

RICOSTRUZIONE DEL FATTO (FORMA E POSIZIONE DELLE TRACCE)

DETERMINAZIONE DELLA NATURA DELLE TRACCE

DETERMINAZIONE DEL SESSO E DELL’ORIGINE DEL DNA (tracce, altro)

CATENA DI CUSTODIA, QUESTIONI TECNICO-GIURIDICHE

SOPRALLUOGO GIUDIZIARIO

Ispezione di luoghi e cose per accertare le tracce e gli altri effetti materiali che il reato abbia lasciato (Clemente Puccini)

AMBIENTE CADAVERE SOGG. VIVENTE

COMPLESSITA’ DELL’INTERVENTO DI SOPRALLUOGO

COORDINAMENTO DEI VARI ESPERTI (medico legale, botanico, genetista, ecc.)

TRAINING DEGLI ESPERTI

MANTENERE INALTERATA LA SCENA

RACCOLTA DATI (immagini, reperti)

Tecniche di repertamento

Evitare contaminazione: utilizzo di guanti e cambio degli stessi nel passare da un reperto all’altro

Repertare il più presto possibile, la probabilità di raccogliere tracce utili diminuisce col passare del tempo

Assicurarsi che i campioni siano confezionati, conservati e trasportati correttamente.In generale campioni fluidi devono essere congelati, tutto il materiale umido deve essere essiccato.

Contrassegnare accuratamente con pennarello indelebile

Mantenere la continuità della catena di custodia, documentare ogni trasferimento

ATTIVITA’ DEL GENETISTA FORENSE

RICERCA E RACCOLTA DELLE TRACCE

RICOSTRUZIONE DEL FATTO (FORMA E POSIZIONE DELLE TRACCE)

DETERMINAZIONE DELLA NATURA DELLE TRACCE

DETERMINAZIONE DEL SESSO E DELL’ORIGINE DEL DNA (tracce, altro)

CATENA DI CUSTODIA, QUESTIONI TECNICO-GIURIDICHE

Bloodstain pattern analysis

40cm-90° 20cm-70° 20cm-45°

20cm-30° 20cm-20° 20cm-10°

Bloodstain pattern analysis

ATTIVITA’ DEL GENETISTA FORENSE

RICERCA E RACCOLTA DELLE TRACCE

RICOSTRUZIONE DEL FATTO (FORMA E POSIZIONE DELLE TRACCE)

DETERMINAZIONE DELLA NATURA DELLE TRACCE

DETERMINAZIONE DEL SESSO E DELL’ORIGINE DEL DNA (tracce, altro)

CATENA DI CUSTODIA, QUESTIONI TECNICO-GIURIDICHE

La traccia “forense” può . . .

Identificare il reo Ricostruire l’evento criminoso Collegare il sospetto alla vittima o alla

scena del delitto Escludere persone innocenti

L’APPROCCIO MEDICO-LEGALE ALLO STUDIO DELLA TRACCIA

Diagnosi GENERICA: è sangue/sperma/capello?

Diagnosi DI SPECIE UMANA: è umano?

Diagnosi DI SESSO: maschile/femminile?

Diagnosi INDIVIDUALE: DNA-confronto

TRACCE BIOLOGICHE

L’individuazione e l’identificazione di fluidi biologici sulla scena del crimine sono un aspetto molto importante in campo forense, in quanto hanno come fine ultimo l’identificazione del soggetto da cui proviene la sostanza.

Ogni fluido biologico ha una composizione unica e la presenza di specifiche componenti è alla base dei test di identificazione.

La determinazione del fluido biologico non deve andare a compromettere la tipizzazione del DNA per l’individuazione del profilo genetico, si devono utilizzare metodiche che non richiedano una grande quantità di materiale per evitare di consumare tutta la traccia a disposizione o che permettano di utilizzare il frammento per più analisi

I test di identificazione si possono dividere in:

Test orientativi: molti tessuti possiedono sostanze caratteristiche specifiche, ma non sono uniche (falsi positivi)

Test di certezza: caratteristiche specifiche ed uniche per quel tessuto

Test orientativi

SANGUE: Test rapidi per la loro semplicità, dotati di una grande sensibilità, ma su di essi grava l’aspecificità per cui possono solo indirizzare e fornire elementi utili che dovranno poi essere confermati con metodi specifici.Quasi tutti sono test colorimetrici dove il viraggio di colorazione può essere un segnale della presenza della sostanza interessata, ma anche un falso positivo, viceversa la mancanza di viraggio determina già l’assenza della sostanza interessata. Si possono ricordare quelli basati sull’utilizzo di leucobasi, sostanze indicatrici incolori e perossido di idrogeno, il luminol.

LIQUIDO SEMINALE: test basati sulla componente enzimatica, ma molto aspecifici.Si può ricordare la lampada di Wood.

SALIVA: test basati sulla presenza dell’enzima α-amilasi, ma aspecifico perché è presente in molti tessuti.

Phenolphthalein test Leucomalachite green test

Luminol

Phadebas test

Test di certezza

Sono metodi più complessi, ma molto specifici e sensibili.

Tale determinazione avviene per mezzo di una reazione antigene anticorpo specifica per ogni tessuto da analizzare.

Come funzionano

HUMAN BLOODVERIFICATION

HUMAN SEMENVERIFICATION

                                             

                                     

                                                                                  

                                                                          

        

NEGATIVE   POSITIVE 4ng/ml INVALID

Interpretazione dei risultati

Il risultato negativo è dato dalla colorazione del solo Test in posizione della T, in quanto la concentrazione della sostanza da analizzare è inferiore al valore soglia (4ng/ml).

Il risultato positivo è data dalla doppia banda e la concentrazione della sostanza è superiore alla soglia.

Se la linea del controllo non si è visualizzata il test è invalidato e si deve ripetere

Negativo Positivo 4ng/ml Invalidato

SOSPETTA TRACCIA EMATICADiagnosi generica di sangueDiagnosi di specieDiagnosi regionale (sangue mestruale)Diagnosi individuale

Profilo genetico

Situazioni complesse:Profilo mistoDNA degradato (drop‑out allelico)Presenza di inibitori della reazione di amplificazione (emoglobina)

Sospetta traccia seminale

Diagnosi di sperma umanoEstrazione del DNA che prevede la separazione delle eventuali cellule femminili (lisi differenziale)Polimorfismi del DNA

Situazioni complesse:Indumento lavatoContaminazione della traccia con materiale fecale o altri inibitoriNei casi di violenza sessuale con più di un aggressore e più di un profilo genetico nella traccia

Identificazione dello sperma

Cosa è lo sperma?Cosa è lo sperma?

• Mistura semi-fluida costituita da:– Cellule– Enzimi– altre molecole organiche ed inorganiche

• Le cellule spermatozoarie sono i componenti più importanti. Ma lo sono anche le cellule epiteliali di sfaldamento nel soggetto azoospermico

Prostate-Specific Antigen (PSA or p30)

• PSA è la proteina prodotta dalla ghiandola prostatica

• PSA + può confermare la presenza di liquido seminale anche in soggetti azoospermici

• Reazione antigene anticorpo

Tracce di salivaDa mozziconi di sigaretta

Da buste e francobolli

Da passamontagna nella regione della bocca

Dalla cute

Tracce di sudore

Tracce all'interno di guanti in lattice

Il DNA dalle impronte digitali

Problema del Low copy number (LCN)

• possibilità di typing misti da contaminazione

• possibilità di artefatti da amplificazione

Resti scheletrici

Esame antropometrico dei resti

Estrazione del DNA

Tecniche di decontaminazione

Tipizzazione del DNA genomico

Tipizzazione del DNA mitocondriale

Risultati in funzione dei fattori ambientali e del tempo

Caso Romanov

Ricostruzione attraverso il DNA mitocondriale dei discendenti

*Il DNA mitocondriale si trasmette solo per via materna

Formazioni pilifereEsame macroscopico (lunghezza, colore, morfologia)

Esame microscopico

Stato della radice pilifera:Fase anagenFase catagenFase telogen

Diagnosi regionaleEstrazione del DNATipizzazione del DNA genomico se presente la radiceTipizzazione del solo DNA mitocondriale da fustoSituazioni complesse:Presenza di inibitori (tinture per capelli)DNA degradato se radice in fase telogenEteroplasmia del DNA mitocondriale e sua diversa rappresentazione nelle formazioni pilifere

Hair with tissue Shed hair

Root band post-mortem Hair match

Metodi di Estrazione del DNA

Ogni cellula nucleata contiene DNA: sangue, saliva, ossa, spermatozoi, cell. epiteliali, capelli.

Chelex: resina chelante che mantiene il DNA a singola elica che può essere utilizzato per la PCR

Metodi organici: fenolo/cloroformio

Kit del commercio

Tali metodiche devono garantire:

• massima quantità possibile di DNA estratto

• minore degradazione possibile

• migliore qualità o purezza dell’estratto

Christmas Tree Stain

• Esame microscopico per le cellule spermatiche

• La colorazione aiuta a distinguere gli spermatozoi dalle cellule epiteliali

• 2 i colori utilizzati:– Verde – citoplasma cellule epiteliali– Rosso – nuclei cellulari e acrosoma

STR (Short Tandem Repeat)

• regioni non espresse, presenti negli introni, con un elevato grado di polimorfismo di lunghezza

• ripetizioni in tandem di corte catene oligonucleotidiche formate da 2-6 paia basi

•struttura tri-tetramerica per ottenere una tipizzazione più precisa degli alleli

•abbondanti lungo il genoma e presenti su cromosomi diversi

• resistenti alla degradazione dovuto alla ridotta dimensione molecolare dei frammenti (100-300bp) che rende possibile l’amplificazione del DNA da reperti biologici (tessuti in via di decomposizione, inclusi in paraffina o formalina, reperti archeologici)

•PCR multiplex partendo da esigue quantità di DNA estratto

•presenza di più alleli per ogni STR analizzato = alta variabilità allelica nelle varie popolazioni

Reazione a catena della polimerasi PCR (Polymerase Chain Reaction)

Introdotta nel 1985 da Mullis e Saiki, la PCR è una tecnica “in vitro” utilizzata per amplificare una specifica regione del DNA di lunghezza e sequenza definita a partire da piccole quantità di estratto.

Nel 1986, negli USA fu introdotta per la prima volta in campo forense

Amplificazione mediante PCR

Denaturazione: aumento della temperatura fino a 94°C per separare i filamenti di DNA

Annealing: raffreddamento del sistema (50°C-60°C) per permettere ai primers di attaccarsi alla regione complementare

Estensione: gli oligonucleotidi,

grazie alla Taq polimerasi, a 72°C

si saldano e formano un nuovo

filamento di DNA

A

GA

C

C

GA

G

A

C

T

T

A

T

Taq

DNA

MgCl2

MgCl2

MgCl2

MgCl2

MgCl2

Buffer

Buffer

Buffer

Buffer R

F

H2OH2O

H2O

H2O

H2O

VANTAGGIVANTAGGI

Tecnicamente gli STR, a confronto con altri marcatori,Tecnicamente gli STR, a confronto con altri marcatori,

presentano il vantaggio di essere:presentano il vantaggio di essere:

1. numerosi

2. equamente distribuiti in tutta la parte eucromatica del genoma

3. altamente polimorfici e quindi informativi

4. analizzabili facilmente tramite PCR

Questa relativa facilitQuesta relativa facilitàà di studio ha portato ad un rapido di studio ha portato ad un rapido incremento del numero degli STRs esaminatiincremento del numero degli STRs esaminati

PCR svantaggi

•sensibilità (rischio di contaminazioni-falsi positivi)

• variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza

• richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers)

• può sintetizzare frammenti relativamente corti

• la sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq pol non possiede attività 3’->5’ esonucleasica)

Inibitori della PCR

•agenti inibenti che agiscono sulla Taq

•coloranti o tessuti particolari (denim)

•emoglobina che interferisce con la Taq polimerasi

•degradazione del DNA

Possibili soluzioni dell’inibizione

•diluire il campione

•aggiungere polimerasi

•aggiungere BSA

•neutralizzare con NaOH

•separare con Microcoon

Contaminazione della PCR

contaminazione dei campioni da esaminare con DNA umano estraneo (dell’operatore o presente nell’ambiente)

•contaminazione nel laboratorio di prodotto di PCR

(altamente volatile) derivato da precedenti reazioni di amplificazione

Metodi per eliminare il pericolo di contaminazione

• separazione delle aree di estrazione, amplificazione ed analisi post PCR, utilizzando strumenti per ciascuna area

• l’uso di reagenti separati ed aliquotati

• allestire sempre controlli positivi e negativi

• utilizzare guanti e camici sterili, puntali con filtro e provette sterili

• irradiazione ultravioletta dell’area PCR e pulizia con appositi detergenti

CODIS

Nel 1990, l’FBI decide di utilizzare loci caratteristici per le indagini forensi.

Durante questi anni il numero dei loci analizzato è aumentato; oggi il CODIS (COmbined DNA Index Sistem) analizza 13 loci altamente polimorfici; tra questi, 11 si trovano su cromosomi differenti, 2 sullo stesso.

Tutti i loci sono localizzati in regioni non codificanti.

L’utilizzo di medesimi loci nelle varie popolazioni permette di avere informazioni sulla frequenza di un determinato allele nella popolazione in esame.

Il CODIS è utilizzato in tutti i laboratori forensi americani.

Sequenziatore automatico

L’elettroforesi capillare su sequenziatore automatico sta diventando un metodo preferenziale per l’analisi dei campioni marcati in fluorescenza.

L’uso del sequenziatore piuttosto del gel, permette una

veloce separazione dei frammenti di DNA, una maggiore

risoluzione e minimizza gli errori manuali dovuti

all’operatore (RIPRODUCIBILITÀ DEI RISULTATI)

DetectorWindow

Si applica corrente Si applica corrente elettrica elettrica

Il Dna negativo migra Il Dna negativo migra verso il polo positivoverso il polo positivo

I frammenti di DNA I frammenti di DNA amplificati vengono iniettati amplificati vengono iniettati elettro-cineticamente elettro-cineticamente all’interno del capillareall’interno del capillare

Il DNA è separato in base Il DNA è separato in base al size:al size:

piccolipiccoli STRs corrono più STRs corrono più velociveloci

grandigrandi STRs corrono più STRs corrono più lentilenti

STRs* passano davanti STRs* passano davanti alla finestra e vengonoalla finestra e vengono eccitati dal raggio lasereccitati dal raggio laser

Padre

Figlio 1

Figlio 2

Madre

Profilo genetico ottenuto con sequenziatore automatico

Profilo genetico del cromosoma X

Profilo genetico misto del cromosoma Y

LARGE

SMALL

Degradazione

quando il campione biologico è esposto a condizioni ambientali avverse, si degrada:

caldo, umido, luce solare, tempo

la degradazione rompe il DNA a random

estese porzioni del DNA sono attaccate per prima

TRACCE MISTE

Nel caso di violenza con piu’ aggressori

Nel caso di commistione tra fluidi biologici appartenenti a piu’ individui

Valutazione dei profili e dell’altezza dei picchi

D5S818 D13S317

D7S820

D8S1179 D21S11 D18S51

Amel

VWAFGAD3S1358 blue panel

green panel

yellow panelRel

ativ

e F

luo

resc

ence

Un

its

Più alto di una stutter band

Più alto di una stutter band

“Stutter” nella posizione sbagliata

“Stutter” nella posizione sbagliataImbalance tra X e

Y

Imbalance tra X e Y

4 picchi in un singolo locus

4 picchi in un singolo locus

Sample Mixture ExampleProfiler Plus dataProfiler Plus data