Manual de Laboratorio

Guía de pruebas de laboratorio para Inmunohematología y Banco de Sangre Sección de Inmunohematología y Banco de

Sangre

Facultad de Microbiología

Universidad de Costa Rica

Dr. Carlos Cordero Gómez

Dr. Miguel Rodríguez Pineda 2009



Sección de Inmunohematología y Banco de Sangre

Guía de pruebas de laboratorio para Inmunohematología y Banco de Sangre

Página 2

Indice

Prefacio ................................................................................................................................. 4

Introducción .......................................................................................................................... 5

La flebotomía o recolección de sangre. .................................................................................. 9

Suspensión de trabajo en el laboratorio de Inmunohematología, glóbulos rojos al 3-5%, .... 12

Lavado de muestras en Inmunohematología. ...................................................................... 14

Lectura, interpretación y escore de las reacciones de aglutinación. ..................................... 16

Determinación en tubo del grupo sanguíneo ABO en adultos. ............................................. 19

Determinación en tubo del grupo sanguíneo ABO en recién nacidos ................................... 22

Determinación en tubo de subgrupos sanguíneos ABO. ...................................................... 25

Determinación en tubo del antígeno Rh/ D. ........................................................................ 29

Detección del antígeno D débil ............................................................................................ 32

Células Control de Antiglobulina Humana. ........................................................................... 34

Conservación de Glóbulos Rojos. .......................................................................................... 37

Determinación del fenotipo Rh ............................................................................................. 39

Determinación de la sustancia H en saliva ........................................................................... 44

Determinación fenotípica del sistema MNSs........................................................................ 49

Determinación fenotípica de los sistemas de grupo sanguíneo Kell, Duffy y Kidd. ............... 55

Células Rastreadoras o células pantalla ............................................................................... 60

Prueba de inmunoglobulina indirecta. ................................................................................. 64

Prueba de antiglobulina directa ........................................................................................... 70

Estudio de Anticuerpos Irregulares ...................................................................................... 74

Prueba de compatibilidad sanguínea ................................................................................... 81

Identificación de Anticuerpos .............................................................................................. 94

Técnica de adsorción de anticuerpos ................................................................................... 98

Técnica de Elución de Anticuerpos .................................................................................... 100

Incompatibilidad materno- fetal ........................................................................................ 107

Anemia Hemolítica Autoinmune ........................................................................................ 112

Anexo 1 ............................................................................................................................. 116





Página 3

Reactivos anti-A y anti-B .................................................................................................... 116

Anexo 2 ............................................................................................................................. 119

Procedimientos para eliminar anticuerpos interferentes. .................................................. 119

2.1 Uso de reactivos Thiol para separar autoaglutinación .............................................................. 119

2.2 Autoadsorción en frío ................................................................................................................ 120

2.3 Técnica de precalentamiento para sueros que contienen aglutininas frías ............................. 121

2.4 Adsorción de autoanticuerpos fríos utilizando estroma de eritrocitos de conejo. .................. 122

2.5 Disociación de IgG utilizando cloroquina .................................................................................. 123

2.6 Adsorción autóloga de autoanticuerpos con reactividad caliente............................................ 125

2.7 Técnica utilizando ZZAP ............................................................................................................. 126

Anexo 3 ............................................................................................................................. 128

Técnicas de elución de anticuerpos ................................................................................... 128

3.1 Elución ácida con digitonina ...................................................................................................... 128

3.2 Técnica de Rubin modificada .................................................................................................... 129

3.3 Técnica de eluído de Lui ............................................................................................................ 130

Anexo 4 ............................................................................................................................. 131

Procedimientos para estudio de anemias hemolíticas inducidas por medicamentos ......... 131

4.1 Demostración de la formación de complejos inmunes inducidos por droga ........................... 131

4.2 Detección de anticuerpos contra penicilina o cefalotina .......................................................... 132





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Prefacio

La presente guía de laboratorio pretende orientar al estudiante en el aprendizaje

de las principales técnicas de Laboratorio de Inmunohematología y Banco de

Sangre.

Está constituida por los procedimientos que el estudiante debe realizar en las

sesiones prácticas de los cursos de Laboratorio de Inmunohematología y Banco

de Sangre de la carrera de Licenciatura en Microbiología y Química Clínica de

la Universidad de Costa Rica.

El propósito principal es que el estudiante logre a través del desarrollo de los

procedimientos que se presentan obtener su propia vivencia en cada práctica

realizada, hacer las anotaciones pertinentes y desarrollar las destrezas y

habilidades propuestas.

También que el estudiante cuente con un material propio de consulta rápido

para su futuro ejercicio profesional.

Los autores





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Introducción

Las secciones de Inmunohematología y Banco de Sangre tienen bajo su

responsabilidad el preparar los hemocomponentes y seleccionar el más indicado

para el paciente a quien el médico se lo prescribe.

Para cumplir con esta labor se debe interaccionar con los donantes de sangre,

realizar pruebas inmunohematológicas como la determinación de grupos

sanguíneos, fenotipos y pruebas de compatibilidad dentro de otras.

El buen desenvolvimiento dentro del Laboratorio y la utilización de medidas

preventivas es un aspecto básico y fundamental para los cursos de Laboratorio

de Inmunohematología y Banco de Sangre.

Aquí le brindamos algunas de las recomendaciones importantes para la

seguridad en el Laboratorio y Banco de Sangre.

En 1987 el CDC introduce el concepto que la sangre de todo paciente debe ser

tratada como potencialmente infecciosa para el Virus de la Hepatitis B (HBV),

Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) y otros patógenos transmitidos

por vía parenteral.

Toda persona que labore en un laboratorio de Banco de Sangre debe saber que

el SIDA y la hepatitis se trasmiten por medio de fluidos corporales y que, por lo

tanto, se deben guardar todas las normas de seguridad necesarias para evitar el

contagio.

La exposición ocupacional al HIV es menos frecuente que la del HBV, debido a

que las concentraciones en que se puede encontrar el HBV son mucho más

altas, además de que este virus puede permanecer estable a 25ºC por más de

siete días, lo que explica su mayor frecuencia e infección.

La transmisión ocupacional de HBV y del HIV se relaciona con:

• inoculación percutánea de sangre, plasma, suero u otros fluidos

corporales, debido a accidentes con agujas.

• Contaminación de la piel con sangre o fluidos corporales sin que medien

punciones, debido al contacto directo de una lesión y el fluido

contaminante.





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• Exposición de mucosas ( oral, nasal o conjuntiva) a sangre o fluidos

corporales, como resultado de pipetear con la boca, salpicaduras al

momento de quitar un tapón de un tubo y/o centrifugación inadecuada

que genere aerosoles con material infeccioso y que entren en contacto con

lesiones en piel.

Los estudiantes deberán cumplir con los siguientes puntos dentro del Laboratorio:

1- No correr.

2- Siempre que va a manipular o trasladar muestras dentro del Laboratorio

estas deberán de estar en una gradilla, no las cargue en las manos, además

utilice guantes para dicho transporte.

3- Utilice zapatos cerrados, no utilice zapatillas abiertas o sandalias. Con el

objetivo de proteger los pies de salpicaduras de sangre o lesiones por

vidrios quebrados.

4- Si se tiene el pelo largo amárrelo con una cola, para evitar que este se vaya

a contaminar con el material que se utiliza.

5- Es importante utilizar antejos para evitar salpicaduras en los ojos, en

especial en aquellas maniobras donde se puedan generar aerosoles.

6- Si se ve afectado por alguna salpicadura lave con abundante agua y en

casos de alguna lesión con algún vidrio debe acudir donde un médico que

lo asista.

7- Siempre utilice gabacha dentro del Laboratorio.

8- Antes de empezar la práctica y hasta el final de la misma utilice guantes.

Los guantes pueden estar hechos de látex o vinil. En ambos casos

demuestran una buena barrera protectora; sin embargo, los de látex

permiten conservar mayor sensibilidad táctil.





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Se debe tener como norma general el uso de guantes cuando se realiza

cualquier procedimiento dentro del laboratorio.

9- Queda prohibido el uso de teléfonos celulares durante el Laboratorio.

10- Lavado de manos.

El frecuente lavado de manos es una de las medidas de precaución más

útiles e importantes, éste se debe realizar posterior al contacto con

pacientes y muestras de laboratorio,

Las manos se deben lavar con agua y jabón:

• después de completar el trabajo y antes de irse del laboratorio

• después de quitarse los guantes

• antes de cualquier otra actividad donde intervenga contacto entre

manos y mucosas

• inmediatamente después de un contacto accidental con sangre o

fluidos corporales

• antes de ir al servicio sanitario.

11- Limpieza de superficies de trabajo.

Todas las superficies de trabajo deben limpiarse antes y después del

trabajo con cloro casero diluido 1:10 o con alcohol yodado. Otros

instrumentos a desinfectar son las tijeras y las centrífugas.

La dilución de cloro recomendado inactiva al HBV en 10 minutos y al

HIV en 2 minutos.

Cuando ocurra un derrame de sangre o fluidos corporales se debe

proceder de la siguiente manera:

• utilizar guantes y gabacha

• absorber el líquido con una toalla o papel absorbente. El objetivo de

este paso es eliminar la mayor cantidad de proteína, ya que las

soluciones de cloro son menos efectivas en presencia de altas

concentraciones proteínicas

• limpiar la superficie con cloro diluido.

• Colocar un papel absorbente empapado con cloro sobre la superficie

sucia





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• Limpiar de nuevo y descartar todo lo usado en un recipiente de

bioseguridad

12- Precaución con agujas.

Los accidentes con agujas se pueden prevenir de la siguiente manera:

• No tapar las agujas después de haber sido utilizadas.

• No separar las agujas de las jeringas.

• No manipular las agujas con las manos.

• Poner las agujas una vez utilizadas en un recipiente rojo o naranja con

el símbolo de bioseguridad.

• Estos recipientes deben de estar colocados cerca del área utilizada para

las flebotomías.

13- Descarte de material.

• Todo material que resulta luego de realizar las pruebas en el

Laboratorio debe ser descartado en recipientes de plástico que

contengan solución de hipoclorito de sodio al 0.5%, aquí se incluyen

tubos, pipetas, portaobjetos y frascos.

• Mientras tanto, el material seco como gasas, aplicadores, papel debe

ser depositado en bolsas de basura de material resistente, estas bolsas

deben de ser de color naranja o rojo y portar el símbolo de

bioseguridad.

• Todos los residuos del Laboratorio que contengan fluidos corporales

deben ser autoclavados previo descarte definitivo.

14- Otras medidas de seguridad.

• No consumir comidas ni bebidas en el laboratorio.

• No guardar alimentos en las refrigeradoras o congeladores que

contengan muestras o bolsas de sangre.

• Estos equipos deben de ser rotulados también como biopeligrosos.

• Es totalmente prohibido fumar dentro del laboratorio.





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Procedimiento 1

La flebotomía o recolección de sangre.

Principio:

La recolección de sangre debe ser practicada mediante métodos asépticos, con

un sistema cerrado, guantes y una sola punción venosa.

En caso de que la primera punción no fuera óptima, para la segunda punción se

debe utilizar un equipo nuevo.

Método:

Antes de la flebotomía:

- Revisar la identificación de los tubos que se van a utilizar.

- Rotular el tubo con el nombre y apellidos de la persona que pertenece la

muestra, número de identificación que puede ser el número de cédula.

- Indicar la persona responsable de realizar el procedimiento, ya sea con las

iniciales o un número designado por el Laboratorio.

- Otra información importante de indicar es la ubicación, fecha y hora de la

extracción.

Preparación de la punción venosa:

- Inspeccionar ambos brazos y seleccionar la mejor vena.

- Limpiar con un algodón impregnado con alcohol al 70% un área de 8

centímetros alrededor del sitio seleccionado para la punción.

- Realizar la limpieza de adentro hacia afuera en forma circular.

- Limpiar en dos ocasiones cuando se amerite.

- La zona debe de estar seca antes de la punción venosa.

Flebotomía:

- Colocar el torniquete.

- Introducir la aguja en la vena seleccionada en un ángulo de 45º y con el bisel

hacia arriba.

- Dejar que la sangre fluya libremente dentro del tubo.





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- Si se está recolectando sangre anticoagulada inmediatamente después de

retirado el tubo del adaptador procesa a mezclar la sangre con suavidad.

- Aflojar el torniquete cuando la extracción haya concluido.

- Colocar un algodón sobre la vena.

- Retirar la aguja y hacer presión con el algodón sobre la vena.

- Indicar al paciente que doble el brazo y que lo mantenga en esa posición por

10 minutos.

- Descartar el material con la aguja en el envase de desecho.

- Colocar las muestras obtenidas en el espacio correspondiente dentro de la

gradilla.

Cuidados:

La recolección de sangre es un procedimiento sencillo y seguro para las

personas. No representa riesgo alguno, sin embargo, en muy pocas ocasiones se

pueden presentar ciertos inconvenientes como:

Desvanecimiento, lipotimia, síncope

Estas reacciones pueden explicarse por una descarga vasovagal. Si esto se

presenta se debe indicar a la persona que coloque la cabeza entre las piernas o

coloque al paciente en posición de Trendelemburg.

Si se presenta nauseas indicar al paciente que respire profundamente.

Si hay hiperventilación el paciente debe respirar en una bolsa de papel.

Si se observa una tendencia a perder el conocimiento, proteja la persona de un

golpe colocando en una posición que evite las caídas.

Tomar la presión y el pulso.

Hematoma durante o después de la flebotomía Si este se presenta se debe de:

Retirar inmediatamente el torniquete y la aguja del brazo.

Colocar tres o cuatro gasas estériles sobre el sitio de venipuntura y aplicar

firmemente presión digital durante 7 – 10 minutos. Una alternativa





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consiste en aplicar un apósito ajustado, que se puede retirar 7 – 10

minutos después para permitir la inspección.

Si se desea, aplicar hielo, cubierto con una gasa, en el área durante 5

minutos.

Si se sospecha una punción arterial, retirar la aguja de inmediato y aplicar

presión firmemente durante 10 minutos. Aplicar un vendaje compresivo

enseguida.





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Procedimiento 2

Suspensión de trabajo en el laboratorio de Inmunohematología, glóbulos rojos al 3-5%,

Principio

La suspensión de trabajo de glóbulos rojos al 3-5% es un procedimiento de

rutina en el laboratorio de Inmunohematología.

La suspensión no requiere ser exacta, sino que puede estar en un rango de

concentración entre un 3 a 5%.

Esta concentración permite una proporción adecuada de reacción entre los

glóbulos rojos y los anticuerpos presentes en los reactivos o muestras a analizar

a través de la reacción de aglutinación.

Este procedimiento tiene como característica principal ser un método

cualitativo, por lo que es importante desarrollar las destrezas necesarias para

realizarlo correctamente.

Materiales y muestras 1. Tubos 12x75 mm limpios y secos.

2. Pipetas Pasteur o de transferencia.

3. Solución salina fisiológicas (0.9%).

4. Muestras de sangre anticoagulada con EDTA.

5. Centrífuga serológica (3000 rpm ).

6. Guantes.

7. Gabacha.

8. Recipientes de descarte de material.

Método: Cuantitativo

1. Transfiera al menos 1 ml de sangre total a un tubo de ensayo

adecuadamente rotulado.

2. Añada solución salina 1 centímetro antes de la boca del tubo.





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3. Centrifugue 1 minuto a 3500 rpm con la centrífuga serológica hasta

obtener un paquete de eritrocitos.

4. Descartar el sobrenadante.

5. Repetir los pasos 1 al 4 dos veces más. El sobrenadante final debe de

estar claro y puede ser completamente removido.

6. Con una pipeta automática transfiera 0.3 ml de los glóbulos rojos lavados

a un tubo de ensayo que contenga 9.7 ml de solución salina fisiológica.

7. Tapar el tubo y mezclar con suavidad hasta homogenizar la solución.

Cualitativo 1. Rotular adecuadamente un tubo de ensayo.

2. Con una técnica apropiada de uso de material biopeligroso tomar una

pipeta Pasteur y transferir una pequeña muestra de sangre al tubo.

3. Añadir solución salina hasta alcanzar una coloración rojo “tomate”.

4. Realice comparaciones visuales con soluciones ya preparadas al 3-5%

5. Descartar el material en los recipientes destinados en el laboratorio.

Práctica:

Realizar al menos 5 suspensiones de forma cualitativa hasta determinar qué

cantidad de sangre y de solución salina deben de se añadidos para hacer una

suspensión de trabajo.

Tenga presente que los seres humanos poseen diferentes valores de hematocrito

(proporción de glóbulos rojos en sangre) por lo que la cantidad de muestra

necesaria para realizar una buena suspensión de trabajo puede variar, de ahí que

es muy importante desarrollar la destreza para hacer suspensiones entre el 3-5%.

Repita el procedimiento tantas veces sea necesario, hasta que domine la técnica

y las proporciones.

Resultados, discusión y conclusiones: _______________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________





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Procedimiento 3

Lavado de muestras en Inmunohematología.

Principio

Los lavados de muestras sanguíneas para obtener sólo el paquete globular es un

procedimiento de rutina dentro de cualquier sección de Inmunohematología.

El propósito es eliminar cualquier interferente proteico que pueda alterar la

reacción de aglutinación. Este aspecto es tan importante que se pueden obtener

reacciones falsas positivas o negativas a partir de muestras mal lavadas.

Materiales y muestras:

1. Tubos 12x75 mm limpios y secos

2. Pipetas Pasteur o de transferencia

3. Solución salina 0.9%

4. Centrífuga serológica (3000 rpm )

5. Guantes

6. Gabacha

7. Recipientes de descarte de material

8. Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA

Método:

1. Rotular adecuadamente un tubo de ensayo.

2. Transferir con una pipeta Pasteur y técnica apropiada de uso de material

biopeligroso una muestra de sangre que no pase de 1 ml a un tubo de

ensayo.

3. Añadir solución salina hasta alcanzar 1 centímetro antes de la boca del

tubo.

4. Equilibrar y centrifugar por 1 minuto a 3500 rpm en una centrífuga

serológica.

5. Una vez centrifugado debe de quedar un paquete globular.

6. Descartar el sobrenadante.

7. Resuspender los glóbulos rojos.

8. Añadir solución salina hasta 1 centímetro antes de la boca del tubo.

9. Repetir el mismo procedimiento dos veces más.





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10. En el último lavado debe de quedar un sobrenadante claro.

11. Descartar el sobrenadante y realizar una suspensión de trabajo al 3-5%

12. Descartar el material en los recipientes adecuados de la práctica.

Práctica:

Realizar al menos cinco lavados de glóbulos rojos.

Repetir el procedimiento tantas veces sea necesario hasta que domine la técnica.

Resultados, discusión y conclusiones:

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________________________________________________________________

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________________________________________________________________

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________________________________________________________________

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Procedimiento 4

Lectura, interpretación y escore de las reacciones de aglutinación.

Principio

Cuando se presentan reacciones de aglutinación se pueden observar diferentes

grados y fuerzas de reacción entre los antígenos y los anticuerpos.

Esta observación es muy importante en Inmunohematología, pues se puede

utilizar estas características distintivas para identificar situaciones donde se

presentan casos de mezclas de anticuerpos, mezclas de sangre e incluso

haciendo uso de un escore o puntuación determinar si los glóbulos rojos en

estudio son homocigotas o heterocigotos para un determinado sistema de grupo

sanguíneo.

Materiales y Muestras:

1- Reactivo anti-A.

2- Glóbulos A al 3-5%

3- Tubos de ensayo

4- Pipetas volumétricas de 1 ml, 5ml y 10 ml

5- Pipetas automáticas

6- Centrífuga serológica (3500 rpm)

7- Solución salina 0.9%

8- Recipientes de descarte de material

9- Un marcador permanente

10- Guantes

11- Gabacha

Método:

Realizar a un volumen final de 100 ul diluciones dobles del antisuero (reactivo

de anti-A) con solución salina hasta una dilución final de 1:512 de la siguiente

manera.





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1- Rotular los tubos correspondientes.

2- Colocar 100 ul. de solución salina del tubo rotulado 1:2 hasta el tubo

1:512.

3- Dispensar 100 ul. del reactivo anti A al tubo rotulado 1:1 y al tubo

rotulado 1:2.

4- Mezclar el tubo 1:2

5- Transferir 100 ul del tubo 1:2 al siguiente tubo 1:4.

6- Mezclar, continuar el procedimiento de forma repetitiva hasta llegar al

tubo 1: 512.

7- Descartar los últimos 100 ul.

8- Añadir una gota de las células “A” a cada uno de los tubos.

9- Mezclar y centrifugar a 3500 rpm por 15 segundos.

10- Desprender el botón con suavidad frente a la luz para observar el

grumo.

11- Anotar las características observadas en cada reacción de

aglutinación y asignar el puntaje que correspondiente en base a la

información de la tabla 1.

Tabla 1: Característica del grumo, intensidad de reacción y puntaje

obtenido.

Observación Macroscópica

Designación en cruces Escore o Puntuación

Un solo grumo de

aglutinación

4+ 12

Un grumo grande con

varios medianos.

3+ 10

Muchos grumos

medianos

2+ 8

Grumos pequeños con

fondo turbio

1+ 5

Fondo turbio con grumos

muy pequeños

Positivo débil ó +/- 2

Hemólisis H 12





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Resultados:

De las reacciones que obtuvo lea, interprete, describa y dibuje el grado de

aglutinación de las reacciones según corresponda:

Escore Observación Una

reacción de

4+

Una

reacción de

3+

Una

reacción de

2+

Una

reacción de

1+

Una

reacción

negativa

Una

reacción de

campo

mixto

Una

reacción de

hemólisis





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Procedimiento 5

Determinación en tubo del grupo sanguíneo ABO en adultos.

Principio:

El sistema de grupo sanguíneo ABO fue el primer sistema descubierto por el Dr.

Karl Landsteiner en 1900 y que le valió el premio Nobel en Fisiología y

Medicina del año 1930. (1)

Este sistema involucra tres antígenos: A, B y H. El antígeno H se produce por la

acción de una fucosiltransferasa capaz de añadir una fucosa a la sustancia

precursora.

La sustancia H puede ser convertida en el antígeno de grupo sanguíneo A por

acción de la transferasa A que añade una N-acetil galactosamina a la cadena

precursora o una galactosa en el caso de la transferasa B; el fenotipo O es el

resultado de una transferasa inactiva, la cual es incapaz de añadir carbohidratos

al antígeno H.

Los seres humanos mayores de 3 a 6 meses de edad desarrollan a través de una

respuesta T independiente anticuerpos antitéticos naturales del tipo IgM capaces

de activar al complemento contra los antígenos ABO que no se posean.

Se desarrollan a partir de la estimulación de sustancias tipo azúcares presentes

en los alimentos y bacterias del medio.

Este sistema es de gran importancia en el campo de la medicina transfusional y

en la investigación clínica. Ha sido de gran ayuda en el ámbito antropológico

donde lo han utilizado como marcador serológico en genética de poblaciones,

desarrollo embrionario, diferenciación celular y en las neoplasias.(2,3)

El siguiente procedimiento es un método aceptable, sin embargo, recuerde que

existen diferentes casas comerciales y que cada una utiliza distintos

componentes para fabricar reactivos así como los tiempos de incubación y de

reacción, por lo que nunca se debe de pasar por alto leer la especificación

técnica que recomienda la casa comercial para el uso de reactivos.





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Tubos de ensayo 12x75 mm Pipetas Pasteur Solución salina

Centrífuga serológica

Recipientes de descarte de material

Guantes

Gabacha

Marcador permanente (pilot)

Para realizar las determinaciones, generalmente se utilizan muestras de sangre

total anticoagulada con EDTA (tubo tapón lila), sin embargo, también se

pueden utilizar sangre sin anticoagunlante. (tubo tapón rojo).

Los glóbulos rojos pueden ser suspendidos en el suero autólogo, plasma o

solución salina, pueden ser lavados y resuspendidos en solución salina antes de

la prueba.

Reactivos

1- Anti-A

2- Anti-B

3- Células A1 y B. Estas células pueden ser obtenidas comercialmente o

preparadas diariamente en el laboratorio en una suspensión entre el 3-5%

Método:

Grupo eritrocitario, (Prueba directa):

1- Rotular 2 tubos como A y B.

2- Homogenizar la muestra de sangre.

3- Realizar una suspensión de trabajo entre el 3-5%.

4- Agregar una gota de la suspensión de trabajo a los tubos rotulados como

A y B.

5- Añadir al tubo rotulado como A dos gotas del anti A.

6- Añadir al tubo rotulado como B dos gotas del anti B.

7- Mezclar y centrifugar por 10 segundos a 3000 rpm.

8- Resuspender suavemente el botón.

9- Leer, anotar e interpretar las reacciones.





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Prueba en suero/plasma (grupo inverso)

1- Centrifugar la muestra a analizar por 5 minutos.

2- Rotular dos tubos como células A y células B.

3- Añadir al tubo rotulado como células A una gota de células A al 3%.

4- Añadir al tubo rotulado como células B una gota de células B al 3%.

5- Añadir a cada tubo dos gotas de suero /plasma de la muestra centrifugada.

6- Mezclar y centrifugar 10 segundos a 3000 rpm.


8- Comparar los resultados obtenidos con el grupo eritrocítico.

Práctica: Determinar el grupo ABO eritrocítico y sérico de al menos 10 muestras

sanguíneas y que en ellas vayan todas las posibles combinaciones de grupos

ABO. Resultados, discusión y conclusiones:

Muestra Anti-A Anti-B Células - A Células- B Interpretación 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10





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Procedimiento 6

Determinación en tubo del grupo sanguíneo ABO en recién nacidos

Principio

La determinación del grupo sanguíneo ABO en el recién nacido es de suma

importancia en la detección y diagnóstico de la enfermedad hemolítica del

recién nacido, así como en la terapia transfusional.

En este tipo de paciente, debido a la inmadurez del sistema inmune al

nacimiento no se tiene la capacidad de producir anticuerpos hasta los primeros

tres a seis meses de vida, razón por la cual la prueba sérica o inversa no puede

ser aplicada.

También las reacciones de aglutinación con el grupo eritrocítico tienden a dar

más débil que en los pacientes adultos debido a que los determinantes

antigénicos ABO en los glóbulos rojos se encuentran en poca cantidad,

pobremente ramificados y expresados en comparación con los antígenos de

glóbulos rojos de personas adultas.

Es por lo anterior que en la determinación de grupo sanguíneo ABO del Recién

Nacido se añade a la batería de reacción un tubo adicional para el reactivo anti-

AB que ayude a detectar y confirmar la reacción.

Una de las ventajas de utilizar este reactivo adicional es que va dirigido contra

otros determinantes antigénicos que los reactivos anti-A o anti-B individuales,

por lo que al utilizar los tres reactivos en conjunto aumenta las posibilidad de

detección antigénica en contraposición que si se utilizara sólo un medio de

reacción, disminuyendo así las reacciones falsas negativas (1,2)

Materiales y muestras

Tubos de 12 x75 mm

Pipetas Pasteur

Solución salina


Recipientes de descarte de material

Guantes





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Gabacha

Marcador permanente (pilot)

Muestras de Sangre de cordón umbilical

Reactivos

1- Anti-A

2- Anti-B

3- Anti-AB

Método:

Por lo general se utilizan muestras de sangre de cordón umbilical (tubo tapón

rojo).

A una alícuota de la muestra realizar tres lavados con solución salina

fisiológica.

Del paquete globular lavado hacer una suspensión de trabajo entre el 3-5%.

Lo anterior debido a que este tipo de muestra posee muchos elementos

adiciones interferentes como son la mezcla de sangre materna y la gelatina de

Wharton que interfieren con las reacciones de aglutinación.

1- Rotular 3 tubos de prueba como A, B y AB.

2- Transferir una gota de la suspensión de trabajo a los tubos rotulados como

A, B y AB.

3- Añadir al tubo rotulado como A dos gotas del anti A.

4- Añadir al tubo rotulado como B dos gotas del anti B.

5- Añadir al tubo rotulado como AB dos gotas del anti AB.



Práctica:

Realizar la determinación de al menos 5 muestras de recién nacido, tratar que no

sean del mismo grupo ABO.





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Muestra Anti-A Anti-B Anti-AB Interpretación 1

2

3

4

5

Comentarios y anotaciones adicionales:

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________





Página 25

Procedimiento 7

Determinación en tubo de subgrupos sanguíneos ABO.

Principio

El sistema de grupo sanguíneo ABO presenta dentro de sus características

algunos fenotipos poco frecuentes clasificados como subgrupos, los cuales se

hacen evidentes a nivel de laboratorio como reacciones de aglutinación más

débil de lo esperado.

Razones que justifican la presencia de estos subgrupos son:

- Mutaciones en los genes A y B que provocan la expresión aberrante de los

genes, codificando la producción de glicosiltransferasas con menor actividad

enzimática para la conversión del antígeno H.

- Expresión débil de un alelo alterno que se ubica en el locus ABO.

- Efecto de genes modificadores o inhibidores que regulen la expresión de los

genes ABO.

La mayor frecuencia de subgrupos ABO es para el antígeno A. Los eritrocitos

de los diferentes subgrupos de A varían ampliamente en la densidad antigénica.

Se ha calculado que los eritrocitos que son A1 pueden expresar entre 1-1.5

millones de sitios antigénicos en contraposición con eritrocitos Am o Ael donde

se ha podido determinar apenas expresan unos 2000 sitios antigénicos.

Los subgrupos de A se clasifican en:

A1, A2, A3, Ax, Aend, Am, Ay, Ael.

Los subgrupos de B se clasifican en:

B3, Bx, Bm, Bel.

Los subgrupos de ABO pueden ser detectados a través de patrones de reacción

serológica incongruentes entre los resultados de la prueba directa con la prueba

inversa.

La observación minuciosa de los siguientes aspectos es fundamental para

determinar las características de los diferentes subgrupos:





Página 26

- Grado de aglutinación con anti-A y anti-A1.

- Grado de aglutinación con anti-AB.

- Grado de aglutinación con anti-H.

- Presencia de anticuerpos anti-A1 en el suero.

- Presencia de sustancias A, B y H en secreciones de saliva.

- Estudios de Absorción/Elución para antígenos ABH en eritrocitos.

Método:

Técnica en tubo para la detección del antígeno A1 utilizando la lectina Dolichos biflorus.

A cada tubo adecuadamente rotulado añadir 1 gota suspensión entre el 3-5% de

glóbulos rojos A1, A2, A1B, A2B, B y O.

A los tubos anteriores añadir 1 gota de la lectina anti-A1.

Mezclar y centrifugar por 15 segundos a 3500 rpm.

Leer, anotar e interpretar los resultados obtenidos.

Interpretación:

- Positivo: presencia de reacción de aglutinación de 1+ a 4+.

- Negativo: Ausencia de reacción de aglutinación.

Técnica en tubo para la detección del antígeno H utilizando la lectina Ulex europeaus:

Añadir 1 gota suspensión de glóbulos rojos A1, A2, A1B, A2B, B y O a cada

tubo adecuadamente rotulado.

Añadir 1 gota de la lectina anti-H a cada tubo.

Mezclar y centrifugar por 15 segundos a 3500 rpm.

Leer por aglutinación y anotar los resultados.

Interpretación:

- Positivo: presencia de reacción de aglutinación de 1+ a 4+.

- Negativo: Ausencia de reacción de aglutinación.





Página 27

Práctica

1) Determinar el grupo ABO de al menos 10 muestras.

Muestra Anti-A Anti-B Células- A Células-B Interpretación

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10





Página 28

2) De las muestras clasificadas escoger las de grupo A y O para determinar

la cantidad de sustancia A o H con las lectinas anti-A1 y anti-H.

3) Hacer las lecturas e interpretar los comentarios que considere necesarios.

4) Anotar en orden de fuerza de aglutinación las reacciones utilizando

Lectina anti - A1 y Lectina anti H para células A1B, A1, B, O, A2 y A2B.

5) Realizar determinaciones en recién nacido.

6) A las muestras de glóbulos rojos rotulados como 1, 2, 3 y 4 realizar sólo

el grupo eritrocítico y anotar el resultado.

Muestra Anti-A Anti-B Anti-AB Interpretación

Grado de Aglutinación

Fondo Grado de Aglutinación

Fondo Grado de Aglutinación

Fondo

1

2

3

4

Anotaciones:

________________________________________________________________________________________________________________________________





Página 29

Procedimiento 8

Determinación en tubo del antígeno Rh/ D.

Principio

La definición de Rh positivo o Rh negativo se refiere a la presencia o ausencia

del antígeno Rh (D) en los eritrocitos humanos.

El primer anticuerpo contra el antígeno D fue descrito en 1939 por Levine y

Stetson, encontrado en el suero de una mujer cuyo hijo había padecido de una

enfermedad hemolítica del recién nacido y además había presentado una

reacción hemolítica después de haber sido transfundida con sangre de su

esposo.

En 1940, Landsteiner y Wiener describieron el anticuerpo obtenido por

inmunización de cerdos y conejos con glóbulos rojos del mono Macacus rhesus.

Estos aglutinaron aproximadamente el 85% de las pruebas con eritrocitos

humanos y fueron denominados con el correspondiente factor Rh positivo y los

que no reaccionaron como Rh negativo. El término Rh se nombra en honor a la

especie en que se descubrió el antígeno

Los antígenos del sistema Rh se encuentran en los seres humanos y en algunas

especies de primates. El antígeno D está completamente desarrollado al nacer.

Los reactivos anti-D pueden tener tres tipos de presentación, los de alto

contenido proteico, los salinos a base de IgM y los químicamente modificados,

que son IgG´s con mayor capacidad aglutinante que los IgG nativos.

Los de alto contenido proteico poseen una concentración entre el 20-24% más

otros aditivos macromoleculares dando un resultado más pronto y una lectura

más fiable.

El diluyente de elevado peso molecular puede producir aglutinación

espontánea de los eritrocitos si estos se encuentran recubiertos de

inmunoglobulinas como son los casos de autoinmunidad y de la enfermedad

hemolítica del recién nacido.





Página 30

Un aspecto a tomar en consideración es que estos sueros, debido a los aditivos

que se le añaden para ayudar a la aglutinación pueden producir reacciones

falsas positivas.

Para detectar estos falsos positivos, es importante correr paralelamente con la

prueba de Rh una prueba control, utilizando un reactivo inmunológicamente

inerte preparado por la misma casa comercial del reactivo anti-Rh.

Este control posee los mismos aditivos que están en el reactivo anti-D, pero sin

los anticuerpos. Si las células que están en estudio son aglutinadas por este

control, el resultado de la prueba debe ser invalidado, siendo necesario

analizarlo por otro método.

En caso de ausencia del reactivo control se puede utilizar albúmina bovina al

22% como medio control produciendo incluso menos falsos positivos que el

anterior ya que la albúmina no contiene los potenciadores de alto peso

molecular pero sí su alto contenido proteico.

Reactivos

1- Anti-D, IgG -IgM de alta concentración proteica.

2- Reactivo para el control de Rh, manufacturado según la casa comercial o

Albúmina al 22%.

Materiales y muestras

1. Tubos de pruebas limpios y secos.

2. Pipetas Pasteur.

3. Solución salina 0.9%.

4. Centrífuga serológica (3000 rpm ).

5. Guantes.

6. Gabacha.

7. Recipientes de descarte de material.

8. Tubos de ensayo.

9. Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA.





Página 31

Método:

1- Marcar dos tubos uno como D ó Rh y otro como control ó Ctrl.

2- Agregar al tubo rotulado como D, 1 gota del reactivo anti-D.

3- Agregar al tubo rotulado como control, 1 gota del reactivo control y en

caso de no disponer de albúmina.

4- Añadir 1 gota de la suspensión entre el 3-5% de los glóbulos del paciente

en estudio.

5- Mezclar y centrifugar por 15 segundos a 3500 rpm en una centrífuga

serológica.

6- Resuspender cuidadosamente, leer, anotar e interpretar los resultados.

Interpretación:

Tabla 2: Interpretación de los resultados de Rh

Anti-D Control Interpretación Rh (D)

0 0 Rh negativo

1+ a 4+ 0 Rh positivo

Si el control está positivo el resultado se considera inválido. Si esto ocurre, lave

los eritrocitos con solución salina a 37ºC previo a preparar la suspensión de

células y repita la prueba.

Si prevalece el resultado positivo en el control, el resultado del Rh (D) se

considera inválido y se requiere investigación adicional con la utilización de

reactivos con anti-D salino o químicamente modificado.





Página 32

Procedimiento 9

Detección del antígeno D débil

Principio

Algunos glóbulos rojos expresan más débilmente el antígeno D en la membrana,

esta condición puede provocar que en la primera fase del análisis cuando se

trabaja con reactivos de alto contenido proteico se presenten resultados

positivos y con otros una reacción negativa.

Estas discrepancias se resuelven cuando las pruebas con resultados negativos se

llevan a la fase de antiglobulina, detectando el antígeno con expresión débil que

en la primera fase no se logró detectar.

Debido a la trascendencia desde el punto de vista transfusional o en la

prevención de la enfermedad hemolítica del recién nacido, todo estudio

serológico con anti-D proveniente de un donante de sangre o un recién nacido

con una lectura negativa en la primera fase se debe continuar hasta la fase de

antiglobulina para confirmar el resultado.

Método:

1- Si la prueba de Rh da resultado negativo incubar el tubo estudio y el tubo

control por 30 minutos a 37ºC.

2- Lavar 3 veces las muestras con solución salina 0.9%

3- Secar bien la última gota.

4- Añadir dos gotas del reactivo de antiglobulina humana.


6- Re suspender cuidadosamente, leer, anotar e interpretar los resultados

7- Confirmar reactividad de reactivo agregando una gota de “Células

Control de Antiglobulina Humana”

8- Mezclar y volver a centrifugar los tubos por 15 segundos a 3500 rpm.

9- Re suspender cuidadosamente, leer, anotar e interpretar los resultados.





Página 33

Interpretación de resultados:

La aglutinación en el tubo de anti-D y la ausencia de aglutinación en el tubo

control indican un resultado positivo. La sangre debe de clasificarse como Rh

positivo.

La ausencia de aglutinación en ambos tubos, el estudio y control indican un

resultado negativo y la sangre debe de clasificarse como Rh negativo.

Presencia de aglutinación en el tubo control invalida la prueba y debe de

repetirse. Si esta vuelve a dar positivo, se debe considerar un estudio para

Anemia Hemolítica Autoinmune iniciando con una prueba de antiglobulina

directa.





Página 34

Procedimiento 10

Células Control de Antiglobulina Humana.

Principio

Las Células Control de Antiglobulina Humana son glóbulos rojos sensibilizados

con inmunoglobulina tipo IgG, son utilizadas para validar metodologías en

tubo con resultados negativos en la fase de antiglobulina humana.

La presencia de aglutinación después de ser añadidas al medio de reacción

indica que los lavados fueron realizados adecuadamente y todos los restos

proteicos fueron eliminados, no neutralizaron el reactivo de antiglobulina

humana y el resultado de la prueba puede ser validado.

Cuando una prueba de antiglobulina humana da un resultado negativo quiere

decir que no hubo reacción antígeno-anticuerpo, los glóbulos rojos en prueba

no contienen el antígeno especifico para el antisuero que se está probando o el

suero en estudio no tiene anticuerpos contra ninguno de los antígenos

expresados en los eritrocitos utilizados, por tanto, en el tubo de reacción debe

de quedar reactivo anti-IgG activo y funcional presente en el medio.

Al adicionar las Células Control de Antiglobulina Humana las IgG activas

libres reaccionan con las células provocando la aglutinación.

Por otro lado, si se presenta un resultado negativo después de ser añadidas

indica que los lavados fueron realizados incorrectamente, quedaron restos de

inmunogloblinas que neutralizaron el reactivo de antiglobulina humana y la

prueba debe ser invalidada y repetida.

Materiales y Reactivos:

Células Control de Antiglobulina Humana entre el 3 – 5 % obtenidas de casa

comercial o preparadas en el laboratorio.

Tubos de pruebas

Gradillas





Página 35

Pipetas


Procedimiento:

1- Mezcle y resuspenda con suavidad las células del reactivo de Control de

Antiglobulina Humana

2- Añada 1 gota de las Células Control de Antiglobulina Humana a cada

tubo con resultado negativo en la prueba de inmunoglobulina humana

incluyendo al control.

3- Mezcle y centrifugue 15 segundo a 3500 rpm

4- Resuspenda cuidadosamente, lea, anote e interprete los resultados.

Práctica:

Determine el grupo ABO y Rh de al menos 10 muestras sanguíneas.

Conclusión:

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________





Página 36


Muestra Anti-A Anti-B Cel.- A Cel.- B Anti-D Control Células Control de AGH

Interpretación

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Nota: No olvide reportar los resultados en cruces en base a la intensidad de aglutinación.





Página 37

Procedimiento 11

Conservación de Glóbulos Rojos.

Preservación de la sangre:

Los glóbulos rojos pueden ser preservados con diversos propósitos como por

ejemplo:

- Preservación de hemocomponentes para ser utilizados con fines

terapéuticos.

- Investigación.

- Fuente de reactivos como las células rastreadoras, células control de

Antiglobulina Humana, células A1, B.

- Control de calidad de los antisueros utilizados de manera rutinaria en

los Bancos de Sangre y servicios de Inmunohematología y demás.

Existen diversas soluciones que ayudan a anticoagular y conservar los glóbulos

rojos como son el:

- ACD (adenina, citrato, dextrosa),

- CPD (citrato, fosfato, dextrosa),

- CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina).

Otros pueden ser soluciones aditivas que lo que permiten es sólo su

conservación brindando fuente de energía y sustancias precursoras para su

biosíntesis normal, entre los que se encuentra el Alsever, Adsol, y el Alsever

modificado.

La parte más importante de las soluciones para la conservación de células rojas

en estado líquido, es que deben proporcionar el mantenimiento intacto del

fenotipo eritrocitario y reducir los riesgos de contaminación microbiana

durante largo tiempo, lo cual posibilita su uso para pruebas diagnósticas in vitro

y su comercialización.

Soluciones sólo anticoagulantes como el EDTA, alteran a cabo de un tiempo la

morfología normal del glóbulo rojo, por lo que no pueden ser utilizadas para

este propósito.





Página 38

Método

Obtener una muestra de su propia sangre siguiendo instrucciones del

procedimiento 1 de este manual.

Recolectar 10 ml y dividirla entre un tubo con EDTA (tapón lila) y un tubo con

solución de Alsever.

Rotular con sus datos personales el tubo con Alsever y colocarlo en la gradilla

para ser guardado en refrigeración a 4ºC.

Es muy importante guardar la muestra pues con ella se trabajará en prácticas

posteriores.





Página 39

Procedimiento 12

Determinación del fenotipo Rh

Principio

Aparte del antígeno D se han descrito otros antígenos pertenecientes al sistema

Rh, específicamente más de 50 diferentes, sin embargo, de estos los principales

por su capacidad de inducir una respuesta inmune y por ende implicados en

reacciones transfusionales o en la enfermedad hemolítica del recién nacido son

los antígenos C, E, c y e.

La asociación de estos factores antigénicos indica que la actividad inmunológica

del sistema Rh proviene de un material de superficie con diversos determinantes

antigénicos.

Algunas asociaciones de antígenos incluyen al D y otras no. La composición de

estas combinaciones antigénicas está determinada genéticamente.

Dos genes homólogos y estrechamente ligados son los responsables de la

producción de los cinco antígenos principales del sistema Rh. Uno llamado

RHD determinará la producción o la no producción del antígeno D, mientras

que el otro gen RHCE será el encargado de la producción de los antígenos C, c,

E y e.

Se han reconocido numerosas combinaciones y variantes de estos genes, pero

los cinco antígenos indicados y sus anticuerpos los más frecuentes del sistema.

De igual manera que para el antígeno D, se encuentran disponibles en el

mercado reactivos pobres en proteínas (químicamente modificados o

monoclonales) o ricos en proteínas con anticuerpos específicos para determinar

la presencia de los antígenos C, E, c y e.

Pueden producir reactividad variable con diferentes haplotipos en los eritrocitos

(fenómeno de dosis), por lo que esta debe ser considerada dependiendo de los

antígenos expresados en membrana a la hora de hacer un fenotipo de Rh, por

ejemplo CDE o CE son los responsables de la mayoría de la expresión de C en

los eritrocitos humanos.





Página 40

Se ha reportado antígenos variables E y c, pero son considerablemente menos

comunes.

Cualesquiera que sean los reactivos utilizados, las indicaciones del fabricante

deben ser seguidas cuidadosamente. Los concentrados de sueros humanos

usados para preparar reactivos, de los demás antígenos Rh; tienen riesgo

significativo de contener especificidades contaminantes reactivas con la

antiglobulina, anticuerpos irregulares e inducir poliaglutinación.

Para evitar estas y otras situaciones, es recomendable correr en paralelo con la

prueba controles positivo y negativo para los antígenos en estudio.

Los eritrocitos seleccionados para el control positivo deben tener

preferiblemente una sola dosis del antígeno implicado. La frecuencia de estos

antígenos en población caucásica es de:

C: 70%, c: 80%, E: 30% y e: 98% respectivamente.


Anti-C, Anti- c, Anti-E, Anti-e, Anti-D, anti-A, anti-B, anti-AB

Células A1, células B, células control de antiglobulina humana

Reactivo de antiglobulina humana

Albúmina 22%

Solución salina 0.9%

Solución de Alsever

Tubos de ensayo para análisis

Pizetas

Pipetas pasteur


Guantes

Gabacha

Jeringas

Agujas

Tubos con EDTA

Tubos con solución de Alsever

Algodón

Alcohol al 70%





Página 41

Recipientes de descarte de muestras y material

Muestras:

Se puede utilizar muestras de sangre con EDTA o sin anticoagular.

Método:

Preparar una suspensión de células al 3 – 5% en solución salina fisiológica.

Rotular tubos como D, C, E, c, e y control.

Añadir una gota del reactivo a cada tubo rotulado.

Añadir una gota de la suspensión a analizar a todos los tubos.

Mezclar y centrifugar 15 segundos a 3500 rpm.

Resuspender, leer, anotar las reacciones

Incubar los tubos que dieron reacción negativa a 37ºC por 15 minutos.


Resuspender, leer, anotar e interpretar las reacciones.


Una aglutinación de 1+ a 4+ indica que hubo reacción antígeno - anticuerpo,

por lo que la prueba debe ser considerada positiva.

La no presencia de aglutinación en el medio indica la ausencia del antígeno y

por lo tanto la prueba es negativa.

Muchos de estos antisueros son del tipo IgM, o IgG químicamente modificados

por lo que no se debe de llevar hasta la fase de antiglobulina humana, sólo con

la incubación a 37ºC y centrifugación es suficiente.





Página 42

Práctica:

Con el tubo de EDTA de su sangre realizar una suspensión entre el 3- 5% y

determinar el grupo sanguíneo ABO/Rh y el fenotipo C, E, c y e.

Seguir realizando determinaciones de grupo en adulto y recién nacido.

Resultados:

Anti-A Anti-B Células A Células B Anti-D Control Mi grupo sanguíneo

es:

Anti-C Anti-c Anti-E Anti-e Mi fenotipo Rh es:





Página 43


Interpretación

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10





Página 44

Procedimiento 13

Determinación de la sustancia H en saliva

Principio

El gen Se es el responsable de la expresión del antígeno H en las secreciones.

En las personas secretoras se puede encontrar sustancia H en saliva, orina,

lágrimas, líquido amniótico, leche y fluidos digestivos. La cantidad encontrada

en estas secreciones puede variar dependiendo del grupo ABO.

Si las personas son del grupo A, B o AB y heredaron el gen Secretor, se pueden

detectar sustancias A, B o ambas en las secreciones.

La mayoría de la sustancia H encontrada en secreciones pertenecen a individuos

del grupo O pasando por las secreciones de los individuos A o B, hasta llegar a

individuos del grupo AB donde puede estar ausente debido a que prácticamente

toda ha sido convertida.

El gen Se es de carácter dominante sobre se. El 80% de la población es

secretora debido a que heredó el gen Se.

El gen “se” no se ha asociado con la codificación de algún producto

demostrable, por lo que se dice que es un gen amorfo y representa al 20% de la

población.

Reactivos y materiales

Sets de reactivos anti A, anti B, anti AB, anti D, anti H, albúmina 22% y

reactivo de antiglobulina humana

Solución salina fisiológica

Células al 3% de los grupos A1, B y O

Muestras con sangre para analizar.

Beacker de 10 ó 25 ml

Tubos tipo Pirex

Pipeteadores

Pipetas de 10 ml





Página 45

Trípodes

Mecheros de bunsen

Chispas para mechero

Cedazos

Centrífugas serológica

Centrífugas de tubos

Pipetas Pasteur

Goteros para pipetas pasteur

Tubos de 12 x 75 mm

Micropipetas de 100-200 ml (en este caso poner puntas de micropipetas)

Pipetas de 1 ml

Papel parafilm

Material de descarte

Gradillas metálicas

Gradillas madera

Puestos de descarte por mesa y material necesario para la limpieza de las

mesas.

Preparación de la muestra:

Colectar aproximadamente 5 ml de saliva fresca en un beaker o frasco de vidrio

de boca ancha.

Transferir la saliva a un tubo 12x75 mm y centrifugue 5 minutos a 3000 rpm.

Transferir el sobrenadante claro a un tubo de vidrio tipo pirex.

Colocar el tubo en un baño de agua hirviendo por 10 minutos

Transferir nuevamente la saliva a un tubo 12 x 75 mm

Centrifugar la muestra por 5 minutos a 3500 rpm

Utilizar el sobrenadante claro y opalescente inmediatamente para su estudio. Si

no lo va a procesar al momento se puede congelar a -20ºC para su posterior

análisis.

Preparar una suspensión al 3-5% de glóbulos O, A1 y B.





Página 46

Preparación de reactivos:

El siguiente procedimiento se va a realizar por mesa de trabajo y de este van a

realizar sus respectivas pruebas.

Realizar diluciones dobles del reactivo anti-A, anti-B y anti-H hasta obtener una

aglutinación de 2+.

Método:

Determinación de la sustancia A, B o H en saliva:

Pipetear 100 ul. del sobrenadante de la saliva en dos tubos de ensayo limpios.

Rotular uno como H y otro como control negativo.

Añadir 50 ul de solución salina al tubo rotulado como control negativo.

Añadir 50 ul de la lectina anti-H diluida al tubo rotulado como H.

A otro tubo rotulado como control positivo añadir 100 ul de la lectina anti-H

diluida con 50 ul de solución salina.

Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.

Añadir 50 ul de la suspensión de glóbulos rojos O a los tres tubos de reacción.


Resuspender, leer e interpretar lo resultados

Realizar el mismo procedimiento cambiando el reactivo diluido anti A o anti B

para determinar la presencia de sustancias A, B o ambas en saliva.


Si la sustancia H está presente en la saliva, la lectina anti-H añadida al medio de

reacción es neutralizada y los glóbulos rojos no aglutinan, a estos individuos los

clasificamos como Secretores.





Página 47

Si en la muestra no hay sustancia H la lectina anti-H no es neutralizada y los

células pueden aglutinar con el reactivo presente en el medio. A estos

individuos los clasificamos como No Secretores.

El anterior principio lleva al concepto de inhibición de la hemaglutinación.

Para validar la prueba se debe correr un control positivo y negativo en paralelo a

la muestra a analizar.

En estos casos el control positivo debe de aglutinar indicando que el anti-H fue

diluido correctamente y queda libre para reaccionar con los glóbulos.

El control negativo indica que no hay sustancias interferentes en la saliva que

produzcan aglutinación espontánea en el medio.

Práctica:

Determinar estado secretor en saliva.

Seguir realizando determinaciones de grupos sanguíneos.

Resultados:

Reacción de inhibición de la hemaglutinación Estado secretor:

Sustancia H

Control Positivo

Control Negativo

Sustancia A

Control Positivo

Control Negativo

Sustancia B

Control Positivo

Control Negativo





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Interpretación

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10





Página 49

Procedimiento 14

Determinación fenotípica del sistema MNSs

Principio

Los antígenos M y N fueron descubiertos en 1927, cuando Landsteiner y Levine

obtuvieron los anticuerpos que los definían mediante la inmunización de

conejos con glóbulos rojos humanos.

Son dos genes estrechamente ligados uno que codifica para los antígenos MN y

el otro para los antígenos Ss.

En este sistema se agrupan 3 antígenos de alta frecuencia y al menos 30 de baja

frecuencia.

Los antígenos del sistema de grupo sanguíneo MNSs se encuentran ubicados en

proteínas integrales de membrana del glóbulo rojo de 43 KDa.

Los antígenos MN se localizan en la glicoforina A (GPA) y los Ss en la

glicoforina (GPB), también se han ubicado los antígenos del sistema Gerbich en

las glicoforinas C y D.

Las glicoforinas además de interaccionar con el citoesqueleto del glóbulo rojo

poseen alta cantidad de ácido siálico en su estructura lo que ayuda a brindar la

carga negativa a la membrana.

La diversidad antigénica está basada predominantemente en las

recombinaciones genéticas, recombinaciones homólogas o conversiones

génicas.

Los eritrocitos que carecen de los antígenos S y s son también negativos para el

antígeno del alta frecuencia U.

Los antígenos M y N así como los S y s se comportan como productos de pares

de genes alélicos, manteniendo una clara relación alélica.

Los anticuerpos contra antígenos del sistema MNSs se han involucrado como

causa de reacciones hemolíticas transfusionales, agudas o tardías, especialmente

en pacientes politransfundidos.





Página 50

Los anticuerpos anti-M y anti-N pueden mostrar efecto de dosis dando

reacciones significativas más intensas y con altos títulos en presencia de

glóbulos rojos homocigotos para los antígenos que frente a glóbulos rojos

heterocigotos.

El anti-M se detecta en el suero humano como una aglutinina en solución salina

a temperatura ambiente sin antecedentes de transfusión; condición que le

permite su denominación de anticuerpo natural.

El anti-M rara vez produce problemas clínicos, aunque cuando reacciona a 37ºC

o en fase de antiglobulina se puede considerar como significativo,

especialmente si este es del tipo IgG.

El hallazgo de un anti-N es menos frecuente que el anti-M, es una IgM y

típicamente se comporta como crioaglutinina, eventualmente puede presentarse

como una IgG con expresión clínica significativa, como ocurre en los pacientes

bajo hemodiálisis.

En estos pacientes posteriormente se logró asociar la producción del anticuerpo

anti-N con el uso de membranas de diálisis esterilizadas con formaldehido.

Dado que las enzimas destruyen los antígenos, la reactividad anti-M y el anti-N

puede ser eliminada por técnicas enzimáticas habituales.

Los antisueros comerciales anti-M o anti-N debido a que han sido seleccionados

y estandarizados para reaccionar adecuadamente con todos los glóbulos en

estudio en muy raras ocasiones presentan efecto de dosis a diferencia de los

anticuerpos producidos por los pacientes.

Frecuentemente se encuentran casos de anti-M que reaccionan sólo con

glóbulos rojos homocigotos. Por el contrario, los sueros de anti-N rara vez

producen este efecto.

Los anticuerpos anti-S, anti-s y anti-U pueden aparecer posterior a una

estimulación eritrocitaria, se detectan en la fase de antiglobulina e in vivo

muestran una significativa actividad hemolítica.





Página 51

La frecuencia de fenotipos del sistema MN en poblaciones caucásicas es de:

MM: 28%, MN: 50% y NN: 22%

Reactivos

Se dispone de reactivos comerciales para determinar los antígenos MNS y s.

Estos se obtienen a partir de inmunización de animales, de origen humano,

anticuerpos monoclonales de ratón y de lectinas.

La lectina más ampliamente utilizada como reactivo análogo del anti-N es el

extraído de las semillas de Vicia gramínea.

En la mayoría de los casos, los reactivos obtenidos de estas distintas fuentes

darán reacciones concordantes, pero pueden a veces hallarse discrepancias por

sutiles diferencias de especificidad, por lo que es imprescindible seguir

estrictamente las indicaciones de la casa comercial.


1. Tubos de pruebas limpios y secos

2. Pipetas pasteur



5. Guantes

6. Gabacha


8. Tubos de ensayo

9. Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA

Procedimiento para la detección de los antígenos MN:

1- Preparar suspensiones de glóbulos rojos al 3-5% en solución salina.

2- Identificar los tubos a analizar como M y N.

3- Añadir 50ul del antisuero correspondiente.

4- Añadir 50ul de la suspensión de glóbulo a analizar.


6- Resuspender las células e interpretar las reacciones





Página 52

Tabla 3: Interpretación de resultados sistema MN

Anti-M Anti-N Interpretación

1+ a 4+ 0 MM

0 1+ a 4+ NN

1+ a 4+ 1+ a 4+ MN

Siempre incluya como control muestras de glóbulos rojos homocigotas para los

antígenos a investigar tanto positivos como negativos.

Si el control no concuerda con el resultado a obtener se considera inválido. Si

esto ocurre, lave los eritrocitos con solución salina a 37ºC previo a preparar la

suspensión de células y repita la prueba.

Si prevalece un resultado no conforme en el control, el resultado se considera

inválido y se requiere investigación adicional con la utilización de reactivos o

técnicas diferentes.

Procedimiento para la detección de los antígenos Ss:

1- Preparar suspensiones de glóbulos rojos al 3-5% en solución salina.

2- Identificar los tubos a analizar como S y s.

3- Añadir 50ul del antisuero correspondiente.

4- Añadir 50ul de la suspensión de glóbulo a analizar.

5- Mezclar e incubar por 30 minutos a 37ºC

6- Lavar tres veces con solución salina.

7- Añadir 100 ul gotas de reactivo de antiglobulina humana.


9- Resuspender las células e interpretar las reacciones.

10- Si el resultado es negativo, realizar la corroboración con células

control.





Página 53

Tabla 4: Interpretación de los resultados sistema Ss

Anti-S Anti-s Interpretación

1+ a 4+ 0 SS

0 1+ a 4+ ss

1+ a 4+ 1+ a 4+ Ss

Práctica:

Con técnica aséptica transfiera una alícuota de la sangre preservada en

ALSEVER a un tubo adecuadamente rotulado.

Guardar el resto de la muestra con solución de Alsever para próximas prácticas.

De la muestra transferida, realizar tres lavados con solución salina fisiológica y

preparar una suspensión al 3-5%.

Determinar el fenotipo para los antígenos M N S y s.

Realizar determinaciones fenotípicas de grupo ABO y Rh de las muestras

provistas en el laboratorio.


Anti-M Anti-N Anti-S Anti-s Fenotipo MNSs:





Página 54


Interpretación

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10





Página 55

Procedimiento 15

Determinación fenotípica de los sistemas de grupo sanguíneo Kell, Duffy y Kidd.

Principio:

Los antígenos del sistema de grupo sanguíneo Kell se ubican en una proteína de

un solo paso transmembrana de 93 KD; en ella se han podido identificar al

menos 25 antígenos distintos.

Este sistema se caracteriza por estar constituido por antígenos de alta y de baja

incidencia dentro de la población.

Se ha observado que 13 de estos antígenos son de alta frecuencia y al menos 5

de baja incidencia, algunos se encuentran organizados en cinco grupos alélicos,

mientras que otros, principalmente los antígenos de alta frecuencia, pueden ser

expresados independientemente.

El antígeno Kell (K) sólo se expresa en la membrana del glóbulo rojo. El

promedio de sitios antigénicos varía de 2300 a 6100 en eritrocitos homocigotos

para K y de 200 a 3500 en células heterocigotas Kk.

El grupo sanguíneo Kell, es altamente inmunogénico y está completamente

desarrollado al nacer.

Al igual que con otros sistemas de grupo sanguíneo, el anti-K puede ser

adquirido al exponerse a eritrocitos con presencia del antígeno ya sea por una

transfusión de sangre o por un embarazo donde el niña/o hereda el antígeno

paterno.

Con muy poca frecuencia se han descrito casos de anti-K y anti-k (Cellano) de

presentación natural. Estos son del tipo IgM, reaccionan a temperatura ambiente

y se presentan secundarios a infecciones agudas bacterianas, principalmente

cuando el agente causal es una E. coli O125.b15.

Desde el punto de vista inmune, los anti-K y anti-k son muy importantes,

usualmente son anticuerpos del tipo IgG1 con fuerte actividad hemolítica in

vivo.





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El sistema Duffy está constituido por una glicoproteína de 35-43 kDa que se

expresa en la membrana del glóbulo rojo.

El número de sitios antigénicos en células Fy (a+b-) se ha estimado en 6900 y

de 17000.

Los antígenos del sistema Duffy están relacionados cuando menos con siete

receptores diferentes de membrana, entre los que se incluyen al receptor de

quimosinas y al receptor de los parásitos de la malaria.

Un hecho importante y que se ha asociado mucho con procesos de evolución y

adaptación de las especies, es que los glóbulos rojos con fenotipo Fy (a-b-),

muy comunes en individuos de raza negra, son resistentes a la invasión de los

parásitos de las especies de Plasmodium vivax y Plasmodium knowlesi.

Los anticuerpos Duffy pueden causar reacción hemolítica severa, asimismo, su

presencia en mujeres embarazadas debe de ser evaluada cuidadosamente

monitoreando cambios constantes en el título de anti- Fy maternos.

Se ha establecido que títulos de anticuerpos maternos de 1:64 o mayores deben

de ser considerados de alto riesgo fetal y neonatal.

En el sistema Kidd (Jk) se ha observado que sujetos Jk(a-b-) tienen resistencia

a la lisis por la urea 2M, aunque conservan normal su función de permeabilidad

al agua.

Una característica del anticuerpo producido contra antígenos del sistema Kidd

es que muestra destrucción mediada por complemento, dichos anticuerpos se

han observado en pacientes que son Jk(a-b-) en donde el 90% de las células

Jk(a+b+) transfundidas son eliminadas en 30 minutos, mientras que se prolonga

al triple cuando son células Jk(a+b-).

Este anticuerpo también se encuentra asociado con la producción de cuadros de

enfermedad hemolítica severa.

Materiales

1. Tubos de pruebas limpios y secos

2. Pipetas pasteur






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5. Gradillas

6. Guantes

7. Gabacha


9. Tubos de ensayo

Muestras:

Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA.

Muestras preservadas con solución de Alsever.

Reactivos:

Anti-K, anti-k, anti-Fya, anti-Fy

b, anti-Jk

a, anti-Jk

b, albúmina al 22%,

antiglobulina humana, Células Control de Antiglobulina Humana.

Método:

1. Preparar suspensiones de glóbulos rojos al 3-5% en solución salina.

2. Identificar los tubos a analizar como K, k, Fya, Fy

b, JK

a, Jk

b, control.

3. Añadir 50ul del antisuero correspondiente a cada tubo rotulado

4. Al tubo control añadir 50 ul de de albúmina al 22%

5. Añadir a todos los tubos 50ul de la suspensión de glóbulo a analizar.

6. Mezclar e incubar por 30 minutos a 37ºC

7. Lavar tres veces con solución salina.

8. Añadir dos gotas de reactivo de antiglobulina humana

9. Mezclar y centrifugar a 3500 rpm por 15 segundos.

10. Resuspender las células, leer e interpretar las reacciones.

11. Si el resultado es negativo, realizar la corroboración con células

control.





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Tabla 5: Interpretación de los resultados sistemas Kell, Duffy y Kidd.

Anti-K Anti-k Interpre. Anti-Fya Anti-Fyb Interpre. Anti-Jka Anti-Jkb Interpre. Control

1+ a 4+ 0 KK 1+ a 4+ 0 Fy(a+b-) 1+ a 4+ 0 Jk(a+b-) 0

0 1+ a 4+ kk 0 1+ a 4+ Fy(a-b+) 0 1+ a 4+ Jk(a-b+) 0

1+ a 4+ 1+ a 4+ Kk 1+ a 4+ 1+ a 4+ Fy(a+b+) 1+ a 4+ 1+ a 4+ Jk(a+b+) 0

Siempre incluya como control muestras de glóbulos rojos conocidos, tanto

positivos como negativos, para los antígenos a investigar.

Si el control no concuerda con el resultado a obtener se considera inválido. Si

esto ocurre, lave los eritrocitos con solución salina a 37ºC previo a preparar la

suspensión de células y repita la prueba.

Si prevalece un resultado no conforme con el control, el resultado se considera

inválido y se requiere investigación adicional con la utilización de reactivos o

técnicas diferentes.

Práctica:

Tomar una alícuota de la sangre preservada en ALSEVER y transferir una

muestra a un tubo adecuadamente rotulado.

Realizar tres lavados con solución salina fisiológica y preparar una suspensión

al 3-5%.

Determinar el fenotipo para los antígenos K, k, Fya, Fy

b, Jk

a y Jk

b.

Realizar fenotipo ABO y Rh de las muestras dadas en el laboratorio.





Página 59

Resultados, discusión y conclusión:

Anti-K Anti-k Interpretación

Anti-Fya Anti-Fyb Interpretación

Anti-Jka Anti-Jkb Interpretación





Página 60

Procedimiento 16

Células rastreadoras o células pantalla

Principio

Parte de la rutina de un Banco de Sangre es la búsqueda constante de

anticuerpos irregulares presentes en el suero de donadores o pacientes que

puedan causar alguna reacción transfusional cuando se administra un

hemocomponente.

Se ha vuelto requisito obligatorio contar con células rastreadoras o pantalla que

permitan establecer la presencia de alguno de estos anticuerpos.

Estas células pueden ser obtenidas tanto comercialmente como realizadas en

nuestro lugar de trabajo, deben ser del grupo O para evitar que los anticuerpos

naturales interfieran en la detección de otros anticuerpos.

Se obtienen a partir de donadores que son fenotipeados y que poseen los

antígenos más comunes dentro de la población y que son reconocidos como de

importancia clínica, es decir, capaces de causar una reacción transfusional o una

enfermedad hemolítica del recién nacido.

Las células seleccionadas deben contar con al menos en una de ellas uno de los

siguientes antígenos: D, C, E, c, e, M, N, S, s, P1, Lea, Le

b, K, k, Fy

a, Fy

b, Jk

a y

Jkb.

Como el objetivo es detectar anticuerpos, la célula rastreadora ideal debe tener

la mayor cantidad de expresión homocigota posible ya que estas células poseen

doble dosis de antígeno en contraposición con las células de individuos

heterocigotas.

Esto es importante pues hay mayor probabilidad de detectar anticuerpos que

reaccionan débilmente o que presentan bajo título con células que expresan más

cantidad de antígeno.

Las células rastreadoras provenientes de tres donadores deberán ser

homocigotas para antígenos del sistema Rh de la siguiente manera R1R1, R2R2

y rr.





Página 61

También en combinación deberán tener los antígenos homocigotas Kidd, Duffy

y MNSs, los cuales se ha observado que muestran efecto de dosis.

Otro punto importante que deben de cumplir las células rastreadoras es contar

con al menos una célula Kell positivo ya que el antígeno Kell es altamente

inmunogénico y de baja incidencia pudiendo llegar a producir severas

reacciones transfusionales.

Si un juego de reactivos no contiene un antígeno en particular el

correspondiente anticuerpo no podrá ser detectado cuando se realice la

investigación.

Al interpretar un rastreo de anticuerpos se debe de contar con una tabla

fenotípica en donde se indica cuáles antígenos están presentes en las células y

que deben acompañar al juego de células según el lote del reactivo.

Las células rastreadoras pueden estar disponibles en diferentes presentaciones a

modo de:

- Un único vial, constituido por no menos de dos células de donantes que han

sido mezcladas, a este se le conoce como pool, son menos sensibles y son

utilizadas en el rastreo de anticuerpos en donantes de sangre.

- Dos viales, cada una de un donador diferente, presentan baja sensibilidad.

- Tres viales, proveniente de tres donantes diferentes, poseen una buena

sensibilidad para la detección de anticuerpos y es la más utilizada en el país.

- Seis viales, proveniente de 6 donantes diferentes son las que poseen la mayor

capacidad de detección de anticuerpos.

Para las pruebas pretransfusionales son requeridas la presencia de células

rastreadoras de al menos tres viales para la detección de anticuerpos.

La detección de niveles de anticuerpos muy bajos en el suero del receptor es

importante porque la presencia de un antígeno positivo, puede resultar en una

respuesta inmune secundaria con una rápida producción de anticuerpo y

destrucción del hemocomponente transfundido.

Una vez confirmada la presencia de anticuerpo en un suero se tiene que

investigar cual es el antígeno causante de la producción de este, por lo que se

hace uso de paneles de identificación de anticuerpos que son un grupo de 8 a 16





Página 62

células con fenotipo completo y que en conjunto permiten establecer cuál es el

antígeno causante.

Método:

Preparación de células pantalla

• Preparar suspensiones de eritrocitos de donadores O al 3% en solución

salina.

• Las células escogidas de referencia son R1R1, R2R2, rr.

• Hacer fenotipo para los grupos sanguíneos Duffy, MNSs, Kk, Kidd, Lewis y

P.

• Escoger el fenotipo de células I, II, III.

• Separar una cantidad de 150 cc de sangre, con el número de donador, fecha

de extracción y de separación.

• Agregar 150 cc de solución salina a la sangre separada.

• Añadir 2 cc de gentamicina.

• Añadir 1 cc de penicilina y agitar.

• Guardar a 4 ºC en el espacio de sangre en cuarentena.

• Las células se deben de cambiar cada mes.

• Si se considera necesario se puede añadir soluciones preservantes como CPD

o Alsever para mantener la calidad y viabilidad de las células.

Práctica:

Proceder a anotar en la pizarra su fenotipo completo.

Una vez anotados todos los integrantes, seleccionar los mejores perfiles para

una célula rastreadora.





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Anotaciones y comentarios:

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

____________________________________________________________





Página 64

Procedimiento 17

Prueba de inmunoglobulina indirecta.

Principio

En 1945 Coombs y colaboradores describieron una prueba para detectar

anticuerpos no aglutinantes o sensibilizantes contra el antígeno Rh, demostraron

de este modo el recubrimiento in vivo o in vitro de eritrocitos por anticuerpos

del tipo IgG y por componentes del complemento.

En la actualidad a esta prueba se le conoce como la prueba de antiglobulina

humana y ha tenido gran desarrollo en el campo de la inmunohematología y

otras áreas afines.

Este antisuero puesto en contacto con el eritrocito recubierto de anticuerpos no

aglutinantes provocará su aglutinación.

En inmunohematología se utilizan dos tipos de pruebas de antiglobulina, la

prueba directa e indirecta.

La prueba de antiglobulina indirecta demuestra la presencia de anticuerpos no

aglutinantes o irregulares en el suero de los pacientes, se utiliza para demostrar

reacciones in vitro entre eritrocitos y anticuerpos, como en los casos de

detección de anticuerpos, identificación de anticuerpos, fenotipo de grupos

sanguíneos y pruebas de compatibilidad, también resulta positiva en algunas

anemias hemolíticas.

El reactivo de antiglobulina se obtiene al inyectar un conejo con globulinas

humanas (IgG y C3) que estimulan la producción de anticuerpos frente a dichas

proteínas. El suero del animal, se somete a procesos de adsorción para eliminar

los anticuerpos no deseados, de tal manera que reaccionará específicamente

contra las globulinas humanas.

Un aspecto importante de tomar en consideración en el procedimiento es la fase

de los lavados, los cuales se deben de realizarse de forma cuidadosa para evitar

que los anti-anticuerpos reaccionen con anticuerpos libres en el medio y sean

neutralizados.





Página 65

Los eritrocitos recubiertos con globulina humana, una vez lavados son

aglutinados por el reactivo de antiglobulina humana. El fragmento Fab de la

molécula de antiglobulina humana reaccionará con el fragmento Fc de la IgG.

Los eritrocitos no recubiertos no son aglutinados. La intensidad de la reacción

de aglutinación observada es proporcional a la cantidad de globulina que

recubre los eritrocitos.

Tipos de reactivos de antiglobulina humana

Existen en el mercado varias modalidades de reactivos de antiglobulina

humana, con diversas propiedades y aplicaciones, los principales son:

- Poliespecífico: Contiene anti-IgG y anti-C3d.

- Poliespecífico: Contiene anti-IgG humano, de conejo y anti C3b y

C3d monoclonal de ratón

- Anti-IgG: Contiene anti-IgG sin actividad anti-complemento

- Anti-IgG (cadenas pesadas): Contiene sólo anticuerpos que reaccionan

con las cadenas gamma humanas

- Anti-C3d y anti-C3b y anti-C3d, C4b, C4d: Contiene solo anticuerpos

que reaccionan con uno o varios componentes del complemento. No tiene

actividad anti-inmunoglobulina.

- Anti-C3d (monoclonal de ratón) y C3b, C3d (monoclonal de ratón)

Contiene sólo anticuerpos reactivos contra el anti- componente designado

del complemento, sin actividad anti-inmunoglobulina.

La mayoría de sueros monoclonales antiglobulina humana poliespecífico

disponibles en el mercado son una mezcla de anti-IgG de conejo y un anti- C3b,

C3d monoclonal. El anti-C3d, C3d monoclonal no contienen anti-C4, por lo

que con este suero produce menos cantidad de reacciones no específicas.

Las desventajas asociadas con el uso de un anti-IgG monoclonal incluyen:

a) Resultados falsos negativos si la prueba no es leída en un estricto período

de tiempo. Una reacción prozona puede ocurrir si la prueba no es

centrifugada y leída en 60 segundos después de añadida la antiglobulina.





Página 66

b) No todas las subclases de IgG son detectadas usando este IgG

monoclonal.

Actualmente la técnica en gel para la prueba de antiglobulina directa e indirecta

es la prueba más utilizada y de mayor sensibilidad que la técnica en tubo.


Tubos con muestras de suero para analizar.

Tubos de 12 X 75 mm para realizar los estudios.

Baño maría a 37ºC.

Pipetas Pasteur.

Bulbos de pipetas.

1 Juego de células rastreadoras 3%.

1 Frasco de suero de Coombs.

1 Frasco de albúmina bovina 22%.

1 Dispensador con solución salina fisiológica.

1 Centrífuga serológica.

1 Gradilla para tubos.

1 Frasco con células de control de antiglobulina humana.

1 Papel toalla.

Método

- En dos juegos de 3 tubos rotule el número de muestra a analizar e indicar si se

trata de:

- Células I,

- Células II y

- Células III

- Mezclar y homogenizar con suavidad el juego de reactivo de las células

rastreadoras.





Página 67

- Añadir al tubo rotulado como células I 50ul de las células reactivo

correspondiente I

- Añadir al tubo rotulado como células II 50ul de las células reactivo

correspondiente II

- Añadir al tubo rotulado como células III 50ul de las células reactivo

correspondiente III

- No confunda los goteros, no deje reactivo en el gotero, cierre bien los

reactivos después de ser utilizados y colóquelos en su lugar.

- Añadir 100ul del suero 1 al juego de tres tubos rotulado como muestra 1.

- Añadir 100ul del suero II al juego de tres tubos rotulado como muestra 2.

- Añadir a todos los tubos 100ul del reactivo de albúmina bovina al 22%.

- Mezclar los tubos.

A partir de este momento iniciamos con las tres fases de la prueba de

antiglobulina humana indirecta.

Fase I, Centrifugación inmediata o prueba rápida:

Centrifugar los tubos 15 segundos a 3000 rpm. En esta fase se detectan

anticuerpos de tipo IgM como los del sistema ABO, auto-anti-I, anti M,

anti N, anti Lewis, etc.

Resuspender con suavidad, leer y realizar las anotaciones.

FASE II, Incubación a 37ºC:

Después de la lectura anterior, colocar los tubos a 37ºC por 30 minutos.

Recuerde que dependiendo de la necesidad o las normativas de

funcionamiento de cada Banco de Sangre se pueden utilizar otros medios

potenciadores de reacción entre los cuales podemos mencionar la

albúmina, solución de baja fuerza iónica (LISS), polietilenglicol (PEG) y

enzimas que facilitan las reacciones antígeno-anticuerpo y que son

escogidos de acuerdo a las características de las técnicas utilizadas.





Página 68

Para cada uno de ellos se deben de apegar para su utilización las

instrucciones que el fabricante establezca.

Al concluir la incubación, centrifugar los tubos 10 segundos a 3000 rpm.

Leer y hacer las anotaciones correspondientes.

Realizar tres lavados con solución salina fisiológica.

FASE III o de antiglobulina:

Añadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana poliespecífico (suero

de Coombs).


Leer y realizar sus anotaciones.

Homogenizar las células reactivos de Control de Antiglobulina Humana.

A las pruebas que dieron negativo, añadir 50ul de las células reactivo de

Control de Antiglobulina Humana.


Leer, hacer las anotaciones respectivas e interpretar los resultados

obtenidos.

Resultados

Fase I

MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III





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Fase II


Fase III


Células Control

de AGH

Células Control

de AGH

Interpretación de Resultados:

Muestra I:

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

Muestra II:

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

Anotaciones y consideraciones finales:

________________________________________________________________

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Procedimiento 18

Prueba de antiglobulina directa

Principio

El principal uso de la prueba de antiglobulina directa es la demostración de

anticuerpos y/o fracciones del complemento que están recubriendo los

eritrocitos in vivo.

Se utiliza para el estudio de anemia hemolítica autoinmune, la hemólisis

inducida por medicamentos, la enfermedad hemolítica del recién nacido y las

reacciones aloinmunes frente a eritrocitos recientemente transfundidos.

Reactivos y Materiales:

Tubos con muestras de eritrocitos a analizar.

Tubos con muestras de suero a analizar.

Tubos de 12 X 75 mm para realizar las reacciones.

Pipetas Pasteur.

Bulbos de pipetas.

Frasco de reactivo de antiglobulina humana.

Pizetas con solución salina fisiológica.

Centrífuga de serológica.

Gradillas.

Frascos con células control de antiglobulina humana.

Baño maría.

Juego de células rastreadoras 3%.

Papel toalla.

Método:

- Rotular tres tubos con el número de muestra a procesar.

- Tomar una alícuota de la muestra y transferir a un tubo rotulado.

- Realizar tres lavados con solución salina fisiológica.

- En el segundo tubo hacer una suspensión de trabajo al 3-5% a partir de

la muestra de eritrocitos lavada.

- Añadir al tercer tubo 50 ul de la suspensión de trabajo realizada.

- Añadir 100 ul del reactivo de antiglobulina humana.

- Mezclar y centrifugar por 10 segundos a 3000 rpm





Página 71

- Resuspender , leer por aglutinación y hacer las anotaciones respectivas.

- A las pruebas que dieron negativo hacer la corroboración con las células

control de antiglobulina.

Práctica:

Muestras de suero:

- Realizar prueba de inmunoglobulina indirecta.

- Durante el proceso de incubación de 30 minutos realizar las pruebas de

inmunoglobulina directa.

Muestras de glóbulos rojos:

- Realizar la prueba de antiglobulina directa.

Resultados

PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA

MUESTRA I MUESTRA II Interpretación

Lectura

Células

Control de

AGH





Página 72

PRUEBA DE ANTIGLOBULINA INDIRECTA

Fase I


Fase II


Fase III


Células Control

de AGH

Células Control

de AGH


Muestra I:

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________





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Muestra II:

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________


________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

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Procedimiento 19

Estudio de Anticuerpos Irregulares

Principio

El objetivo de esta prueba es detectar la presencia de anticuerpos clínicamente

significativos fuera del sistema ABO en el plasma de los pacientes/donantes a

los cuales se les realiza el estudio.

Los anticuerpos irregulares son por lo general del tipo IgG, reactivos a 37ºC y/o

en la prueba de antiglobulina o en ambas, pueden causar reacciones

transfusionales o hemolíticas graves, así como producir un acortamiento de la

sobrevida de las células transfundidas.

Ejemplos de este tipo de anticuerpos son los dirigidos contra los sistemas de

grupo sanguíneo Rh, Kell, Duffy, Kidd, SsU, dentro de otros.

Debe de realizarse rutinariamente en todos los receptores de hemocomponentes

y no sustituye a la prueba cruzada.

La incidencia de anticuerpos fuera del sistema ABO, en diferentes poblaciones

oscila entre 0.78 y 1.64%.

Un paso importante en los protocolos de pruebas pretransfusionales es el

efectuar la determinación del grupo ABO/Rh junto con la detección de

anticuerpos irregulares.

Los métodos empleados en la detección de anticuerpos irregulares pueden

incluir 2 a 3 células pantalla o rastreadoras. Deben de contar con la mayoría de

los antígenos de significancia clínica, ser incubados a 37ºC utilizando el medio

de reacción establecido por el Banco de Sangre como el salino, albúmina,

enzimático o baja fuerza iónica y finalizados con la prueba de antiglobulina

humana de tipo IgG o anti IgG + C3d.

De preferencia cuando la determinación se realiza en tubo se debe utilizar el

reactivo poliespecífico (anti IgG+C3d) debido a que con él se pueden detectar

algunos anticuerpos poco frecuentes demostrados sólo por la actividad del





Página 75

complemento como ocurre con los anticuerpos dirigidos contra el sistema de

grupo sanguíneo Kidd.

Cuando un anticuerpo irregular es detectado, la especificidad debe de ser

definida mediante la confrontación del suero/plasma del paciente con las células

del panel de identificación de anticuerpos.

Una vez identificada la especificidad del anticuerpo, se debe de buscar un

hemocomponente que no posea dicho antígeno, realizarle la prueba cruzada y

una vez obtenido un resultado negativo proceder a transfundir al paciente.

Materiales y reactivos


Tubos de 12 X 75 mm para realizar las reacciones.

Baño de María a 37ºC.

Pipetas Pasteur.

Bulbos de pipetas.

1 Juego de células rastreadoras 3%.

1 Frasco de suero de antiglobulina humana.

1 Frasco de albúmina bovina al 22%.

1 Pizeta con solución salina fisiológica.

1 Centrífuga serológica.

Gradillas.

1 Frasco con células de control de antiglobulina humana.

1 Papel toalla.

Método: Rotular un juego de 3 tubos donde vaya indicado el número de muestra a

analizar y en uno de ellos lo siguiente.

Células I, Células II y Células III.

Mezclar con suavidad y homogenizar el juego de reactivos de las células

rastreadoras

Añadir 50ul de las células I al tubo rotulado como I.

Añadir 50ul de las células II al tubo rotulado como II.

Añadir 50ul de las células III al tubo rotulado como III.

Añadir 100ul del suero/plasma en estudio a cada uno de los tubos.





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Añadir 100ul del reactivo de albúmina bovina al 22% a todos los tubos.

Mezclar y realizar las tres fases de la prueba de antiglobulina humana

indirecta.

Leer, hacer las anotaciones respectivas e interpretar los resultados

obtenidos.

Durante el período de incubación de 30 minutos analice los resultados de

los casos presentados en la práctica.

RESULTADOS

Fase I


Fase II


Fase III


Células Control

de AGH

Células Control

de AGH





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Muestra I:

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________________________________________________________________

________________________________________________________________

Muestra II:

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________


________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

_____________________________________________________________

Práctica:

Analizar los siguientes casos obtenidos de rastreos de anticuerpos.





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Procedimiento 20

Prueba de compatibilidad sanguínea

Principio

La transfusión sanguínea ha representado una parte importante en la práctica

médica desde hace más de un siglo. En su inicio era utilizada como un

recurso desesperado sin garantía de que el paciente obtuviese algún

beneficio.

Hoy en día, la medicina transfusional es una disciplina médica exitosa y

científica gracias a los conceptos básicos aportados por varios investigadores

dentro de los que se puede mencionar al creador del área de la

inmunohematología Karl Landsteiner y colaboradores, quien en 1900

descubren los antígenos de grupo sanguíneo ABO.

A pesar de este descubrimiento se continuaron reportando éxitos y fracasos a

la transfusión hasta que Ottemberg en 1908 introduce el concepto de realizar

las pruebas cruzadas ABO compatible antes de cualquier transfusión de

sangre.

Posteriormente, en mucho menor cantidad cada ciertos procesos

transfusionales se seguían reportando reacciones transfusionales graves en

pacientes ABO compatibles, hasta que en la década de los 40´s se hace del

conocimiento la presencia de otros tipo de sistemas de grupo sanguíneo

eritrocitarios, motivando el inicio de las investigaciones y métodos de

compatibilidad sanguínea que conocemos hasta hoy en día.

Los pioneros en este campo mezclaron el suero del paciente con las células

rojas del donador y observaron la lisis, la aglutinación o ambas del glóbulo

rojo lo que se conoce como la prueba cruzada mayor.

Actualmente el cruce de sangre para la compatibilidad sanguínea forma parte

de una serie de procedimientos conocidos como pruebas pretransfusionales,

las cuales tienen el propósito de seleccionar los hemocomponentes de la

sangre que tengan una aceptable sobrevida y no causen daño al receptor,





Página 82

involucrando procedimientos de identificación, serológicos del donador y del

receptor.

Dentro de los procedimientos obligatorios que estipulan los estándares

internacionales están:

- Solicitud, identificación y colección de la muestra de sangre del

receptor.

- Pruebas del donador las cuales involucran el grupo ABO/Rh,

determinación del fenotipo Rh y Kell, detección de anticuerpos

irregulares y las pruebas serológicas para enfermedades transmisibles por

transfusión sanguínea.

- Determinación del grupo ABO y Rh del receptor.

- Detección de anticuerpos irregulares del receptor.

- Selección de hemocomponentes ABO y Rh apropiados para receptor.

- Prueba cruzada mayor.

- Revisión de la unidad del hemocomponente seleccionado donde se

observan aspectos como la fecha de expiración, realización de estudios

serológicos, detección de anticuerpos irregulares, estado general como

por ejemplo no presencia de coágulos, hemólisis, roturas en la bolsa, etc.

- Comparación entre resultados actuales y el historial de las pruebas

pretransfusionales previas del receptor.

- Reidentificación del receptor antes de la transfusión.

Tomando en cuenta los antígenos del sistema de grupos sanguíneos ABO y

Rh (D) la compatibilidad puede alcanzar hasta un 98%; el resto del

porcentaje restante se logra por medio del estudio de anticuerpos irregulares

clínicamente significativos y la prueba de compatibilidad entre el suero del

receptor y los eritrocitos del donador.

En la actualidad, y a pesar de los procedimientos pretransfusionales, no es

factible tener un 100% de seguridad absoluta de que todos los procesos





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prevengan la sensibilización de los receptores a los aloantígenos

eritrocitarios y que se anulen las reacciones transfusionales tardías,

causadas por la presencia de anticuerpos en cantidades no detectables, en el

suero del receptor antes de la transfusión.

PROCESO DE LAS PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES

La Solicitud, identificación y colección de la muestra de sangre:

Aproximadamente el 50% de las reacciones por transfusión se deben a

reacciones hemolíticas secundarias a errores de tipo clerical por

identificación equívoca del paciente a transfundir, confusión al momento de

extraer la muestra, o en el laboratorio.

Los procedimientos exactos en la identificación del paciente, la muestra

sanguínea y la unidad a transfundir, tienen que estar perfectamente definidos

y escritos en Manuales de Procedimiento de Banco de Sangre, en forma de

rutas críticas para ser consultados cuando sean requeridos.

Antes de realizar la extracción de sangre, el tubo y la solicitud deben de

coincidir con la identificación del paciente, preguntando directamente

cuando sea factible al paciente o corroborando con brazaletes de

identificación; nunca se debe de guiar por los números de cama ya que los

pacientes pueden ser cambiados dependiendo de la necesidad del servicio.

La solicitud debe tener como datos mínimos:

- Identificación del paciente, número de cédula de identidad o pasaporte.

- Nombre completo y edad del receptor.

- Sexo.

- En caso de conocerse se debe de indicar valores como por ejemplo grupo

ABO y Rh, hemoglobina y hematocrito, antecedentes transfusionales,

gestaciones, inmunización materno fetal, reacciones adversas que se

hubieran presentando y medicamentos que se están administrando.

- Diagnóstico de certeza o de probabilidad, así como el motivo de la

indicación transfusional.

- Número de expediente, cama y nombre del servicio donde será

transfundido.





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- Señalar el producto a solicitar incluyendo cantidad de unidades, volumen

o características requeridas.

- Fecha y hora en que se realizará la transfusión y, de ser necesario el

señalamiento de la urgencia de la transfusión.

- Fecha, nombre completo y firma del médico que indica la transfusión.

- Las solicitudes transfusionales deben ser escritas en forma legible para

evitar al máximo la equivocación.

Después de haber realizado una adecuada identificación del receptor, la

muestra de sangre debe ser obtenida, usando técnicas muy cuidadosas para

evitar hemólisis, ya que la misma produce activación del complemento y

algunos anticuerpos pueden ser enmascarados al requerirse del complemento

para visualizar la reacción antígeno-anticuerpo.

Si no existen problemas serológicos de fondo son suficientes 5 ml de sangre

del receptor para realizar todos los procedimientos inmunohematológicos.

DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUINEO ABO/ Rh EN EL RECEPTOR

Grupo ABO

En la medida de lo posible los receptores deberán recibir hemocomponentes

sanguíneos ABO idénticos, sin embargo, en ciertas situaciones puede ser

necesario hacer selecciones alternativas.

La determinación del grupo ABO es el paso más importante de las pruebas

serológicas pretransfusionales. Se emplean antisueros hemoclasificadores

anti A y anti B para determinar grupo eritrocítico y glóbulos rojos con

antígenos A1 y B para la prueba inversa.

En receptores menores de 4 meses de edad la prueba inversa no se realiza, ya

que en este tipo de pacientes el desarrollo de los anticuerpos naturales

todavía es inmaduro.

En caso de discrepancias entre grupo directo e inverso se emplearán técnicas

adicionales antes de establecer el tipo sanguíneo.





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Cuando se está en presencia de una urgencia extrema, en la que el grupo

ABO no se puede determinar se podrá utilizar glóbulos rojos empacados del

grupo O para transfundir.

ESQUEMA DE SELECCION DE HEMOCOMPONENTES POR ABO:

Si se va a transfundir sangre total o sangre total reconstituida no hay alternativa transfusional, todas deberán de transfundirse grupo ABO idéntico.

Si la solicitud se refiere a Glóbulos Rojos Empacados se pueden utilizar

alternativas como se indican en la tabla 1 dependiendo de las existencias y

reservas del Banco de Sangre.

Tabla 6: Alternativas de selección de unidades de Glóbulos Rojos

Empacados dependiendo del grupo ABO del paciente a transfundir

Grupo del Paciente

Alternativas

Primera Segunda Tercera Cuarta O O - - -

A A O - -

B B O - -

AB AB A * B* O

* Uno u otro de estos grupos sanguíneos pueden ser utilizados en cualquier

momento, pero si se escoge uno debe de mantenerse por el resto de las

transfusiones realizadas, no es recomendable hacer cambio de grupo.

Debido a lo anterior, se prefiere la utilización de unidades del grupo A sobre B,

ya que la frecuencia en la población del grupo A es mayor y, por lo tanto, es

más frecuente encontrar más cantidad de sangre A en reservas en los Bancos de

Sangre.





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Grupo Rh

La identificación de antígeno Rh D se realiza usando el hemoclasificador

anti D , la prueba puede realizarse en tubo o en placa de acuerdo a lo

establecido por el fabricante y será validado mediante una prueba de control

en paralelo, que permita demostrar que el eritrocito previamente no tenía

inmunoglobulina tipo IgG adherida en la superficie, si el control es positivo,

el resultado debe ser invalidado.

Cuando la prueba da un resultado negativo, se investigará la expresión débil

del antígeno con la utilización del reactivo de antiglobulina humana, en

neonatos y donadores de sangre.

Las reacciones positivas con anti D, incluyendo el antígeno D expresado

débilmente se clasificarán como Rh POSITIVOS y los restantes como Rh

NEGATIVOS.

Si el grupo Rh no puede ser establecido, dado a que el control también

presenta aglutinación y la transfusión es urgente podrá ser utilizado glóbulos

rojos empacados Rh negativo.

Los hemocomponentes Rh positivos deberán rutinariamente ser enviados a

receptores Rh positivos.

El uso de productos Rh negativos para pacientes Rh positivos es permitido,

aunque en forma ideal, deberán de reservarse exclusivamente para pacientes

o receptores Rh negativos.

De forma inversa, los productos Rh negativos pueden no estar disponibles,

en esta situación se podrá optar por otras medidas alternativas, como

posponer la transfusión o en caso de que el retardo de la transfusión ponga

en peligro la vida del paciente y siempre que el rastreo de anticuerpos del

paciente esté negativo se podría utilizar sangre Rh positiva con un riesgo de

inmunización de un 70%.





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PRUEBA CRUZADA PARA TRANSFUSIÓN DE ERITROCITOS

El cruce de sangre en la actualidad ha sido expuesto a una serie de

interrogantes en cuanto a si debe ser eliminada o no en aquellos pacientes

que no presentan anticuerpos irregulares.

Lo anterior, dado que el rastreo rutinario de anticuerpos en los sueros del

receptor y del donador tiene una alta sensibilidad.

Esto no aplica para cuando la transfusión sea destinada a un paciente que

presente anticuerpos clínicamente significativos.

A estos pacientes, una vez identificado el anticuerpo y seleccionada una

unidad carente del antígeno es obligatorio realizar la prueba cruzada.

La prueba cruzada mayor se refiere a la técnica mediante el cual se

demuestra la ausencia de anticuerpos en el plasma del receptor contra los

antígenos del glóbulo rojo del donador.

Por otro lado, la prueba cruzada menor se refería al cruce entre los eritrocitos

del receptor con el suero del donador y ha sido sustituida en la mayoría de

los bancos de sangre por el rastreo rutinario de anticuerpos clínicamente

significativos en los donantes de sangre.

En caso de existir en el donante un anticuerpo de baja incidencia en su

plasma estos probablemente no causen una reacción transfusional al ser

diluidos en el plasma del receptor.

También se han modificado los medios de reacción, las temperaturas

óptimas y los períodos de incubación, seleccionando procedimientos con un

menor tiempo, costo y un máximo de detecciones de incompatibilidad.

La incubación de la prueba cruzada a temperatura ambiente ha sido siendo

eliminada y se cambió por la fase I de lectura rápida.

La prueba cruzada está constituida por tres fases que se describen en detalle

en la parte del procedimiento y se considera que existe compatibilidad

cuando no se visualiza hemólisis o aglutinación en ninguno de los pasos de

la prueba.





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PRUEBA CRUZADA EN SITUACIONES ESPECIALES

Urgencias.

La necesidad urgente de transfusión en ciertas situaciones clínicas establece

que la sangre sea liberada antes de que la prueba cruzada sea terminada.

El médico tratante debe estar consciente de este riesgo y firmar una hoja de

autorización para que la unidad sanguínea sea liberada, mientras el Banco de

Sangre finaliza la prueba.

En caso de que durante el proceso se determine alguna incompatibilidad en

alguno de los pasos se dará aviso de inmediato al médico encargado para que

se administre el tratamiento oportuno.

De acuerdo a la necesidad de liberación urgente del producto sanguíneo el

Banco de Sangre puede optar por:

- Enviar glóbulos rojos empacados del grupo O Rh negativo y en caso de

no tener en existencia emplear grupo O Rh positivo cuando se

desconozca el grupo sanguíneo del receptor.

- Enviar sangre compatible a grupo ABO y Rh del receptor y donador.

- Siempre que sea posible, realizar la primera fase de centrifugación

inmediata antes de enviar el producto sanguíneo.

- Cuando la transfusión no es de extrema urgencia, pero la sangre se

requiere lo más pronto posible, se puede acortar el tiempo de incubación

de la fase II de la prueba cruzada, empleando diferentes medios de

reacción que requieran un período de incubación más breve a 37ºC para

finalizar con la fase de Antiglobulina Humana.

Prueba de compatibilidad para productos plasmáticos

Deberán ser transfundidos con la corroboración previa del grupo inverso de

acuerdo al esquema transfusional que se indica en la tabla 7.

En el caso de la transfusión de plasma no se debe tomar en consideración el

tipo Rh del paciente o donante debido a que estas unidades no contienen el

antígeno D.





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Para el caso de la transfusión de plaquetas, estas deben de ser transfundidas

bajo el esquema de sangre total pues poseen componentes celulares y

plasmáticos.

También para las plaquetas, dependiendo del tipo de receptor y del volumen

de células transfundidas se puede considerar la administración de

inmunoglobulina Rh a los pacientes Rh negativos transfundidos con

productos Rh positivos.

Tabla 7: Alternativas de selección de unidades de plasma dependiendo del

grupo ABO a transfundir

Grupo del Paciente

Alternativas

Primera Segunda Tercera Cuarta O O A* B* AB

A A AB - -

B B AB - -

AB AB - - -

* Uno u otro de estos grupos sanguíneos pueden ser utilizado en cualquier

momento, pero si se escoge uno debe de mantenerse por el resto de las

transfusiones realizadas, no es recomendable hacer cambio de grupo.

Materiales y reactivos:

Frascos de anti A, anti B, anti AB, anti D, anti A1, Reactivo de antiglobulina

humana, albúmina al 22%, células A y B al 3%.

Tubos con muestras de eritrocitos a analizar.


Células rastreadoras.

Tubos de 12 x 75 mm para realizar las reacciones

Solución salina al 0.85% (Pizetas).

Centrífugas Serológicas.

Microscopios.

Frascos con células control de antiglobulina humana.

Pipetas Pasteur.





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Bulbos para pipeta Pasteur.

Baños de María a 37ºC.

Portaobjetos.

Caja de aplicadores.

Gradillas metálicas.

Gradillas madera.

Papel toalla.

Método:

- Rotular los tubos con el nombre Paciente 1, Paciente 2, Paciente 3 y

Paciente 4

- Realizar suspensiones de trabajo 3-5% de los donantes 1, 2, 3 y 4.

- Añadir 50ul de la suspensión del donante 1 al tubo rotulado como Paciente

1.


2.


3.


4.

- Añadir 100ul del suero del paciente 1 al tubo rotulado como paciente 1.




- Añadir 100 ul de albúmina bovina al 22% a todos los tubos.

- Mezcle los tubos, a partir de este momento iniciamos con las tres fases de

la prueba de antiglobulina humana indirecta.

- Fase I: Centrifugación inmediata o prueba rápida:

Centrifugar los tubos 15 segundos a 3500 rpm. En esta fase se

establece la compatibilidad al sistema ABO, sin embargo, otros

anticuerpos (ejemplo: auto-anti-I), pueden también ser detectados

en esta fase. Leer y realizar las anotaciones.





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- Fase II o a 37ºC:

Después de la lectura anterior colocar todos los tubos a 37ºC por 30

minutos.

Al concluir la incubación sacar los tubos del baño y centrifugar por

10 segundos a 3000 rpm.

Leer y hacer las anotaciones correspondientes.

Realizar tres lavados con solución salina fisiológica.

Llevar la prueba a la fase de antiglobulina.

- Fase III o antiglobulina:

Añadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana poliespecífico.

Mezclar y centrifugue 10 segundos a 3000 rpm.

Leer y realizar anotaciones.

Las reacciones con resultado negativo confirmar con las células

control.

Durante el período de incubación realizar las determinaciones de grupo

sanguíneo eritrocitario a cada una de las suspensiones de los pacientes y

donantes.

RESULTADOS

Prueba Cruzada

Paciente 1/

Donante 1

Paciente 2/

Donante 2

Paciente 3/

Donante 3

Paciente 4/

Donante 4

Fase I

Fase II

Fase III

Grupo

ABO/Rh

Donante

Grupo

ABO/Rh

Paciente





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Anti-A Anti-B Anti-D Control Grupo eritrocítico

ABO /Rh

Paciente 1

Paciente 2

Paciente 3

Paciente 4

Anti-A Anti-B Anti-D Control Grupo eritrocítico

ABO /Rh

Donante 1

Donante 2

Donante 3

Donante 4


Paciente 1:

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________________________________________________________________

________________________________________________________________

Paciente 2:

________________________________________________________________

________________________________________________________________

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Paciente 3:

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________________________________________________________________

________________________________________________________________

Paciente 4:

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Recomendaciones:

Los resultados de las pruebas deberán ser leídos contra luz blanca.

Se puede utilizar espejos magnificadores, lentes y microscopios que ayuden

con la lectura de las pruebas.

El botón de las células se resuspenderá, se hará la lectura y se asignará los

puntajes en cruces en la hoja de trabajo.

En caso de resultados incompatibles deberán ser investigados en busca de su

causa.

Consideraciones finales:

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Procedimiento 21

Identificación de Anticuerpos

Principio

Una vez que se ha detectado la existencia de un anticuerpo irregular se debe

identificar su especificidad y su importancia clínica.

La determinación de la especificidad de los anticuerpos detectados en los

análisis pretransfusionales es importante para seleccionar unidades que no

posean el antígeno contra el cual va dirigido el anticuerpo.

Los paneles de identificación están compuestos por juegos de 8 a 16 tipos

diferentes de células del grupo O con fenotipo conocido contra los principales

antígenos de grupo sanguíneo.

Estos paneles poseen células positivas y negativas en combinación estratégica

para poder identificar anticuerpos contra alguno de los siguientes antígenos de

grupo sanguíneo:

D, C,E, c, e y usualmente V, VS, f, Cw

M, N, S, s

Fya, Fy

b

Jka, Jk

b

K, k y usualmente Kpa, Kp

b, Js

a, Js

b

Lua, Lu

b

Lea, Le

b

P1

Xga

Otros antígenos con fenotipo poco frecuente pueden ser incluidos dentro del

panel e incluso pueden estar incluidos dependiendo de la zona geográfica donde

se encuentre la investigación.

El panel de identificación dispone de una tabla antigénica de reacción donde se

indica la positividad de los diferentes antígenos en relación a la célula que se





Página 95

está analizando, así como el lote del reactivo, fecha de vencimiento y un lugar

destinado para hacer las anotaciones de los resultados obtenidos y sus

interpretaciones.

Para el estudio de anticuerpos es importante tener presente las características de

los anticuerpos como son:

- rango térmico,

- temperatura óptima de reacción,

- sensibilidad o aumento de reacción con enzimas,

- fuerza de reacción de los resultados positivos, tanto aglutinación como

hemólisis.

- Resultado del autocontrol para la detección de autoanticuerpos.

Si se tiene la sospecha que en el estudio están presentes dos o más anticuerpos

se puede hacer uso de diferentes técnicas, procesos y reactivos durante el

análisis.

La aplicación de dos o más técnicas o medios de reacción permite separar los

anticuerpos en base a sus características de reacción con sus antígenos

respectivos, de tal manera que permitan separarlos y diferenciarlos con mayor

claridad.

Dentro de estas técnicas se deben considerar la utilización de procedimientos de

absorción/elución, reacciones a diferentes temperaturas y uso de enzimas como

medio de reacción.

La mayoría de pacientes se sensibilizan contra un único antígeno y es fácil

determinar su especificidad, basta con ubicarse en el perfil de reacción dentro de

la tabla antigénica del panel.( 1,2 )

Características de los anticuerpos en las fases de reacción: • Fase de Centrifugación Inmediata:

A 22ºC reaccionan mejor los anticuerpos del tipo IgM como el M, N,

Lewis, y el P.





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El anti I tiene un rango térmico desde 4ºC hasta fase de antiglobulina, sin

embargo, su temperatura óptima es de 4ºC, por lo que para detectarlo

mejor se debe incubar en el refrigerador.

• INCUBACION A 37ºC:

En este grupo se incluyen los anticuerpos del tipo IgG que tiene la

capacidad de aglutinar sin llegar a la fase de antiglobulina humana. Se

pueden mencionar los anti C, c, E, e, que reaccionan óptimamente al ser

incubados por 30 minutos. También pueden reaccionar a esta

temperatura el anti S, s, D y el Kell.

• FASE DE ANTIGLOBULINA HUMANA:

En esta fase se incluyen todos los anticuerpos tipo IgG no aglutinantes

como el anti Duffy, Kidd, Lutheran, S, s y Cellano.

EQUIPOS Y REACTIVOS:


Panel de identificación

Panel de identificación tratado con enzima

Tubos 12 x 75mm para reacción.

Centrífugas serológicas.

Papel toalla.

Pipetas Pasteur.

Bulbos para pipetas Pasteur.

Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar.


Tubos con eritrocitos a analizar

Frascos con cloroformo.

Tubos 13 X 100 mm.

Tapones rojos.

Pipetas 10 ml.

Pipeteadores.





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Método:


- Mezclar con suavidad y homogenizar el juego de reactivos del panel de

identificación según corresponda.

- Rotular un juego de 11 tubos con el número y la muestra a analizar.

- Añadir 50ul de las células reactivo correspondiente 1 al tubo rotulado

como células 1.

- Añadir 50ul de las células reactivo correspondiente 2 al tubo rotulado

como células 2 y así sucesivamente hasta completar los 11 tubos.

- Añadir 100ul del suero o plasma a estudiar a los 11 tubos.

- A todos los tubos añadir 100ul del reactivo de albúmina bovina al 22%.

- Mezclar y a partir de este momento se inicia con las tres fases de la

prueba de antiglobulina humana indirecta.

- Anotar los resultados obtenidos en la tabla antigénica que corresponde al

lote del panel.

- Identificar según perfil antigénico obtenido el antígeno contra el cual va

dirigido el anticuerpo en estudio.





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Procedimiento 22

Técnica de adsorción de anticuerpos

Principio

En inmunohematología se habla de adsorción cuando se utilizan células

con fenotipo conocido para provocar que un anticuerpo se pegue a la

superficie del glóbulo rojo.

A partir de un proceso de adsorción se pueden separar a nivel de

laboratorio dos o más anticuerpos mezclados en un suero.

Como primer punto para seleccionar las células a utilizar en la absorción

se deben agrupar las reacciones obtenidas en el panel de identificación y

establecer cuáles eventuales anticuerpos pueden estar presentes.

Seguidamente se debe buscar dentro de las unidades del Banco de Sangre

una unidad cuyo fenotipo posea sólo uno de los antígenos que se

sospecha.

Una vez seleccionada la unidad se toma una alícuota y se realiza el

proceso de adsorción bajo las condiciones óptimas del anticuerpo en

estudio.

La parte final del proceso establece una centrifugación que sirve para

separar los glóbulos rojos sensibilizados del plasma y así obtener los dos

anticuerpos separados.







Papel toalla.

Pipetas Pasteur.






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Baños a 37ºC

Tubos 13 X 100 mm.

Tapones rojos.

Pipetas 10 ml.

Pipeteadores.

Método:

- Seleccionar una unidad adecuada para adsorción de glóbulos rojos y

tomar estérilmente una alícuota de unos 20 ml.

- Lavar tres veces el paquete con solución salina fisiológica.

- Dejar el paquete el máximo posible sin salina después del último lavado.

- Agregar igual cantidad del suero en estudio.

- Incubar a 37ºC por 30 minutos.

- Mezclar cada 10 minutos para ayudar al proceso de adsorción.

- Tomar una muestra de eritrocitos y realizar una prueba de antiglobulina

humana directa.

- Mantener en incubación a 37ºC, hasta que se alcance el máximo de

positividad de antiglobulina humana directa, idealmente debe tener una

aglutinación de 3 a 4 cruces.

- Centrifugar 10 minutos a 2000 r.p.m, para separar el suero adsorbido y

los eritrocitos sensibilizados.

- Rotular un tubo con los datos necesarios y transferir el suero del tubo

centrifugado.

- Al suero realizar el panel de identificación de anticuerpos.

- Al paquete globular realizar procedimiento de elución.





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Procedimiento 23

Técnica de Elución de Anticuerpos

Principio

El término elución significa en Inmunohematología liberar los anticuerpos

unidos a la membrana del glóbulo rojo proveniente de un proceso de adsorción.

Dependiendo de las necesidades y protocolos de trabajo del Banco de Sangre se

puede:

- Separar el anticuerpo conservando la integridad de la membrana del

glóbulo rojo o se puede

- Separar el anticuerpo rompiendo las membranas del eritrocito mediante

agentes químicos como el éter, cloroformo, digitonina o mediante

condiciones físicas extremas como la congelación o el calor.

Una vez liberado el anticuerpo en el eluído se procede a determinar su

especificidad a través del panel de identificación de anticuerpos.







Papel toalla.

Pipetas Pasteur.





Frascos con cloroformo.

Baños a 37ºC.

Tubos 13 X 100 mm.

Tapones rojos.





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Pipetas 10 ml.

Pipeteadores.

Método:

Técnica de elución con cloroformo

- Tomar el paquete de glóbulos rojos sensibilidados después del proceso

de adsorción. - Lavar una vez con solución salina.

- A un volumen igual de células lavadas agregar un volumen de

cloroformo.

- Tapar el tubo y agitar fuertemente por 1 minuto.

- Centrifugar 10 minutos a 2000 r.p.m,

- El tubo queda dividido en tres capas, una del cloroformo, otra de restos

de membrana y un eluido o hemolizado donde se encuentra el anticuerpo

separado.

- Transferir el eluído a otro tubo y realizar un panel de identificación de

anticuerpos.

Recomendaciones:

Para encontrar la especificidad del anticuerpo los resultados positivos por

aglutinación así como los negativos deben ser comparados con la tabla

antigénica del panel en su lote respectivo.

Para trabajar procedimientos de adsorción/elución siempre tomar en

consideración la temperatura óptima de reacción. Esta va a ser la temperatura

donde ocurrió la aglutinación más fuerte.


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Práctica:

Esta práctica incluye los procedimientos del 20 al 22 inclusive.

Se trabajará en grupo de trabajo por mesa en dos sesiones de laboratorio.

La primera sesión realizar la identificación de anticuerpos con panel

corriente y panel con enzima.

Con las muestras indicadas realizar proceso de adsorción y elución de

anticuerpos.

Obtener el suero adsorbido y colocar en la gradilla para trabajarlo en la

siguiente sesión de laboratorio.

Obtener el eluído y colocar en la gradilla para trabajarlo en la siguiente

sesión de laboratorio.

La segunda sesión de laboratorio realizar la identificación de anticuerpos

del suero adsorbido y del eluído.

Hacer el análisis y resolución de los casos de identificación de

anticuerpos propuestos.





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PRACTICA DE CASOS:





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Procedimiento 24

Incompatibilidad materno- fetal

Principio

La enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) es una enfermedad en la

cual la madre en gestación produce in vivo aloanticuerpos del tipo IgG contra

antígenos de glóbulo rojo del feto que este heredó del padre.

Debido a esta sensibilización, los glóbulos rojos sufren una destrucción

acelerada tanto antes como después del nacimiento.

Para los recién nacidos que padecen la enfermedad hemolítica la elevación de

los niveles de bilirrubina se convierte en un problema clínico más grave que la

pérdida de la capacidad de transporte de oxígeno como resultado de la

hemólisis.

Los antígenos localizados en la membrana de los eritrocitos, se desarrollan en

diferentes etapas de la vida intrauterina o postnatal.

Los antígenos contra el sistema de grupo sanguíneo Rh, Kell, MNSs, Duffy por

mencionar algunos, presentan al nacimiento una potencia antigénica similar a la

observada en los eritrocitos de una persona adulta.

Otros, por el contrario, se encuentran poco desarrollados, de ahí que su

expresión antigénica sea menor que los antígenos de un eritrocito de una

persona adulta, ejemplos de estos antígenos pueden ser los sistemas ABO, P1 y

Lutheran.

También hay antígenos que están muy pobremente expresados al nacimiento y

es hasta después del primer año de vida cuando logran expresarse

completamente, ejemplos de estos antígenos son los del sistema Lewis y el

antígeno I.

El contar con este tipo de información es importante pues a pesar de que la

madre sea portadora de alguno de los anticuerpos de la clase IgG contra algún

antígeno que no esté bien desarrollado al nacimiento, como por ejemplo un anti-





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Lea, la debilidad o ausencia antigénica en el eritrocito del feto, impide que se

inicie o exprese la enfermedad.

En estos casos, puede existir la incompatibilidad eritrocitaria, sin embargo, no

es una evidencia irrefutable del diagnóstico etiológico de la enfermedad

hemolítica.

Las acciones básicas en el estudio de la EHRN, se ajustan a las circunstancias

en que se ubica el médico y el paciente.

Una manera de estudiar los casos es dividiendo a los sujetos de estudio en tres

grupos: el feto o neonato, la madre y el padre.

Al feto o neonato se le debe realizar al menos las siguientes pruebas para su

estudio:

Grupo ABO/Rh, prueba de antiglobulina directa, fenotipo eritrocitario, rastreo

de anticuerpos con las células pantallas y con las células A1 y B procedente del

eluído de la muestra.

Si la muestra lo permite rastreo de anticuerpos con las células A1 y B

procedente del suero de la muestra.

Que se busca con estos análisis?

- Demostrar la presencia del antígeno en los glóbulos rojos del

feto/neonato.

- Demostrar la presencia del anticuerpo en el suero o glóbulo del feto

neonato y por consiguiente la reacción hemolítica que se está

produciendo.

Análisis en la madre:

- Determinar grupo ABO/Rh.

- Realizar estudio de anticuerpos.

- Fenotipo

Que se busca con ellos?

- Demostrar la ausencia del antígeno.





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- Demostrar la presencia del anticuerpo.

Análisis al padre:

- Determinar grupo ABO/Rh.

- Determinar el fenotipo eritrocitario.

Que se busca con ellos?

- Demostrar la presencia del antígeno en los glóbulos rojos paternos.

De esta manera se puede contar con un panorama más completo de la situación

y se puede iniciar la evaluación del caso.

La enfermedad hemolítica del recién nacido, desde el punto de vista

inmunohematológico, se puede clasificar en tres categorías principales

dependiendo de la especificidad del anticuerpo sensibilizante:

- Enfermedad Hemolítica por ABO, principalmente por un anti-A,B en

mujeres del grupo O.

- Enfermedad Hemolítica por Rh, debida al anti-D.

- Enfermedad Hemolítica por otros anticuerpos irregulares.

Transfusión intrauterina y del neonato

La sangre para transfusión intrauterina debe ser seleccionada compatible con

los anticuerpos maternos capaces de cruzar la placenta.

Los glóbulos rojos empacados seleccionados para la transfusión intrauterina

deberán ser de preferencia O Rh negativo, y utilizando el suero de la madre

para realizar las pruebas de compatibilidad.

Para las unidades de exanguíneotransfusión deberán ser compatibles con

cualquier anticuerpo materno que hubiera entrado a la circulación fetal.

Todas las unidades seleccionadas para estos procedimientos deberán ser del

grupo sanguíneo O, filtradas, irradiadas, de menos de 5 días de recolectada y

en el caso para las exanguíneotransfusión el plasma para su reconstitución

deberá ser compatible con el grupo ABO del recién nacido.





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Tubos 12 x 75 mm de reacción.

Pipetas Pasteur.

Bulbos pipetas.

Muestras de suero y eritrocitos a analizar

Solución salina fisiológica.

Juego de reactivos anti A, anti B, anti AB, anti D, albúmina bovina al

22%, reactivo de antiglobulina hunana.

Panel de identificación de anticuerpos.

Frascos con células control de AGH.


Baños maría a 37°C.


Gradillas de madera.

Gradillas de metálicas.

Microscopios.

Papel toalla.

Método:

- Realizar a la muestra de sangre rotulada como niño una prueba de

inmunoglobulina directa.

- Determinar el grupo sanguíneo ABO/Rh del niño.

- Realizar a la muestra de plasma de la madre un rastreo e identificación de

anticuerpos.

- Realizar una prueba cruzada entre la muestra del niño y el plasma del

donador.

RESULTADOS:

Tipo de incompatibilidad materno fetal analizada:

________________________________________________________________





Página 111

Rastreo de anticuerpos materno:

________________________________________________________________

Identificación de anticuerpo materno:

________________________________________________________________

Prueba cruzada:

________________________________________________________________


________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________





Página 112

Procedimiento 25

Anemia Hemolítica Autoinmune

Principio

La anemia hemolítica inmune se define como un acortamiento en la sobrevida

del glóbulo rojo debido a/o a través del sistema inmune, específicamente por los

autoanticuerpos.

Las anemias hemolíticas autoinmune se clasifican en:

- Anemia Hemolítica Autoinmune por anticuerpos calientes

- Síndrome de aglutininas frías

- Hemoglobunuria paroxística al frío

- Anemia Hemolítica Autoinmune Combinada (Anticuerpos fríos y

calientes)

- Anemia Hemolítica Inmune inducida por drogas

- Anemia Hemolítica Inmune inducida por alloanticuerpos

Cada una de estas se subclasifica en grupos de enfermedades dependiendo de la

causa que desencadena la enfermedad, es decir, si es primaria o secundaria.

La Anemia Hemolítica Autoinmune es designada como primaria si se considera

como una entidad idiopática, es decir, si no está asociada con alguna

enfermedad demostrable que la desencadene.

En contraste, la secundaria está asociada con un desorden primario y con

razones suficientes para sospechar que su asociación es más que meramente

fortuita.

Estos desordenes son diagnosticados en base a las características serológicas de

reacción.

La mayoría de los casos de AHAI son causados por autoanticuerpos cuya

reacción es en caliente, es decir, anticuerpos cuya reactividad optima con los





Página 113

glóbulos rojos humanos es a 37ºC y que por lo general es una inmunoglobulina

de la clase IgG.

El Síndrome de Aglutininas frías es generalmente causado por un

autoanticuerpo de la clase IgM y que exhibe una reactividad máxima a 4ºC.

El anticuerpo causante de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna es una

inmunoglobulina IgG bifásica que difiere en su modo de acción. Este anticuerpo

se detecta in vitro por su habilidad de causar hemólisis de los glóbulos rojos

normales en un procedimiento que lleva dos pasos, una incubación en frío

seguido por una incubación a 37ºC en presencia del complemento.

Finalmente, la ingesta de ciertos medicamentos pueden causar anemia

hemolítica pero aquí el anticuerpo siempre posee una especificidad por la droga

o sus metabolitos.

Reactivos y materiales:

Tubos 12 x 75 mm de reacción

Pipetas Pasteur.

Bulbos pipetas.

Muestras de suero y eritrocitos a analizar

Solución salina.

Reactivo de antiglobulina humana poliespecífico.

Reactivo de antiglobulina humana monoespecífico IgG.

Reactivo de antiglobulina humana monoespecífico C3

Panel de identificación eritrocitos.

Frascos con células control de AGH.


Baños maría a 37°C.


Gradillas de madera.

Gradillas de metálicas.

Microscopios.

Papel toalla.





Página 114

Método:

De la muestra en estudio:

Hacer una suspensión de trabajo entre el 3-5% y:

- Realizar una prueba de antiglobulina humana directa utilizando el

reactivo poliespecífico.


reactivo monoespecífica IgG.


reactivo monoespecífico C3.

Realizar un rastreo e identificación de anticuerpos.

RESULTADOS

Prueba de antiglobulina humana directa:

MUESTRA Poliespecífico Monoespecífico

IgG

Monoespecífico

C3

Rastreo de anticuerpos: _________________________________________

Identificación: ___________________________________________________


________________________________________________________________

________________________________________________________________

________________________________________________________________





Página 115





Página 116

Anexo 1

Reactivos anti-A y anti-B

Los antisueros para ser utilizados en inmunohematología pueden ser obtenidos

de diferentes fuentes.

Cada una de estas fuentes involucra distintos costos de producción así como

distintas especificidades y sensibilidades.

Este tipo de variación de los reactivos puede ser utilizada de manera secuencial

y escalonada a ser requerida según el estudio que se está realizando, por

ejemplo, en el estudio de subgrupos, fenotipo pocos frecuentes y en las anemias

hemolíticas inmunes.

REACTIVOS:

Reactivos anti-A y anti-B:

A partir de aloanticuerpos: Con anticuerpos del tipo IgM en su mayoría con pequeñas

concentraciones de IgG, los cuales son dirigidos contra antígenos

ABH que no posee la fuente de obtención. La reactividad anti-A y

anti-B observada en secreciones como leche, saliva, lágrimas,

fluido cervical y ascítico son del tipo IgA.

Isoaglutininas con especificidad anti-A1 se encuentran en

individuos fenotipeados como A2B.

Anticuerpos de origen natural se pueden encontrar en sueros de

donadores fenotipeados como A1 y A1B son de baja potencia y

presentan dos especificidades: anti-H y anti. HI.

A partir de Anticuerpos Inmunes: Los anticuerpos obtenidos son en su mayoría del tipo IgG. Las

especificidades anti-A y anti-B encontradas en sujetos O

generalmente no pueden ser separadas por absorción, en tal forma

que se dice que tienen una especificidad anti-A+B. La presencia de

antígenos Ii son esenciales para optimizar la reacción de este tipo

de sueros, siendo su especificidad del tipo anti-AI, anti-BI, anti

(A+B) I y anti-HI.





Página 117

Los anti H con mayor potencia se encuentran en individuos con

fenotipo Bombay. Se ha reportado su presencia natural en animales

como perros, gatos, cerdos, conejos y pollos.

Además se puede preparar por inmunización de conejos, cabras o

pollos con eritrocitos O.

A partir de Hibridomas: Se han producido una gran variedad de anticuerpos monoclonales

con especificidades anti-A, anti-B y anti-A+B aplicando la

tecnología de hibridomas, algunos ejemplos son:

1) anti-A del tipo IgM del hibridoma AH21, del tipo IgG el

hibridoma AH16;

2) anti-B del tipo IgM del hibridoma 3E-7;

3) anti-H del tipo IgM, del hibridoma BE2, del tipo IgG del

hibridoma 101.

4) Anti A 1 hibridoma la clona S12

Lectinas: Se ha descrito un gran número derivadas de semillas de

leguminosas.

1) Con especificidad anti-A, ejemplos Dolichos biflorus, Vicia

cracca, Phaseolus lunatus limensis y Helio promatia.

2) Lectinas específicas anti-B se han encontrado sólo en hongos,

tales como Polyporus formentarius y Marasmius oreades.

3) Lectinas con especificidad anti-A+B, la lectina 1 de la

Bandeirae simplicifolia.

4) Ulex europaeus, otras semillas con la misma especificidad son

Cytitus sessilifolius y Laburnum alpinum.

Pueden presentarse discrepancias en la realización de la prueba. Estas son

inherentes a los eritrocitos, el suero, la técnica o a errores humanos. En

cualquiera de los casos se debe resolver primero esta discrepancia antes de

cualquier otro procedimiento adicional.





Página 118

Cuando las discrepancias se asocian a problemas inherentes al paciente se debe

solicitar información necesaria para resolver la misma como pueden ser la

edad, diagnóstico, historia transfusional, historia de medicación, niveles de

inmunoglobulinas, historia ginecológica.

Aspectos a estudiar y resolver cuando se presentan incongruencias de grupo

son:

1- Prueba inversa débil (concentración de anticuerpos baja ) a. Recién nacidos

b. Ancianos

c. Hipogammaglobulinemias

d. Neoplasias

e. Tratamiento con inmunosupresores

f. Síndrome de inmunodeficiencias

g. Trasplante de médula ósea

h. Se recomienda la incubación de la prueba inversa a temperatura

ambiente por 15 minutos, si es negativa incubar 15-30 minutos a

4ºC.

2- Prueba directa débil (concentración de antígenos baja ) a. Subgrupo de A o de B

b. Depresión de antígenos por diseritropoyesis

c. Antígeno B adquirido como consecuencia de una obstrucción

intestinal, carcinoma de colon o recto.

d. Anticuerpos contra antígenos de baja incidencia presentes en

reactivos anti-A o anti-B.

e. Se recomienda el cambio de lote de reactivos.

3- Discrepancias entre la prueba directa e inversa asociada a concentraciones anormales de proteínas. a. Mieloma múltiple

b. Uso de expansores como dextrán y polivinilpirrolidona

c. Gelatina de Wharton.

d. La recomendación inicial es lavar la muestra de eritrocitos con

solución salina y repetir el grupo. Diluir el suero 1:2 con solución

salina y repetir la prueba con la dilución.





Página 119

Anexo 2

Procedimientos para eliminar anticuerpos interferentes.

2.1 Uso de reactivos Thiol para separar autoaglutinación

Principio

Los reactivos Thiol tienen la capacidad de romper las uniones disulfuro de la

molécula pentamérica de IgM.

Los autoanticuerpos que reaccionan en frío son en su mayoría de esta clase, por

lo que se puede hacer uso de estos para separar la aglutinación causada por un

autoanticuerpo reactivo al frío.

La presencia de autoanticuerpos en un suero puede entorpecer o anular la

realización de otras pruebas serológicas que queremos como puede ser la

determinación del grupo sanguíneo, pruebas de compatibilidad, así como

enmascarar la presencia de alloanticuerpos clínicamente significativos.

Es en estas situaciones donde hacemos uso de ellos y así poder realizar las

pruebas que se necesiten sin interferentes.

Estos reactivos se encuentran disponibles como 2-mercaptoetanol (2-ME) o

ditiotreitol (DTT) y pueden ser utilizados para el tratamiento de glóbulos rojos

que aglutinan espontáneamente debido a la presencia de autoanticuerpos fríos.

Materiales:

DTT 0.01 M ó 2-ME 0.1 M

Buffer de PBS a Ph 7.3

Glóbulos rojos empacados para ser tratados, lavados tres o cuatro veces.

Método:

- Diluir los glóbulos rojos a un 50 % de concentración en PBS.





Página 120

- Añadir un volumen igual de DTT 0.01 M en PBS o 2-ME al 0.1 M en

PBS a los glóbulos rojos.

- Mezclar e incubar a 37ºC por 15 minutos si utiliza DTT o 10 minutos si

utiliza el 2-ME.

- Lavar los glóbulos rojos tres veces con solución salina fisiológica.

- Diluir los glóbulos rojos tratado a un 3-5% de concentración en solución

salina fisiológica y utilizar esta suspensión para realizar las pruebas de

grupo sanguíneo.

2.2 Autoadsorción en frío

Principio

La autoadsorción puede ser utilizada para remover autoanticuerpos reactivos al

frío, seguida por la detección de alloanticuerpos de importancia clínica.

Materiales:

Ficina al 1% ó papaína al 1%

2 ml de suero a ser adsorbido

3 ml de glóbulos rojos empacados

Método

- Lavar los glóbulos rojos 4 veces con solución salina a 37ºC y divídala en

tres alícuotas iguales en tubos 13 x 100 mm.

- Remover completamente el sobrenadante después de cada lavado.

- Añadir un volumen igual de ficina al 1% o de papaína al 1% a cada

alícuota de glóbulos rojos lavados.

- Mezclar e incubar a 37ºC por 15 minutos.

- Lavar los glóbulos rojos tres veces en solución salina fisiológica.

- Centrifugar el último lavado por 5 minutos a 1000 xg y remover el

máximo sobrenadante como sea posible.





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- A uno de los tubos tratado con enzima añadir 2ml del suero autólogo

- Mezclar e incubar a 4ºC por 30 a 60 minutos

- Centrifugar a 1000 x g por 5 minutos y transferir el suero a un segundo

tubo de glóbulos rojos tratado con enzima.

- Mezclar e incubar a 4ºC por 30 a 40 minutos.

- En muchos casos, dos adsorciones son más que suficientes para remover

los autoanticuerpos. Si el autoanticuerpo es particularmente fuerte, repetir

una nueva adsorción con un tercer tubo de glóbulos rojos tratados con

enzima.

- Después de la adsorción final, utilizar el suero para ver la actividad de

alloanticuerpos.

Nota:

La dilución del suero en estos procesos puede provocar una pérdida de reacción

de los alloanticuerpos, por lo que es importante remover el máximo de salina

residual en el cada paso.

La autoadsorción no puede ser utilizada si el paciente ha sido transfundido

recientemente. En estos casos se recomienda la absorción con estroma de

eritrocitos de conejo.

2.3 Técnica de precalentamiento para sueros que contienen aglutininas frías

Principio

La reactividad de un autoanticuerpo frío de la clase IgM puede ser reducida o

eliminada utilizando las pruebas precalentadas.

Muchos problemas encontrados en las pruebas de compatibilidad, detección de

anticuerpos y pruebas de identificación pueden ser causados por aglutininas

frías los cuales pueden ser resueltos a través de esta técnica.





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Materiales:

Solución salina fisiológica calentada a 37ºC

Suero del paciente

Albúmina bovina al 22%

Células reactivo ( rastreadoras, panel o para donador)

Método:

- Rotular adecuadamente los tubos que se van a utilizar.

- Añadir una pequeña cantidad de la suspensión de células al tubo

correspondiente, reactivos, solución salina y colocarlos en el baño a 37ºC.

- Realizar el procedimiento deseado siempre dentro del baño de maría

guardando la temperatura apropiada.

2.4 Adsorción de autoanticuerpos fríos utilizando estroma de eritrocitos de conejo.

Principio

Los procedimientos de autoadsorción no son recomendados cuando el paciente

ha sido recientemente transfundido.

Los eritrocitos de conejo son conocidos porque son ricos en el antígeno I, el

estroma hecho de eritrocitos de conejo es ideal para realizar estas adsorciones.

Materiales

Estroma de eritrocitos de conejo

Suero del paciente que contiene el autoanticuerpo





Página 123

Método

- Centrifugar al menos 2 minutos una muestra del reactivo de eritrocitos de

conejo y remueva completamente el sobrenadante.

- Añadir 1 ml del suero a adsorber.

- Mezclar fuertemente preferiblemente utilizando un vortex.

- Incubar a 4ºC por 15 a 60 minutos y mezclar ocasionalmente.

- Centrifugar al menos 2 minutos y transferir el suero adsorbido a un tubo

limpio.

- Realizar el rastro de anticuerpos, identificación o prueba de

compatibilidad con este suero acorde a los procedimientos de rutina.

Nota:

Además del antígeno I, los eritrocitos de estroma de conejo poseen antígeno B,

antígenos del sistema P y antígenos del sistema H.

Tenga presente que el suero adsorbido con estroma de eritrocitos de conejo no

puede ser utilizado para realizar el tipeo sérico para el sistema ABO.

Algunos alloanticuerpos incluyendo el anti-D, anti-E y el anti-Leb, se han

reportado que también son adsorbido con el estroma de eritrocitos de conejo.

2.5 Disociación de IgG utilizando cloroquina

Principio

La mayoría de las anemias hemolíticas autoinmunes poseen una reactividad en

caliente (37ºC), donde se presentan autoanticuerpos de la clase IgG.

Este tipo de muestra presenta una prueba de antiglobulina humana directa

positiva.

En ocasiones se requiere hacer análisis adicional como la determinación de

grup o fenotipo, las cuales son de difícil realización debido a la interferencia de

los autoanticuerpos que recubren a los glóbulos rojos.





Página 124

Bajo condiciones controladas, el difosfato de cloroquina disocia la IgG de los

glóbulos rojos con el mínimo daño a la membrana.

Utilizando este procedimiento se puede realizar fenotipo completo de los

glóbulos rojos que poseen una prueba de antiglobulina humana directa positiva.

Materiales:

Solución de difosfato de cloroquina.

Glóbulos rojos sensibilizados por una IgG

Glóbulos rojos control heterocigotos para el antígeno de la prueba a ser

fenotipeado.

Reactivo de antiglobulina humana monoespecífico anti-IgG

Método:

- A un volumen de los glóbulos rojos sensibilizados lavados añadir 4

volúmenes de la solución de difosfato de cloroquina.

- Tratar el control de la misma forma.

- Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.

- Remuever una pequeña alícuota de los glóbulos tratados y lavarlos 4

veces con salina fisiológica.

- Pruebar los glóbulos lavados con el reactivo de antiglobulina humana

monoespecífico anti-IgG

- Si la prueba da negativo, lavar el resto de la muestra y el control tres

veces y utilizarlos para las pruebas de fenotipo.

- Si la prueba da positiva seguir incubando por espacios de 30 minutos por

un máximo de 2 horas hasta que la prueba de un resultado negativo.

Nota:

El difosfato de cloroquina no disocia moléculas del complemento, por lo que

sólo se puede utilizar el reactivo monoespecífico IgG.

Incubaciones mayores de dos horas o a 37ºC pueden resultar en hemólisis, daño

o pérdida de antígenos del glóbulo rojo.

Puede haber desnaturalización de antígenos Rh.





Página 125

2.6 Adsorción autóloga de autoanticuerpos con reactividad caliente

Principio

Los autoanticuerpos con reactividad caliente pueden enmascarar la presencia de

alloanticuerpos coexistentes en el suero.

La adsorción del suero con glóbulos rojos autólogos puede remover los

autoanticuerpos, permitiendo la detección de los alloanticuerpos.

Células autólogas circulantes, sin embargo, también están cubiertas por

autoanticuerpos.

Algunos de los autoanticuerpos pueden ser removidos de la superficie de

glóbulos rojos autólogos.

La autoadsorción no se puede realizar si se ha realizado una transfusión

reciente.

Procedimiento enzima y calor:

Materiales:

Albúmina bovina al 6%, preparada por dilución con salina.

Ficina al 1% o papaína activada con cisteína al 1%.

Muestra de sangre que contiene un autoanticuerpo caliente.

Método:

- Lavar al menos 4 veces 2 ml de los glóbulos rojos y descartar el

sobrenadante final.

- Añadir al paquete celular un volumen igual de albúmina a 6%.

- Mezclar e incubar a 56ºC por 3 a 5 minutos.

- Agitar la mezcla durante este tiempo.

- Centrifugar a 1000 xg por 2 minutos y separar el sobrenadante.

- Lavar los glóbulos tres veces en solución salina y descartar el

sobrenadante final.





Página 126

- Añadir 1 ml de ficina al 1% o papaína a los glóbulos rojos.

- Mezclar e incubar a 37ºC por 15 minutos

- Lavar los glóbulos 3 veces con solución salina.

- Centrifugar el último lavado 5 minutos a 1000 xg.

- Utilizar succión para remover el máximo posible de sobrenadante.

- Dividir los glóbulos en dos alícuotas iguales.

- A una alícuota añadir 2 ml de suero del paciente.


- Centrifugar a 1000 xg por 2 minutos y transferir el suero a la segunda

alícuota de glóbulos tratados con enzima.


- Centrifugar a 1000 xg por 2 minutos y obtener el suero absorbido.

- Probar el suero absorbido por actividad de anticuerpos utilizando la

técnica de la antiglobulina indirecta.

2.7 Técnica utilizando ZZAP

Materiales

Papaína activada con cisteína al 1%

Buffer PBS pH 7.3

Ditiotreitol al 0.2 M

Muestras de sangre que contengan autoanticuerpos calientes.

Métodos

- Preparar reactivo ZZAP mezclando 0.5 ml de papaína activada cisteína

con 2.5 ml de DTT y 2 ml de PBS a pH 7.3.

- Alternativamente puede utilizar 1 ml de ficina, 2.5 ml de DTT y 1.5 ml de

PBS a pH 6.5

- A dos tubos que contengan 1 ml de glóbulos rojos empacados añadir 2 ml

del reactivo ZZAP.





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- Mezclar e incuba a 37ºC por 30 minutos

- Lavar los glóbulos tres veces con salina.

- Centrifugar el último lavado por 5 minutos a 1000 xg.

- Utilizar succión para remover todo el sobrenadante.

- Dividir los glóbulos en dos alícuotas iguales.

- A una alícuota añadir 2 ml de suero del paciente.


- Centrifugar a 1000 xg por 2 minutos y transferir el suero a la segunda

alícuota de glóbulos tratados con enzima.


- Centrifugar a 1000 xg por 2 minutos y obtener el suero absorbido.

- Probar el suero absorbido por actividad de anticuerpos utilizando la

técnica de la antiglobulina indirecta.





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Anexo 3

Técnicas de elución de anticuerpos

Principio

La liberación del anticuerpo adsorbido a los antígenos del glóbulo rojo en

una prueba de antiglobulina humana directa es utilizado por los

investigadores para determinar si los anticuerpos asociados son

autoanticuerpos calientes o alloanticuerpos de importancia clínica y para la

separación de mezclas de anticuerpos de la clase IgG.

En estos procedimientos, a diferencia de la utilización de cloroquina, se

pretende separar el o los anticuerpos manteniendo la integridad de estos para

ser identificados sin importar la membrana del glóbulo rojo.

3.1 Elución ácida con digitonina

Materiales:

Digitonina al 0.5 %

Glicina al 0.1 M, pH 3.0

Buffer de fosfato 0.8 M, pH 8.2

Suero de albúmina bovina al 30%

1 ml de glóbulos rojos empacados lavados 6 veces en salina fisiológica

Resupender en salina en el último lavado.

Método:

- Calientar los reactivos a 37ºC antes de su uso.

- Mezclar 1 ml del paquete de glóbulos lavados con 9 ml de salina

fisiológica en un tubo 16 x 100 mm.

- Añadir 0.5 ml de digitonina y mezclar 1 minuto por inversión hasta que

los glóbulos sean hemolizados.

- Centrifugar a 1000 xg por 5 minutos y descartar el sobrenadante.

- Lavar el estroma al menos 5 veces hasta que este aparezca de color

blanco.





Página 129

- Centrifugar al menos 2 minutos a 1000 g durante el proceso de lavado.

- Descartar el sobrenadante final y añadir 0.2 ml de glicina al estroma.

- Mezclar por inversión al menos por 1 minuto.

- Centrifugar el tubo a 1000 xg por 5 minutos.

- Transferir el eluato del sobrenadante a un tubo limpio y añadir 0.2 ml de

buffer de fosfato.

- Mezclar y centrifugar a 1000 xg por 2 minutos.

- Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y añadir un tercio de volumen

de albúmina bovina al 30%.

- Realizar las pruebas de identificación de anticuerpo con el eluído.

Nota:

El pH bajo de la solución del buffer ácido aumenta la elución de los anticuerpos

del estroma de los glóbulos rojos.

El buffer de fosfato es añadido para restaurar la neutralidad del eluído ácido.

La acidificación persistente puede causar lisis de los glóbulos rojos añadidos al

eluído.

La adición de la albúmina bovina al eluído protege contra la hemólisis.

3.2 Técnica de Rubin modificada

Método:

- Lavar un paquete de eritrocitos en estudio 3 veces con solución salina,

descartar la salina en cada lavado.

- Agregar 0.5 ml de solución salina fisiológica.

- Agregar éter a la mitad del volumen anterior , tapar y agitar fuertemente

por 30 segundos.

- Destapar, colocar el tubo en un beaker con una corriente continua de agua

a 50ºC y girar constantemente durante 5 minutos a 56ºC en un baño de

maría.

- Centrifugar un minuto a 3400 r.p.m y pasar el sobrenadante a otro tubo.





Página 130

- La mezcla contiene el anticuerpo eluído de los eritrocitos, hacer el estudio

de anticuerpos para conocer su especificidad.

3.3 Técnica de eluído de Lui

Método:

- Lavar los glóbulos rojos tres veces con salina.

- Agregar 0.5 a 1.0 ml de solución salina congelada a 1ºC.

- Incubar por 15-30 minutos a -20ºC.

- Descongelar la muestra.

- Centrifugar 5 minutos a 3400 r.p.m y pasar el sobrenadante a otro tubo.

- Hacer el estudio de anticuerpos para conocer su especificidad.





Página 131

Anexo 4

Procedimientos para estudio de anemias hemolíticas inducidas por medicamentos

4.1 Demostración de la formación de complejos inmunes inducidos por droga

Principio

Ciertos tipos de medicamentos y sus respectivos anticuerpos pueden formar

complejos inmunes que atacan a los glóbulos rojos. Estos no son específicos

contra los antígenos del glóbulo rojo, pero su unión inespecífica a la membrana

puede activar el complemento, lo cual va a producir hemólisis in vivo.

Este procedimiento provee los mecanismos para demostrar la formación del

complejo inmune asociado con la interacción del complejo droga-antidroga.

Materiales

Medicamento bajo investigación, en la misma forma que el paciente lo recibe.

(tabletas, soluciones o cápsulas)

PBS a pH 7.0-7.4

Suero del paciente

Suero normal fresco como fuente de complemento y conocido que carezca de

anticuerpos.

Glóbulos rojos O tratados y no tratados con enzimas proteolíticas

Método

- Preparar 1 mg/ml de la suspensión del medicamento en buffer de PBS.

- Centrifugar y ajustar el pH del líquido supernatante a 7.0 con NaOH 1N o

HCL 1N.





Página 132

- Utilizar 0.2 ml de cada reactante como sigue:

- Suero del paciente + medicamento

- Suero del paciente + complemento (suero normal) + medicamento

- Suero del paciente + complemento (suero normal) + PBS

- Suero normal + medicamento

- Suero normal + PBS

- A 150 ul de cada mezcla de prueba añadir 50 ul de una suspensión al 5%

de glóbulos rojos O.

- A otro juego de tubos de cada mezcla de prueba añadir 50 ul de una

suspensión al 5% de glóbulos rojos O tratados con enzima.

- Mezclar e incubar a 37ºC por 1 o 2 horas, mezclar cada cierto tiempo.

- Centrifugar y examinar por aglutinación y hemólisis.

- Lavar los glóbulos 4 veces con solución salina fisiológica y realizar la

prueba de antiglobulina directa utilizando el reactivo poliespecífico.

Interpretación:

Hemólisis, aglutinación o recubrimiento puede ocurrir.

Cualquier actividad en las pruebas que poseen el suero del paciente y ausencia

en los controles indican interacción de la droga-antidroga.

4.2 Detección de anticuerpos contra penicilina o cefalotina

Principio

Los glóbulos rojos pueden ser cubiertos con la penicilina o cefalosporinas. Este

recubrimiento puede estar asociado con la positividad de la prueba de

antiglobulina humana directa.

Materiales

Buffer de salina barbital (BBS) a pH 9.6

Penicilina (1 x 106 U por 600 mg)

Solución de cefalotina (Keflin) – 400 mg

2 ml de glóbulos rojos lavados del grupo O

Suero o eluato aprobar.





Página 133

Método

- Preparar células cubiertas con penicilina incubando 1 ml de glóbulos

rojos con 600 mg de penicilina en 15 ml de BBS por 1 hora a temperatura

ambiente.

- Lavar 3 veces con solución salina y almacenar en solución de Alsever a

4ºC.

- Preparar glóbulos rojos sensibilizados con cefalotina incubando 1 ml de

glóbulos rojos con 400 mg de cefalotina de sodio en 10 ml de BBS por 2

horas a 37ºC.

- Lavar 3 veces con solución salina fisiológica y almacenar en solución de

Alsever a 4ºC.

- Mezclar 100 ul del suero o eluato con 50 ul de la suspensión del 5% de

las células sensibilizadas.

- Diluir el suero 1:20 con solución salina fisiológica las células cubiertas

con cefalotina.

- Pruebar en paralelo con eritrocitos sin sensibilizados y el suero del

paciente.

- Incubar la prueba a 37ºC por 30 a 60 minutos. Centrifugar y examinar

macroscópicamente por aglutinación.

- Lavar los glóbulos 4 veces en solución salina fisiológica y realizar la

técnica de antiglobulina directa utilizando el reactivo poliespecífico y

monoespecífico IgG.

Nota:

Todos los sueros normales reaccionan con los glóbulos rojos cubiertos con

cefalotina debido a la adsorción de proteínas no inmunológicas.

Esta reactividad se logra eliminar si el suero es diluído 1:20 antes de usar.





Página 134

Bibliografía

1) American Association of Blood Banks. Manual Técnico. 15 Edición,

Bethesda MD. American Association of Blood Banks, 2005.

2) Rodríguez, M. Carboni, L. Garantía de Calidad en Banco de Sangre. San

José, Costa Rica. Publicaciones de la UCR, 1995

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