Manual de Lab Bioquimica

8/4/2019 Manual de Lab Bioquimica

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Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular I

Segundo Laboratorio

Agua, pH y Accin Amortiguadora de los Aminocidos

I. IntroduccinLas biomolculas polares orgnicas e inorgnicas de las clulas vivientes existen y

reaccionan de manera primaria en un ambiente acuoso. El agua, una molculanotablemente escencial para la vida, solubiliza y modifica las caractersticas debiomolculas como cidos nucleicos, protenas y carbohidratos al formar puentes dehidrgeno con sus grupos funcionales, interacciones que modifican las propiedades dedichas biomolculas y sus conformaciones en una solucin.

La comprensin de los mecanismos homeostticos utilizados por los organismospara conservar un entorno intracelular relativamente constante debe considerar el pH, elamortiguamiento del mismo a nivel de los lquidos corporales y compartimientossubcelulares.

Por otro lado tenemos que una de las mltiples funciones de los aminocidos es que,tanto aminocidos libres, as como, algunos que an formando parte de las protenas,pueden potencialmente funcionar como buffers. Esto se debe gracias a que losaminocidos en un medio acuoso contienen un grupo carboxilo que funciona comocido dbil, y un grupo amino que funciona como base dbil.

II. Objetivos1. Definir el concepto de amortiguador (buffer) y estudiar sus funciones y modo de

accin.2. Conocer los componentes de un buffer.3. Demostrar la accin de los amortiguadores en el pH.4. Demostrar la accin amortiguadora de los aminocidos.

III. ProcedimientoIII a) Sustancia buffer

1. Se toman tres beakers de 25ml y se preparan de la siguiente manera:

a) Beaker 1 (Problema 1): 10ml de agua destilada + 2 gotas de anaranjado demetilo.

b) Beaker 2 (Problema 2): 8ml de agua destilada + 1ml de cido actico + 1ml deacetato de sodio + 2 gotas de anaranjado de metilo.

c) Beaker 3 (Control de color): 8ml de agua destilada + 1ml de cido actico +1ml de acetato de sodio + 2 gotas de anaranjado de metilo.


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Se toman los beakers 1 y 2 se procede a titular con gotas de cido clorhdrico 0.1Nhasta observar un cambio de color en comparacin con el beaker 3.Cuente y anote las gotas utilizadas en cada caso.

2. Se toman tres beakers de 25ml y se preparan de la siguiente manera:

a) Beaker 1 (Problema 1): 10ml de agua destilada + 2 gotas de fenolftalena.

b) Beaker 2 (Problema 2): 8ml de agua destilada + 1ml de cido actico + 1ml deacetato de sodio + 2 gotas de fenolftalena.

c) Beaker 3 (Control de color): 8ml de agua destilada + 1ml de cido actico +1ml de acetato de sodio + 2 gotas de fenolftalena.

Se toman los beakers 1 y 2 se procede a titular con gotas de hidrxido de sodio 0.1Nhasta observar un cambio de color en comparacin con el beaker 3.Cuente y anote las gotas utilizadas en cada caso.

III b) Accin buffer de los amonocidos

1. Se toman 2 beakers y se agrega 10ml de glicina 0.1N a cada uno y se procede a medirel pH de la misma (pH basal)

2. Se toma uno de los beakers y con el electrodo del pHmeter dentro de la solucin, seprocede a titular con HCl 0.1N de la siguiente manera:

5 veces 0.1ml (2 gotas)5 veces 0.2ml (4 gotas)

14 veces 0.5ml (10 gotas)5 veces 0.2ml (4 gotas)

5 veces 0.1ml (2 gotas)

En cada adicin de HCl, esperar y anotar la medida de pH

3. Se toma el otro beaker con glicina y con el electrodo del pHmeter dentro de lasolucin, se procede a titular con NaOH 0.1N de la misma forma descrita en el pasoanterior.

LEER DE SU LIBRO DE TEXTO1. AGUA, pH y BUFFER2. GENERALIDADES, PROPIEDADES Y TITULACION DE LOSAMINOACIDOS


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Accin Buffer de los Aminocidos

pH Basal de Glicina

VolmenHCl

pH VolmenNaOH

pH


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Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular ITercer Laboratorio

Actividad de la Anhidrasa Carbnica y Acidez Titulable

I. IntroduccinEl mantenimiento estable de la concentracin de hidrogeniones a nivel del

organismo es escencial para la vida. Generalmente el pH tanto a nivel intra comoextracelular es mantenido a niveles muy constantes. El pH del organismo es estabilizadogracias a la capacidad amortiguadora que poseen los lquidos corporales.

Uno de los buffers en el organismo es el cido carbnico; este cido en solucin seencuentra parcialmente disociado en hidrogenin y bicarbonato: H2CO3 H+ yHCO3 . Si a una solucin de cido carbnico le aadimos H+, el equilibrio de laecuacin anterior tiende a desviarse a la izquierda, y por el contrario si agregamos gruposOH a la solucin el equilibrio tiende a ir a la derecha de la ecuacin. Como ejemplo deotros buffers a nivel del organismo tenemos a las protenas tanto intra comoextracelulares.

Uno de los rganos que contribuye con el mantenimiento del pH a nivel sistmicoson los riones durante la formacin de la orina. En el laboratorio podemos determinarla cantidad de H+ aadidos al lquido tubular (orina) que se han combinado con elamortiguador de fosfato y otros amortiguadores orgnicos. El procedimiento consiste entitular la orina con una base fuerte como NaOH hasta un pH de 7.4, que es el pHnormal del plasma. El nmero de miliequivalentes de NaOH necesarios para hacer que elpH de la orina vuelva a 7.4 es igual al nmero de miliequivalentes de H+ aadidos a laorina que se han combinado con el amortiguador de fosfato y otros amortiguadoresorgnicos. El cido titulable medido no incluye a los H+ unidos a NH 4+ porque el pKde la reaccin del amonaco/amonio es de 9.2 y slo llevamos con NaOH hasta un pHde 7.4.

II. Objetivos1. Conocer los principales sistemas amortiguadores del organismo y su localizacin.2. Estudiar la funcin, localizacin y modo de accin de la anhidrasa carbnica.3. Definir la importancia y determinar la acidez titulable de la orina


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III. ProcedimientoIII a) Accin de la Anhidrasa Carbnica

1.A un estudiante voluntario se le extraen 3 ml de sangre y se procede a desfibrinarlaen un beaker pequeo con perlas de cristal.

2. Se toman tres tubos de ensayo rotulados como A, B y C respectivamente y sepreparan de la siguiente manera:

a) Tubo A: 15 ml de agua destilada + 1 ml de azul de bromotimol 0.04% + 0.5ml de bicarbonato al 5%.

b) Tubo B: 15 ml de agua destilada + 1 ml de azul de bromotimol 0.04% + 0.1ml de sangre desfibrinada + 0.5 ml de bicarbonato al 5%.

c) Tubo C: 15 ml de agua destilada + 1 ml de azul de bromotimol 0.04% + 0.1ml de sangre desfibrinada + 0.5 ml de bicarbonato al 5% + 1 ml deacetazolamida al 1 %.

NOTA: Todos los tubos se preparan y se mantienen en hielo para lograr y manteneruna temperatura de 4 grados centgrados.

3. Usando el pHmeter se procede a tomar el pH a cada tubo.

4. Luego se colocan los tubos en una corriente de CO2 y se tomar el tiempo necesario

para que el contenido de cada tubo de ensayo cambie de color.

5. Finalmente se procede a tomar nuevamente el pH de cada tubo.

Anote y analice los resultados obtenidos:

Tubo

pH antes del

CO2

pH luego del

CO2 Tiempo

A

B

C


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III b) Acidez Titulable

1. Un estudiante voluntario procede a depositar orina en un beaker.

2. En otro beaker se toman 25 ml de la orina y se mide el pH.

3. Con el electrodo del pHmeter dentro del beaker se titulan los 25 ml de orinacon NaOH 0.1N hasta llegar a un pH de 7.4.

4. Se calculan los miliequivalentes de cidos excretados en la orina utilizando lasiguiente equivalencia:

1 ml de NaOH 0.1N 0.1 mEq de cidos urinarios

LEER DE SU LIBRO DE TEXTOPRINCIPALES SISTEMAS AMORTIGUADORES DEL ORGANISMO Y SULOCALIZACION


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Cuarto Laboratorio

Reconocimiento de los Aminocidos y las Protenas

I. IntroduccinLas protenas son las biomolculas ms abundantes despus del agua y desempean

un gran nmero de funciones, que las caracterizan como componentes escenciales eindispensables para la vida. Virtualmente todos los procesos en los organismos vivosdependen de este tipo de molculas. Por ejemplo, las enzimas y las hormonaspolipeptidicas dirigen y regulan el metabolismo en el cuerpo, mientras que las protenascontractiles del msculo permiten el movimiento. En el hueso, forman el esqueletonecesario para el depsito de cristales de calcio y fosfato, actuando como lo hacen las

varillas en el concreto armado. En el torrente sanguneo, las protenas como lahemoglobina y la albmina plasmtica son molculas escenciales para la vida, igualmentelas inmunoglobulinas participan en la destruccin de bacterias y virus. En resumen, lasprotenas realizan una increible diversidad de funciones.

Las protenas no son ms que polmeros de 20 L alfa aminocidos unidos medianteenlaces peptdicos y van a mostrar una amplia variacin en sus tamaos, formas ypropiedades. Sus propiedades qumicas y fisiolgicas dependen no slo de su tamao yforma, sino tambien de las propiedades de los aminocidos que las componen.

II. Objetivos1. Estudiar la estructura, propiedades, clasificacin y funcin de de los aminocidos,

pptidos y protenas.

2. Identificar aminocidos y protenas utilizando pruebas de laboratorio especficas.

3. Desmostrar el efecto de la desnaturalizacin de las protenas por accin del pH,metales pesados y la temperatura.

III. ProcedimientoIII a) Pruebas utilizadas para la identificacin de aminocidos y protenas:

1. Reaccin de la Ninhidrina: Los aminocidos en general reaccionan con lanihidrina (hidrato de hicelohidrindeno) en presencia de calor dando dixido decarbono, amonico y un aldehdo que contiene un tomo de carbono menos que elcompuesto original. La reaccin da lugar a la formacin de un producto de color azulo prpura, que es til para la estimacin cualitativa y cuantitativa de los aminocidos.No obstante, el color azul no es especfico para aminocidos debido a que elamonaco y la mayora de los polipptidos y protenas desarrollan el color con laninhidrina.


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Para realizar la prueba se toman 2 ml de la solucin a analizar en un tubo de ensayo yse le agregan 5 gotas de la solucin de ninhidrina. Se calienta en un bao de marapor 1 a 2 minutos y si la prueba es positiva se desarrollar un color azul.

2. Reaccin de Biuret: La reaccin de Biuret est dada por aquellas sustancias cuyasmolculas contienen 2 grupos carbamino (-CO.NH) ligados directamente o a travsde un solo tomo de carbono o nitrgeno. Sustancias similares que contienen enlugar del grupo carbamino, grupos CS.NH, tambin responden a la prueba. Estoimplica que compuestos no proteicos que contienen los grupos necesariosrespondern a la prueba. Las protenas disuelven el hidrxido cprico del reactivo yforman compuestos coloreados violeta o violeta-rosado que depende de la naturalezade las protenas.

Para realizar la prueba se toman 2 ml de la solucin a analizar en un tubo de ensayo yse le agregan 2 ml del reactivo de Biuret, mezcle bien y si la prueba es positiva sedesarrollar un color violeta.

3. Reaccin de Milln: Esta reaccin se debe a la presencia de grupos hidroxifenilos(C6H5OH) en la molcula proteica. Cualquier compuesto fenlico que no estsustituido en la posicin 3, 5, como la tirosina, fenol y timol, dan lugar a la reaccin.

De estos compuestos, solamente la tirosina o tirosina halogenada se encuentranpresentes en las protenas, de manera que la reaccin de Milln tiene lugarnicamente con las protenas que tienen tirosina.

La prueba no es satisfactoria para soluciones que contienen sales inorgnicas en grancantidad, ya que el mercurio del reactivo de Milln es precipitado y se vuelveinactivo, razn por la que este reactivo no se usa para medir albmina en la orina. Sila solucin a examinarse es muy alcalina debe ser previamente neutralizada, ya que ellcali precipita tambin el mercurio en forma de xidos amarillos.

Para realizar la prueba se toman 2 ml de la solucin a analizar en un tubo de ensayo y

se le agregan 3 a 4 gotas del reactivo de Milln. Se mezcla y se calienta en un bao demara por 1 a 2 minutos. Las protenas se precipitan por accin de los cidosminerales fuertes del reactivo, dando un precipitado blanco que se vuelvegradualmente rojo al calentar. Si no se desarrolla color aada 2 o 3 gotas ms delreactivo y caliente otra vez. Se debe evitar un exceso de reactivo ya que puedeproducir un color amarillo, el cual no indica reaccin positiva.

4. Reaccin Xantoproteica: Esta reaccin se debe a la presencia en la molculaproteica de grupos fenilos (-C6H5), con el cual el cido ntrico forma compuestosnitrados amarillos. Los complejos de la molcula proteica de importancia en estareaccin son los de tirosina y triptfano. La fenilalanina no responde a este ensayo enlas condiciones en que se ha desarrollado. La reaccin no es satisfactoria para elexamen de orina debido al color amarillo de la reaccin final.

Para realizar la prueba se toman 2 ml de la solucin a analizar en un tubo de ensayo yse le agrega 1 ml de cido ntrico concentrado. Se calienta en un bao de mara y seobserva la formacin de un precipitado amarillento que se vuelve gradualmenteamarillo y se disuelve impartiendo el color a la solucin. Deje enfriar y aadacuidadosamente un exceso de hidrxido de amonio o de sodio y observe que el coloramarillo se intensifica y pasa a anaranjado.


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III b) Identificacin de aminocidos y protenas:

1. Tome 4 tubos de ensayo y coloque en ellos 2 ml de agua destilada y proceda arealizar las pruebas de Ninhidrina, Biuret, Milln y Xantoproteica.

2. Tome 4 tubos de ensayo y coloque en ellos 2 ml de la solucin de glicina y proceda arealizar las pruebas de Ninhidrina, Biuret, Milln y Xantoproteica.

3. Tome 4 tubos de ensayo y coloque en ellos 2 ml de la solucin de albmina dehuevo diluida y proceda a realizar las pruebas de Ninhidrina, Biuret, Milln yXantoproteica.

Anote y analice los resultados obtenidos.

Prueba RealizadaSustancia

Analizada Ninhidrina Biuret Milln Xantoproteica

Agua Destilada

Glicina

Albmina

III c) Desnaturalizacin de las protenas por accin del pH:

Se toman 3 tubos de ensayo y se les agrega 2 ml de solucin de albmina de huevo acada uno de ellos. Al tubo nmero 1 agregue 10 gotas de HCl concentrado y observe, alnmero 2 agregue 10 gotas de cido actico glacial y observe, al tubo nmero 3 agregue10 gotas de agua destilada como control. Luego realice la prueba de Biuret a cada tubo.Anote y analice los resultados obtenidos.

Tubo Observacin Prueba de Biuret1 Albmina+HCl

2 Albmina+CH3COOH

3 Albmina+Agua destilada

III d) Desnaturalizacin de las protenas por accin de los metales pesados:

Se toman 3 tubos de ensayo y se les agrega 2 ml de solucin de albmina de huevo a

cada uno de ellos. Al tubo nmero 1 agregue 10 gotas de nitrato de plata y observe, alnmero 2 agregue 10 gotas de nitrato de potasio y observe, al tubo nmero 3 agregue 10gotas de agua destilada como control. Luego realice la prueba de Biuret a cada tubo.Anote y analice los resultados obtenidos.


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Tubo Observacin Prueba de Biuret

1 Albmina+Nitrato de plata

2 Albmina+Nitrato de potasio

3 Albmina+Agua destilada

III e) Desnaturalizacin de las protenas por accin de la temperatura:

Se toman 1 tubo de ensayo y se le agrega 2 ml de solucin de albmina de huevo. Lleveel tubo al calor y observe. Luego realice la prueba de Biuret.Anote y analice los resultados obtenidos.

Tubo Observacin Prueba de Biuret

1 Albmina+Calor

LEER DE SU LIBRO DE TEXTO: ESTRUCTURA Y FUNCION DEAMINOACIDOS, PEPTIDOS Y PROTEINAS.


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Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular IQuinto Laboratorio

Obtencin e Identificacin de la Casena de la Leche

I. IntroduccinLa leche es un alimento muy nutritivo, ya que contiene protenas, lpidos, lactosa, sales

inorgnicas y vitaminas. La casena es la protena principal, siendo esta una protenaconjugada que posee fsforo como grupo prosttico.

Como muchas otras protenas de origen animal, esta es de un alto valor biolgico, ya que

posee todos los aminocidos escenciales para el desarrollo y crecimiento normal del hombre.

La separacin de la casena se realiza mediante la precipitacin con cido y junto a sta,cierta cantidad de grasa que ser extrada con solventes orgnicos en los que la casena esinsoluble.

II. Objetivos1. Conocer los fundamentos bioqumicos del aislamiento de la casena.

2. Conocer la importancia de las reacciones de Biuret, Milln y Xantoproteica en laidentificacin de la casena y algunos de los aminocidos que la componen.

3. Determinar la presencia en la leche de fosfatos utilizando la prueba de Molibdato deAmonio y la presencia de cloruros mediante la prueba de Nitrato de Plata.

III. ProcedimientoIII a) Aislamiento de la casena:

1) Caliente 100 ml de leche hasta 40 grados centgrados y luego agregue 1 ml de cidoactico glacial hasta que precipite toda la protena. Filtre con una gaza o al vaco hastasacar el mximo de lquido. Guarde el filtrado para la determinacin de fosfatos y

cloruros identificandolo como filtrado acuoso.

2) Suspenda el precipitado del paso anterior en 50 ml de etanol al 95% y agite. Filtre conuna gaza o al vaco hasta sacar el mximo de lquido. Guarde el filtrado para ladeterminacin de fosfatos y cloruros identificandolo como filtrado alcohlico. Repita elproceso aadiendo 50 ml de una solucin alcohol-ter 1:1 y filtre al vaco. Guarde elfiltrado para la determinacin de fosfatos y cloruros identificandolo como filtradoalcohol-ter.

3) El resduo obtenido es la casena que procederemos a identificar.


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III b) Identificacin de la casena y aminocidos de la misma:

En 3 tubos de ensayo diferentes aada 0.5 gramos de la casena obtenida y realice laspruebas de Biuret, Milln y Xantoproteica. Observe y anote los resultados.

Prueba Biuret Milln XantoproteicaResultados

III c) Determinacin de fosfatos y cloruros:

1) Tome los filtrados obtenidos durante el aislamiento de la casena; si tienen turbidezllevelos a centrifugar y tome el sobrenadante.

2) Determinacin de fosfatos con la prueba de Molibdato de Amonio: En 3 tubos deensayo por separados tome una muestra de 2 ml de cada uno de los filtrados obtenidosen el paso A. Acidifique el medio aadiendo cido ntrico y luego aada 2 ml demolibdato de amonio. Observe el cambio de color.

3) Determinacin de cloruros con la prueba de Nitrato de Plata: En 3 tubos de ensayo porseparados tome una muestra de 2 ml de cada uno de los filtrados obtenidos en el paso Ay aada a cada uno nitrato de plata al 1% gota a gota. Observe la formacin de unprecipitado blanco.

Tabla de resultados

Filtrado Nitrato de plata Molibdato amonio

AcuosoAlcohlico

Alcohol-ter


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Sexto Laboratorio

Digestin de Carbohidratos por la Amilasa Salival

I. IntroduccinVirtualmente todas las reacciones que ocurren en el organismo estn mediadas por

enzimas, protenas catalticas que incrementan la velocidad de las reacciones sin que ellas seconsuman durante el proceso que ellas catalizan. Sin enzimas la vida no sera posible ya quelas mismas llevan a cabo funciones capitales relacionadas con la salud y la enfermedad.

La velocidad de ciertas reacciones catalizadas por enzimas responde a las variacionessutiles del pH intracelular que caracterizan la acidosis o alcalosis metablica. Adems, dado

que esta velocidad se eleva o disminuye en respuesta a las fluctuaciones correspondientes entemperatura, la fiebre y la hipotermia perturban la homeostasia al modificar numerosasreacciones catalizadas por enzimas. Sin embargo estos cambios mnimos pueden convertirseen ventaja para el mdico si ste manipula controladamente dichos cambios.

Otros factores que afectan la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas sonlos cambios en la concentracin, ya sea, de los sustratos sobre los cuales acta la enzima, ascomo, cambios en la concentracin de la propia enzima. Tambin la cintica enzimticapuede verse afectada debido a la presencia de sustancias inductoras o inhibidoras de laactividad enzimtica.

II. Objetivos1. Estudiar el concepto de enzima.

2. Analizar los diferentes factores que afectan la cintica enzimtica.

3. Estudiar el papel de la amilasa salival en la digestin de los carbohidratos.

4. Introducir otras enzimas que participan en la digestin de los carbohidratos.

III. ProcedimientoIII a) Efecto de la temperatura sobre la accin de la amilasa salival:

1. Tome 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno de ellos 1 ml de solucin saliva 1:9 yluego, lleve cada tubo a la temperatura indicada para cada uno de ellos en el cuadroque aparece ms adelante y deje incubar durante 5 minutos.

2. Luego de incubar agregue a cada tubo 5 ml de solucin almidn al 1%.

3. Dejando los tubos en su temperatura correspondiente, proceda a realizar la pruebade Yodo a cada tubo a los 0, 3, 6 y 9 minutos luego de agregado el almidn.


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4. Al cabo de los 9 minutos, realice la prueba de Benedict a cada uno de los tubos de

ensayo.

5. Complete el siguiente cuadro con los resultados obtenidos:

Prueba de YodoTubo # Temperatura 0 Min 3 Min 6 Min 9 Min

Prueba deBenedict

1 0 Grados2 Temp. Ambiente

3 38 Grados

4 100 Grados

III b) Efecto del pH sobre la accin de la amilasa salival:

1. Tome 7 tubos de ensayo y agregue a cada uno de ellos 1.5 ml de solucin saliva 1:9 yluego, agregue 3 ml de la solucin buffer correspondiente a cada tubo (indicado en el

cuadro que aparece ms adelante). Deje en incubacin durante cinco minutos.


3. Proceda a realizar la prueba de Yodo a cada tubo a los 0, 3, 6, 9 y 12 minutos luegode agregado el almidn.

4. Al cabo de los 12 minutos, realice la prueba de Benedict a cada uno de los tubos deensayo.


Prueba de YodoTubo

#Solucin Buffer 0 Min 3 Min 6 Min 9 Min 12 Min

Prueba deBenedict

1 pH 2.5

2 pH 5.4

3 pH 6.0

4 pH 6.8

5 pH 7.4

6 pH 8.0

7 pH 10.0


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III c) Efecto de la presencia de inductores e inhibidores enzimticos:

1. Tome 6 tubos de ensayo y agregue a cada uno de ellos 1 ml de solucin saliva 2:8,aada luego, a cada tubo, 1 ml de la sustancia indicada en el cuadro que aparece msadelante, deje en incubacin durante cinco minutos.


3. Proceda a realizar la prueba de Yodo a cada tubo a los 0, 5, 10, y 15 minutos luego deagregado el almidn.

4. Al cabo de los 15 minutos, realice la prueba de Benedict a cada uno de los tubos deensayo.


Prueba de Yodo

Tubo # Sustancia 0 Min 5 Min 10 Min 15 Min

Prueba de

Benedict1 Agua destilada

2 Cloroformo

3 NaF

4 NaCl 0.9%

5 Fenol puro

6 HgCl2 1%

Leer de su libro de texto:Propiedades generales de las enzimasCintica enzimticaFactores que afectan cintica enzimtica


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Sptimo Laboratorio

Caracterizacin de Carbohidratos

I. IntroduccinLos carbohidratos se presentan en forma de azcares, almidones y fibras, y son uno de

los tres principales macronutrientes que aportan energa al cuerpo humano (los otros son loslpidos y las protenas). Actualmente est comprobado que al menos el 55% de las calorasdiarias que ingerimos deberan provenir de los carbohidratos.

Los carbohidratos o hidratos de carbono glcidos constituyen compuestos qumicosformados principalmente por carbono, hidrgeno y oxgeno, elementos que se conjugan para

formar diversos tipos, en una proporcin generalmente de 1:2:1, respectivamente. Estasbiomolculas ejercen funciones fundamentales en los seres vivos, como: soporte (celulosa),reserva de alimento (almidn), reserva energtica (glucgeno), energa inmediata (glucosa).

Pueden clasificarse atendiendo a varios criterios: de acuerdo al nmero de monmerosque constituyen al carbohidrato, al nmero de carbonos de sus monmeros o segn el grupofuncional que posee ese monmero.

Entre los polisacridos que son fisiolgicamente importantes tenemos al almidn y elglucgeno. El primero est formado por una cadena -glucosdica. Compuesto que soloproduce glucose en la hidrlisis, es un homopolmero denominado glucosano o glucano.Constituye la fuente ms importante de carbohidratos de los alimentos. Los dosconstituyentes principales del mismo son: la amilosa (15-29%) que tiene estructura helicoidalno ramificada y la amilopectina (80-85%), que consiste en cadenas muy ramificadas. Por suparte, el glucgeno es el polisacrido que se almacena en el organismo animal y contiene unaestructura mucho ms ramificada que la amilopectina.

II. Objetivos1. Estudiar las propiedades, diferencias y clasificacin de los carbohidratos.

2. Utilizar distintas pruebas de laboratorio para caracterizar y clasificar loscarbohidratos.

III. ProcedimientoIII a) Pruebas utilizadas para la identificacin de carbohidratos:

1. Reaccin de Molish: La presencia de carbohidratos en una muestra se pone demanifiesto por la reaccin de Molish, que a cierto punto es la reaccin universal paracualquier carbohidrato. Se basa en la accin hidrolizante y deshidratante del cido sulfricosobre los hidratos de carbono. En dicha reaccin el cido sulfrico cataliza la hidrlisis delos enlaces glucosdicos de la muestra y la deshidratacin a furfural (en las pentosas) o


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hidroximetilfurfural (en las hexosas). Estos furfurales se condensan con el alfa naftol delreactivo de Molisch (reaccin de Molisch) dando un producto coloreado.

Realizacin de la prueba: en un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar,agregue dos gotas de reactivo de Molisch y mezcle bien. Luego incline el tubo y deposite 1ml de H2SO4 concentrado deslizndolo lentamente por la pared del tubo. No mezcle. Slocoloque el tubo en posicin vertical y observe la formacin del anillo rojo violeta queaparece en la zona de contacto de los dos lquidos.

2. Reaccin de Benedict: Una de las reacciones ms comunes en la identificacin decarbohidratos es la reaccin de Benedict. Esta reaccin es especfica para azcares congrupo reductores libres (C=O). Todos los monosacridos poseen un grupo reductor libre.Los disacridos maltosa y lactosa tienen grupos reductores libres, pero la sacarosa no losposee, ya que se pierden los grupos reductores de sus componentes cuando sta es formada.

Esta prueba se basa en la capacidad del carbohidrato de reducir el Cu2+ en un medioalcalino. Este Cu1+ se oxida y precipita en forma de Cu2O, lo que proporciona lacoloracin positiva de la reaccin. La coloracin depender de la concentracin de xido decobre y sta a su vez de la reduccin del cobre; va desde verde, amarillo, anaranjado o rojizo,dependiendo de la coloracin.

Realizacin de la prueba: en un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar,agregue 2 ml del reactivo de Benedict y proceda a colocar el tubo de ensayo en un bao deMara a 100 C durante dos minutos.

3. Reaccin de Seliwanoff: Los carbohidratos se clasifican como cetosas o aldosas. Valedecir, que las cetosas en el carbono 2 tienen una funcin cetona, que en presencia de uncido fuerte producen rpidamente derivados furfricos que reaccionan con un difenolllamado resorcina que est contenido en el reactivo de Seliwanoff. La sacarosa (un disacridoformado por glucosa y fructosa) y la inulina (un polisacrido de la fructosa) dan positiva lareaccin, ya que el HCl del reactivo provoca en caliente la hidrlisis del compuesto liberando

fructosa (responsable de la reaccin positiva).

Realizacin de la prueba: en un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar,agregue 2 ml del reactivo de Seliwanoff y proceda a colocar el tubo de ensayo en un bao deMara a 100 C durante dos minutos.

4. Reaccin de Bial: Consiste en la formacin de un producto de color azul-verdoso entreel furfural de los carbohidratos y el orcinol del reactivo de bial en medio clorhdrico. Esespecfica de pentosas.

Realizacin de la prueba: en un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar,agregue 1 ml del reactivo de Bial + 2.5 ml de cido clorhdrico concentrado y proceda acolocar el tubo de ensayo en un bao de Mara a 100 C durante 5-10 minutos.

5. Identificacin de polisacridos mediante la prueba de yodo: Los polisacridos danun color especfico en presencia de yodo. El almidn que est compuesto de amilosa(estructura lineal) y amilopectina (estructura ramificada) cuando se le agrega yodo se obtieneun color azul ya que a pesar de que la amilosa es el componente menos abundante, est en laparte externa del grnulo de almidn, sin embargo, si realizaramos la prueba a laamilopectina nicamente obtuvieramos una coloracin rojo-violeta en presencia de yodo. Laprueba es igualmente satisfactoria para el glucgeno.


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III b) Identificacin de carbohidratos:

1. Utilizando 4 tubos de ensayo para cada uno de los carbohidratos indicados en latabla que aparece ms adelante, deposite 2 ml de cada uno de ellos en cada uno delos tubos y proceda a realizar las pruebas de Benedict, Molish, Seliwanoff y Bial a lostubos respectivamente.

RESULTADOSCarbohidrato Molish Benedict Seliwanoff BialGlucosa 1%Maltosa 1%Manosa 1%Ribosa 1%

Galactosa 1%Fructosa 1%Lactosa 1%Sacarosa 1%

Agua destilada

2. En un plato de petri o en un vidrio de reloj coloque un poco de solucin de almidny agregue gotas de una solucin de yodo. Repita el mismo procedimiento con unpoco de yuca y papa.

Sustancia Resultados prueba de yodoSolucin almidn

YucaPapa

LEER DE SU LIBRO DE TEXTO:CARBOHIDRATOS DE IMPORTANCIA FISIOLOGICACLASIFICACION, NOMENCLATURA Y ESTRUCTURA DE LOSCARBOHIDRATOS


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Octavo LaboratorioCaracterizacin de Lpidos

I. IntroduccinLos lpidos son biomolculas orgnicas formadas bsicamente por carbono e

hidrgeno y generalmente tambin oxgeno; pero en porcentajes mucho ms bajos. Ademspueden contener tambin fsforo, nitrgeno y azufre. Es un grupo de sustancias muyheterogneas que tienen en comn estas dos caractersticas:1. Son insolubles en agua2. Son solubles en disolventes orgnicos, como ter, cloroformo, benceno, etc.

Son compuestos de gran importancia bioqumica, ya que desempea grandes funcionescomo la liberacin y reserva de energa qumica, proven de una barera hidrofbica quepermite la compartimentalizacin del contenido acuoso de las clulas y estructurassubcelulares. En adiccin a esto, los lpidos llevan a cabo varias funciones en el organismo,por ejemplo, algunas vitaminas liposolubles tienen funciones regulatorias o funciones comocoenzimas, y las prostaglandinas y hormonas esteroideas juegan papeles mayores en elcontrol de la homeostasis del organismo.

Hay ciertos cidos grasos poliinsaturados esenciales que deben ser suministrados en ladieta como lo es el cido linoleico dndole esto mayor valor nutricional.

Los lpidos se clasifican de varias formas, una de ellas es atendiendo a que posean ensu composicin cidos grasos (Lpidos saponificables) o no lo posean (Lpidosinsaponificables), dividiendose as en dos grupos:

1. Lpidos saponificablesA. Simples

1. Acilglicridos2. Cridos

B. Complejos1. Fosfolpidos2. Glucolpidos

2. Lpidos insaponificablesA. TerpenosB. EsteroidesC. Prostaglandinas

Los triglicridos son los ms abundantes en los vegetales y uperio uperiors. Seacumulan en los depsitos grasos y en las semillas como forma de reserva alimenticia.


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II. Objetivos1. Estudiar los lpidos; su importancia, estructura, clasificacin, funcin y caractersticas

fsico-qumicas.

2. Estudiar la importancia de las diferentes pruebas usadas en la identificacin de loslpidos y reacciones de importancia biolgica para la identificacin de las caracteristicasde los lpidos.

III. ProcedimientoIII a) Solubilidad de los lpidos:

Los lpidos son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen enpequesimas gotas formando una emulsin de aspecto lechoso, que es transitoria, puesdesaparece en reposo por reagrupacin de las gotitas de grasa en una capa que, por su menordensidad, se sita sobre el agua.

Por el contrario, las grasas son solubles en disolventes orgnicos, como el ter,cloroformo, acetona, benceno, etc. Su solubilidad en alcoholes depender del tamao delmismo as como de su ramificacin (a mayor nmero de carbonos ms soluble ser el lpidono as con la ramificacin).

Procedimiento:

Tome 10 tubos de ensayo y aada a cada tubo 2 mL de cada una de las siguientessustancias o disolventes: Agua destilada, cido clorhdrico concentrado, benceno,cloroformo, tetracloruro de carbono, ter, alcohol metlico, alcohol etlico, alcoholisoproplico, alcohol butlico . A todos los tubos aada 1 mL de aceite. Observe los

resultados.

III b) Nmero de yodo:

Es una medida del grado de insaturacin de los componentes de una grasa. Ser tantomayor cuanto mayor sea el nmero de dobles enlaces (C=C) por unidad de grasa,utilizndose por ello para comprobar la pureza y la identidad de las grasas. Es la cantidad(gramos) de yodo absorbidos por 100 gramos de grasa.

El nmero de yodo oscila entre 0 (cidos grasos saturados) a 350.

Fundamento terico del mtodo:

La grasa disuelta se hace reaccionar con monobromuro de yodo en exceso. El yodopor s mismo no reacciona con los dobles enlaces. En su lugar se utilizan bromo ohalogenados mixtos como yoduro de cloro ICl o el bromuro de yodo IBr. La cantidad demonobromuro de yodo que no se adiciona a los dobles enlaces oxida una solucin deyoduro (I-) a yodo (I2), y ste se determina por valoracin con una disolucin de tiosulfatosdico (2Na2S2O3). La reaccin de adicin se lleva a cabo en oscuridad para evitar que seproduzcan reacciones laterales de radicales inducidos por la luz y ello provocara un gastoaparente mayor de halgeno, falseando los resultados. A continuacin se muestran las tresreacciones involucradas:


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1) IBr + R1-CH=CH-R2 R1-CHBr-CHI-R22) IBr + KI KBr + I23) I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6

Procedimiento:

1) Tomar dos matraces de 500 ml cada uno.Uno de ellos ser nuestro matraz blanco o control y el otro, nuestro matraz experimento oproblema. Agrega las siguientes sustancias en sus debidos matraces.

Control: - 10 ml de Cloroformo.- 12 ml de yodo Hanus.

Experimento: - 10 ml de Cloroformo.- 12 ml de yodo Hanus.- 1.0 ml de aceite.

2) Lleve estos dos matraces, debidamente tapados, a la oscuridad por un perodo de 30 mins.Agitar ambos matraces cada 5 minutos.

3) Pasado este tiempo, retrelos de la oscuridad y agregue a cada matraz lo siguiente: 7 ml de KI(solucin de yoduro de potasio). Agitar. 100 ml de agua destilada(lavar el tapn del matraz con esta agua para no

perder yodo libre en l) quien aadir volumen a la mezcla.

4) Titular el exceso de yodo de cada matraz con tiosulfato de sodio 0.1Nhasta que la mezclacontenida en cada matraz tome una coloracin amarillenta. Una vez que esto suceda, tapecada matraz y agtelo para conseguir que cualquier cantidad de yodo libre quede atrapado enla capa de cloroformo y se ponga en contacto con la solucin de yoduro de potasio.

5) Agregue 1 ml de una solucin de almidn al 1% como indicador para asegurarnos de que

no quede yodo libre en la solucin.

6) Calcule el nmero de yodo para la muestra dada.

Clculos:

Calcule losgramos de yodo absorbidos por cada 100 grs. de grasa.

1) Para esto primero necesitamos saber qu cantidad de yodo se consumi en el matrazproblema. Esto lo conseguimos restando la cantidad de tiosulfato de sodio 0.1N requeridospor el blanco menos la cantidad de tiosulfato de sodio 0.1N requeridos por el problema ya

que esto representa el tiosulfato equivalente al yodo absorbido por la materia grasa.Ej. Suponiendo que el matraz control consumi 50 ml de tiosulfato mientras que el experimento sloconsumi 20 ml : 50-20 = 30mlque representan los ml de yodo consumidos ya que 1 ml de tiosulfatoequivale a 1 ml de yodo.

2) Con una regla de tres busque los mililitros de yodo consumidos por 100 gramos de grasa.

Ej. 10 gr de grasa (usados en el experimento) ---- 30 ml de yodos consumidos100 gramos de grasa -----x


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3) Por ultimo ajuste estos ml de yodos a gramos que es lo que nos interesa. Esto lo puedeslograr por la siguiente regla de tres:

Ej. 1ml de yodo ----- 0.0127 gramos de yodo.ml de yodos consumidos* ---- x

* = resultado del clculo anterior.

4) Por ultimo debes calcular el nmero de yodo en base al peso de la grasa, calculando lamisma utilizando la formula de la densidad. D=m/V donde D = densidad, m = masa, V=volumen. D= 0.916 para la grasas.

III c) Nmero de saponificacin:

La saponificacin consiste en una hidrlisis alcalina de la preparacin lipdica(conKOH o NaOH). Los lpidos derivados de cidos grasos (cidos monocarboxlicosdecadena larga) dan lugar a sales alcalinas (jabones) y alcohol, que son fcilmente extrablesen medio acuoso.

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El nmero de saponificacin no es ms que los miligramos de KOH necesarios para

saponificar 1 gramo de materia grasa.

Esta prueba es otra prueba cualitativa que podemos aplicar a los lpidos. Esta nos

permite ver si el tipo de lpido es saponificable (contiene cidos grasos) o no (no contienecidos grasos).

En los lpidos saponificables nos orienta hacia cul sera el peso molecular de lamolcula expresando una relacin inversa entre esta molcula y el nmero de saponificacin.Se describe una relacin inversa ya que a menor peso de la molcula mayor cantidad demolculas existirn en cierta cantidad grasa dada, as que mayor cantidad de cidos grasoshabrn. Debido a esto ltimo tambin habrn muchos grupos carboxlicos con los cualesreacciona el KOH. Por lo tanto, mayor cantidad de KOH consumida dar un nmero mayorde saponificacin.

Tomemos los dos ejemplos siguientes de Tripalmitina (PM=819)y Tributirinina(PM=412). En 1 gramo de tributirina hay mayor nmero de molculas detnglicridos que en 1 gramo de tripalimtina, ste ltimo por tener mayor peso molecular,completa el gramo de grasa con menor nmero de molculas de triglicridos.


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Efectivamente, teniendo en cuenta que el peso molecular de la tripalmitina es 819 y dela tributirina es 302, habr 819/302 6 2.7 veces ms molculas de tributirina que detripalmitina en un mismo peso de cada una de las grasas indicadas. En conclusin, el nmerode saponificacin de la tributirina ser tambin 2.7 veces mayor que el de la tripalnitina.

Procedimiento:

1) Tomar dos matraces de 250 mL cada uno.

Agrega las siguientes en sus debidos matraces: Control: - 50 mL de KOH Experimento: - 50 mL de KOH.

- 5mL de aceite.

2) Conecte cada matraz a un condensador de reflujo enfriado por aire y lleve a bao de marapor 30 minutos. Agite con frecuencia.

3) Aada 1mL de fenolftalena (indicador de medio bsico) a cada matraz y luego titule conHCl 0.5N para corregir cualquier consumo de lcali del control. Anote los mL consumidospor cada matraz.

4) Calcule el nmero de saponificacin.

Clculos:

Calcule los miligramos de KOH necesarios para saponificar 1 gramo de materia grasa.

1) Para esto primero necesitamos saber qu cantidad de KOH que se consumi en el matrazproblema que lo conseguimos restando la cantidad HCl 0.5N consumidos por el blancomenos la cantidad de HCl 0.5N requeridos por el problema.

Ej. Suponiendo que el matraz control consumi 50 mL de HCl mientras que el experimento slo consumi20 mL : 50-20 = 30mL.

2) Como lo deseado es saber los gramos de grasa y no los ml de ella, convierta los mLconsumidos a gramos con la frmula de la densidad de la grasa: D=m/V donde D =densidad, m = masa, V= volumen. D= 0.916 para la grasas.

Ej. 10 mL de aceite; m=D*V= 0.916*10mL=9.16gr.

3) Con una regla de tres busque los mililitros de HCl consumidos por 1 gramo de grasa.Ej. 9.16 gr de grasa (usados en el experimento) ---- 30 mL de HCl consumidos


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1 gramos de grasa ---- -x

4) Por ultimo ajuste estos mL de HCl a su equivalente en KOH que es lo que nos interesa.Esto lo puedes lograr por la siguiente regla de tres:

Ej. 1mL de HCl ----- 28.05 mg de KOH.mL de HCl * ---- x

*= resultado del clculo anterior.

LEER DE SU LIBRO DE TEXTO:LIPIDOS DE IMPORTANCIA FISIOLOGICA, FUNCIONES, CLASIFICACION,CARACTERISTICAS FISICO-QUIMICAS.


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Noveno Laboratorio

cidos Nucleicos

I. IntroduccinEstructura Primaria.

En todas las clulas vivas hay cidos nucleicos; en su mayora estn constituyendo lasnucleoprotenas, complejos formados por protenas bsicas (protaminase histonas) y cidosnucleicos. Desde que Miescher aislara por vez primera una nucleoprotena, en 1869, se hanpuesto a prueba numerosas tcnicas para separar los cidos nucleicos de las protenas a lasque estn unidas. Se sabe que no todos los cidos nucleicos son iguales; en los tejidos

constituidos por clulas provistas de grandes ncleos, como el Timo, predomina un tipo decido nucleico, llamado antes cido timonucleico; en otras clulas, que tienen ncleosdiminutos, como las levaduras, predomina un tipo distinto: cido nucleico de levadura. Estosdos tipos de cidos nucleicos se denominan hoy, atendiendo a su composicin qumica,cido desoxirribonucleico (ADN) y ribonucleico (ARN) respectivamente.

El ADN est fundamentalmente compuesto de fosfato, las bases pricas: adenina y guanina,las bases pirimdicas: timina y citosina, y el azcar 2-desoxi-d-ribosa.

El ARN difiere del ADN por contener la base pirimdicas uracilo en lugar de la timina y elazcar d-ribosa en lugar de la 2-desoxi-d-ribosa.

Los datos que hoy poseemos ponen de manifiesto la existencia de una frmula qumicabsica, comn a ambos tipos de cidos nucleicos y consistente en una cadena o esqueletoconstituido por grupos alternados de fosfato de azcar furanosa unidos por enlaces regulares35fosfodiester. Las bases pricas o pirimdicas se unen a este esqueleto o cadena de azcarfosfato a travs de enlaces BetaNglicsilo en la posicin 1de la ribosa o de ladesoxirribosa.

A cada sub-unidad estructural, formada por una base nitrogenada y un azcar, se ledenomina nuclesido. A estos que contienen un fosfato en las posiciones 2, 3 5 se lesllama nucletidos (el nmero seguido del signo () indica la posicin en la base. A loscompuestos formados por asociacin de dos o ms nucletidos, constituyendo pequeas

molculas, se les denomina oligonucletidos.

Estructura Secundaria.

Los diversos estudios fisioqumicos del ADN en solucin acuosa han demostrado que setrata de un polmero del elevado peso molecular (5x10 elevado a la sexta potencia) y queofrece una configuracin mas bien rgida y distendida. Entre las consecuencias de su elevadopeso molecular y de la rigidez de sus molculas se destaca la elevada viscosidad de lassoluciones acuosas de ADN. Solucin con 104 g/ml de ADN, es dos veces ms viscosaque el agua. Otra consecuencia de las citadas propiedades de la molcula de ADN es la gran


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facilidad con que las fuerzas de friccin (agitacin a gran velocidad, paso a travs de unapipeta o jeringa) reducen su peso molecular por rotura de su cadena. Es prcticamenteimposible obtener a partir de material biolgico ADN sin que tenga cierto grado de friccin,por lo que es muy probable que los pesos moleculares del ADN aislado (5x10 a la sextapotencia) tengan poco que ver con el tamao de la molcula del ADN en vitro.

El ADN fibroso aislado tiene un modelo de difraccin de rayos X muy neto, indicioexperimental directo de una estructura secundaria muy regular. Watson y Crick propusieronen 1953 una estructura secundaria del ADN, que dedujeron de stos modelos de difraccinde rayos X, y que estaban de acuerdo con las observaciones de Chargaff (4), mostrando queciertos pares de base de ADN, se presentan en cantidades equimoleculares. Esta estructurade Watson y Crick est constituida por dos cadenas de ADN que se enrollan helicoidalmenteen torno a un eje central comn, originando una molcula de cadena doble y de unos 20Amgstron de dimetro. Las cadenas de azcar-fosfato estn situadas en la parte externa deestas hlices orientadas con direccin de enrollamiento a la derecha; las bases pricas ypirimdicas se encuentran enlazadas por puentes de hidrgeno, en la parte interna de lascitadas hlices, con los planos de sus anillos orientados perpendicularmente al eje central.Slo se tolera el apareamiento de bases entre la adenina y la timina o uracilo, en el caso delRNA, y entre la guanina y citosina.

Nucleoprotenas.

Como se dijo anteriormente, los cidos nucleicos se encuentran conjugados con protenas.Las nucleoprotenas el ADN y ARN pueden degradarse en sus components y seridentificados por separados.

II. Objetivos1. Estudiar los cidos nucleicos: clasificacin, diferencias estructurales y funcionales,localizacin y sus componentes.

2. Analizar la importancia de la homogenizacin de las levaduras, pruebas de Bial, Biuret y deidentificacin de fosfatos y bases nitrogenadas en el reconocimiento de los componentes queformas los cidos nucleicos.

III. Procedimiento1. Suspenda 15 grs de levadura en 125 ml de NaOH 0.04 M y homogenice con licuadorpor 5 minutos. Transfiera el contenido a un matraz Erlemeyer y caliente en un bao deMara por 20 minutos. Luego debe centrifugar por 3 minutos y tomar el sobrenadante elcual llevar a un beaker (250ml) donde le agregarn gotas de cido actico glacial hasta que elmedio este cido.

2. Tome la muestra y agregue 100mL de una solucin de HCl/Etanol 95% (1:99).Proceda a centrifugar por 3 minutos. Tome precipitado y lave con Etanol 95%. Centrifuguenuevamente, tomando luego el precipitado.

- Tome una muestra del precipitado y haga la prueba de Biuret.


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3. A cada tubo de ensayo con el precipitado restante de la muestra agregue 3mL deH2SO4 3N y lleve a bao de mara durante 3 minutos. Hecho esto realice las siguientespruebas:

A. Identificacin de la Ribosa.

Tome 4 tubos de ensayo y agregue lo siguiente en cada uno:

Tubo Sustrato Reactivo de Bial HCL concentrado1 1 ml Agua destilada 1 ml 2.5 ml2 1 ml de ribosa 1% 1 ml 2.5 ml3 1 ml de ribosa 0.5% 1 ml 2.5 ml4 1 ml del precipitado 1 ml 2.5 ml

Lleve al calor por 5 minutos o hasta que observe un cambio de color.

El reactivo de Bial est compuesto por iones frricos, etanol y orcinol. Consiste en laformacin de un producto de color azul-verdoso entre el furfural y el orcinol en medio

clorhdrico. Es especfico de pentosas.B. Identificacin Base Nitrogenada.

Agregue gotas de Hidrxido de amonio (NH4OH) concentrado hasta obtener un mediobsico y algunas gotas de Nitrato de Plata 0.1 M a una pequea cantidad del precipitadoobtenido que ha sido colocado en un tubo de ensayo. Observe.

C. Identificacin de Fosfatos.

Agregue un poco del precipitado en un tubo de ensayo y aada Hidrxido de Amonio(NH4OH) concentrado hasta obtener un medio bsico, acidifique con algunas gotas de

HNO3 y agregue Molibdato de Amonio (1mL). Observe.

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Manual de Lab Bioquimica

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