PowerPoint Presentation

PCRThe Polymerase Chain Reaction

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGIFAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKANUNIVERSITAS MATARAMBy:

ALLVANIALISTA IKALOR (E1A012004)MUHAMMAD SYAMSUSSABRI (E1A012022)

SEJARAH PENEMUAN

Penemu PCRIlmuwan Amerika Bernama: KARY BANKS MULLISKary Banks Mullis lahir tanggal 28 Desember 1944 di Lenoir, Carolina Utara, Amerika serikat. Ia dibesarkan kedua orang tuanya, Cecil Banks Mullis dan Bernice Alberta Barker, dan tinggal di dekat areal peternakan milik kakek dari pihak ibunya.

Gelar sarjana kimianya ia raih dari Georgia Tech. Sedangkan gelar doktor dalam bidang biokimia diterimanya dari Universitas Carolina, Berkeley, tahun 1973, setelah berhasil mempertahankan tesis berjudul Schizokinen: Struktur dan Kerja Sintetik.Tahun 1979, Mullis bergabung dengan Emeryville Cetus Corporation di Carolina sebagai peneliti setelah beberapa kali menjalani magang di fakultas kedokteran Universitas Kansas. Saat bekerja di tempat inilah Mullis membangun ide mengenai PCR.Uniknya, ide brilian itu muncul bukan di saat ia berkutat di dalam laboratorium, tetapi muncul di saat ia sedang berada di dalam mobil Honda Civicnya dalam perjalanan dari San Fransisco ke Mendocino sekira tahun 1985. Pemikiran dan ide-ide terbaik saya kebanyakan muncul di saat saya sedang mengemudi, begitu katanya. Tak sia-sia, pemikiran genius itulah yang kemudian mengantarkan Mullis menjadi seorang peraih hadiah Nobel bidang kimia pada 1993.

PENGERTIAN PCRReaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatis untuk melipatgandakan suatu sekuen nukleotida tertentu secara in vitro. metode ini banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetik.Pada awal perkembangannya PCR hanya dapat melipatgandakan DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitas molekul mRNA.PCR ini dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan kali bahkan jutaan kali dari semula.Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara mengamplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.

TIPE-TIPE PCRBerikut ini macam-macam tipe dan modifikasi dari PCR adalah sebagai berikut: Real-Time PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Nested PCR Multiplex-PCR PCR-ELISA Touchdown PCR Allele-specific PCR Assembly PCR Assymetric PCR Dial-out PCR Hot start PCR, dan lainya.

Basic Components of PCRTemplate DNA (0.5 - 50 ng) < 0.1 ng plasmid DNA, 50 ng to 1 g gDNA for single copy genes

Oligonucleotide primers (0.1 2.0 M)dNTPs (20 250 M) Thermostable DNA pol (0.5 2.5 U/rxn)MgCl2 (1 5 mM) affects primer annealing and Taq activityBuffer Working concentrationsKCL (10 50 mM)Tris-HCl (10 mM, pH 8.3)NaCl2 (sometimes)dNTPsTaq polymerasePrimersDNA templateBuffer+ +A C T GMgCl26KOMPONEN UTAMA PCRDNA CetakanDNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. Fungsi DNA template di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. DNA ini dapat berupa DNA Kromosom, DNA Plasmid, ataupun DNA apapun asal di dalamnya terdapat fragmen DNA target yang di tuju.Penyiapan DNA templat untuk proses PCR dapat dilakukan dengan menggunakan metode lisis sel ataupun dengan cara melakukan isolasi DNA kromosom atau DNA plasmidReaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan proses denaturasi DNA template (cetakan).

Oligonukleotida PrimerPrimer merupakan komponen PCR yang sangat menentukan akurasi sekuen DNA yang ingin diamplifikasi. Di dalam merancang primer perlu diperhatikan panjang primer yang akan dipilih. Umumnya panjang primer berkisar antara 18 30 basa.Primer dengan panjang kurang dari 18 basa akan menjadikan spesifisitas primer rendah.Primer yang digunakan dalam amplifikasi umumnya terdiri dari dua jenis, yakni forward dan reverse. Forward primer bergerak dengan arah 5 > 3 untai DNA template. Sementara reverse primer bergerak dengan arah 3 > 5 untai DNA template.Oligonukleotida yang digunakan ada dua:Oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5-fosfatOliginukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan sekuen pada ujung 3OH rantai DNA.

Primer DesignTypically 20 to 30 bases in lengthAnnealing temperature dependent upon primer sequence (~ 50% GC content)Kandungan G+C)) (% jumlah G dan C) sebaiknya sama atau lebih besar dari kandungan (G+C) DNA target. Sebab primer dengan % (G+C) rendah diperkirakan tidak akan mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif pada tempat yang dituju dengan demikian akan menurunkan efisiensi proses PCR.Selain itu, urutan nukleotitda pada ujung 3 sebaiknya G atau C. Nukleotida A atau T lebih toleran terhadap mismatch dari pada G atau C, dengan demikian akan dapat menurunkan spesifisitas primer.Avoid primer complementarity (primer dimer)

Primer Design Software

OLIGO

PRIMER

PrimerQuest

3. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus OH pada ujung 3 dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA templat. Konsentrasi optimal dNTPs untuk proses PCR harus ditentukan.dNTP dirancang untuk menghemat waktu dalam proses PCR dan untuk meyediakan produktivitas yang tinggi dalam aplikasi PCRKonsentrasi optimal dNTPs ditentukan oleh panjang target DNA yang diamplifikasi. Untuk panjang target DNA kurang dari satu kilobasa biasanya digunakan konsentrasi dNTPs sebanyak 100 uM, sedangkan untuk panjang target DNA lebih besar dari satu kilobasa diperlukan konsentrasi dNTPs sebanyak 200 uM.4. DNA PolimeraseEnzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 95 oC. Aktivitas polimerase DNA bergantung dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut diisolasi .Pada awal perkembangannya, DNA polimerase yang digunakan dalam PCR adalah fragmen Klenow. DNA polimerase I ini berasal dari Escherichia coli (Mullis dan Fallona, 1989)Fragmen Klenow adalah DNA polimerae yang telah dihilangkan aktivitas eksonukleasenya (5 3)Beberapa kelemahan fragmen klenow adalah bahwa enzim ini tidak tahan panasInactivated bila diberikan suhu yang sangat tinggi

Jumlah polimerase DNA yang digunakan tergantung pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Untuk panjang fragmen DNA kurang dari dua kilobasa diperlukan 1,25 2 unit per 50 uL campuran reaksi, sedangkan untuk panjang fragmen DNA lebih besar dari dua kilobasa diperlukan 3 unit per 50 uL campuran reaksi.ENZIM POLIMERASE THERMOSTABLETaq DNA PolimeraseTaq DNA Polimerase ini berasal dari bakteri Thermus aquaticus BM, Taq DNA PoTaq DNA Polimerase ini tersusun atas satu rantai polipeptida dengan berat molekul 95 kDEnzim ini memiliki kemampuan polimerasi DNA yang sangat tinggi, tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 35Enzim ini paling aktif pada pH 9 pada suhu 20 C dan suhu aktivitas optimumnya sekitar 75C 80CKelebihan dari enzim ini yaitu sangat tahan terhadap suhu tinggi yang sangat diperlukan untuk memisahkan rantai DNA cetakanAktivitas enzim ini dalam menggabungkan nukleotida mencapai 150 nukleotida perdetik per molekul enzimSenyawa tambahan yang dapat meningkatkan efisiensi polimerasi Taq DNA polymerase adalah DMSO, gelatin, gliserol, dan ammonium sulfat.

b. Tth DNA PolimeraseEnzim ini diisolasi dati Thermus thermophilus HB8Tth DNA Polimerase ini mempunyai prosesivitas yang tinggi dan tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 35.Enzim ini menunjukkan aktivitas tertinggi pada pH 9 pada suku 25CTth DNA Polimerase juga dapat menggunakan substrad yang dimodifikasi sehingga juga dapat digunakan untuk melabel fragmen DNA dengan radionukleotidadigoxigenin maupun biotinOleh karena itu enzim Tth DNA Polimerase mempunyai aktivitas transkiptase balik yang tinggi pada suhu tinggi maka enzim ini dapat digunakan untuk mengatasi masalah yang timbul akibat adanya struktur sekunder pada molekul RNA dengan demikian enzim ini dapat digunakan untuk melakukan RT-PCR (Reverse Transkriptase PCR)Enzim ini dapat melakukan RT-PCR molekul sampai ukuran 1000 pasangan basa

c. Pwo DNA PolimeraseEnzim Pwo DNA Polymerase diisolasi dari archaebacteria hiperhiperthormofilik Pyrococcus woesei.Enzim ini memiliki berat molekul 90 kDEnzim ini mempunyai prosesivitas polimerasi 53 yang tinggi dan mempunyai aktivitas eksonuklease

d. Pfu dan Tli DNA PolymerasePfu DNA Polymerase di isolasi dari bakteri Pyrococcus furiosisTli DNA Polymerase di isolasi dari bakteri Thermococcus litoralis

5. PCR BufferReaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium.Ada dua jenis buffer PCR yaitu Low-salt buffer(pH 8,75 dan kapasitas buffer rendah) dan High-salt buffer (pH 9,2 dan kapasitas buffer tinggi).Untuk panjang DNA target antara 0 5 kilobasa biasanya diperlukan low-salt buffer sedangkan untuk panjang DNA target lebih besar dari lima kilobasa digunakan high-salt buffer.Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM MgCl2. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain.

MgCl2 (mM) 1.5 2 3 4 5

6. Magnesium Chloride

Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah.Umumnya konsentrasi optimal MgCl2 berkisar antara 1,0 1,5 mM. Konsentrasi MgCl2 yang terlalu rendah akan menurunkan perolehan PCR. Sedangkan konsentrasi yang terlalu tinggi akan menyebabkan akumulasi produk non target yang disebabkan oleh terjadinya mispriming.

Common PCR AdditivesBSA (usually at 0.1 to 0.8 g/L final concentration)Stabilize Taq polymerase & overcome PCR inhibitors

DMSO (usually at 2-5% v/v, inhibitory at 10% v/v)Denaturant - good at keeping GC rich template/primer strands from forming secondarystructures. Glycerol (usually at 5-10% v/v)Increases apparent concentration of primer/template mix, and often increases PCR efficiency athigh temperatures. Stringency Enhancers (Formamide, Betaine, TMAC)Concentrations used vary by typeEnhances yield and reduces non-specific priming

Non-ionic detergents (Triton X, Tween 20 or Nonidet P-40) (0.11%)NOT SDS (0.01% SDS cuts Taq activity to ~10% of normal)Stabilize Taq polymerase & suppress formation of 2 structurePCR Additives - LiteratureAdditiveReferencesDMSO(Dimethyl Sulfoxide)Amplifications 5: 16Gene 140: 1Nucleic Acids Research 18: 1666Betaine(N,N,N-trimethylglycine = [carboxymethyl] trimethylammonium)Biochemistry 32: 137BioTechniques 21: 1102Genome Research 6: 633Nucleic Acids Research 25: 3957Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 70: 298Trends in Biochemical Science 22: 225FormamideNucleic Acids Research 18: 7465 Non-ionic detergentse.g. Triton X-100, Tween 20 or Nonidet P-40 (NP-40)Biotechniques 12: 332Nucleic Acids Research 18: 1309TMAC(tetramethylammonium chloride)Nucleic Acids Research 18: 4953Nucleic Acids Research 23: 3343 dC7GTP(7-deaza-2'-deoxyguanosine)Nucleic Acids Research 16: 3360 BSA(Bovine Serum Albumin)Applied and environmental microbiology 62:1102-1106BioTechniques 23:504BioTechniques 25:564Nucleic Acids Research 16: 9775 25PCR - Before The Thermocycler8 BORING Hours Per PCR!

95 C5 min35 Times55 C3 min72 C5 min

26

ThermocyclersHeated LidsAdjustable Ramping TimesSingle/Multiple BlocksGradient Thermocycler Blocks

Standard Tube, Volume, CostEvaporation & Heat Transfer Concerns

Ependol

Thin Walled Tube, Volume, Cost Evaporation & Heat Transfer ConcernsTAHAPAN METODE PCR1. Denaturasi2. Annealing (Penempelan Primer) 3. Pemanjangan Primer (Extention) PROSEDUR KERJA PCR

31A Simple Thermocycling Protocolannealing94C94C55C72C4C3 min1 min45 sec1 min holdInitial denaturation of DNA1X35X1Xextensiondenaturation

1. DENATURASI

Yaitu proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal, dilakukan pada kisaran suhu 92-95CBerlangsung sekitar 3-5 menitBila waktu terlalu cepat mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase

2. Annealing (Penempelan Primer)

Merupakan tahapan terpenting dalam PCRMenggunakan primer yang didesain sendiriFungsi primer menyediakan fragmen tempat melekatnya tag polimeraseSebagai penanda awal mulainya amplifikasiWaktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 45 detik. Kisaran temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36C -72C, namun suhu yang biasa digunakan berkisar antara 50C 60CSemakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya.

3. Pemanjangan Primer (Extention) Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari ujung 3. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada 35 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target. Suhu yang digunakan berkisar antara 70C-74C dalam waktu 1-2 menitHasil sintesis DNA yang dihasilkan dalam satu siklus berperan sebagai cetakan (template) pada siklus berikutnya

Directional SynthesisReaksi-reaksi tersebut diulangi lagi sehingga pada akhir siklus akan diperoleh molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru yang merupakan hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan.Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target dalam campuran reaksi.

Xeroxing DNA1 copy

Cycle 1PLUS dNTPs, buffer, salts,Taq pol,primersCycle 35n36 = 68,719,476,736 copies in ~ 2 hrs2 copiesCycle 24 copiesCycle 38 copies43Typical PCR Temps/Timeshold4o C or 10 mM EDTAStop reaction5 10 min70o 75o CFinal extension0.5 2 min

70o 75o CPrimer extension0.5 1 min45o 65o CPrimer annealing0.5 1 min90o 95o CDenature1 3 min90o 95o CInitial denaturation

25 40 cyclesUJI ELEKTROFORENSISProduk PCR dapat diidentifikasi melalui ukurannya dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Metode ini terdiri atas menginjeksi DNA ke dalam gel agarosa dan menyatukan gel tersebut dengan listrikElektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama

Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik Hasilnya untai DNA kecil pindah dengan cepat dan untai yang besar diantara gel menunjukkan hasil positif

^-^ TERIMA KASIH ^-^