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Research Collection
Doctoral Thesis
Ueber Lycomarasmin, ein welkaktives Stoffwechselprodukt ausFusarium lycopersici Sacc.
Author(s): Boller, Arthur
Publication Date: 1951
Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000139350
Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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ETH Library
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Prom. Nr. 2047
Ueber Lycomarasmin,ein welkaktives Stoffweehsel-
produkt aus Fusarium
lycopersici Sacc.
VON DER
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN
HOCHSCHULE IN ZÜRICH
ZUR ERLANGUNG
DER WÜRDE EINES DOKTORS DER
TECHNISCHEN WISSENSCHAFTEN
GENEHMIGTE
PROMOTIONSARBEIT
VORGELEGT VON
ARTHUR BOLLER
Dipl. Ingenieur-Chemiker
von Hittnau (Kt. Zürich)
Referent : Herr Prof. Dr. PI. A. Plattner
Korreferent : Herr Prof. Dr. L. Ruzicka
1951
Offsetdruck: Schmidberger & Müller, Kilchberg-Zch.
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MEINEN LIEBEN ELTERN
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Meinen verehrten Lehrern, Herrn Prof.Dr.L.Ruzicka
und Herrn Prof.Dr.PI.A.Plattner, danke ich herzlich
für ihre wertvollen Anregungen und das wohlwollende
Interesse, das sie dieser Arbeit entgegenbrachten.
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INHALTSVERZEICHNIS .
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Seite
Einleitung 1
Isolierung von Lycomarasmin und Substanz J 4
A. Isolierung von Stoffwechselproduk-
ten verschiedener Fusarien-Stämme 4
B. Isolierung von Lycomarasmin 6
C. Isolierung von Substanz J 8
Biologische Versuche mit Lycomarasmin 12
A. Der Welktest 12
B. üeber den Verlauf des Welkprozesses 13
C. Toxigenität in vitro und Pathogeni¬
tät in vivo 14
D. Die Dosis minima 15
E. Weitere biologische Versuche 16
Konstitution des Lycomarasmins 17
A. Physikalische Eigenschaften von
Lycomarasmin und Substanz J 17
B. Einheitlichkeit des Lycomarasmins 18
C. Zusammensetzung und Molekularge¬
wicht von Lycomarasmin 21
D. Spektroskopische Untersuchungen 26
E. Titrationen 35
F. Salze von Lycomarasmin und Substanz J 41
ff. Derivate von Lycomarasmin und 43
Substanz J
H. Nachweis-Reaktionen mit Lycomaras¬
min und Sub»tanz J 50
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Seite
I. Van Slyke-Reaktion mit Lycomarasmin
und Substanz J 52
J. Jodoform-Reaktion 52
K. üeberführung von Lycomarasmin in
Substanz J 53
L. Die saure Hydrolyse von Lycomarasmin
und Substanz J 57
M. Saure Hydrolyse von Derivaten der
Substanz J 70
N. Einwirkung nitroser Gase auf Lyco¬
marasmin und Substanz J 73
0. Hofmann'scher Abbau von Lycomarasmin
und Substanz J 75
P. Einwirkung von Natriumhypochlorit
auf Substanz J 78
Q. Oxydation von Lycomarasmin und Sub¬
stanz J mit Perjodsäure 80
R. Oxydation von Lycomarasmin mit Blei-
(iV)-acetat 83
S. Oxydation von Lycomarasmin und Sub¬
stanz J mit Kaliumpermanganat 85
T. Ozonisation von Substanz J 92
U. Hydrierungs-versuche mit Lycomarasmin
und Substanz J 94
Zur Synthese einer welkaktiven Verbindung
durch Woolley. 97
Biologische Prüfung von Vergleich3substanzen 98
Diskussion der Ergebnisse 105
Zusammenfas sung 116
Literaturverzeichnis 119
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EINLEITUNG .
*********************
Gewisse Pilze, die als Parasiten auf Pflanzen
leben, haben die Fähigkeit, ihre Wirtspflanzen zum
Welken und zum Absterben zu bringen. Solche Welke¬
krankheiten werden u.a. auch von Pilzen der Gattung
Fusarium hervorgerufen (Fusariosen). Sie wurden vor
allem an wertvollen Kulturpflanzen untersucht, da
die wirtschaftlichen Schäden, welche durch den Pilz¬
befall entstehen, sehr erheblich sind. Besonders Ba¬
nane, Baumwolle, Flachs, Kartoffel, Sesam, Tabak, To¬
mate und Zuckerrübe sowie gewisse Blumenarten sind
dem Angriff von Fusarien-Stämmen unterworfen.
Die Tomatenwelke z.B. ist verbreitet in den
Südstaaten der USA, tritt aber auch in Asien, Austra¬
lien, Südafrika und Südeuropa auf. Die Infektion kann
schon sehr früh vom Samen aus oder im Saatbeet erfol¬
gen und, da schleichender Befall unauffällig ist, ins
Freiland verschleppt werden. Die Früchte frühzeitig
infizierter Tomaten bleiben klein, reifen unvollkom¬
men und schmecken fade. Der Erreger dringt vom Erdbo¬
den in die Wurzeln und von diesen in den Stengel hin¬
ein, worauf früher oder später im Laubwerk die cha¬
rakteristischen Krankheitssymptome auftreten (86).
Die Frage nach dem Mechanismus des pathogenen
Effektes ist noch nicht völlig geklärt. Als Ursache
des parasitogenen Welkens werden z.B. diskutiert«
1. Mechanische Verstopfung der Wassérieitungs-
bahnen durch den Erreger;
2. Chemische Verstopfung der Wasserleitungs¬
bahnen durch pathologische Ausscheidungen des Wirtes
(Gummi, Harze etc.);
3. Mechanische Unterbrechung des Wasserfadens
in den Gefässen durch die Gase, die der Erreger beim
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Abbau der Kohlenhydrate des Wirtes bildet;
4. Uebersteigerung der Wasserabgabe in den
Blättern infolge einer Uebersteigerung der Trans¬
piration, oft bedingt durch eine Störung des Re¬
gulationsvermögens der Wirtszellen;
5. Störung des Turgors in den Stengeln und
Blättern infolge Vergiftung des Wirtsplasmas.
Sie unter 4) und 5) genannten Eventualitä¬
ten setzen die Bildung besonderer toxischer, wel¬
keauslösender Stoffe durch den Erreger voraus,
die Marasmine genannt werden sollen (26).
Die Toxin-Theorie der Welkekrankheiten fusst
vor allem auf der Beobachtung, dass Filtrate von
Kulturen pathogener Pilze, die auf künstlichen
Nährböden gezüchtet wurden, imstande sind, gesun¬
de Pflanzen zum Welken zu bringen.
Gottlieb (33) gelang es, in den trachealen
Systemen welker Pflanzen Toxine nachzuweisen; es
ist dies der einzige Fall, wo aus der infizierten
Wirtspflanze ein Toxin gewonnen werden konnte.
Wellmann (81) bevorzugte ebenfalls die To¬
xin-Theorie, weil er Unterschiede in der Toxizi¬
tät von Kulturflüssigkeiten milder und virulenter
Stämme von Fusarium lycopersici feststellte.
Diese Fragen lassen sich aber erst dann be¬
arbeiten, wenn es gelingt, die giftigen Stoff¬
wechselprodukte der Parasiten zu isolieren. Die
Versuche, die mit Kulturflüssigkeiten des Erregers
der Tomatenwelke (Fusarium lycopersici) unternom¬
men wurden, waren von Erfolg gekrönt, denn es ge¬
lang Plattner und Clauson-Kaas (13,56) aus welk¬
aktiven Kulturfiltraten eine einheitliche Verbin¬
dung mit starker Welkwirkung zu isolieren, die
Lycomarasmin (57) genannt wurde und
die in 0,03 prozentiger Lösung bei p„ 7, nach
Zugabe von Spuren Eisen(III)- Chlorid, abge-
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sohnittene Tomatenblätter, die in Welkstoff-freier
Lösung wochenlang frisch bleiben, in 1-3 Tagen
vollständig zum Welken bringt.
Das Ziel der im folgenden beschriebenen Ar¬
beit war, das lycomarasmin weiter zu charakterisie¬
ren und die Konstitution der Verbindung aufzuklären.
Diese Untersuchungen waren nur möglich durch enge
Zusammenarbeit von Biologen und Chemikern. Den Lei¬
tern der beiden Arbeitsgruppen, den Herren Prof.
PI.A.Plattner und E.Gäumann möchte ich für ihre
wertvollen Ratschläge zur Förderung dieser Arbeit
herzlich danken. Frau Dr.S.Kaef-Roth und Frl. P.Turel,
die für die Herstellung der Fusarienkulturen besorgt
waren und die die biologischen Teste ausführten, so¬
wie ihren Mitarbeiterinnen, Frl.Hemmeier und Frl.
ünholz und Herrn R.gempf, der die Aufarbeitung der
Kulturfiltrate durchführte, sei mein aufrichtigster
Dank ausgesprochen. Viele weitere Anregungen und
tatkräftige Mithilfe verdanke ich ferner Dr.ü.Mager
und Dr.H.Günthard.
Sämtliche Analysen wurden in der mikroanaly¬
tischen Abteilung des organisch-chemischen Labora¬
toriums der E.T.H ausgeführt. Herrn W. Manser und
seinen Mitarbeitern möchte ich an dieser Stelle
bestens danken.
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-4-
ISOLIERUNG VON LYCOMARASMIN»#*******##**********#*********»**#*******»****
UND SUBSTANZ J.*»«*»**»#*****»»»*#**#*
A. ISOLIERUNG VON STCFFÏÏECHSELPRCDUKTEN VERSCHIEDE¬
NER FUSARIEN-STAElffiiE.
Ueber den Stoffwechsel der Pilzgattung Fusa¬
rium liegen bereits ausgedehnte Untersuchungen vor.
(54). Viele dieser Pilze sind imstande, aus Kohlen¬
hydraten Fette zu produzieren, die in ihren Eigen¬
schaften dem Olivenöl nahestehen (84), einige, wie
F.javanicum Koorders (2,3,19), F.solani (80), F.oxy-
sporum Schlecht., F.scirpi Lamb, et Fautr., F.oxy-
sporum Schlecht, v. aurantiacum (Lk.) Wr. und F.ave-
naceum (Fr.) Sacc. forma I n.c.Wr. (9,29,53,59-61)
sowie F.caeruleum (10) bilden antibiotisch wirksa¬
me Verbindungen (76).
Versuche, die für das Welken verantwortlichen
chemischen Verbindungen zu identifizieren, sind
schon oft unternommen worden. Aber schon die Frage,
ob das Toxin mit Wasaerdampf flüchtig ist, wurde
verschieden beantwortet. Lathrop (47) konnte in
Kulturflüssigkeiten Propionaldehyd nachweisen. Spä¬
ter wurden jedoch solche Aldehyde nicht mehr gefun¬
den. Rosen (66) fand im Destillat von Lösungen, auf
denen Pilze gezüchtet wurden, einen giftigen Stoff,
mass ihm aber wenig Bedeutung zu, weil auch der
Rückstand aktiv war. In Betracht gezogen wurden
auch Aethanol und Ammoniak; beide sind aber in der
Konzentration, in der sie in Kulturfiltraten auf¬
treten, nicht toxisch (34,51).
Rosen (66) machte Nitrite für das welken
verantwortlich, aber Van der Veen (78) stellte
fest, dass der Nitrit-Gehalt zu gering, ist, um für
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-5-
dae Welken verantwortlich zu sein. Schaffnit, Ah¬
met und Luz (1,51,71) konnten in den Kulturlösun¬
gen überhaupt kein Nitrit nachweisen.
Pur das Vorhandensein enzymatischer Welk¬
gifte trat Hutchinson (39) schon 1913 ein, er ar¬
beitete aber mit einer Bakteriose. 1922 konnte Bew-
ley (8) ein Stoffwechselprodukt von Verticillium
mit Alkohol fällen, dessen wässerige Lösung durch
Erhitzen auf 100° bedeutend an Giftigkeit verlor.
White (82) wies ebenfalls das Vorkommen eines En¬
zyms in Toxinlösungen von F. lycopersici nach.
Lüdtke und Ahmet (50) untersuchten Kulturlö-
sungen von ?. vasinfectum. Sie Filtrate wurden im
Vakuum zur Trockene gedampft und der Rückstand mit
Methanol ausgezogen. Sarin war die Aktivität ange¬
reichert. Auf G-rund einiger Versuche mit unreinen
Präparaten und Hodellsubstanzen nahmen sie an, daas
der Welkstoff ein Amin und nicht eine Aminosäure
darstelle.
In neuester Zeit versuchten Wolf und Wolf
(85), welkaktive Substanzen aus Kulturlösungen von
F. oxysporum v.nicotianae, dem Erreger der Tabak¬
welke zu isolieren. Bas toxische Prinzip ist in Ae¬
ther und Aceton unlöslich. Aus dem Trockenrückstand
konnte aber mit Methanol ein welkaktiver Faktor ex¬
trahiert werden. Baneben existiert ein in Methanol
unlöslicher Stoff, der wohl Nekrose, kaum aber Wel¬
ken verursacht. Es scheinen also wenigstens zwei to¬
xische Substanzen vorhanden zu sein.
Bisher gelang es also nur Plattner und Clau-
son-Kaas (56) im Falle des Lycomarasmins aus Kul¬
turlösungen von Fusarien-Stämmen eine einheitliche,
chemisch eindeutig definierte welkaktive Verbindung
zu isolieren und es macht den Anschein, dass andere
Fusarien-Stämme andere Welkstoffe mit anderen che¬
mischen Eigenschaften produzieren.
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B. ISOLIERUNG VON LYCOMAHASMIN.
Auf Grund umfangreicher Vorversuche wurde
festgestellt, dass es sich beim Welkstoff um eine
Verbindung handelt, die ähnliche Eigenschaften wie
eine Amino-dicarbonsäure besitzt und es wurde dem-
gemäss eine Isolierungsmethode gewählt, die eine
möglichst vollständige, schonende und einfache Ab¬
trennung des Welkstoffes von den übrigen Bestand¬
teilen der Kulturflüssigkeit erlaubte. Analog der
Foreman'sehen Methode (24) zur quantitativen Be¬
stimmung von Asparaginsäure und Glutaminsäure in
Eiweiss-Hydrolysaten wurden die sauren Bestandtei¬
le der Kulturflüssigkeit in die Barium-Salze über¬
geführt und dabei gleichzeitig Sulfat- und Phos-
phationen gefällt und Ammonium-Salze zersetzt. Nach
dem Einengen im Vakuum wurde die wässerige Barium¬
salz-Lösung mit Methanol versetzt, worin die Barium-
Salze der Amino-dicarbonsäuren und des Lycomarasmins
schwer löslich- sind. Nach dem Abtrennen und Auflö¬
sen in Wasser liess sich die welkaktive Verbindung
mit Säure in Freiheit setzen. Der Welkstoff, in
Wasser sehr wenig löslich, liess sich so direkt in
nahezu reiner Form isolieren und durch Umlösen aus
Katronlauge-Salzsäure konnte die Verbindung analy¬
senrein erhalten werden. Die Ausbeute an Lycomaras-
min schwankte sehr stark. Im Verlaufe der Aufarbei¬
tung zahlreicher Ansätze (total ca. 1000 L) ergaben
sich recht unterschiedliche Resultate. Bei einem An¬
satz von 10 L wurde eine maximale Ausbeute von 250
mg Lycomarasmin /L Kulturlösung erhalten; bei vie¬
len Ansätzen bewegte sich die Ausbeute um 30 - 100
mg /L. Schliesslich mussten zeitweise die Isolie¬
rungsversuche unterbrochen werden, weil kein Lyco¬
marasmin mehr gewonnen werden konnte.
Trotzdem es bis vor kurzem an einem quantita¬
tiven Welktest fehlte, konnte festgestellt werden,
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dass die Ausbeute an Lycomarasmin auf Grund von
Welkversuchen mit Kulturlösungen erheblich grös¬
ser (mindestens zehnmal grösser, und zwar unter
Berücksichtigung der Wirkungssteigerung bei Zu¬
satz von Perri-Ionen) sein sollte. Dafür sind ver¬
schiedene Erklärungen möglich:
1. 90 1» des Lycomarasmins oder noch mehr
werden bei der Aufarbeitung der Kulturlösungen
zerstört. Leider war es aus Substanzmangel bisher
nicht möglich, für eine Probeaufarbeitung die mini¬
mal notwendige Menge von 1 g Lycomarasmin einzu¬
setzen. Auf Grund der Eigenschaften der Verbindung
ist es aber wenig wahrscheinlich, dass diese Ver¬
mutung richtig ist, insbesondere als auch Inaktivie-
rungsprodukte des Lycomarasmins nicht in so grossen
Mengen isoliert werden konnten.
2. Lycomarasmin stellt ein weniger wirksames
Abbauprodukt eines hochaktiven Welkstoffes dar, wo¬
bei der Abbau bei der Aufarbeitung erfolgt. Diese
Frage liesse sich nur bei Anwendung noch milderer
Aufarbeitungsmethoden - was aber praktisch kaum
durchführbar sein dürfte - beantworten.
3. In den Kulturlösungen liegt ein Gemisch
von Welkstoffen mit verschiedenen Eigenschaften (Lös¬
lichkeit, Aktivität, Stabilität etc.) vor. Dafür
sprechen u.a. die Verschiedenartigkeit der Welke¬
bilder bei reinen Lycomarasmin-Lösungen und bei Kul¬
turlösungen (13) sowie die Versuche von White (82),
der in den Toxinlösungen von F.lycopersici ein
welkaktives Enzym nachweisen konnte.
4. In den Kulturlösungen liegt ein Aktivator
vor, der die Aktivität des Lycomarasmins stark er¬
höht und der bei der Aufarbeitung entweder zerstört
oder abgetrennt wird. Gegen eine solche Erklärung
spricht die Tatsache, dass die Aktivität einer Kul¬
turlösung, der Lycomarasmin zugesetzt wurde, genau
um den Betrag erhöht wird, der dem zugesetzten Lyco-
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-8-
marasmin entspricht.
Immerhin konnte festgestellt werden, dass
Ferri-Ionen die Wirksamkeit des Lycomarasmins auf
das Zehnfache steigern und dass maximale Wirksam¬
keit vorhanden ist, wenn das molare Verhältnis
von lycomarasmin zu Eisen(III)-Chlorid 1:1 be¬
trägt. Dies deutet auf die Bildung einer Verbin¬
dung ähnlich dem in kristallisierter Form erhalte¬
nen Kupfer-Salz von lycomarasmin (58). Die Spezi¬
fität der Lyeomarasmin-Aktivierung durch Ferri-
ionen ergibt sich aus der Tatsache, dass Lycomaras-
min-Iösungen mit Kupfer(II)-sulfat-Zusatz nicht ak¬
tiver sind als reine lycomarasmin-Lösungen.
Woolley (87) isolierte das lycomarasmin vor
kurzem nach der Methode von Plattner und Clanson-
Kaas (56) und konnte die gemachten Angaben bestäti¬
gen.
C. ISOLIERUNG VON SUBSTANZ J.
Aus den alkoholisch-wässerigen Mutterlaugen
des Lycomarasmins schieden sich meistens nach län¬
gerem Stehen wechselnde Mengen einer ähnlichen, aber
inaktiven Verbindung aus, die als Substanz J bezeich¬
net wurde (56). Die Ausbeute schwankte ebenfalls
stark, betrug jedoch nie über 100 mg/ L Kulturflüs¬
sigkeit . Dass ein Zusammenhang zwischen Lycomarasmin
und Substanz J besteht, Hess sich leicht feststellen:
Wurde das Kulturfiltrat während der Aufarbeitung, be¬
sonders bei alkalischer oder saurer Reaktion, zu
stark erhitzt, so vergrösserte sich die Ausbeute an
Substanz J auf Kosten der Lycomarasmin-Menge.
Zur Ueberführung von Lycomarasmin in Substanz J
vgl. S.53.
Experimenteller Teil.
_lsolierung_v£n_Ly_comarasmin (vgl. 56).
Unter verschiedenen Stämmen von Fusarium lyco-
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persici Sacc. erwies sich der von Dr.T.Fontaine
vom U.S.Department of Agriculture in Beltsville
Md. uns zur Verfügung gestellte Stamm 257 (ETH Nr.
5414) als bester Produzent von toxischen Stoffwech¬
sellösungen. Zur Produktion von Kulturflüssigkeit
wurde die Richard'sehe Nährlösung, modifiziert
nach Luz (51):
Ammoniumnitrat 10 g
prim. Kaliumphosphat 5 g
Magnesiumsulfat-heptahydrat 2,5 g
Eisen(III)-chlorid-hexahydrat 0,02 g
Glucose 50 g
dest.Wasser 1000 cm'
verwendet, die in 2 L Glaxokolben (Pepex) mit je
500 cm3 Nährlösung dreimal in Intervallen von je
24 Stunden im strömenden Dampf sterilisiert wurde.
Zur Beimpfung der Kulturgefässe diente die Spo-ren-
suspension einer 8-tägigen Heiskultur des Pilzes.
Die beimpften Kolben wurden während 5 Wochen bei
24° in einem dunklen Raum inkubiert, dann wurde
die Kulturlösung vom Myzel (Filtration durch Sei¬
dengaze) getrennt und im Tomatentest auf Welkin¬
tensität geprüft. Sowohl das Aussehen der Kultu¬
ren als auch die Wirksamkeit der Filtrate waren
starken Schwankungen unterworfen. Im folgenden
soll die Aufarbeitung eines Ansatzes beschrieben
werden, der gute Welkwirkung zeigte.
Das Kulturfiltrat von 37 Kolben (14,350 I)
wurde mit 10,2 L 0,2-n. Bariumhydroxyd-Lösung ver¬
setzt. Die ausgefallene Mischung von Bariumsulfat
und Bariumphosphat liess sich nach Zugabe von 300 g
Celite (*) gut abnutschen. Das stark nach Ammoniak
riechende Filtrat wurde nun im Vakuum (20 mm) bei
einer Badtemperatur von 40 - 50° möglichst rasch
(*) Filter-Kieselguhr der Firma Johns-I.'anville,
New York.
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bis fast zur Trockene verdampft, wobei das Ammoniak
sich verflüchtigte und die zurückbleibende Lösung
(750 cm') schwach sauer wurde (pjj 6,8). Das Kon¬
zentrat wurde nun in einen 5 L fassenden Erlenmeyer-
Kolben gegeben, das Eindampfgefäss mehrmals mit dest.
Wasser gut nachgespült, von den vereinigten Lösungen
(1,130 L) 50 cm5 für den Welktest weggenommen und
dann 2,40 L Methanol zugegeben. Dabei schied sich
ein flockiger, meist etwas orange gefärbter Nieder¬
schlag aus, der nach Stehen über Nacht von der über¬
stehenden klaren Lösung durch Dekantieren und Filtrie¬
ren abgetrennt und im Vakuum über Kaliumhydroxyd ge¬
trocknet wurde. Nicht ganz trocken wogen die rohen
Barium-Salze 57 g. Sie wurden in 4 Portionen mit to¬
tal 420 cm' dest.Wasser ausgezogen, der Rückstand
nach der Filtration verworfen und die Lösungen mit
total 170 cm3 1-n. Salzsäure auf ph 2,6 eingestellt.
Nach 2-tägigem Stehen bei 0° wurden die drusenartig
vereinigten farblosen Nadeln abfiltriert, mit Wasser
und dann mit Methanol nachgewaschen und getrocknet.
Ausbeute 2,675 g Lycomarasmin = 145 mg /L Nährlösung.
Zersp. 231-232°.(*)
Zur Analyse wurde noch zweimal aus 1-n. Natron¬
lauge (40 cm') - 1-n. Salzsäure (40 cm') umgefällt,
beim ersten Male unter Zusatz von 1 g Tierkohle.
Nach dem Waschen mit Wasser und Methanol und dem
Trocknen im Hochvakuum (14 Std. bei 60°) erhielt man
2,360 g analysenreines Lycomarasmin. Zersp. 229-230°.
[«il1^ = - 45,8° (c = 0,52; pH 7, Phosphatpuffer)
3,810 mg Subst. gaben 5,442 mg CO« und 1,879 mg HgO2,936 mg Subst. gaben 0,405 cm' N2 (24°, 726 mm)
C9H15°7N3 Ber* C 38>" H 5'45 * 15'16 *
Gef. •• 38,98 •• 5,52 » 15,15 #
(*) Alle Schmelzpunkte sind korrigiert. Die spez.
Drehungen wurden in einem Rohr von 1 dm Länge
bestimmt.
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Bilanz_de_r_Wjälkt£8£e_1
Das ursprüngliche Kulturfiltrat besass 150
Welkeinheiten /cm5 (*), d.h. total 2175000 Einhei¬
ten. Da 1 cm5 i-m. Lycomarasmin-Iöaung mit Eisen-
(Ill)-chlorid-Zusatz 15000 Welkeinheiten besitzt,
müssten nach dem Welktest total 40,3 g Lycomaras-
min vorhanden sein. Das während der Aufarbeitung
des Kulturfiltrates anfallende Konzentrat enthält,
verdünnt auf das ursprüngliche Volumen der Kultur¬
lösung, noch 100 Welkeinheiten /em3. Auch auf Grund
dieses niedrigeren Testwertes beträgt die lycomaras-
min-Ausbeute nur rund 10 #.'
Isolierung_von_Sub£tanz £ (vgl. 56).
Aus den alkoholisch-wässerigen Mutterlaugen
des lycomarasmins schieden sich nach 3-wöchigem
Stehen bei 0° 360 mg (20 mg /L Nährlösung) körni¬
ge, orange gefärbte Kristalle ab. Zersp. 263-265°.
Durch mehrmaliges Umfallen aus Natronlauge-
Salzsäure unter Zusatz von Tierkohle konnte die
färbende Verunreinigung entfernt werden. Nach dem
Trocknen im Hochvakuum (14 Std. bei 80°) wog die
analysenreine Substanz J 250 mg. Zersp. 271-273°.
W"0* lu'2° (c s °'56' pH 7, Puffer)
3,780 mg SubBt. gaben 5,671 mg C02 und 1,672 mg HgO2,252 mg Subst. gaben 0,218 cm' N2 (20°, 718 mm)
C9H12°7N2 Ber* G 41'54 H 4'65 H 10'77 *
Gef. •' 40,95 " 4,95 " 10,66 £
(*) Zur Definition der Welkeinheit vgl. S.12
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BIOLOGISCHE VERSUCHE MIT»»a*»**»«**»»»»»*»******»*«**»*»****»»******
IYCOMARASMIH .
*************************
A. DER WELKTEST (31,88).
Wie schon erwähnt, fehlte bis in neuester
Zeit ein quantitativer Welktest. Mit der Gewin¬
nung grösserer Lycomarasmin-Mengen konnte die
Ausarbeitung eines solchen in Angriff genommen
werden. Unter Beachtung gewisser Details wie Ver¬
wendung gleichaltriger Blätter gleicher Grösse,
Aufrechterhaltung konstanter Temperatur, Beleuch¬
tung und Feuchtigkeit, Verwendung von mindestens
40 Testblättern je Teststufe gelingt es, die Kon¬
zentration x mit Sicherheit von der Konzentration
2x bzw. x/2 zu unterscheiden. Dabei stützt sich
der Test nur auf die Pleckennekrose, die bei To¬
matenblättern mit Lycomarasmin-Lösungen sehr aus¬
geprägt in Erscheinung tritt. Ermittelt wird die¬
jenige Konzentration der Testlösung, die einer
Welkintensität der Stufe 2 (starke Pleckenbildung
im ersten Fiederblatt nach 48 Stunden) entspricht.
Iiese Menge wird eine Welkeinheit genannt. Ein
Kulturfiltrat, das in der Verdünnung 1:500 im Mit¬
tel von mindestens zehn Blättern eine Welkinten¬
sität der Stufe 2 auslöst, besitzt somit 500 Welk¬
einheiten /cm'. 1 cm' 1-m. lycomarasmin-lösung
enthält 1000 Welkeinheiten; setzt man dieser Lö¬
sung perrichlorid oder Perrisulfat zu (Verhältnis
von Lycomarasmin zu Eisen = 1:1), so steigt die
Welkkraft der Lösung auf 15000 Einheiten. Ge-
wichtsmässig ausgedrückt enthält Lycomarasmin
3,6 Welkeinheiten /mg.
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B. ÜBBER DEN VERLAUF DES WELKPROZESSES (26,27).
Lindford (48) zeigte, dass die von gewissen
Fusarien ausgeschiedenen Toxine die Fähigkeit der
Pflanze, ihre Transpiration zu regulieren, zer¬
stört hatten. Andere Forscher konnten später seine
Beobachtungen bei ähnlichen Versuchen nicht bestä¬
tigen (35).
Ueber den Verlauf des Welkprozesses stellten
Gäumann und Jaag (26,27) unter Verwendung von Lyco-
marasmin eingehende Untersuchungen an. Lycomarasmin
löst bei Tomatenblättern 2-3 Stunden nach Giftzu¬
satz eine Schockphase aus, die sich in einer Dros¬
selung der Wasserbilanz äussert und die zeitlich
von der Konzentration unabhängig ist. Hach Ueber-
windung der Schockphase erfolgt eine Phase vorüber¬
gehender Uebersteigerung der Transpiration, die
dann nach 5-8 Stunden unvermittelt zu Ende geht
und durch eine Phase der Lähmung des Wasserhaus¬
haltes abgelöst wird. Darnach wird die Erkrankung
bei 10~3 molaren und stärkeren Lycomarasmin-Lösun-
gen sichtbar, bei geringeren Konzentrationen zeigt
sich nur eine pathologische Uebersteigerung der
Wasserabgabe.
Gäumann und Jaag nehmen an, dass das Wasser¬
defizit, wie das pathologische Welken selbst, ei¬
ne Folge der Vergiftung der Protoplasten der Wirts¬
zellen durch die toxischen Stoffwechselprodukte
des Erregers (Veränderung der Semipermeabilität
der Plasmagrenzschichten) darstelle. Die Schock¬
wirkung fällt mit dem Eintritt des Lycomarasmins
in die Gewebe zusammen. Bei der Giftwirkung des
Lycomarasmins scheint auch ein photischer Effekt
beteiligt zu sein, denn die Welksymptome sind bei
10~5 molaren Lyoomarasmin-Lösungen am Lichte kräf¬
tiger als im Dunkeln.
Lycomarasmin wirkt als Plasmagift verhält-
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nismässig spezifisch, im Gegensatz etwa zum Patu-
lin, das zwar wirksamer aber unapezifisch ist.
Während das physiologische Welken infolge
Wassermangels von Anfang an den gesamten Spross
erfasst, treten beim toxigenen Welken zunächst
lokale Schädigungen auf, die sukzessive weiter¬
sehreiten. Sas toxigene Welken steht mit dem Was¬
serverlust in keinem ursächlichen Zusammenhang
und es wird vermutet, dass bei der lycomarasmin-
Welke auch ein Aussteifungseffekt auftritt, der
die grünen Pflanzengewebe starrer werden läset.
Bin Koagulase-Effekt der Welkgifte, wie er auch
mit Hühnereigelb nachgewiesen werden konnte,
scheint den Tatsachen am ehesten gerecht zu wer¬
den.
Die Dauer der Aufnahme- und Einwirkungs¬
zeit des Lycomarasmins ist ein ebenso wesentli¬
cher Paktor für die Ausprägung der Krankheita-
symptome wie die Menge des aufgenommenen Welk-
toxins.
Bei den verschiedenen Tomatensorten be¬
steht keine Beziehung zwischen der Krankheits¬
anfälligkeit und der Empfindlichkeit gegenüber
Welkgiften. Ein Einfluss der Ernährung auf die
Toxinempfindlichkeit der Tomatenpflanzen konn¬
te nicht festgestellt werden (31).
C. TOIIGEHITAET IH VITHO UHD PATHOGENITAEÎ IH VIVO.
Bei zwei eingehend untersuchten Stämmen
von Fusarium lycopersici besteht kein Zusammen¬
hang zwischen der Toxigenität in vitro und der
Pathogenität in vivo: der in vivo hochpathogene
Stamm bildet in vitro wenig und der in vivo nahe¬
zu apathogene Stamm bildet in vitro viel Welk-
toxin.
Trotzdem halten es Gäumahn, Haef und Mie-
scher (31) für sehr wahrscheinlich, dass das Ly-
Page 21
-15-
comarasmin,das in künstlicher Kultur gewonnen
wird, mit dem Giftstoff identisch ist, den der
Pilz im Innern seines Wirtes produziert und zwar
aus folgenden Gründen:
1. Das Lycomarasmin vermag schon für sich
allein die überwiegende Mehrzahl der Symptome
der infektiösen Tomatenwelke auszulösen; durch
Zugabe eines Glukosans (z.B. Inulin) entstehen
auch noch die restlichen Symptome (27).
2. Der Pressaft aus spontan erkrankten To¬
matenpflanzen besitzt dieselben pathogenen Ei¬
genschaften wie Lycomarasmin.
3. Der Erreger vermag in saprophytischer
Kultur mit Hilfe der ihm vom Wirte zur Verfügung
gestellten Nährstoffe lycomarasmin zu produzieren.
D. DIE DOSIS MINIMA.
Die doeia minima (die Giftmenge, die bei ei¬
ner bestimmten Konzentration je kg lebendgewieht
notwendig ist', um unter bestimmten äusseren Be¬
dingungen ein bestimmtes Ausmass von irreversiblen
Schädigungen, im vorliegenden Falle von irreversib¬
len Welksymptomen, auszulösen) für reines Lyco¬
marasmin liegt bei der Konzentration von 10~2»5
molar bei 150 mg je kg Lebendgewicht. Sie nimmt
mit abnehmender Konzentration ab und liegt bei der
Konzentration von 10"4 molar bei 50 mg /kg. Dieses
überraschende Ergebnis erklären Gäumann, Naef und
Mi-escher (31) mit verschieden grossen Transport¬
verlusten, unterschiedlichen Aufnahmezeiten und
der dadurch veränderten Zeitspanne für Nebenreak¬
tionen (in erster Linie wird an die Bildung des
zehnmal giftigeren Lycomarasmin-Eisen-Komplexes
gedacht).
Die dosis minima des Lycomarasmin-Eisen-
Komclexes (aequimolare Mischung von Lycomarasmin
Page 22
-16-
und Ferri-Salzen) liegt bei den Konzentrationen
von 10"' bis 10"*'^ molar bei ungefähr 10-15 mg
Toxin je kg Lebendgewicht.
E. WEITERB BIOLOGISCHE VERSUCHE.
Lycomarasmin wirkt auf den Anthocyandurch-
tritt bei roten Rüben und auf die Plasmaströmung
von Elodea canadensis nur wenig ein und scheint
keine bakterio- oder fungistatische Wirkung zu
besitzen. Z.B. ist es als Antibiotikum selbst in
der Konzentration von 10 c molar unwirksam gegen
Staph, aureus, Bact. coli und Mycobact. paratu-
berculosis aus Ratten und Schildkröten sowie ge¬
gen weitere 60 durchgetestete Bakterien und 100
Pilze. Unwirksam ist es auch gegen Paramaecien,
dagegen noch in der Verdünnung von 10~* molar
sehr wirksam gegen Colpidien (25,28,31).
Mit Lycomarasmin-Lösungen welken ausser
Tomaten auch andere Blutenpflanzen, u.a. Pelar-
gonium-Arten, die Direktträgerrebe und der Raps,
aber diese Pflanzen sind als Testobjekte unge¬
eignet. Das Wirtsspektrum des Lycomaraamin-Eisen-
Komplexes ist weit grösser als dasjenige des rei¬
nen Lycomarasmins.
Vom Standpunkt des in der Tomatenpflanze
verfügbaren Eisens ist es durchaus möglich, dass
das Lycomarasmin im Innern des Wirtes normaler¬
weise nicht als reines Lycomarasmin, sondern in
Gestalt des zehnmal giftigeren Lycomarasmin-Ei-
sen-Komplexes wirkt.
Page 23
-17-
KOHSI IIUIIOÏ DES******************************
LYCOMARASMINS .
**»****»****»****##**»**
A. PHYSIKALISCHE EIGENSCHAFTEN VON LYCOMARASMIN
UND SUBSTANZ J (56).
Lycomarasmin bildet ein farbloses mikrokri¬
stallines Pulver, kann aber aus verdünnter Lösung
in Form feiner Nadeln erhalten werden. Substanz J
stellt ein farbloses grobkristallines Pulver dar.
Beide Substanzen zersetzen sich, allerdings bei
gut reproduzierbaren Temperaturen, unter starkem
Schäumen und unter Braunfärbung, Lycomarasmin bei
228-230° fast ohne vorheriges Sintern, Substanz J
bei 273-276° nach Sintern ab 250°. Die Zersetzungs¬
punkte verschiedener Präparate zeigten nur geringe
Abweichungen (± 5°) von diesen Werten.
lycomarasmin ist in Wasser fast unlöslich.
Die Löslichkeit der Substanz J ist etwas grösser
(0,5 bis 1#), und zwar in kaltem und heissem Wasser
praktisch gleich gross. Die wässerigen Lösungen bei¬
der Substanzen zeigen stark saure Reaktion. In ver¬
dünnten Laugen oder Säuren sind beide Verbindungen
löslich. Aus diesen Lösungen lassen sie sich durch
Neutralisieren wieder unverändert ausfällen. Sowohl
Lycomarasmin als auch Substanz J sind in organischen
Lösungsmitteln unlöslich.
Die spezifische Drehung von Lycomarasmin
variiert (nach Lösen der Substanz in verdünnter
Lauge) in Phosphatpuffer von pg 7 von - 43° bis
- 48°, diejenige von Substanz J unter analogen Be¬
dingungen von - 110° bis - 116°.
Page 24
-18-
B. EINHEITLICHKEIT DES LYCOMARASMINS.
Die peptidartige Natur der Substanz bringt
es mit sich, dass deren Einheitlichkeit nur schwie¬
rig zu beurteilen ist. Die Tatsache, dass aus ver¬
schiedenen Ansätzen von aktiven Pilzkulturen stets
Welkstoffpräparaten mit praktisch identischen Ei¬
genschaften erhalten wurden, spricht jedoch sehr
für die Auffassung, dass die Verbindung chemisch
einheitlich ist.
Mit Hilfe der Verteilungschromatographie
an Filtrierpapier (17), wo Lycomarasmin mit Nin-
hydrin erst unter energischeren Bedingungen eine
Färbung ergibt als die Aminosäuren, konnte unter
Verwendung verschiedener Lösungsmittel immer nur
ein Fleck beobachtet werden.
Schliesslich war die aus dem Kupfer-Salz
des lycomarasmina (vgl. S.42) mit Schwefelwasser¬
stoff regenerierte Verbindung in allen ihren Ei¬
genschaften mit dem Ausgangsprodukt identisch
(58).
Experimenteller Teil.
Allgemeine£ über_die_V£rt^ilungS£hromatographii
an_Fi1trierpap^er.
Die Versuche wurden nach der von Consden
und Mitarbeitern (14-17) beschriebenen Methode
ausgeführt.
1. Herstellung der Lösungsmittel.
Das verwendete Phenol (puriss. Ciba) wur¬
de nicht weiter gereinigt. Bei der Herstellung
der Phenol-Lösungen wurde dest.Wasser, das frei
von Schwermetall-Salzen war, verwendet (21).
Tert. Amylalkohol (Sdp. 99-100°) und sek.
Butanol (Sdp. 95,3-95,5°) wurden mit einer 3o
cm langen iVidmer-Kolonne destilliert.
Page 25
-i9-
Das verwendete Collidin (Schweiz. Teerindu-
strie) war ein Gemisch basischer Destillate des
Steinkohlenteers. Es wurde nach Consden (17) durch
Behandlung mit Brom gereinigt und im Vakuum frak¬
tioniert destilliert. Verwendet wurden bei 62-67°
und 17 mm übergehende Anteile. Das s-Collidin
(light und Co. Ltd.) war ebenfalls nach Consden
behandelt und anschliessend im Vakuum destilliert.
Sdp.14 62°.
2. Ausführung der Papierchromatogramme.
Die Versuche wurden in Akkumulatorenzellen
(21 x 8 x 27 cm) resp. in Glaswannen (45 x 45 x
50 cm) ausgeführt. Die Tröge, die die Lösungen für
die mobile Phase enthielten, waren aus Pyrex-Hohr
nach Longenecker (49) hergestellt und ruhten im
Gefäss auf einem Gestell aus Pyrex-Glasstäben.
Die Chromatogramme dauerten bei 12-16° Raumtempe¬
ratur je nach Lösungsmittel und Filtrierpapier
4-7 Stunden für die Akkumulatorenzellen reap. 20-
22 Stunden für die Glaswannen. Dabei legte die
Front der mobilen Phase 15-20 cm resp. 25-30 cm
zurück. Pur Phenol diente Filtrierpapier Whatman
Nr.l, für die anderen Lösungsmittel Whatman Nr.4.
Bei den Versuchen mit Phenol wurde der sta¬
tionären Phase 1 % konzentriertes Ammoniak und et¬
was Natriumcyanid, bei denen mit Collidin und Ben-
zylalkohol 0,2 # Diaethylamin zugesetzt.
Das Filtrierpapier trocknete man bei 80°
während 10 Minuten (Amylenhydrat und sec.Butanol)
bzw. 30 Minuten (Phenol, Collidin, Benzylalkohol).
Darnach wurde das Filtrierpapier zur Feststellung
der fluoreszierenden Aminosäuren im UV-Licht be¬
trachtet und anschliessend durch Bespritzen mit
einer 0,2-prozentigen Hinhydrin-Lösung in mit Was¬
ser gesättigtem n-Butanol und Erhitzen auf 80-90°
(10 Minuten) die Aminosäuren sichtbar gemacht. Zur
Page 26
-20-
Kontrolle wurden jeweils nach Möglichkeit auf dem
gleichen Piltrierpapier die zu untersuchenden Stof¬
fe bzw. Gemische und die zu erwartenden reinen Ami¬
nosäuren angesetzt.
Unter R_-Wert versteht man das Verhältnis
w /Wo» wobei wi der von der Substanz, W~ der von
der Front des Lösungsmittels zurückgelegte Weg ver¬
standen wird.
Wo im folgenden keine näheren Angaben ge¬
macht werden, handelt es sich um Chromatogramme
mit Phenol.
Verhalten von Ly£omararaj.n_und_Subs_tanz J i"L7£r~
teilungs£hromatogramm anJPiltrierpapi.er.
Zur Feststellung der Lage der Flecken wur¬
den je 10 mg Lycomarasmin und Substanz J in wenig
wässerigem Ammoniak gelöst und die Lösungen mit
dest. Wasser auf 1 cm' gebracht. Davon wurden je.
5 mm? auf das Papier gegeben und die R_,-Werte der
beiden Substanzen in verschiedenen Lösungsmitteln
festgestellt. Es zeigte sich, dass Lycomarasmin
bei normaler Ausführung der Ninhydrin-Reaktion
keine Färbung ergibt. Erhitzte man dagegen das mit
Ninhydrin bespritzte Filtrierpapier während kurzer
Zeit auf der Heizplatte (30 Sekunden) oder bespritz¬
te man das Papier mit einer 0,02-n. Kaliumpermanga-
nat-Lösung oder führte man die Hinhydrin-Reaktion
bei höherer Temperatur durch - alles Methoden, die
auf eine Zersetzung des Lycomarasmins hindeuten -
so liess sich das Lycomarasmin sichtbar machen.
Substanz J dagegen gab schon unter normalen
Bedingungen mit Ninhydrin einen charakteristischen
braunvioletten Fleck. Die ermittelten R^-Werte sind
in Tabelle 1 zusammengestellt. Für die Charakteri¬
sierung von Lycomarasmin und Substanz J im Papier-
chromatogramm eignen sich nur Phenol und Collidin
Page 27
-21-
als Lösungsmittel.
Tabelle 1.
R_-Werte von lyoomarasmin und Substanz J in ver¬
schiedenen Lösungsmitteln.
Lösungsmittel Rp-Werte
Lycomarasmin Substanz J
Phenol 0,24-0,26 viol. 0,04-0,06 braunviol.
Oollidin 0,15-0,16 viol. 0,08 viol.
Amylenhydrat 0 viol. 0 viol.
Benzylalkohol 0 viol. 0 braunviol.
C. ZUSAMMESSETZÜHG USD MOLEKULARGEWICHT TON
LYCOMARASMIN.
1. Bruttoformel des LyoomaraBmins.
Die Analysen verschiedener Präparate von Ly¬
comarasmin gaben stets Werte, die für die Summen¬
formel (CgH,507ir5)I1 sprechen. Da die üblichen Me¬
thoden zur Molekulargewichts-Bestimmung der chemi¬
schen Eigenschaften der Substanz wegen nicht in
Frage kamen, blieb die Grösse von n vorerst unbe¬
kannt .
2. Diffusionsmessungen mit Lycomarasmin.
Herrn Dr.Kai O.Pedersen in Upsala sind wir
zu grossem Dank verpflichtet, dass er das Moleku¬
largewicht des Lycomarasmins nach der Diffusions¬
methode ermittelte. Es liess sich zwar so unter
den gegebenen Voraussetzungen kein genauer Wert
sondern nur ein oberer Grenzwert ermitteln, aber
es konnte doch entschieden werden, dass n = 1
ist, dass also dem Lycomarasmin die Formel
CgH-jcCUN-r zukommt.
Ohne auf die theoretische Seite der Diffu-
Page 28
-22-
sionsmessungen näher eingehen zu wollen - sie sind
an anderer Stelle bereits beschrieben worden (55) -
entnehmen wir dem Brief von Herrn Dr.Kai O.Pedersen
folgende Einzelheiten:
Die zwei Experimente mit Lycomarasmin wurden
in einer Claesaon-Zelle (12) ausgeführt. Das Lyco¬
marasmin wurde in einem Phosphatpuffer mit pjj 7 und
einer Jonenstärke von 0,2 gelöst. Dabei ergaben
sich die Ergebnisse, die in Tabelle 2 zusammenge¬
stellt sind.
Tabelle 2.
Ergebnisse der Diffusionsmessungen an Lycomarasmin.
Lycomarasmin-Konzentrat ion DA .107A
D .107m
0,26 #
0,33 *
43,3
44,2
47,7
47,1
D, = Diffusionskonstante, nach der "area method"
ermittelt.
D_ = Diffusionskonstante, nach der "moment method"m
ermittelt.
Zur Bestimmung des Molekulargewichtes diente
der Mittelwert der Diffusionskonstanten,
D20 = 44.10"7
Die Berechnung des Molekulargewichtes erfolg¬
te nach der Gleichung:
k . (f0/f)5M =
D5. V
Dabei bedeuten:
M = Molekulargewicht D = Diffusionskonstante
k = Konstante als f(T, Lösungsmittel). Sie besitzt
für Wasser von 20° den Wert k = 24,1 .10~15
f = Reibungskoeffizient für ein gegebenes Molekül
f0= Reibungskoeffizient für ein sphärisches, un-
hydratisiertes Molekül
Page 29
-23-
V = spezifisches Volumen der Substanz.
Man kann annehmen, dass das spezifische Vo¬
lumen V für Lycomarasmin «inen Wert zwischen 0,6
und 0,8 besitzt. Daraus werden die folgenden ma¬
ximalen Werte für das Molekulargewicht M erhalten:
V = 0,8 D20 = 44.10-7 M = 354.(fQ/f)5V = 0,6 D20 = 44.10"7 M = 472.(f0/f)3Sa f0/f immer ^ 1 ist, ist das Molekular¬
gewicht von Lycomarasmin kleiner als 472. Das
Natriumsalz von lycomarasmin, das für die Diffu¬
sionsmessungen verwendet wurde, stellt also das
Salz des Monomeren dar. Die Diskrepanz zwischen
den Werten für D, und D deutet auf ungleichmäs-a m
sige Diffusion, wahrscheinlich infolge eines Ef¬
fektes elektrischer ladungen auf die Diffusion.
3. Bestimmung des Molekulargewichtes des
Kupfer-Salzes von Lycomarasmin auf rönt-
genographischem Wege (*).
Die gute Kristalliaationsfähigkeit des
Kupfer-Salzes von Lycomarasmin (vgl.S.41) ermög¬
lichte die Bestimmung des Molekulargewichtes von
Lycomarasmin auf röntgenographischem Wege und
gleichzeitig eine kristallographische Charakte¬
risierung eines Lycomarasmin-Derivates.
Bei langsamem Auskristallisieren aus Was¬
ser entsteht das Kupfer-Salz (CgHj^CJS^CUjHgO)in wohlausgebildeten Kristallen, die der Kri¬
stallklasse D2h (orthorhombische Holoedrie) an¬
gehören und die folgende Flächen zeigen:
Prisma I. und III.Stellung und seitl.
(*) Für die Röntgenaufnahmen konnten die Appa¬
raturen des röntgenographisch-petrographi-
schen Institutes der ETH (Leitung Prof.Dr.
B.Brandenberger) benutzt werden.
Page 30
-24-
Hauptpinakoid.
Die Flächen schliessen folgende Winkel (Mittelwer¬
te) ein (*):
zwischen (110) und (1Ï0) = 70o08«
zwischen (110) und (010) = 54°56'
zwischen (011) und (OTl) = 51°11'
zwischen (011) und (010) = 64°15'
Aus der stereographischen Projektion Hessen
sich folgende Winkelwerte ermitteln:
£ = 35° und tj = 26°
Die daraus nach den Gleichungen
tg£ = a : b und tg 1| = c : a
ermittelten Achsenverhältnisse sind zusammen mit
den auf röntgenographischem Wege erhaltenen Werten
in Tabelle 3 zusammengestellt.
Tabelle 3.
Makroskopisch und röntgeno graphisch ermittelte Ach¬
senverhältnisse am Kupfersalz des lycomarasmins.
Achsenverhältnis makroskopisch röntgenographisch
DKA GA
a : b 0,700 : 1 0,692 : 1 0,689 s 1
c : a 0,487 : 1 0,493 : 1 0,493 : 1
Zur Bestimmung der Ausmasse der Elementar¬
zeile wurden sowohl Drehkristall-(DKA) als auch
Goniometer-Aufnahmen (GA) durchgeführt, erstere
nur zur Kontrolle der Justierung und Ermittlung
der Translationsabstände. Aus den Goniometer-Auf¬
nahmen liess sich neben den Trahslationsabständen
die Punktgruppe ermitteln. Es handelt sich um
^h rmmm •
(*) Zur Bestimmung der Winkelwerte konnte das
Zweikreis-Goniometer des mineralogischen In¬
stitutes der ETH (Prof.Dr.R.L.Parker) benutzt
werden.
Page 31
-25-
Dabei traten keine systematischen Auslöschun¬
gen auf; die Zahl der Formeleinheiten n pro Elemen¬
tarzelle beträgt in diesem Falle, da es sich um ei¬
nen Punkt allgemeiner Lage handelt, 8. Nach der Be¬
ziehungd . V
II =
n
(V = Volumen der Elementarzelle) lässt sich bei be¬
kannter Dichte d der Substanz das Molekulargewicht
M des Kupfer-Salzes ermitteln. Die Dichte wurde
nach der Methode von Bernal und Crowfoot (7) be¬
stimmt.
Die Ergebnisse der Kolekulargewichtsbestim-
mung sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Tabelle 4.
Ergebnisse der Molekulargewichtsbestimmung.
Translationsabstände
in X
Goniometer-
Aufnahmen
Drehkristall-
Aufnahmen
a ( *(100))b ( *(001))c f*(010))
'
10,59
7,30
21,46
10,64
7,36
21,58
Elementarvolümen V
in A^ (a.b.c) 1658,7 1689,4
Molekulargewicht K
(n = 8; dgefm) 36C.1 366,7
Röntg. Dichte dR(n = 8; Mber#) 1,721 1,690
Aus der Analyse berechnet sich ein Moleku¬
largewicht von Mfcer. = 356,8. Nach der Schwebe¬
methode wurde für das Kupfer-Salz eine Dichte
dgef. = 1,737 ermittelt.
Page 32
-26-
Aus den Werten kann ersehen werden, dass das
Formelgewicht des Kupfer-Salzes dem Molekulargewicht
entspricht, dass also dem Lycomarasmin die einfa¬
che Formel CqH,,-07N, zukommt.
D. SEEKTROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN.
l.Ultraviolett-Absorptionsspektren (Fig. 1)
Im Ultraviolett-Absorptionsspektrum zeigen we¬
der Lycomarasmin noch Substanz J eine charakteristi¬
sche Absorption. Sie gleichen darin also gewöhnli¬
chen Dipeptiden, z.B. dem in Fig. 1 ebenfalls ent-
„,,U.V.-SPEKTREN
4.0
320 2»0 240 200 m/i
Fig. 1 Ultraviolett-Absorptionsspektren.
Kurve 1: Glycyl-dehydroalaninKurve 2: Substanz J
Kurve 3: LycomarasminKurve 4: Glycyl-alanin
Page 33
-27-
haltenen Glycyl-alanin. Im Gegensatz dazu besitzt
Glycyl-dehydroalanin ein Absorptionsmaximum bei
245 mjx (logg = 3,75). Die bisher für Substanz J
vorgeschlagenen Strukturformeln mit der Gruppierung
?H3 §H2-N=C oder -NH-C
I ICOOH COOH
erscheinen aus diesem Grunde unwahrscheinlich.
2. Infrarot-Absorptionsspektren (5,65) (*).
Beim Versuch, aus den Infrarot-Absorptions¬
spektren Schlüsse auf die Konstitution von Lycomaras-
min und Substanz J zu ziehen, zeigte es sich, dass
keine neuen Erkenntnisse gewonnen werden konnten.
Verschiedene aufschlussreiche Banden fallen zusammen
oder liegen doch so nahe beieinander, dass eine ein¬
deutige Differenzierung unmöglich ist. Im Hinblick
auf synthetische Untersuchungen und zu Vergleichs¬
zwecken sei aber doch etwas näher auf diese Spektren
eingegangen.
Gewisse Gruppierungen, die erstmals auf ande¬
re Weise nachgewiesen werden konnten, Hessen sich
auch aus den Infrarot-Absorptionsspektren ersehen.
Wo eine Interpretation der Absorptionen möglich war,
wurden die entsprechenden Gruppierungen in die Fi¬
guren eingefügt.
NH- und OH-Pre£uenzen.
Bei den Wasserstoff-Dehnungsschwingungen kann
im Spektrum zwischen OH- und NH-Frequenzen nicht un~
terschieden werden. Im nicht assoziierten Zustand
findet man in folgenden Bereichen Absorptionen:
OH-Banden : 3760-3350 cm-1 NH-Banden : 3470-3050 om
(*) Die Infrarot-Absorptionsspektren wurden von
Herrn A.Hübscher auf einem Baird-"double beam"-
Spektrographen aufgenommen. Die Diskussion der
Spektren verdanke ich Herrn Dr.H.Günthard.
Page 34
-28-
Die assoziierten OH- und HH-Schwingungsbanden variie¬
ren in ihrer Lage stark. Banden von 3330-3030 cm"1
findet man bei Alkoholen, Aminen und Säuren.
Banden dieser Art lassen sich leicht bei Lyco-
marasmin (Fig. 4 und 5), Substanz J (Pig. 6 und 7),
bei den Barium-Salzen dieser beiden Substanzen (Fig.
8 und 9)f bei Glycyl-dehydroalanin (Fig.12) und bei
Sarkosin (Fig.10 und 11) erkennen.
£H-Freç^uen^en.
Diese zeigen sich zwischen 3280 und 2700 cm"1.
In normalen aliphatischen Verbindungen tritt die Ban¬
de gewöhnlich unterhalb 3000 cm-1 auf. Beim Arbeiten
mit "Nujol", das ebenfalls GH-Gruppierungen enthält,
rühren sie naturgemäss teilweise auch von diesem her;
beim Arbeiten mit "Perfluorkerosene" dagegen stammen
sie von der untersuchten Substanz. Die mit "Per- •
fluorkerosene" als Trägersubstanz aufgenommen Verbin¬
dungen Lycomarasmin (Fig. 5)» Substanz J (Fig. 7)
und Sarkosin (Fig. 11) zeigen deutliche CH-Banden.
Int erpretati£n_von_Amiden.
Alle Amide besitzen eine starke Bande bei
1670-1610 cm"1, herrührend von der CarbonylSchwingung.
Unsubstituierte Amide besitzen daneben noch 2-
4 charakteristische Banden, nämlich meistens zwei
Banden in der Gegend von 3330 cm--1- (Dehnungsschwin¬
gung der KHg-Gruppe) und in unmittelbarer H^ihbar-
schaft der Carbonyl-Bande eine weitere, weniger in¬
tensive, meist bei 1620-1560 cm"1 (NH2"Bie6ungB-schwingung).
Die monosubstituierten Amide besitzen ausser
der Carbonyl-Bande eine Absorption bei 3330-3175 cm-1
(NH-Dehnungsschwingung) und eine solche bei 1560-
1515 cm"1 (CN-DehnungsSchwingung).
DiBubstituierte Amide besitzen nur die charak¬
teristische, starke und breite Carbonyl-Frequenz bei
Page 35
-29-
1665-1640 cm-1.
Beim Lycomarasmin (Fig. 4 und 5) und bei Sub¬
stanz J (Fig. 6 und 7) findet man nun gerade in den
für Amide charakteristischen Regionen zahlreiche an¬
dere Banden und ein Entscheid, ob im Lycomarasmin
ein primäres Säureamid vorliegt, ist nicht leicht
zu fällen. In beiden Verbindungen treten zweifellos
-C0-NH- Gruppierungen auf und eine solche lässt sich
auch im Spektrum des Glycyl-dehydroalanins (Fig. 12)
erkennen. Möglicherweise enthält aber das lycomaras¬
min eine primäre Säureamid-Gruppierung, während dies
bei Substanz J unwahrscheinlich ist (vgl. auch die
Diskussion der Spektren der Pikrolonat-Ester von Sub¬
stanz J, S.31).
Interpretatio^vo^Jtainosäure/w
Die Spektren der Aminosäuren werden charakteri¬
siert durch eine Reihe wenig intensiver Banden in der
Gegend von 2900-2500 cm-1 und durch eine Bande in der
Gegend von 2350-2000 cm-1. Alle primären Aminosäuren
zeigen in ihren Absorptionen eine gewisse Regelmässig¬
keit in der Doppelbindungs-Region. In diesem Gebiete
erscheinen drei Banden, die stärkste, hervorgerufen
durch das Carboxylat-Ion, zwischen 1610 und 1560 cm"**.
Die zweite dieser Banden, erheblich schwächer, er¬
scheint zwischen 1637 und 1610 cm-1j die dritte
schliesslich zeigt sich in der Gegend von 1530-
1500 cm-1.
Besonders dem lycomarasmin-Spektrum (Fig. 4
und 5) fehlen die Eigenarten des Aminosäure-Spek¬
trums in den verschiedenen Regionen, wie sie, wenn
auch nicht sehr ausgeprägt, im Spektrum von Glycyl-
dehydroalanin (Fig. 12) zutage treten. Das Spektrum
von Substanz J (Fig. 6 und 7) zeigt dagegen gewis¬
se Aehnlichkeiten mit demjenigen von Sarkosin
(Fig. 10 und 11) in dem für Aminosäuren charakte¬
ristischen Gebiet.
Page 36
-30-
,lnterpre^atip_n_v£n_Säuren und Salzen.
Die Carbonyl-Frequenz der Carboxylgruppe er¬
scheint gewöhnlich in der Gegend von 1750-1690 cm-1.
Die OH-Dehnung der nicht ionisierten Carboxylgruppe
äussert sich in einer breiten Bande mittlerer In¬
tensität zwischen 2900 und 3300 cm"1. Die O-H-Bie-
gungsSchwingung erscheint im Spektrum zwischen
1350 und 1440 cm-1 und die C-O-Dehnungsschwingung
bei 1200-1320 cm-1.
Das ionisierte Carboxyl zeigte die Carbonyl-
Frequenz bei 1550-1625 cm-1 und das Carboxylat-
Syetem erscheint bei 1400-1460 cm-1.
Nicht ionisierte Carboxylgruppen können in
den Spektren von lycomarasmin (Fig. 4 und 5), Sub¬
stanz J (Fig. 6 und 7) und Glycyl-dehydroalanin
(Fig. 12) nachgewiesen werden, nicht dagegen in
denen von Sarkosin (Fig. 10 und 11) und den Barium-
Salzen von Lycomarasmin (Fig. 8) und Substanz J
(Fig. 9)» wobei in letzteren 1 Atom Barium pro
Molekül Säure vorhanden ist. lycomarasmin und Sub¬
stanz J enthalten also im freien Zustand höchstens
zwei nicht ionisierte Carboxylgruppen. Gleichzeitig
kann aus den Spektren ersehen werden, dass Sub¬
stanz J mehr nicht ionisierte Carboxyle als lyco¬
marasmin enthalten dürfte.
Ionisierte Carboxylgruppen enthalten lyco¬
marasmin (Fig. 4 und 5), Substanz J (Fig. 6 und 7),
die Bariumsalze dieser beiden Substanzen (Fig. 8
und 9), Glycyl-dehydroalanin (Fig. 12) und Sarko¬
sin (Fig. 10 und 11).
Vor_handensj»in von Methvlgrupp_en in_Ly_co_maras-
min und Subs^anz^^
Obwohl durch Anwendung von "Perfluorkerosene"
ala Trägersubstanz anstelle von "Nujol" bei Sarkosin
(Fig. 10 und 11) eindeutig das Vorhandensein einer
Page 37
-31-
Methylgruppe bewiesen werden konnte (1380-1420
cm-1), war ein Entscheid bei Substanz J und Lyco-
marasmin nicht möglich. Auf Grund des Spektrums
scheint aber in Lycomarasmin eine Methylgruppe
zu fehlen.
Vorhandensedn .einer £nd^ändigjän_Methy^en-
jjrup]>e_in Subs^anz^j,
Sine endständige Methylengruppe zeigt zwei
charakteristische Banden, die eine bei 1645-1655
ear1 und die andere bei 885-895 cm"1. Im Spektrum
des Glycyl-dehydroalanina (Pig. 12) lassen sich
diese beiden deutlich erkennen; bei Substanz J
(Fig. 6 und 7) ist ein eindeutiger Entscheid nicht
möglich, sehr wahrscheinlich fehlt aber hier diese
Gruppierung.
Di£kussi£n_der_S£ektren der Pitoolonat-Bster
aus jSubs^anz_J_j,
Bei den Pikrolonaten der Methyl- und Aethyl-
ester von Substanz J handelt es sich um die einzi¬
gen kristallisierten Derivate, die bisher von Sub¬
stanz J erhalten wurden. Dabei steht noch nicht
fest, ob es sich bei ihnen um Derivate von Substanz
J oder um Derivate von UmwandlungsProdukten dieser
Verbindung handelt.
Immerhin lassen sich in den Spektren (Fig.
13-15) leicht die Ester-Gruppierungen ( eine Bande
bei 1720-1750 cm'1,die andere bei 1150-1250 cm-1)
erkennen. Die breiten Banden sprechen für das Tor¬
liegen mehrerer Ester-Gruppierungen.
Ebenso klar zeigen sich die für die Gruppie¬
rung -CO-JJH- charakteristischen Frequenzen, nicht
dagegen die für -CO-HH2 spezifischen Banden.
Zwei Banden in der Gegend von 1500 und 1600
cm-i werden durch die Anwesenheit des Benzolringes
Page 38
-32-
hervorgerufen und zwei Banden in der Gegend von
1300-1370 cm-1 und 1500-1600 cm-1 sind durch Ni-
trogruppen bedingt.
Die für eine endständige Methylengruppe
charakteristischen Banden fehlen dagegen.
Auf Grund de£ Sp£ktrumjï in_Lvc£marasmin und
jîubs t; anz_J_fehlende Grupj>ierungen.
Lactone (1820-1760 cm-1), Anhydride (zwei
Banden, bei 1820 und 1770 cm-1) una cyclische Di-
acylimide (zwei Banden, bei 1780 und 1690 cm-1)kommen auf Grund des Spektrums als mögliche Bau¬
einheiten für lycomarasmin und Substanz J nicht in
Frage.
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-35-
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E. TITRATIONEN.
Auf die Frage, wieviele protonenabapaltende
Gruppen eine Aminosäure enthält, geben gewöhnlich
Titrationskurven genauen Aufschluss; oft kann man
sogar aus der Grösse der p^-Werte auf die Art der
protonenabBpaltenden Gruppen schliessen.
Bei lycomarasmin und Substanz J liegen die
Verhältnisse insofern nicht ganz so einfach, weil
die Substanzen zu Beginn der Titration ungelöst
vorliegen; erst im Verlaufe der Laugen-Zugabe
tritt Lösung ein. Dadurch wird natürlich die Ge¬
nauigkeit der Titration und damit der pK~Werte
herabgesetzt. Auf der anderen Seite weiss man
über das Verhalten gewisser protonenabspaltender
Gruppen, wie sie möglicherweise für Lycomarasmin
oder Substanz J in Betracht zu ziehen wären, nichts.
Bei der Titration von Lycomarasmin werden
Page 42
-36-
zwei Aequlvalerite Lauge zur Neutralisation benö¬
tigt. Im Infrarot-Absorptionsspektrum zeigt sich
aber eine Carboxylat-Gruppe und ausserdem ist Ly¬
comarasmin in verdünnter Säure löslich. Es ist
also anzunehmen, dass zu Beginn der Titration mit
Lauge im Lycomarasmin zwei nicht ionisierte Carbo-
xyl-Gruppen, eine Carboxylat-Gruppe und eine Ammo¬
nium-Gruppe rorliegen. Sie Titration des Lycomaras-
mins mit Lauge läset sich also schematisch so for¬
mulieren s
( ^3COOH
COOE
VCOO"
E3Z»
,m\~COOE
X .
COO"
»
. COO" *2
H2I
{,+ 1
KH,
COO"
COO"
COO" *3
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COOE
COO"
1 coo"
H2X
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COO"
COO"
l COO"
HX~—
1HE2
'
coo"
\ coo"
\. coo"
+ B"
+ B+
HZ
Bei der Titration des Lycomarasmins mit Säure
kann noch folgende Reaktion verwirklicht .werden:
{ COOH
COOH
coo-
+ HT { COOH
COOH
COOH
H3I H.r
Page 43
-37-
Aus der Kurve 1 (Fig. 2) können folgende
scheinbare Pg-Werte entnommen werden:
V ~ 3,9 "X /v/4,5 PK* ~9,1^ *3
Auf eine rechnerische Bereinigung dieser
Werte wurde verzichtet.
Bei der Aufnahme der Heutralisations-Kurve
des Lycomarasmins in Gegenwart von Calcium-Ionen
änderte sich ihre Gestalt in charakteristischer
Weise (Kurve 2; Pig. 2). Während der im sauren
Gebiet verlaufende Teil der Neutralisationskurve
durch die Gegenwart des Calcium-Salzes nur wenig
beeinflus8t wird, tritt das dritte Proton nun
nicht mehr bei p 9,1, sondern bereits bei p_ 6,8
aus. Diese Verschiebung konnte auch bei anderen
Salzen, z.B. denen des Kupfers, Nickels, Eisens,
Kobalts und Mangans beobachtet werden: die neu¬
tralen Lycomarasmin-Lösungen wurden durch Zugabe
solcher Salze sauer und das Lycomarasmin zeigt
demnach das gleiche Verhalten wie die von Schwar-
zenbach (72) untersuchten Komplexone. Der Verlauf
der Neutralisations-Kurve in Gegenwart von Calcium-
ionen läset sich zwangslos erklären, wenn man eine
Komplex-Bildung zwischen Lycomarasmin und Calcium
annimmt. Schwarzenbach formuliert den Vorgang in
analogen Fällen wie folgt :
Ca++ X -
HX
fm3C00"
C00"
C00"
NH2.coo<;
coo'
coo"
Ca
CaX
Die Reaktion kann dabei in zwei Teil-Reak¬
tionen zerlegt werden:
Page 44
-38-
HX + HT
Ca++ +
( NH?"
coo"X ,
coo
p
*• coo~_
X CaX
Die aus der Kurve entnommenen p -Werte lie¬
gen bei:
p '/v3,8 p'/v4,4 P' «v6,8a- j^o a,5
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12
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;/ J 2
6
5
4
3
Ti.i i I I I
FIG. 2
2 3 AOUI V.BASE
Pig. 2 Neutralisations-Kurven von lycomaraamin.
Kurve 1: ohne Zusatz
Kurve 2: mit Zusatz von Calciumchlorid
Die Titrationskurve der Substanz J (Kurve 1,
Pig. 3) unterscheidet sich deutlich von derjenigen
Page 45
-39-
des lycomaraamine. Oie ersten beiden Protonen wer¬
den bei der Titration der Substanz J mit Lauge bei
p„ 3,0 reap. 4,5 abgespalten, also noch ähnlich wie
beim Lycomarasmin. Dagegen erfolgt die Abspaltung
des dritten Protons schon bei p„ 7,0. Die Zuordnung
dieser p^-Werte stützt sich auf folgende Tatsachen:
Substanz J enthält auf Grund der chemischen Reaktio¬
nen sicher eine Amino-Gruppe. Daneben sind auf Grund
der Titrations-Kurve noch zwei Carboxyl-Gruppen und
als Gegenstück zur Ammonium-Gruppe eine Carboxylat-
Gruppe vorhanden:
COOH
COOH
COO"
\3,0
*24,5
K3
Eigentümlich berührt dabei die hohe Acidität
der Ammonium-Gruppe. Dass es sich dabei um eine
solche und nicht um eine Carbozyl-Gruppe handeln
muss,also eine Formulierung als
COOH
COOH
COOH
C00~
für Substanz J nicht in Präge kommt, ersieht man
daraus, dass bei der Einwirkung von 1 Mol Barium¬
hydroxyd auf 1 Mol Substanz J ein amorphes Barium-
Salz erhalten wird, das im Infrarot-Absorptions¬
spektrum keine nicht ionisierte Carboxyl-Gruppe
mehr zeigt. Nach obiger Formulierung müsste aber
eine solche noch vorhanden sein.
Schliesslich wurde auch noch das komplexe
Kupfer-Salz von lycomarasmin mit Lauge titriert
(Kurve 2, Fig. 3). Das Salz verhält sich wie eine
Page 46
-40
einbasische Säure (p 'a» 3,8) und die folgende
Formulierung dürfte den Verlauf der Titration
wiedergeben:
NR
X J C00^Cu1 coox
*• COOH h
X
( 2..cooA
1 C00"'
tcoo"
+ HT
Im alkalischen Gebiet dürfte dann eine (we¬
nigstens teilweise) Zersetzung des Kupfer-Komple¬
xes erfolgen, was den nicht geradlinigen Verlauf
der Kurve erklären könnte.
1 2 3 AQUIV.BASE
Fig. 3 Neutralisations-Kurven von Substanz J
(Kurve 1) und des Kupfer-Salzes von Ly-
comarasmin (Kurve 2).
Die Aufnahme der Titrations-Kurven verdanke ich
den Herren Dr.W.Ingold, Dr.O.Häfliger und ff.Frick.
Page 47
-41-
Experimenteller Teil.
Die Neutralisations-Kurve des LycOmarasmins
mit und ohne Calcium-Zusatz wurde mit Hilfe einer
Wasserstoff-Elektrode, diejenigen der Substanz J
und des Kupfer-Salzes von Lycomarasmin mit einer
Glas-Elektrode aufgenommen. Als Base diente in al¬
len Fällen Tetramethyl-ammoniumhydroxyd-Lösung.
F. SALZE VON LYCOMABASMIN ÜKD SUBSTAHZ J.
Um die Einheitlichkeit der beiden isolierten
Verbindungen besser stützen zu können, wurde ver¬
sucht, von Lycomarasmin und Substanz J kristalli¬
sierte Salze herzustellen, die zur Charakterisie¬
rung und eventuell zur Abtrennung der Verbindungen
aus den Kulturlösungen hätten dienen können.
Durch Umsetzung von Lycomarasmin mit Kupfer¬
sulfat und Bariumhydroxyd gelang es, ein gut kri¬
stallisiertes Kupfer-Salz, CqH1,07N,Cu,H2O zu iso¬
lieren. Das daraus mit Hilfe von Schwefelwasser¬
stoff regenerierte Lycomarasmin war in allen sei¬
nen Eigenschaften mit dem früher beschriebenen ana¬
lysenreinen Produkt identisch (58).
Substanz J gab unter analogen Bedingungen ei¬
ne hellblaue, schmierige Masse, leicht löslich in
Wasser, unlöslich in Alkoholen, die im Gegensatz
zur Verbindung aus Lycomarasmin wahrscheinlich ein
Salz und nicht eine Komplex-Verbindung darstellt.
Es ist möglich, dass die Gruppe des Lycoma-
rasmins, die bei der Umwandlung in Substanz J als
Ammoniak abgespalten wird, an der Komplex-Bildung
beteiligt ist.
Bei der Umsetzung von Lycomarasmin mit Ba¬
riumhydroxyd ( 1 Mol : 1 Mol) entstand ein farb¬
loses Pulver, leicht löslich in Wasser, unlöslich
in Alkoholen, das auf Grund der Röntgen-Pulverauf-
Page 48
-42-
nahme amorph ist. Substanz J ergab ein Barium-
Salz mit sehr ähnlichen Eigenschaften.
Versuche, aus Lycomarasmin und Substanz J
andere kristallisierte Salze oder MölBkül-Verbin-
dungen (Pikrate, Helianthate oder Brucinsalze) zu
erhalten, schlugen fehl.
Experimenteller Teil.
Kupfer-Salz von Ly£omarasmin_(58).
277 mg lycomarasmin und 250 mg CuS0.,5 HgOwurden mit 20 cm^ Wasser versetzt. Dabei trat
rasch Lösung des Lycomarasmins, Bildung einer
tiefblauen Farbe und Veränderung des p„ (die Lö¬
sung wurde kongosauer) ein. Sie Lösung wurde nun
mit der berechneten Kenge Bariumhydroxyd-Lösung
versetzt und nach dem Filtrieren im Vakuum über
Schwefelsäure eingeengt. Dabei schieden sich 380
mg tiefblaue Kristalle aus, die zur Analyse noch¬
mals aus Wasser umkristallisiert (Löslichkeit ca.
100 mg /15 cm' Wasser) und im Hochvakuum 20 Stun¬
den bei 55° über Phosphorpentoxyd getrocknet wur¬
den.
3,790 mg Subst. gaben 4,204 mg C02, 1,513 mg HgOund 0,842 mg GuO
3,192 mg Subst. gaben 0,333 cm3 N2 (19°, 733 mm)
C9H1307N5Cu,'H20Ber. C 30,29 H 4,24 Cu 17,83 H 11,78 $
Gef. " 30,28 » 4,47 " 17,75 " 11,76 £
Der Wassergehalt des Produktes blieb bei 3-
tägigem Stehen über Calciumchlorid-Lösung konstant.
Das umkristallisierte Kupfer-Salz wurde mit Schwe¬
felwasserstoff zersetzt, das lycomarasmin zur Ana¬
lyse nochmals aus Natronlauge durch Zusatz von
Salzsäure umgefällt und 16 Stunden im Hochvakuum
bei 60° getrocknet. Zersp. 227-228°.
Page 49
-43-
Hlf0= ~ 46,6° (0= °,48; PH 7' ^spkatpuffer)
3,710 mg Subst. gaben 5,295 mg C02 und 1,810 mg HgO3,137 mg Subst. gaben 0,416 cm^ Ng (20°, 728 mm)
CgH1507N3 Ber. C 38,99 H 5,45 N 15,16 *
Gef. » 38,95 " 5,46 A 14,80 <f>
Das auf diese Weise gereinigte Lyconfarasmin
war in allen seinen Eigenschaften mit dem früher
beschriebenen analysenreinen Produkt identisch.
Barium-Salz von Ly^marasminj,
138,5 mg Lycomarasmin und 157,5 mg Barium-
hydroxyd-oktahydrat wurden zusammen in 20 cm3 Was¬
ser gelöst und die Lösung nach der Filtration im
Vakuum über Kaliumhydroxyd eingedampft. Es bildete
sich eine farblose glasige Kasse, die in Wasser auf¬
genommen und mit Aethanol versetzt wurde. Das Ba¬
rium-Salz des Lycomarasmins fiel in quantitativer
Ausbeute aus. Nach dem Trocknen im Hochvakuum
(16 Stunden bei 50°) wurde mit der Verbindung eine
Eöntgen-Pulveraufnähme ausgeführt. Schwärzungen
zeigten sich nach 4-stündiger Belichtung keine, die
Substanz ist amorph.
Barium-Salz; von £>ubstanz_J_.
Aus 130 mg Substanz J und 157,5 mg Bariumhy-
droxyd-oktahydrat wurde analog wie oben ein Barium-
Salz erhalten, das ebenfalls amorph war.
G. DERIVATE VON LYCOMARASMIN UND SUBSTANZ J.
Zur Peststellung funktioneller Gruppen im Ly¬
comarasmin und in Substanz J konnten infolge der Ns-
tur der Verbindungen (Unlöslichkeit in organischen
Lösungsmitteln, leichter Uebergang von Lycomarasmin
in Substanz J) nur in beschränktem Umfange Umset-
Page 50
-44-
zungen mit den üblichen Reagentien durchgeführt
werden.
Das von Sanger (63,68) zum Kachweis primä¬
rer und sekundärer Amino-Gruppen eingeführte 2,4-
Dinitro-fluor-benzol ergab mit Lycomarasmin nur
unverändertes Ausgangsprodukt zurück, während
mit Substanz J ein gelbes glasiges Derivat ent¬
stand, das nicht kristallin erhalten werden konn¬
te.
3,5-Dinitro-benzoylchlorid und AcetylcM"-
rid bewirkten Inaktivierung des Lycomarasmins.
Die nicht kristallisierbaren Reaktionsprodukte
dürften wenigstens teilweise Derivate der Substanz
J darstellen. Nach der Reaktion mit Acetanhydride
Pyridin unter milden Bedingungen konnte nur un¬
verändertes Lycomarasmin erhalten werden.
Bei der Einwirkung von p-Toluol-sulfochlo-
rid auf lycomarasmin entsteht nach wooHey (87)
ein öliges Tosylat, das das Derivat der Glycyl-
asparaginsäure darstellen soll, indem bei der
Tosylierung ein Bruchstück mit 3 C-Atomen abge¬
spalten wird. Nach unserer Auffassung handelt
es sich bei dieser Verbindung aber eher um ein
Derivat der Substanz J, denn auch bei sorgfäl¬
tigster Untersuchung der Tosylierungs-Produkte
von lycomarasmin konnten ausser p-Toluol-sulfa-
mid keine weiteren Spaltprodukte nachgewiesen
werden. Auch bei der Tosylierung von Substanz J
konnten ausser einem öligen Derivat, das auf
Grund seiner Eigenschaften mit dem oben beschrie¬
benen Produkt aus Lycomarasmin identisch zu sein
scheint, keine weiteren Produkte gefasst werden.
Mit 2,4-Dinitro-phenylhydrazin trat unter
normalen Bedingungen weder mit Lycomarasmin noch
mit Substanz J Reaktion ein.
Bei der Veresterung von Lycomarasmin mit
Page 51
-45-
llethanol und gasförmiger Salzsäure trat Ammoniak-
Abspaltung ein; das Ammoniak konnte mit Pikrolon-
säure als Ammonium-pikrolonat identifiziert wer¬
den.
Bei der Veresterung von Substanz J unter
den gleichen Bedingungen entstand ein in Aether
unlösliches Ester-hydrochlorid, das nach der Ue-
berführung in den Ester mit Pikrolonsäure ein
kristallisiertes Ester-pikrolonat ergab. Nach
den Resultaten der Analyse wurden drei Carboxyl-
gruppen verestert. Durch Einwirkung wässeriger
Natronlauge auf eine alkoholische Lösung des Es¬
ter-pikrolonat es gelang es aber nicht, Substanz J
zu regenerieren; möglicherweise trat neben der
Veresterung eine andere Reaktion ein (z.B. Iso¬
merisierung) .
Schliesslich wurde versucht, lycomarasmin
durch Umsetzung mit Phosphor-oxychlorid zu phos-
phorylieren (36). Nach der Reaktion Hess sich
aber das Ausgangsprodukt unverändert zurückgewin¬
nen.
Experimenteller Teil.
Einwirkung_von_2A4-Dinj.tro-fluor-be_nzol auf Ly-
^marasmin^
110 mg lycomarasmin und 270 mg Natrium-hy-
drogencarbonat wurden in 3 cm3 Wasser gelöst und
eine Lösung von 160 mg 2,4-Dinitro-fluor-benzol
in 6 cm^ Aethanol zugegeben. Nach 20-stündlger
Reaktion (Schütteln) wurde die schwach gelbe Lö¬
sung am Vakuum eingedampft, der Rückstand in we¬
nig Wasser aufgenommen, zur Entfernung des über¬
schüssigen Reagens zweimal mit Aether extrahiert
und die Lösung mit Salzsäure auf p„ 2,6 gebracht.
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Page 53
-47-
60 mg ( s 49 <f> d.Th.) p-Toluol-sulfamid, Smp.
134-136° (die Mischprobe mit einen synthetischen
Präparat, Smp. 135-136°, schmolz bei 134-136°)
isoliert werden.
Die wässerige Lösung gab nach dem Ansäuern
bei sechsmaligem Ausschütteln mit Aethylacetat
150 mg (Ausbeute = 50 #,berechnet als Derivat der
Substanz j) eines farblosen, öligen und wasser¬
löslichen Produktes. Weitere Spaltstücke, insbe¬
sondere solche mit 3 C-Atomen, konnten nicht nach¬
gewiesen werden.
Einwirkung_v£n_p-Toluol-sulfochlorid_auf_Substanz J.
200 mg Substanz J ergaben nach analoger Be¬
handlung 200 mg ( = 60 <f> d.Th.) eines farblosen,
öligen und wasserlöslichen Produktes, das mit dem
Derivat aus Lycomarasmin identisch zu sein scheint.
Weitere Spaltstücke konnten auch hier nicht nachge¬
wiesen werden.
EinwjLrkungjme_thanolis_cher SalZB_äure_ auf Lyc_omarasminj.
100 mg Lycomarasmin wurden in 10 cm' absolu¬
tem Methanol suspendiert und unter Kühlung leitete
man Salzsäure-Gas bis zur Sättigung ein. Nach dem
Abdampfen des Methanols wurde die Veresterung noch
zweimal wiederholt und der Veresterungsrückstand
über Kaliumhydroxyd im Vakuum getrocknet.
Bei der Umsetzung des Veresterungsproduktes
mit Pikrolonsäure (100 mg, gelöst in 10 cm' Aetha-
nol) schieden sich 25 mg dunkelgelbe Kristalle ab,
die zur Analyse nochmals aus Aethanol umkristalli¬
siert und im Hochvakuum 14 Stunden bei 55° getrock¬
net wurden. Zersp. 238-240°.. (In der Literatur
wird für Ammonium-pikrolonat ein Zersp. von 275°
angegeben.
Page 54
-48-
3,659 mg Subst. gaben 5,752 mg G02 und 1,279 mg HgO
C10H11°5H5 Ber# G 42'73 H 3'94 *
Gef. » 42,90 " 3,91 #
Einwirtang_methanoli£Cher ^alz£äur£ auf Sjibstanz^^
400 mg Substanz J wurden in 20 cm' absolutem
Methanol suspendiert und durch Einleiten von Salz¬
säure-Gas wie oben dreimal verestert. Von wenig un¬
veränderter Substanz J (40 mg) wurde abfiltriert.
Das Reaktionsgemisch wog nach dem Trocknen über
Kaliumhydroxyd 640 mg.
Herstellung des Pikrolonat-Esters.
Durch Behandlung mit ammoniakalischem Chlo¬
roform (37) wurde die überschüssige Salzsäure ent¬
fernt und das Ester-hydrochlorid in den Ester über¬
geführt. Nach dem Abfiltrieren des Ammoniumchlorides
und Verdampfen des Chloroforms nahm man in Methanol
auf und versetzte mit einer Lösung von 500 mg Pi-
krolonsäure in 20 cm3 Methanol. Beim Eindampfen
schieden sich 310 mg gelbe feine Nadeln ab, die bei
153-154° schmolzen. Zur Analyse wurde viermal aus
Methanol umkristallisiert und im Hochvakuum 14 Stun¬
den bei 55° getrocknet. Der Smp. stieg dabei auf
161-162°.
3,778 mg Subst. gaben 6,42a mg C02 und 1,482 mg H-O
3,089 mg Subst. gaben 0,410 cm5 N2 (24°, 726 mm)
4,371 mg Subst. verbr. 6,889 cm5 V50-n. HagSpO-C22H26°12N6
Ber. C 46,64 H 4,63 N 14,84 3 0CH3 16'44 *
Gef. '• 46,37 " 4,39 " 14,57 " " 16,30 #
Pikrolonsäure selbst verbraucht bei der Me-
thoxyl-Bestimmung kein Natrium-thiosulfat.
Page 55
-49-
Zersetzung des Pikrolonat-Esters mit Natronlauge.
215 mg Pikrolonat des Methylesters von Sub¬
stanz J wurden in 20 cm? Methanol gelöst und mit
20 cm? 1-n. Katronlauge versetzt. Der gelbe Nie¬
derschlag (Natrium-pikrolonat) wurde nach 5-stün-
digem Schütteln abfiltriert, gut mit Wasser nach¬
gewaschen, die Lösung im Vakuum auf 5 cm? einge¬
engt, mit 1-n. Salzsäure auf pH 2,6 gebracht und
mit 10 cm? Aethanol versetzt. Nach 2-wöchigem
Stehen bei 0° war keine Substanz J ausgefallen.
Auch nach nochmaliger Behandlung mit 25 cm? 1-n.
Natronlauge bei 40° und Ansäuern mit Salzsäure
fiel keine Substanz J aus. im Verteilungs-Chro-
matogramm auf Filtrierpapier zeigte die Lösung
den für Substanz J charakteristischen Flecken
(Kontrolle: Substanz J IL, 0,05) nicht; versetz¬
te man dagegen 1 cm? der Lösung mit 1 cm? konz.
Salzsäure und hydrolysierte man während 7V2 Stun¬
den bei 140-150° im Bombenrohr, so Hessen sich
nach dem Abdampfen und Aufnehmen in 1 cm? Wasser
im Verteilungs-Chromatogramm Asparaginsäure (IL,
0,16; Zontrolle Rp 0,15) und Glycin (Bj, 0,44; Kon¬
trolle R_ 0,46) deutlich nachweisen.
Einwl.rkuj^_aethanoli8cher Salzsäure» auf Substanz^^
400 mg Substanz J wurden in 20 cm? absolutem
Aethanol suspendiert und wie oben verestert. 80 mg
Substanz J blieben unverändert und wurden abfil¬
triert. Das Reaktionsgemisch wog nach dem Trocknen
über Kaliumhydroxyd 540 mg. Das Bster-hydrochlorid
wurde wie oben in den Ester übergeführt und die
aethanolische Lösung mit 500 mg Pikrolonsäure in
20 om? Aethanol versetzt. Beim Eindampfen schieden
sich 220 mg gelbe feine Nadeln ab, die bei 140-141°
schmolzen, zur Analyse wurde viermal aus Aethanol
Page 56
-50-
umkrlstallisiert und Im Hochvakuum 14 Stunden bei
55° getrocknet. Smp. 145-146°. Infrarot-Absorptions¬
spektrum Pig. 14, S.55.
3,828 mg Subst. gaben 6,981 mg C02 und 1,762 mg HgO
C25H32°12N6 Ber* G 49,34 H 5'30 *
Gef. • 49,77 " 5,15 #
Bei einem anderen Ansatz wurde ein Pikrolonat
erhalten, das sich bei 199-200 zersetzte. Zur Ana¬
lyse wurde auch dieses Präparat viermal aus Aethanol
umkristallisiert und im Hochvakuum 14 Stunden bei
55° getrocknet. Zersp. 206-207°. Infrarot-Absorptions¬
spektrum Fig. 15, S.35.
3,734 mg Subst. gaben 6,706 mg C02 und 1,727 mg HgO3,010 mg Subst. gaben 0,364 cm5 H2 (20°, 723 mm)
C25H32°12ir6 Ber* C 49'34 H 5'30 S 13'81 *
Gef. " 49,01 " 5,18 " 13,40 %
Einwirkung_v£n_I^O£phor-£^chlp_rj.d_auf_Iy_co_marasmin.
100 mg Lycomarasmin wurden in einem Dreihals-
Kolben in 1-n. Katronlauge gelöst und bei 0° unter
Rühren im Verlaufe von 3 Stunden eine Lösung von
3 g Phosphor-oxychlorid in 20 cm^ Tetrachlorkohlen¬
stoff und 1-n. Natronlauge so zugetropft, dass die
Lösung immer schwach aUcalisch (Indikator Phenol¬
phthalein) blieb. Die wässerige Lösung wurde hier¬
auf mit 1-n. Salzsäure auf p„ 2,6 gebracht. Nach
12-stündigem Stehen bei 0 hatten sich 90 mg un¬
verändertes Lycomarasmin, Zersp. 220-223°, abge¬
schieden.
H. NACHWEIS-REAKTIONEN ItIT LYCOMARASMIN UND SUB¬
STANZ J.
Lycomarasmin zeigte in vitro sofort eine
Page 57
-51-
starke violette Ninhydrin-Reaktion, die von einer
Ammoniak-Abspaltung herrührt. Substanz J gab mit
Ninhydrin eine charakteristische Gelbfärbung.
Mit Nessler-Reagens (eine Anzahl von Amino¬
säuren reagieren in alkalischer Lösung mit Ness¬
ler-Reagens unter Bildung gelber bis braunroter
Eiederschläge (69)) ergab Lycomarasmin erst beim
Erwärmen einen braunroten Niederschlag während
Substanz J auch dann keine Reaktion zeigte.
Die Jodoform-Reaktion, die mit Lycomarasmin
positiv, mit Substanz J negativ ausfiel, wird un¬
ten nochmals erwähnt.
Sowohl Lycomarasmin wie Substanz J gaben mit
Kercuro- uid Kercuri-nitrat einen weissen Nieder¬
schlag; sie gleichen darin den Amino-dicarbonsäu-
ren (38).
Mit Ferrichlorid ergaben beide Substanzen
keine Farbreaktion. Während Lycomarasmin imstande
war, bei p„ 7 Eisen(lIl)-Ionen als farblosen Kom-n
plex und in 1-n. Natronlauge Gupri-lonen als tief¬
blauen Komplex in Lösung zu halten, fielen bei Sub¬
stanz J die entsprechenden Hydroxyde aus.
Beide Verbindungen nahmen aus wässeriger Lö¬
sung bei p^. 7 rasch Brom auf und entfärbten eine
verdünnte Kalium-permanganat-Lösung.
Die Farbreaktion mit p-Nitrobenzoyl-chlorid
nach Edlbacher und Litvan (22), die bei Aminosäu¬
ren eine blaue, bei Kethyl-aminosäuren eine rote
Färbung ergibt, fiel mit Lycomarasmin und Substanz
J negativ aus. Bei der Einwirkung von 3,5-Dinitro-
benzoyl-chlorid auf Lycomarasmin in alkalischer Lö¬
sung dagegen entstand eine schmutzig rotbraune Fär¬
bung.
Die Sakaguchj.-Reaktion mit llatriumhypochlorit
und cL-Napbthol war bei Lycomarasmin und Substanz J
Page 58
-52-
negativ (67), ebenso die Reaktion auf Kethylke-
tone (Legal-Test).
I. VAU SLYKE-REAKTION MIT LYCOHARAS*;IN UND SUB¬
STANZ J.
Sowohl Lycomarasmin als auch Substanz J ga¬
ben unter normalen Bedingungen keine van Slyke-
Reaktion; eine primäre oL- oder/3-Amino-Gruppe ist
also in keiner der beiden Substanzen vorhanden.
Experimenteller Teil.
Es wurde die übliche (64) Mikroapparatur be¬
nutzt. Sie Substanzen wurden in neutralisierter,
wässeriger Lösung zugegeben. Konzentration ca.
0,6 ft. Die bei einer Schüttelzeit von 5 Minuten
bei 25° erhaltenen Stickstoff-Mengen überstiegen
den Blindwert nicht.
J. JODOFORM-REAKTION.
Lycomarasmin gab bei kurzem Erwärmen auf
60° eine positive Jodoform-Reaktion, Substanz J
dagegen nxcht. Pur Lycomarasmin muss also eine
Gruppierung:
ICH,-C- oder CH,-C-
3 U 3 I0 OH
angenommen werden, oder, was unwahrscheinlicher
ist, die Substanz gab mit dem Reagens eine Ver¬
bindung, die eine dieser Gruppierungen besitzt.
Versuche, nach der Reaktion des Lycomaras-
mins mit alkalischer Jod-Jodkalium-Lösung kristal¬
lisierte Abbauprodukte zu erhalten, schlugen fehl.
Eine C-ilethyl-Bestimmung (44) beim Lycomaras¬
min fiel negativ aus.
Page 59
-53-
Bxperimenteller Tell.
Die Jodoform-Reaktion wurde nach den Anga¬
ben Ton woollejr(87) ausgeführt. Das aus Lycomaras-
min isolierte Jodoform (Smp. 119-120°) war nach
Hlsch-schmelzpunkt (Smp. 119-120°), Geruch und
Aussehen identisch mit einem aus Aceton nach der
gleichen Reaktion erhaltenen Produkt (Smp. 119-
120°).
E. UEBEHPUEHRUNG VON LYCOMARASMIN IN SUBSTANZ J.
Um den Zusammenhang zwischen Lycomarasmin
und Substanz J, der schon bei der Isolierung des
Welkstoffes vermutet wurde, näher zu ergründen,
stellten wir Versuche zur Inaktivierung von Lyco¬
marasmin durch Erwärmen der Substanz in wässeriger
Lösung bei verschiedenem Pg an. Die Reaktion, die
auch mit Hilfe der Verteilungs-Chromatographie an
Filtrierpapier untersucht wurde, scheint in alka¬
lischer Lösung am schnellsten, in neutraler am
langsamsten zu verlaufen.
Analoge Versuche mit Glycinamid und L-Aspara-
gin, wo sowohl die Menge des unveränderten Amides
als auch die der gebildeten freien Aminosäure ab¬
geschätzt werden konnte, zeigten das gleiche Ergeb¬
nis.
Das bei der Umwandlung von Lycomarasmin in
Substanz J gebildete Ammoniak wurde ebenfalls be¬
stimmt. Die Werte erreichten 1 Mol Ammoniak pro
Mol Lycomarasmin nicht ganz. Substanz J konnte
schliesslich in 50-55- prozentiger Ausbeute iso¬
liert werden.
Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass Lyco¬
marasmin eine Säureamid-Gruppierung besitzt, die
bei der Inaktivierung zu Substanz J als Ammoniak
Page 60
-54-
abhydrolysiert wird. Dass dies aber nicht die
einzige Reaktion ist, die sich dabei abspielt,
ergibt sich aus den Analysenwerten, den Ausbeu¬
ten an Substanz J bei der Inaktivierung und dem
Ergebnis der Jodoform-Reaktion.
Experimenteller Teil.
Saure Inaktivierung.
100 mg Lycomarasmin wurden mit 6,23 cm5 1-n.
Salzsäure, 10 cm' Wasser und 5 cm' Aethanol ver¬
setzt, wobei in der Kälte teilweise Auflösung
stattfand. Sie Lösung wurde 2 Stunden im Oelbad
auf 100° erhitzt und nachher zur Destillation
7,7 cm' 1-n. Natronlauge und 10 cm' Aethanol zu¬
gegeben. Das Ammoniak bestimmte man durch Austrei¬
ben und Absorption in 0,1-n. Salzsäure acidime-
trisoh (Indikator Alizarin-sulfosäure). Gef. 0,83
und 0,86 Mol Ammoniak pro Mol CqHjcO,,»,.Die verbleibende Lösung wurde im Vakuum auf
2,5 cm' eingeengt, mit 1-n. Salzsäure auf p„ 2,6
gebracht und mit 20 cuP Aethanol versetzt. Nach
längerem Stehen bei 0° schieden sich 47,6 mg Sub¬
stanz J aus. Ausbeute 51 jtt Zersp. 271-273°.
Neutrale_Inaktiyi.erungJ.
3100 mg Lycomarasmin wurden in 20 cm Wasser
unter Durchleiten von Stickstoff während 6 Stun¬
den auf 110° erhitzt, nach dem Abkühlen 1,5 cm'
1-n. Natronlauge zugesetzt und das Ammoniak wie
oben bestimmt. Gef. 0,76 Mol Ammoniak pro Mol Ly¬
comarasmin.
Die verbleibende Lösung brachte man mit 1-n.
Salzsäure auf p 2,6 und versetzte mit 30 cm' Ae¬
thanol. Nach längerem Stehen schieden sich 45,0 mg
Substanz J aus. Ausbeute 48 $, Zersp. 272-274°.
Page 61
-55-
Alkali£che_Inaktivierung_.
100 mg Lycomarasmin wurden in 25 cnr 0,2-n.
Bariumhydroxyd-Lösung gelöst, die Lösung 2 Stun¬
den auf 90° erwärmt und das Barium mit Schwefel¬
säure ausgefällt. Die Lösung brachte man mit Salz¬
säure auf p„ 2,6 und versetzte mit 20 cm' Alkohol.
Nach längerem Stehen schieden sich 48 mg Substanz J
aus. Ausbeute 51 #• Zur Analyse wurde einmal aus
Natronlauge-Salzsäure umgefällt und im Hochvakuum
20 Stunden bei 80° getrocknet. Zersp. 273-275°.
Wd° = " 115° (C = °'52; PH 7' PQOSPnatPuffer)
3,810 mg Subst. gaben 5,724 mg C0„ und 1,671 mg HpO
C9H12°7N2 Ber* C 41*54 H 4'65 *
Gef. « 41,00 " 4,91 $
Versuche, aus den Mutterlaugen von Substanz J
andere Verbindungen zu isolieren, schlugen fehl.
Nach energischer salzsaurer Hydrolyse (7V2 Stun¬
den bei 140-150°) Hessen sich im Papierchromato-
grairm Asparaginsäure (R_ 0,17$ Kontrolle R_, 0,15)
und Glycin (R_, 0,45; Kontrolle H_, 0,44) nachweisen.
Auch Brenztraubensäure konnte in Spuren mit 2,4-Di-
nitro-phenylhydrazin im Hydrolysat nachgewiesen
werden (Smp. des 2,4-Dinitro-phenylhydrazons 213°).
Verlauf der I.nakjbivie_rung (Papierchromatographie).
In einem Vorversuch wurde festgestellt, dass
sich Substanz J bei 2-stündigem Erhitzen mit Natron¬
lauge auf 90° nicht verändert; immer trat der braun¬
violette Pleck von Substanz J (R„ 0,04) im Papier-
chromatogramm in gleicher Intensität zutage.
30 mg Lycomarasmin wurden in Natronlauge ge¬
löst und die Lösung auf p„ 7 gebracht. Je V3 dieser
Lösung wurde mit V2 cm3 Natronlauge (1-n.), Salz¬
säure (1-n.) und Wasser während 1 Stunde auf 90°
Page 62
-56-
erwärmt. Dann wurden die Proben neutralisiert,
auf 1 cm' verdünnt und im Papierchromatogramm
untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zu¬
sammengestellt .
Je 10 mg Glycinamid und L-Asparagin wurden
mit je V2 cm' Wasser, 1-n. Katronlauge und 1-n.
Salzsäure während 90 Minuten auf 90° erhitzt.
Die Lösungen wurden dann wie oben behandelt und
untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 ent¬
halten.
Tabelle 5.
Untersuchung des Verhaltens von Lycomarasmin,
Glycinamid und L-Asparagin beim Erhitzen wäs¬
seriger Lösungen von verschiedenem pH auf 90°.
p^,-fferte und Inten¬
sität der Flecken
nach der Behandlung
M
neutral
e d i u
sauer
m
alkalisch
Lycomarasmin
1Substanz J
0,26
viel
nichts
0,24
mittel
0,05
mittel
0,25
Spur
0,04
viel
Glyc inamid
1Glycin
0,87
viel
nichts
0,89
z.viel
0,44
Spur
C,88
Spur
0,46
viel
L-Asparagin
L-Asparaginsäure
0,48
viel
nichts
0,47
z.viel
0,15
Spur
0,49
Spur
0,16
viel
Page 63
-57-
L. DIS SAURE HYDROLYSE VON LYCOMARASMIN UND
SUBSTANZ J (58,87).
lycomarasmin und Substanz J erwiesen sich
gegen salzsaure Hydrolyse als überraschend resi¬
stent. Bei Substanz J konnte eine vollständige
Spaltung, die durch Bestimmung des Verhältnisses
van Slyke-Stickstoff zu Total-stickstoff kontrol¬
liert wurde, erst nach längerem Erhitzen mit kon¬
zentrierter Salzsäure im Einschlussrohr auf 145°
erzielt werden. Eine Probe des so erhaltenen Hy-
drolysates wurde nach dem Verfahren von Wieland
(83) an einer mit Salzsäure vorbehandelten Säule
von Aluminiumoxyd in neutrale und saure Aminosäu¬
ren aufgetrennt. Die Hälfte des ursprünglich vor¬
handenen Stickstoffs konnte dabei im Filtrat (Ami-
no-monocarbonsäuren) nachgewiesen werden, während
die andere Hälfte sich erst mit Natronlauge eluie-
ren liess (Amino-dicarbonsäuren). In Uebereinstim-
mung mit diesem Befunde wurde bei der präparati-
ven Aufarbeitung aus dem Hydrolysat Asparaginsäu-
re als Kupfer-Salz und Glycin als 3,5-Dinitro-
benzoat und als freie Aminosäure erhalten. Die ge¬
mäss der Bruttoformel Gcfl-\2C1^2 fehlenaen 5 G-Ato-
me Hessen sich beim Kochen der Substanz J mit
2,4-Dinitro-phenylhydrazin und 2-n. Salzsäure in
Form des Dinitro-phenylhydrazons der Brenztrauben-
säure, das allerdings nur in sehr geringer Ausbeu¬
te entstand, fassen.
Die in etwas abgeänderter Weise durchgeführ¬
te Hydrolyse von Lycomarasmin gab ähnliche Resul¬
tate. Brenztraubensäure wurde als Dinitro-phenyl-
hydrazon in Ausbeuten bis zu 37 1° isoliert, wäh¬
rend ein Modellversuch - Behandlung von Brenz¬
traubensäure mit Salzsäure unter gleichen Bedin-
Page 64
-58-
gungen - nur eine Ausbeute von 14 # ergab. Fer¬
ner wurden 1 Kol Stickstoff als Ammoniak, 0,9 Kol
als K-2,4-Dinitro-phenyl-glycin (63,68) und 0,54
Hol als H-2,4-Dinitro-phenyl-asparaginsäure er¬
halten. Da wir bei der Herstellung eines Ver¬
gleichspräparates von H-2,4-Dinitro-phenyl-L-aspa-
raginsäure ebenfalls nur Ausbeuten von ca. 60 $
erzielen konnten, so ist anzunehmen, dass alle
Spaltprodukte annähernd quantitativ erfasst wur¬
den.
Dies wurde inzwischen auch von woolley (87)
bestätigt, der die Aminosäuren nach der Hydrolyse
mikrobiologisch bestimmte.
Die aus dem Hydrolysat isolierte E-2,4-Dini-
tro-phenyl-asparaginsäure erwies sich als praktisch
vollständig racemiaiert. Da ein Modellversuch zeig¬
te, dass L-Asparaginsäure unter den eingehaltenen
Hydrolysen-Bedingungen ebenfalls sehr weitgehend
racemisiert wird, so kann die Präge nach der Kon¬
figuration der Asparaginsaure-Molekel im Lycomaras-
min nicht beantwortet werden (vgl. dazu S. 70).
Woolley- (89) hat vor einiger Zeit darauf
hingewiesen, dass die bei der Hydrolyse von Lyco-
marasmin auftretende Brenztraubensäure sekundär
aus Serin entstanden sein könnte. Er hat ferner
gezeigt, dass synthetische Seryl-glycyl-aspara-
ginsäure, mit Lactobacillus casei getestet, wie
Lycomarasmin eine gewisse Anti-Strepogenin-Wir-
kung (74,89-92) aufweist. Eine Konstitution mit
endständigem Seryl-Rest kommt Jedoch für Lycoma¬
rasmin aus verschiedenen, später beschriebenen
Gründen kaum in Frage.
Um aber wenigstens zu prüfen, ob Serin über¬
haupt bei der Hydrolyse von Lycomarasmin oder Sub¬
stanz J auftritt, wurden diese beiden Substanzen
der Hydrolyse nach drei sehr verschieden energi-
Page 65
-59-
schen Methoden unterworfen und die Reaktionspro¬
dukte nach Gonsden et al. (14,17) auf Filtrier-
papier chromatographisch untersucht. Dabei konn¬
ten in keinem Falle irgendwelche Anzeichen für
die Anwesenheit von Serin oder Isoserin im Hydro-
lysat gefunden werden, während in Modellversuchen
mit Serin und isoserin diese beiden Aminosäuren
nach den bei 145° durchgeführten Hydrolysen weit¬
gehend unverändert blieben. Nach der salzsauren
Behandlung von Serin konnte erwartungsgemäss in
geringer Ausbeute Brenztraubensäure nachgewiesen
werden.
Die Versuche bestätigten ferner die Tatsa¬
che, dass Lycomarasmin zwar sehr rasch in Substanz
J übergeht, dass diese aber gegen weitere Hydrolyse
recht resistent ist. Leider zeigte es sich dabei
auch, dass eine partielle Hydrolyse des Lycoma-
rasmins zu Dipeptiden wohl kaum durchführbar sein
dürfte, ja es erhebt sich in diesem Zusammenhan¬
ge schon die Frage, ob Lycomarasmin überhaupt ei¬
ne Peptid-Bindung enthält.
Experimenteller Teil.
Hydroly_se_ von Subs^anz^j^
1. Hydrolysen-Geschwindigkeit.
100 mg Substanz J wurden in 12 cm' konzen¬
trierter Salzsäure am Rückfluss gekocht. Nach 6,
20 und 30 Stunden wurde je 1 cm' für eine Stick¬
stoff-Bestimmung nach K.leldahl und 1 cm' für eine
Amino-Stickstoff-Bestimmung nach van Slyke (Schüt¬
telzeit 5 Minuten bei 20°) auspipettiert. Das Ver¬
hältnis van Slyke-E zu Total-H war: 0,082 nach 6-
stündiger Hydrolyse, 0,240 (20 Stunden) und 0,368
(30 Stunden).
Page 66
-60-
2. Bestimmung der Stickstoff-Vert
71,2 mg eines Präparates von Substanz J, das
10,41 £ Xotal-Stickstoff enthielt (bestimmt nach
Kjeldahl sowie nach Dumas, ber. 10,77 $>), wurden
in 2 cm' konzentrierter Salzsäure im Einschluss¬
rohr bei 140° hydrolysiert. Die Lösung wurde schon
nach kurzer Zeit gelbbraun und schied wenige schwar¬
ze Flocken aus. Nach 53 Stunden wurde das Bohr ge¬
öffnet und die Lösung quantitativ filtriert. Das
Filtrat wurde im Vakuum über Kaliumhydroxyd ein¬
gedampft, der Bückstand mit 1-n. Natronlauge neu¬
tralisiert und die Lösung mit Wasser auf 25 cm'
gebracht. Zur Kjeldahl- und van Slyke-BeStimmung
wurden zweimal je 2 cm' entnommen. Weitere 15 cm'
wurden durch eine Säule aus 6 g Aluminiumoxyd
(nach Wieland (83) mit Salzsäure vorbehandelt)
filtriert. Die Säule wurde anschliessend mit 50 cm'
Wasser gespült und dann mit 20 cm' 0,5-n. Natron¬
lauge + 30 cm' Wasser eluiert. Filtrat und Eluat
wurden angesäuert, eingedampft, neutralisiert und
auf je 10 cm' gebracht. Zur Kjeldahl- und van
Slyke-Bestimmung wurden wieder zweimal je 2 cm'
auspipettiert. Die Resultate sind in Tabelle 6
zusammengefasst.
Tabelle 6.
Stickstoff-Verteilung bei der Hydrolyse von
Substanz J.
Vor Hydrolyse
<f> N
Hydrolysat
$> N
Filtrat
JA N
Eluat
$ N
Total-N
Amino-N
100
0
97,5
98,5
51,5
57,0
46,5
45,0
Die Resultate sind innerhalb der Fehlergren¬
ze der Methode in üebereinstimmung mit der Annahme,
Page 67
-61-
dass bei der Hydrolyse je 1 Mol Amino-dicarbon-
säuren und Amino-monocarbonsäuren gebildet wur¬
den (*).
3. Isolierung und Identifizierung der Hydrolysen-
Produkte.
Zur Isolierung und Identifizierung der ent¬
standenen Hydrolysen-Produkte mussten Hydrolysate
verwendet werden, die nach späteren Srfahrungen
nicht völlig hydrolysiert waren. Die nachstehend
beschriebenen Resultate wurden mit einem Ansatz
von 160 mg Substanz J erzielt, der mit 5 cm* konz.
Salzsäure 18 Stunden im Einschlussrohr bei 140°
behandelt worden war. Das gelbbraune Hydrolysat
wurde durch Filtration von wenigen schwarzen Flok-
ken befreit und im Vakuum zur Trockene eingeengt.
Die Hydrochloride wurden nun mit 1 g Kupfer(II)-
hydroxyd und 25 cm' Wasser kurz gekocht und fil¬
triert. Der Rückstand wurde mit kochendem Wasser
mehrmals ausgewaschen und Filtrat und Waschwasser
auf 10 cm3 eingedampft. Durch Fällen mit 100 cm'
Aethanol fielen 80 mg blaues Kupfer-Salz aus. Die¬
ses wurde in Wasser durch Zugabe von 1 Tropfen
konz. Salzsäure gelöst, die Lösung mit Kupfer(II)-
carbonat gekocht und filtriert.
Asparaginsäure. Aus dem Filtrat schieden
sich 30 mg Kupfer-aspartat aus, welches abfiltriert
und durch Lösen in viel Wasser und starkes Einen¬
gen umkristallisiert wurde. Das so erhaltene Prä¬
parat wurde abgenutscht, mit Wasser und Aethanol
gewaschen und zur Analyse zwei Tage im Vakuum über
Galciumchlorid getrocknet.
(*) äs ist darauf hinzuweisen, dass Glycin etwas
zu hohe Amino-Stickstoff-"Werte gibt (42).
Page 68
-62-
3,806 mg Subst. gaben 2,475 mg COg, 1,619 mg HgOund 1,086 mg CuO
3,511 mg Subst. gaben 0,162 cm3 N2 (19°, 720 mm)
C4H504NCu, 4,5 H20Ber. G 17,42 H 5,12 Cu 23,06 N 5,08 $
Gef. « 17,75 " 4,76 " 22,80 " 5,11 $
Die Ausbeute entspricht nur ca. 15 i> d.Th.
(berechnet für 1 Mol Asparaginsäure pro Mol CgH120„N2).Glycin. Das wässerig-alkoholische Filtrat
der Kupfer-Salz-Fällung wurde auf 10 cm3 eingedampft,
üeber Nacht schieden sich feine Kristalle eines
zweiten Kupfer-Salzes aus. Sie wurden abfiltriert
(12 mg), mit wenig Wasser und Aethanol gewaschen,
in Wasser gelöst und das Kupfer mit Schwefelwas¬
serstoff gefällt. Das Filtrat wurde eingedampft
und im Hochvakuum sublimiert. Das Sublimat (5,1 mg)
zersetzte sich nach Braunfärbung bei 233-236°.
2,768 mg Subst. gaben 3,234 mg G02 und 1,668 mg HgO1,501 mg Subst. gaben 0,249 cm? N2 (17°, 718 mm)
C2H502N Ber. C 32,00 H 6,71 K 18,66 <f>
Gef. » 31,88 » 6,74 " 18,45 #
Die Kutterlaugen des Glycin-Kupfers wurden
mit Schwefelwasserstoff behandelt, das Filtrat vom
Schwefelwasserstoff befreit und nach dem Eindampfen
mit 3,5-Dinitro-benzoylchlorid nach Saunders (70)
acyliert. Ausbeute 20 mg eines Dinitro-benzoyl-
Derivates vom Smp. 174-175°• Zur Analyse wurde aus
Wasser umkristallisiert und im Hochvakuum 12 Stun¬
den bei 110° getrocknet. Smp. 174-176°, Misch¬
schmelzpunkt mit synthetischem 3,5-Dinitro-ben-
zoyl-glycin (Smp. 176-178°) 175-177°.
3,772 mg Subst. gaben 5,563 mg C02 und 0,887 mg H202,832 mg Subst. gaben 0,400 cm? K? (18°, 708 mm)
Page 69
-63-
CgRyy^ Ber. C 40,16 H 2,62 H 15,61 JE
Gef. - 40,25 " 2,63 " 15,44 <f>
Die Ausbeute an Glycin, als Glycin-Kupfer
und Dinitro-benzoyl-glycin isoliert, entspricht
ca. 25 $> d.Th. (berechnet für 1 Mol Glycin pro
Mol CgH1207K2).Brenztraubensäure. 40 mg Substanz J wurden
14 Stunden mit der gleichen llenge 2,4-Dinitro-
phenylhydrazin-hydrochlorid und 7 cm' 2-n. Salz¬
säure gekocht. Nach 12-stündigem Stehen hatten
sich 2,0 mg Kristalle eines roten Dinitro-phe-
nylhydrazons Zersp. 210-212° gebildet. Diese wur¬
den abfiltriert und das Filtrat nach Zugabe von
2 cm3 konz. Salzsäure 15 Stunden weitergekocht,
wobei noch 4,5 mg Dinitro-phenylhydrazon vom glei¬
chen Zersp. erhalten wurden. Die beiden Präparate
waren in kaltem Wasser fast unlöslich. Sie lösten
sich leicht in 0,01-n. Katronlauge. Die alkali¬
sche Lösung wurde mit Benzol geschüttelt, das Ben¬
zol abgetrennt und die wässerige Schicht nach dem
Ansäuern nochmals mit Benzol geschüttelt. Die
Benzol-Schicht wurde getrocknet und eingeengt.
Das Dinitro-phenylhydrazon schied sich dabei in
Form kleiner, gelber Kristalle ab. Zersp. 212-213°,
Mischschmelzpunkt mit Brenztraubensäure-dinitro-
phenylhydrazon (Zersp. 215-216°) 214-215° (unter
Zersetzung). Kit alkoholischer Natronlauge gaben
beide Präparate eine starke tiefrote Färbung.
Eydroly_se_ von Lycomarasjnin^
260 mg Lycomarasmin wurden mit 10 cm' kon¬
stant siedender Salzsäure 8V2 Stunden im Ein-
schlussrohr auf 140-150° erhitzt. Anschliessend
wurde das Hydrolysat unter Vorschaltung einer mit
Trockeneis gekühlten Vorlage im Vakuum eingedampft,
Page 70
-64-
zweimal mit Wasser versetzt und wieder eingeengt.
1. Aufarbeitung und Identifizierung der Brenztrau-
beneäure.
Das in der Vorlage angefallene Kondensat
versetzte man mit 120 mg 2,4-Dinitro-phenylhydra-
zin, gelöst in 10 cm' heisser 2-n. Salzsäure. Vom
ausgeschiedenen Derivat wurde abfiltriert, dieses
mit wenig Wasser gewaschen und dann direkt auf dem
Filter mit 5 cm' 2-n. Natriumcarbonat-Lösung gelöst.
Das alkalische Filtrat wurde angesäuert, der gelbe
Eiedersehlag zentrifugiert und dreimal, mit 2 cm'
Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen im Hochvakuum
(3 Stunden bei 70°) wog der Niederschlag 70 mg.
Ausbeute 28$ d.Th. Zersp. 213-217°.
Zur Analyse wurde das Hydrazon aus Aethyl-
acetat umkristallisiert und im Hochvakuum während
14 Stunden bai 65° getrocknet. Zersp. 213-214°,
Mischprobe mit synthetischem Brenztraubensäure-
dinitro-phenylhydrazon (Zersp. 215-217°)217°.
3,755 mg Subst. gaben 5,577 mg C02 und 1,005 mg HgO2,004 mg Subst. gaben 0,369 cm' Ng (16°, 726 mm)
CgH806N4 Ber. C 40,30 H 3,Cl N 20,89 $
Gef. » 40,52 " 3,00 » 20,77 #
Andere Hydrolysen ergaben Ausbeuten von 18,
37 und 17 # an Brenztraubensäure-dinitro-phenyl-
hydrazon.
Modellversuch. 92 mg frisch destillierte
Brenztraubensäure wurden mit 5 cm' konstant sie¬
dender Salzsäure 8 Stunden bei 150° im Einschluss¬
rohr erhitzt. Die Lösung war bräunlich geworden
und enthielt ebenfalls einige Flocken. Bei glei¬
cher Aufarbeitung wie oben erhielt man 55 mg
Brenztraubensäure-dinitro-phenylhydrazon. Ausbeu¬
te 14 $, d.Th.
Page 71
-65-
2. Bestimmung der Stickstoff-Verteilung.
Ammoniak. Der Hydrolysen-Rückstand wurde
in Wasser aufgenommen, von braunschwarzen Flok-
ken abfiltriert und auf 25 cm' gebracht. Davon
wurden 10 cm' entnommen, mit 10 cm' Wasser und
10 cm''Aethanol, 2 Tropfen Phenolphthalein-Lö-
sung und 5 Spatelspitzen Calciumhydroxyd ver¬
setzt und das Ammoniak durch Austreiben und Ab¬
sorption in 0,1-n. Salzsäure acidimetriach be¬
stimmt (Indikator AIizarin-sulfosäure)(41).
Gef. 1,06 Mol pro Mol CgH^O,,!!,. In der rest¬
lichen Lösung (15 cm') wurde das Ammoniak in
gleicher Weise bestimmt: Gef. 1,02 Mol. Andere
Hydrolysen ergaben 1,00; 1,03; 0,99 Mol Ammoniak.
Aminosäuren. Die vereinigten, von Ammoniak
befreiten Lösungen wurden mit CO« gesättigt, im
Vakuum auf 10 cm' eingedampft, filtriert und auf
25 cm' gebracht. Davon wurden zweimal je 2 cm'
zur van Slyke-Bestimmung verwendet (Schüttelzeit
5 Minuten). Gef. 1,97 Mol Amino-Stickstoff pro
Mol CqHjcCUN,. Die restliche Lösung wurde zur
Trockene eingedampft, mit Natronlauge auf pg 7
gebracht, nach Turba (77) an 30 g Aluminiumoxyd
chromatographiert und mit 120 cm' Wasser nachge¬
waschen. Das Filtrat, welches die neutralen Ami¬
nosäuren enthält, wurde im Vakuum eingedampft und
auf 25 cm' gebracht. Davon wurden zweimal 2 cm'
zur van Slyke-Bestimmung verwendet. Gef. 1,05 liol
Amino-Stickstoff pro Mol CgH^C,!!,. Die Säule
wurde ausgestossen und in 6 Portionen mit total
200 cm' 0,05-n. Katronlauge gewaschen. Das Sluat
enthielt 0,62 Fol Amino-Stickstoff pro Kol einge¬
setztes Lycomarasmin. Dieser niedrige Wert ist
wahrscheinlich auf eine unvollständige Elution
Page 72
-66-
der Amino-dicarbonsäuren zurückzuführen.
3. Identifizierung von Glycin und Asparaginsaure.
503 mg Lycomarasmin wurden mit 19 cm' kon¬
stant siedender Salzsäure 8 Stunden im Einschluss¬
rohr auf 140-150° erhitzt, die Lösung wie oben am
Vakuum eingedampft und mit Wasser auf 50 cm' ge¬
bracht. Eine Probe der schwach gefärbten Lösung
wurde zur Prüfung auf optische Aktivität zweimal
durch wenig Tierkohle filtriert. Es konnte jedoch
keine Drehung beobachtet werden. Der Rest der Lö¬
sung wurde zuerst alkalisch eingeengt, dann sauer
zur Trockene eingedampft, mit Natronlauge auf pH 7
gebracht und an 40 g Aluminiumoxyd (mit Salzsäure
nach Wieland (83) vorbehandelt) chromatographiert.
Glycin. Aus dem durch Nachwaschen mit 160 cm'
Wasser erhaltenen Filtrat wurde durch Umsetzung
mit 2,4-Dinitro-fluor-benzol nach Sanger (63,68)
das N-2,4-Dinitro-phenyl-Derivat des Glycins er¬
halten. Ausbeute 380 mg = 0,9 Mol Glycin pro Kol
C9H15°7NV Zur A0811*88 wurde dreimal aus Methanol
umkristallisiert und im Hochvakuum 12 Stunden bei
25° und 6 Stunden bei 65° getrocknet. Zersp. 197-
198°. Kischprobe mit einem synthetischen Vergleichs-
präparat (Zersp. 197,5-198°) Zersp. 197-198°.
3,880 mg Subst. gaben 5,645 mg GOg und 0,955 mg HgO2,610 mg Subst. gaben 0,408 cm' Ng (19°, 732 mm)
C8H706N3 Ber. C 39,84 H 2,93 N 17,43 %
Gef. » 39,70 " 2,76 » 17,60 #
Asparaginsaure. Die Säule wurde anschlies¬
send mit total 200 cm' 0,5-n. Natronlauge behan¬
delt, das Eluat angesäuert und im Vakuum einge¬
dampft. In gleicher Weise wie oben wurde das N-
2,4-Dinitro-phenyl-Derivat hergestellt. Ausbeute
Page 73
-67-
285 mg = 54 <f>, während im Modellversuch (s.u.)
58 j5 erhalten wurden. Zur Analyse wurde viermal
aus Aether-Petrolaether umkristallisiert und im
Hochvakuum 12 Stunden bei 60° getrocknet. Zersp.
194-197°. Mischprobe mit synthetischer N-2,4-
Dinitro-phenyl-D,L-asparaginsäure (Zersp. 191-
193°) (Tabelle 7, Nr. 1) Zersp. 192-194°.
4,220 mg Subst. gaben 6,175 mg COg und 1,198 mg KgO3,034 mg Subst. gaben 0,383 cm5 N2 (21°, 723 mm)
C 40,14 H 3,03 N 14,05 #
Gef. » 39,93 " 3,18 " 13,95 #C10H9°8N3 Ber*
Beim isolierten Derivat konnte keine Dre¬
hung festgestellt werden; zum Vergleich wurde
2,4-Dinitro-phenyl-L-asparaginsäure hergestellt.
Ausbeute 60 #, Zersp. 194-195° (Tabelle 7, Nr. 4).
120 mg L-Asparaginsäure wurden 8 Stunden
im Binsehlussrohr mit 10 cm' konstant siedender
Tabelle 7.
Eigenschaften isolierter und synthetischer
N-2,4-Dinitro-phenyl-asparaginsäuren.
Dinitro-phenyl-Derivat Zersp. wr c (EtOH)
1. aus D,L-Asparagin¬säure 191-193° __
am
2. aus Hydrolyse von
Lycomarasmin 194-197°.
nicht
beobachtb. 0,72
3. aus Modell-Kydro-lyse 193-194° + 4° 0,72
4. aus L-Asparagin-säure 194-195° + 18° 0,77
5. aus Hydrolyse des
DNPh-Derivates von
Substanz J (S. 72) 193° + 16° 0,69
6. aus Oxydation von
Lycomarasmin mit
KI.'in04 (S. 92) 193-194° + 18° 0,66
Page 74
-68-
Salzsäure auf 140-150° erhitzt. Dabei sank die
spezifische Drehung von + 28,5° auf + 3,5°. Das
wie üblich hergestellte 2,4-Dinitro-phenyl-Deri-
vat schmolz bei 193-194° (Zers.). Ausbeute 58 #
(Tabelle 7, Nr. 3).
Hydrol£S£n-Ve_rsuch£ unter Verwendung_der_Ver^e^-
l.ung£-Çhroma£ographie auf Filtriergajgier (14,17).
1. Versuch zur partiellen Hydrolyse von Lycoma-
rasmin (18).
26 mg Lycomarasmin wurden in 1 cm? konz.
Salzsäure und 1 cm? Eisessig gelöst und im Ther¬
mostat bei 37° hydrolysiert. Nach bestimmten Zeit¬
intervallen wurden der Hydrolysen-Lösung Proben
von 5 mm? entnommen, diese auf einem Objektträ¬
ger mit Hohlschliff im Vakuum bei 20° über Kalium¬
hydroxyd eingedampft, dann mit 5 mm? Wasser ver¬
setzt und auf das Filtrierpapier gegeben. Die er¬
ste Probe (Hydrolysen-Dauer 26 Stunden) zeigte im
Verteilungs-Chromatogramm einen deutlichen braunen
Fleck mit Rp 0,05 (Kontrolle: Substanz J; R_ 0,04).
Das gleiche Resultat wurde auch nach einer Hydro¬
lysen-Dauer von 17 Tagen gefunden. Demnach wird
bei der partiellen salzsauren Hydrolyse leicht
Substanz J gebildet, die unter diesen Bedingungen
nicht oder nur sehr langsam weiter hydrolysiert
wird.
2. Hydrolyse von Lycomarasmin mit 1-n. Salzsäure.
20 mg Lycomarasmin wurden in 20 cm? 1-n.
Salzsäure gelöst und am Rückfluss gekocht. Pro¬
ben zu 1 cm3 wurden im Vakuum über Kaliumhydroxyd
eingedampft, in 0,1 cm? Wasser aufgenommen und
von dieser Lösung 5 mm? auf das Filtrierpapier
gegeben. Nach 1-stündiger Hydrolyse erhielt man
im Verteilungs-Chromatogramm einen deutlichen
braunen Fleck mit Rg 0,04 neben zwei schwächeren
Page 75
-69-
lila Flecken mit R_, 0,17 und 0,46. (Kontrollen:
Substanz J R_, 0,04; D,I-Asparaginsäure Rp 0,15;
Glycin fi-, 0,45). Kach 54-stündigem Kochen war
der der Substanz J entsprechende Fleck (R_ 0,03)
fast vollständig verschwunden, während das Gly¬
cin (iL, 0,43) und die Asparaginsäure (Rg, 0,16)
deutlich in Erscheinung traten.
3. Hydrolyse von Lycomarasmin und Substanz J
mit konstant siedender Salzsäure bei 150°.
Je 10 mg Lycomarasmin und Substanz J wurden
mit 1 cm-5 konstant siedender Salzsäure im Ein¬
schlussrohr während 7V2 Stunden bei 145-150° hy¬
dro lysiert. Kach beendeter Hydrolyse wurde die
überschüssige Salzsäure im Vakuum über Kalium¬
hydroxyd entfernt. Die Hydrochloride nahm man
in 1 cm5 Wasser auf und verwendete davon 5 mm'
für Verteilungs-Chromatogramme. Aus diesen ging
hervor, dass die energische salzsaure Hydrolyse
der beiden Verbindungen nur zwei Aminosäuren,
Asparaginsäure, R-, 0,15 (Kontrolle R_, 0,16) und
Glycin, Rj, 0,42 (Kontrolle R^ 0,41) liefert.
Modellversuch. 130 mg D,L-Serin wurden mit
4 cm' konstant siedender Salzsäure während 7V2
Stunden im üinschlussrohr auf 140-150° erhitzt.
Die Lösung wurde dann unter Vorschaltung einer
mit Trockeneis gekühlten Vorlage im Vakuum ein¬
gedampft, zweimal mit Wasser versetzt und wieder
eingeengt. Das in der Vorlage angefallene Konden¬
sat versetzte man mit 120 mg 2,4-Dinitro-Phenyl¬
hydrazin, gelöst in 10 cm' heisser 2-n.Salzsäure.
Das entstandene Hydrazon wurde in der bei der Hy¬
drolyse des Lycomarasmins angegebenen Weise ge¬
reinigt und getrocknet. Der Eiederschlag wog 60 mg.
Ausbeute 18 i«, Zersp. 213-214°. Mischprobe mit
synthetischem Brenztraubensäure-dinitro-phenyl-
Page 76
-70-
hydrazon (Zersp. 215-216°) Zersp. 214-215°.
Der Eindampfrückstand wurde in 5 cm' Wasser
aufgenommen und davon 5 mm' für ein Verteilungs-
Chromatogramm verwendet. Neben dem für Serin cha¬
rakteristischen Fleck S-, 0,38 (Kontrolle D,L-Serin
IL, 0,37) ergab sich ein solcher mit IL, 0,57, der
von ei -Alanin herrühren dürfte (Kontrolle L-«t -Ala¬
nin Ej, 0,57).
10 mg D,I-Isoserin wurden mit 1 cm' konstant
siedender Salzsäure analog behandelt. Im Vertei-
lungschromatogramm zeigte sich deutlich der für
isoserin charakteristische braunviolette Fleck
mit E_ 0,42 (Kontrolle: D,L-Isoserin R^ 0,44).
Sowohl Serin wie Isoserin wurden unter den
beim Lycomarasmin angewandten Hydrolysen-Bedin¬
gungen keineswegs vollständig zerstört; sie lies-
sen sich im Papierehromatogramm nachher eindeutig
nachweisen.
M. SAUEJä HYDROLYSE VON DERIVATEN DER SUBSTANZ J.
Woolley (87) erhielt bei der sauren Hydroly¬
se einer Tosyl-Verbindung, hergestellt durch Tosy-
lierung von Lycomarasmin in der Wärme, Tosyl-gly-
cin und Asparaginsäure. Ueber den Verbleib des
fehlenden Spaltstückes mit 3 C-Atomen sagt er
nichts aus, ist aber der Ansicht, dass es bei der
Tosylierung abgespalten wurde.
Die Versuche wurden mit einer aus Substanz J
erhaltenen flüssigen Tosyl-Verbindung (vgl. S. 47)
wiederholt und die Resultate von Woolley konnten
bestätigt werden. Auch in diesem Falle gelang es
bei der Hydrolyse mit einem Salzsäure-Ameisensäu-
re-&emisch nicht, die fehlenden 3 G-Atome zu fassen.
Tosyl-glycin und Asparaginsäure, letztere als N-
Page 77
•71-
2,4-Dinitrophenyl-Derivat, konnten nach der Hydro¬
lyse isoliert werden. Das Derivat der Asparagin¬
säure war dabei optisch aktivt die Asparaginsäure
liegt im Lycomarasmin in der natürlichen I-Porm
vor.
Bei der Hydrolyse des öligen N-2,4-Dinitro-
phenyl-Derivates aus Substanz J mit einem Salzsäu¬
re-Ameisensäure-Gemisch erhielt man Asparaglnsgure,
nicht aber Glycin. Bekanntlich wird N-2,4-Dinitro-
phenyl-glycin bei energischer saurer Behandlung
weitgehend zerstört (65,66), ohne dass sich dabei
Glycin bildet. Auch in diesem Falle erwies sich
das K-2,4-Dinitrophenyl-Derivat der Asparaginsäure
als optisch aktiv. Weitere Verbindungen konnten
nicht isoliert werden. Aus diesen Hydrolysen-Ver¬
suchen geht hervor, dass das Stickstoff-Atom des
Glycins in der Substanz J nicht peptidisch gebun¬
den vorliegt; es muss vielmehr mindestens ein sub¬
stituierbares Wasserstoff-Atom tragen. Das Stick¬
stoff-Atom der Asparaginsäure scheint dagegen sehr
wahrscheinlich peptidisch gebunden zu sein. Eigen¬
tümlich berührt die Tatsache, dass es auch hier
nicht gelang, die drei fehlenden C-Atome in irgend¬
einer Form nachzuweisen.
Experimenteller Teil.
In einem Vorversuch wurde festgestellt, dass
sich bei 8-stündiger Behandlung von 2,4-Dinitro-
phenyl-D,L-Asparagin8äure und -Glycin mit 5-n.
Salzsäure bei 140-150° im Einschlussrohr keine
Aminosäuren bilden.
Hyd_rp_ly_se_ des 2_,4-Dinitr£phenvl-Derivates_ aus
Subst^anz^^
200 mg öliges 2,4-Dinitro-phenyl-Derivat
aus Substanz j wurden mit einer Mischung von
Page 78
-72-
15 cm' 100-prozentiger Ameisensäure und 15 cm'
0,5-n. Salzsäure während 48 Stunden am Rückfluss
gekocht. Die braun gefärbte Lösung dampfte man
unter Vorschaltung einer mit Trockeneis gekühl¬
ten Vorlage im Vakuum zur Trockene. Im Kondensat
konnte mit 2,4-Dinitrophenyl-hydrazin keine Brenz¬
traubensäure nachgewiesen werden.
Den Rückstand nahm man in 20 cm' Wasser auf
und extrahierte die Lösung im Kutscher-Steudel-
Apparat mit Aether. Aus der gelb gefärbten aethe¬
rischen Lösung Hessen sich keine kristallisier¬
ten Produkte, insbesondere kein 2,4-Dinitrophenyl-
glycin isolieren. Im Papierchromatogramm zeigte
es sich, dass die wässerige Lösung Asparaginsäu-
re enthielt (R_, 0,17; Kontrolle D,L-Asparaginseu¬
re IL, 0,16). Das auf übliche Weise hergestellte
2,4-Dinitrophenyl-Derivat (Rohausbeute 30 mg) zeig¬
te nach zweimaligem Umkristallisieren aus Aether-
Petrolaether den zersp. 193° (der Mischschmelz¬
punkt mit dem Derivat aus L-Asparaginsäure gab
keine Depression) und in Peinsprit die spezifi¬
sche Drehung:
[d]£° = + 16° (c =0,69)
(vgl. Tabelle 7, Mr. 5, S. 67).
Hydrp_l£se> des_ To^yl-Derivajses aus_ Subs^anz^JU
300 mg ölige Tosyl-Verbindung aus Substanz J
(vgl. S. 47) wurden mit einer Mischung von 18 cm'
100-prozentiger Ameisensäure und 18 cm' 0,5-n.
Salzsäure während 48 Stunden am Rückfluss gekocht.
Auoh hier fiel der Nachweis der Brenztraubensäure
in dem beim Eindampfen erhaltenen Kondensat nega¬
tiv aus. Der Rückstand wurde in 8 cm' Wasser auf¬
genommen und die Lesung viermal mit Aethylacetat
extrahiert. Die 50 mg Extrakt kristallisierten
Page 79
-73-
beim Stehen. Uach zweimaligem Umkristallisieren
aus Nasser schmolz die farblose Substanz bei 141°;
eine i:ischung mit p-Tosyl-glycin (Smp. 143°) schmolz
bei 142°. Die nach der Extraktion verbleibende wäs¬
serige Lösung zeigte im Papierchromatogramm Aspa-
raginsäure als einzige Aminosäure (IL, 0,16; Kon¬
trolle: D,L-Asparaginsäure IL, 0,17). Durch Umsatz
mit 2,4-Dinitro-fluor-benzol wurde wie oben das
2,4-Dinitrophenyl-Derivat hergestellt. Es schmolz
nach zweimaligem Umkristallisieren aus Aether-Pe-
trolaether bei 194° und zeigte in Peinsprit die
spezifische Drehung:
[ol]20° = + 18° (c = 0,72)
N. EINWIRKUNG NITROSER GASE AUF LYCOMARASMIN UND
SUBSTANZ J.
Bei der Einwirkung nitroser Gase auf stark
salzsaure Lösungen von Lycomarasmin und Substanz
J entsprechend den Angaben von Gonsden et al. (17)
ging Lycomarasmin in Substanz J über und diese wur¬
de, wenn auch langsamer, weiter angegriffen. Bei
der energischen salzsauren Hydrolyse der Reak¬
tionsprodukte entstanden, nachgewiesen mit Hilfe
der Verteilungs-Chromatographie auf Filtrierpa¬
pier, in beiden Fällen Glycin und Asparaginsäure.
Auf Grund der Grösse und Intensität der Flecken
waren dabei die beiden Aminosäuren im Verhältnis
1:1 vorhanden. Unter den gleichen Reaktionsbedin¬
gungen reagierten Aminosäuren und Peptide mit
freier Amino-Gruppe quantitativ.
In Lycomarasmin und Substanz J enthält also
weder die Asparaginsäure noch das Glycin eine pri¬
märe Amino-Gruppe. wooHey (87) gelangte auf Grund
Page 80
-74'
anderer Reaktionsbedingungen zum gleichen Resultat.
Experimenteller Teil.
Einwirkung nitroser Gase auf Lycomarasmin.
6,2 mg Lycomarasmin wurden in 2 cor 5-n.
Salzsäure gelöst und während 10 Minuten bei 32-35°
nitrose Gase (entwickelt aus Natriumnitrit und
konz. Salzsäure) durchgeleitet. Nach dem Eindamp¬
fen im Exsiccator über Kaliumhydroxyd nahm man in
wenig Wasser auf, dampfte nochmals zur Trockene,
löste in 0,5 cm3 Wasser und untersuchte die Lö¬
sung im Papierchromatogramm. Es zeigte sich der
für Substanz J charakteristische Fleck mit R_
0,05 (Kontrolle: Substanz J R_, 0,05). Die verblei¬
bende Lösung wurde mit 0,5 cm' konzentrierter Salz¬
säure versetzt und im Einschlussrohr während 8
Stunden auf 140-150° erhitzt, über Kaliumhydro¬
xyd zur Trockene verdampft und nach Aufnehmen in
0,6 cm3 Wasser wiederum an Filtrierpapier unter¬
sucht. Es zeigten sich zwei violette Flecken mit
Rp 0,16 (Kontrolle: D,L-Asparaginsäure R_ 0,15)
und R_, 0,46 (Kontrolle: Glycin Rj, 0,46) in unge¬
fähr gleicher Intensität und Grösse.
Einwirkung nitroser Gase auf Substanz J.
8,1 mg Substanz J wurden analog mit nitro-
sen Gasen behandelt. Im Papierchromatogramm er¬
schien die Substanz J (R^ 0,05) nach der Behand¬
lung nur noch schwach. Nach der salzsauren Hydro¬
lyse zeigten sich im Verteilungs-Chromatogramm
Asparaginsäure mit R, 0,17 und Glycin mit R^ 0,46
wiederum in ungefähr gleicher Intensität.
Kodellversuche.
9,4 mg D,L-Asparaginsäure und IC mg L-Glu-
taminsäure wurden in gleicher Weise desaminiert.
Page 81
-75-
Darnach konnten die beiden Aminosäuren im Papier-
chromatogramm nicht mehr nachgewiesen werden.
9,7 mg Glycyl-D,L-Asparaginsäure gaben nach
der Desaminierung den für diese Substanz charakte¬
ristischen Fleck E_ 0,25 nicht mehr; nach der salz¬
sauren Hydrolyse bei 140-150° zeigte sich dann
Asparaginsäure Rp 0,17 (Kontrolle: D,L-Asparagin-
säure R^ 0,16), nicht aber Glycin.
0. HOFMANN1SCHER ABBAU VON LYCOMARASMIN UND SUBSTANZ J.
Woolley (87) unterwarf Lycomarasmin und Sub¬
stanz J einem Hofmann'sehen Abbau mit Kaliumhypo-
bromit und hydrolysierte darnach die Reaktionage-
mische mit Salzsäure. Während bei Blindversuchen
Asparagin vollständig reagierte, Asparaginsäure
dagegen nur zum kleineren Teil verändert wurde,
erhielt Woolley nach der Hydrolyse des Reaktions¬
produktes aus Lycomarasmin keine Asparaginsäure
mehr, wohl aber aus Substanz J. Ueber das Schick¬
sal des Glycins wird dabei nichts ausgesagt. Auf
Grund dieser Resultate nahm er an, dass das drit¬
te Stickstoff-Atom des Lycomarasmina sich als Säu-
reamid-Gruppe im Asparaginsäure-Teil befindet und
in Analogie zum Asparagin gab er einer Formulie¬
rung als Asparagin-Derivat den Vorzug.
Eigene Versuche über den Hofmann'sehen Ab¬
bau von Lycomarasmin, Substanz J und verschiede¬
ner Aminosäuren bestätigten die Befunde von Woolley
nicht. Bei Anwendung der von ihm erwähnten Bedin¬
gungen (grosser Ueberschuss am Kaliumhypobromit)
konnten nach der Hydrolyse weder bei Lycomaras¬
min noch bei Substanz J irgendwelche Aminosäuren
nachgewiesen werden. Modellversuche mit Aminosäu¬
ren (Asparaginsäure, Glycin u.a.m.) zeigten eben-
Page 82
-76-
falls eine vollständige Zerstörung dieser Verbin¬
dungen.
Bei der Verwendung aequimolarer Mengen (1 Mol
Hatriumhypobromit auf 1 Mol Lycomarasmin, Substanz
J oder Aminosäure) ergab sich unter sonst analogen
Bedingungen folgendes Bild: Die Aminosäuren blie¬
ben weitgehend erhalten, Asparagin ging teilweise
in Asparaginsäure und Lycomarasmin ebenso in Sub¬
stanz J über, während letztere erhalten blieb. Nach
der Hydrolyse der ReaktionsProdukte aus Lycomaras¬
min und Substanz J konnten Asparaginsäure und Gly¬
cin im Papierchromatogramm in ungefähr gleicher
Menge nachgewiesen werden und auch Brenztrauben-
säure liess sich als 2,4-Dinitro-phenylhydrazon
identifizieren.
Unter Verwendung von 2 Mol Reagens pro Mol
Substanz Hessen sich die Aminosäuren nach der
Reaktion nur noch ganz schwach nachweisen; der
grösste Teil wurde also bei der Reaktion zerstört.
Nach der Hydrolyse der Reaktionsprodukte aus Ly¬
comarasmin und Substanz J liessen sich im Papier¬
chromatogramm die beiden Aminosäuren Asparaginsäu¬
re und Glycin deutlich nachweisen. Der Glycin-
Gehalt war in beiden Hydrolysaten geringer als
der Asparaginsäure-Gehalt und im Hydrolysat aus
Lycomarasmin konnte wiederum Brenztraubensäure
nachgewiesen werden.
Ein Beweis für das Vorliegen eines Aspara-
gin-Derivates im Lycomarasmin konnte also nicht
erbracht werden.
Experimenteller Teil.
Versuche_nac£ d_en Angaben von Woolley_.
Je 5 mg Lycomarasmin, Substanz J, Aspara¬
ginsäure, Glutaminsäure, Glycin, et-Alanin, Serin
Page 83
-77-
und Asparagin wurden mit 2 cm' Wasser versetzt,
mit 1-n. Kalilauge auf p_ 7 gebracht, die Lösun-
gen auf 0° abgekühlt und mit einer kalten Lösung
von 200 mg Brom in 4 cm' l-n. Kalilauge versetzt,
die Mischung */2 Std. bei 0° und 1 Std. bei 40° ge¬
halten. Darnach gab man einen geringen Ueberschuse
an 1-n. Salzsäure zu, dampfte im Vakuum unter 40
rasch zur Trockene, nahm in 1 cm' Wasser auf und
untersuchte die Lösung im Papierchromatogramm.
Alle Aminosäuren einschliesslich Asparagin
waren nach der Behandlung mit Kaliumhypobromit
auf dem Papierchromatogramm nicht mehr nachweisbar.
Auch die für Lycomarasmin und Substanz J charakte¬
ristischen flecken zeigten sich nicht mehr.
Die Lösungen aus Lycomarasmin und Substanz J
wurden hierauf mit 1 cm' konz. Salzsäure versetzt
und während 7V2 Std. bei 140-150° hydrolysiert.
Nach Eindampfen im Vakuum und Aufnehmen in J. cm'
Wasser liessen sich im Papierchromatogramm in bei¬
den Fällen weder Asparaginsäure noch Glycin nach¬
weisen.
Versuche_mit_l_Mol_H£pobromit. J>r£ Mol Substanz^
Je yiO mMol Lycomarasmin, Substanz J und
der oben erwähnten Aminosäuren wurden in 1 cm'
Wasser suspendiert, mit 1-n. Natronlauge auf p„ 7
gebracht und die Lösungen auf 0° gekühlt. Dazu
wurden 0,3 cm' einer Lösung, enthaltend 1,60 g
Brom in 30 cm' 1-n. Natronlauge, gegeben und
die Mischung wie oben behandelt. Im Papierchro¬
matogramm erschienen die für die eingesetzten
Aminosäuren charakteristischen Flecken recht
stark. Nur beim Asparagin (IL 0,46) erfolgte
eine teilweise Umwandlung in Asparaginsäure (IL,
0,15) und aus Lycomarasmin entstand teilweise
Substanz J (IL, 0,04).
Page 84
-78-
Die Lösungen aus lycomarasmin und Substanz
J wurden wie oben hydrolysiert, im Vakuum unter
Vorschaltung einer mit Trockeneis gekühlten Vor¬
lage abgedampft, der Rückstand in Wasser aufge¬
nommen und der Papierchromatographie unterworfen:
R_-Werte und Intensität Asparaginsäure Glycin
lycomarasmin 0,18 stark 0,44 stark
Substanz J 0,17 stark 0,42 stark
In beiden Fällen konnte im Kondensat Brenz-
traubensäure als 2,4-Dinitro-phenylhydrazon, Zersp.
211-213°, nachgewiesen werden.
Versuche_ml;t_2_Mol_Hy_P9_bromit. j>r£ Mol Substanz^
Die Versuche wurden wie oben, jedoch mit
der doppelten Menge Hypobromit-Lösung durchge¬
führt. Im Papierchromatogramm erschienen die für
die eingesetzten Substanzen charakteristischen
Flecken nur noch sehr schwach oder überhaupt nicht
mehr. Die Ergebnisse stehen demnach in Widerspruch
zu den Befunden von Woolley (87).
Nach der Hydrolyse zeigte sich für lyco¬
marasmin und Substanz J folgendes Bild:
Rp-Werte und Intensität Asparaginsäure Glycin
lycomarasmin 0,14 z.stark 0,43 schwach
Substanz J 0,14 z.stark 0,43 schwach
Im Hydrolysat aus lycomarasmin konnte Brenz-
traubensäure als 2,4-Dinitro-phenylhydrazon, Zersp.
210-212° nachgewiesen werden.
P. BIKWIRKDKG VOH HATRIÜMHYPOCHLORIT AUF SDBSTAKZ J.
Da Substanz J am Glycin-Stickstoff-Atom ein
substituierbares Wasserstoff-Atom besitzt, wurde
Page 85
-79-
durch Abbau der Verbindung mit Natriumhypochlo-
rit (4,46) geprüft, ob die Gruppierung einer
A-Alkyl-aminosäure vorhanden sei. Da aber bei
dieser Behandlung weder flüchtige Basen noch
flüchtige Carbonylverbindungen entstanden, ist
das Vorhandensein einer Gruppierung:
IAlkyl-HH-CH
GOOH
in Substanz J ausgeschlossen.
Hach der energischen salzsauren Hydrolyse
des Reaktionsgemisches Hessen sich wohl Aspara-
ginsäure und Glycin, nicht aber Brenztraubensäu-
re nachweisen. Der Angriff des Hypochlorites
scheint also in dem Teil des Moleküls zu erfol¬
gen, der bei der Hydrolyse Brenztraubensäure
ergibt.
Experimenteller Teil.
Der Abbau wurde nach der von Plattner und
Mager (53,61) beschriebenen Methode durchgeführt.
120 mg Substanz J (0,46 mMol) wurden in 1-n. Sa¬
tronlauge gelöst und auf p„ 6,8 gebracht. Zu der
auf 0° gekühlten Lösung gab man 1 cm' Natrium¬
hypochlorit-Lösung (0,93 mAequivalente) und liess
während 10 Minuten stehen. Unter einem Stickstoff-
Strom tropfte man die Lösung in siedendes Wasser,
wobei in einer ersten Vorlage mit 10 cm3 0,1-n.
Schwefelsäure die flüchtigen basischen, in einer
zweiten mit 240 mg 2,4-Dinitro-phenylhydrazin,
gelöst in 20 cm' 2-n.Salzsäure, die flüchtigen
Carbonyl-Verbindungen absorbiert werden sollten.
Nach beendeter Zersetzung ( 5 Minuten) wurde noch
während 10 Minuten mit Stickstoff nachgespült.
In der ersten Vorlage mit Schwefelsäure
Page 86
80-
liess sich acidimetrisch kein Verbrauch feststel¬
len, es bildeten sich bei der Oxydation also kei¬
ne leichtflüchtigen Basen, in der zweiten Vorlage
fiel kein 2,4-Dinitro-phenylhydrazon aus, es ent¬
standen also keine leichtflüchtigen Carbonyl-Ver¬
bindungen.
Las Reaktionsgemisch wurde im Vakuum auf
10 cm5 eingedampft und mit Salzsäure auf p„ 2,6
gebracht. Substanz J schied sich bei 1-wöchigem
Stehen bei 0° nicht aus. Auch im Papierchromato-
gramm zeigte sich der für Substanz J charakteri¬
stische Fleck mit R_, 0,05 nicht mehr.
Die Lösung wurde dann unter Normalbedingun¬
gen hydrolysiert und im Papierchromatogramm un¬
tersucht. Es zeigten sich die für Asparaginsäure
(R-, 0,16; Kontrolle: D,I-Asparaginsäure R_ 0,16)
und Glycin (R_, 0,46; Kontrolle: Glycin Ej, 0,45)
charakteristischen Flecken. Brenztraubensäure
liess sich nicht isolieren.
Q. OXYDATIOH VON LYCOMARASMIN UND SUBSTANZ J MIT
PERJODSAEÜRE.
Während Verbindungen mit zwei Hydroxyl-
ode-r prim. Amino-Gruppen an benachbarten C-Atomen
sehr rasch mit Perjodsäure in alkalischem Medium
reagierten (40) (Serin, Weinsäure, Threonin, (3-Phe¬nyl- j3-oxy-aethylamin-hydrochlorid, Aethanolamin
und o^fl-Diamino-propionsäure-hydrochlorid zeig¬
ten schon nach 5-10 Minuten Verbrauch eines Aeç-i.-
valentes Perjodsäure) wurden Lycomarasmin und Sub¬
stanz J nur langsam oxydiert.
Formulierungen mit einem endständigen Seryl-
Rest kommen also für Lycomarasmin nicht in Frage.
Page 87
-81-
Bei der Oxydation von Lycomarasmin liess
sich eine Spur Ammoniak, wahrscheinlich von der
Inaktivierung der.Substanz herrührend, nachwei¬
sen. Es entstanden aber weder bei Lycomarasmin
noch bei Substanz J mit Dimedon fällbare Alde¬
hyde, insbesondere kein Formaldehyd oder Acet-
aldehyd.
Experimenteller Teil.
Bei.s£ie_l_für_ei.ne 9jcy.dat^on in_alkalischem_Me_di:um.
11,92 mg Lycomarasmin (0,043 mMol) wurden
in einem 50 cm3 fassenden Messkolben mit 1 cm'
2-n. Natronlauge, 10 cm3 gesättigter Kaliumcar-
bonat-Lösung und 2 cm3 einer Perjodsäure-Löaung,
enthaltend 0,385 mMol Perjodsäure, versetzt und
mit Wasser auf 50 em3 aufgefüllt. Nach verschie¬
denen Zeitintervallen wurden Proben à 10 cm3 ent¬
nommen, mit 50 cm3 gesättigter Borsäure-Lösung
und 2 cm3 20-prozentiger Ealiumiodid-Lösung ver¬
setzt und das ausgeschiedene Jod mit 0,02-n. ar-
seniger Säure titriert. Die Resultate sind in
Tabelle 8, S.82 zusammengestellt.
Sie Proben wurden darnach einzeln mit Essig¬
säure angesäuert, das ausgeschiedene Jod mit Thio-
sulfat gebunden, überschüssige 0,4-prozentige Di-
medon-Lösung zugesetzt und kurz erwärmt. Nach
mehrtägigem Stehen bei 0° fiel bei Lycomarasmin
und Substanz J kein Dimedon-Derivat aus; bei der
Oxydation von Serin liess sich das Dimedon-Deri¬
vat des Formaldehyds (Smp. 190°) in quantitati¬
ver Ausbeute isolieren.
Be£t^mmung_d£s_Ammoniaks_:L
Die Bestimmung des Ammoniaks bei der Oxyda¬
tion mit Perjodsäure wurde nach der von van Slyke
Page 88
-82-
et al. (79) entwickelten Methode durchgeführt.
Hinter das Reagensglas, in welchem die Oxydation
mit Perjodsäure durchgeführt wurde (enthaltend
die gleichen Lösungen wie oben, dazu 1 cm3 5-pro¬
zentige Glycin-Iösung) schaltete man drei Reagens¬
gläser, die zur Hälfte mit einer 2-prozentigen
Borsäure-Lösung, die als Indikator eine Mischung
von Bromkresolgrün und 'Methylrot enthielt (52),
beschickt waren. Nach dem Abblasen des Ammoniaks
durch einen mit Schwefelsäure gereinigten Stick¬
stoff-Strom wurde der Ammoniak-Gehalt mit 0,02-n.
Salzsäure aeidimetrisch bestimmt.
Während bei D,L-Serin so 0,89 Mol, bei D,L-
Threonin 0,94 Mol Ammoniak pro Mol Substanz gefun¬
den wurde, betrug der Wert bei Lycomarasmin nur
0,02 Mol. (Oxydations-Dauer 1 Stunde).
Tabelle 8.
Oxydationen mit Perjodsäure.
Substanz Oxydations¬ Verbrauch Mol HJO.
dauer pro Mol Substanz
D,L-Serin 5 Min.
15 Min.1,031,09
D,L-Threonin 5 Min.
15 Min.
1,161,21
Weinsäure 20 Min.
120 Min.
1,131,18
Aethanolamin 5 Min.
30 Min.
0,940,97
«i,/9-Diamino-propionsäure-HCl
60 Min. 1,23
ß-Phenyl-ß-oxy-aethylamin-HGl
10 Min.
30 Min.
1,161,22
Lycomarasmin 30 Min.
16 Std.
40 Std.0,501,02
Substanz J 30 Min.
4 Std.
16 Std.
0,360,68
Page 89
-83-
R. OXYDATION VOU LYCOtoARASMIM HIT BLEI(IV)-ACETAT.
In einem Vorversuch wurde die Oxydation.von
lycomarasmin mit Blei(IV)-acetat quantitativ un¬
tersucht. Der Versuch dauerte bei 37° 45 Stunden,
der Verbrauch betrug 2,12 mAequivalente Blei(IV)-
acetat pro mLol Lycomarasmin. Bei einem zweiten
Oxydations-Versuch konnte die Entwicklung von Koh¬
lendioxyd beobachtet werden. Flüchtige Carbonyl-
Verbindungen Hessen sich dabei keine nachweisen.
Im Papierchromatogramm zeigten sich ganz schwach
Asparaginsäure, Glycin und Glycinamid. Nach der
Hydrolyse konnten Asparaginsäure und Glycin deut¬
lich nachgewiesen werden. Brenztraubensäure Hess
sich nicht fassen.
Der Verbrauch von 2 mAequivalenten Blei(IV)-
acetat und die Bildung von Kohlendioxyd deuten auf
die Oxydation einerot-Oxysäure hin; in diesem Fal¬
le müsste im Lycomarasmin der Teil des Moleküls.,
der bei der Hydrolyse Brenztraubensäure ergibt,
als «C-Oxysäure vorliegen.
Experimenteller Teil.
Quantitativer Vorve^sjich^
Zur Bestimmung wurden 27,3 mg Lycomarasmin
(0,098 mKol) in möglichst wenig 2-n. Katronlauge
gelöst, etwas festes Natriumacetat und 10 cm5 Eis¬
essig zugegeben und mit einem Ueberschuss an Blei(IV)-
acetat in Eisessig versetzt. Nach 45-stündigem Ste¬
hen bei 37° und Zugabe von Kaliumiodid-Natrium-
acetat-Lösung (43) wurde das freigesetzte Jod mit
0,1-n. Natriumthiosulfat-Lösung titriert und aus
der Differenz mit einer Blindprobe der Verbrauch
an Blei(IV)-acetat bestimmt. Dieser betrug 2,12
mAequivalente pro mft'ol Lycomarasmin.
Page 90
-84-
Präparativ£r_V£r£uch^
136 mg Lycomarasmin (0,49 mMol) wurden in
möglichst wenig 2-n. Natronlauge gelöst, 2 g was¬
serfreies Natriumacetat und 50 cm' Bisessig zuge¬
geben. Die Oxydation mit 18 cm' Blei(IV)-acetat-
lösung, enthaltend 1,1 mAequivalente, führte man
im Stickstoff-Strom bei 60-65° durch. Das gebil¬
dete Kohlendioxyd wurde in titrierter Bariumhy¬
droxyd-Lösung ( 20 cm' ca. 0,2-n.) absorbiert und
anschliessend leitete man die Gase durch eine Lö¬
sung yon 150 mg 2,4-Dinitro-phenylhydrazin in Ae-
thanol-Schwefelsäure. Die Rücktitration der Ba¬
riumhydroxyd-Lösung mit 0,1-n. Salzsäure (Indi¬
kator Phenolphthalein) ergab die Bildung von 0,57
mMol Kohlendioxyd (der Mehrverbrauch dürfte auf
etwas mitgerissene Essigsäure zurückzuführen sein).
Flüchtige Carbonyl-Verbindungen konnten keine ge-
fasst werden. Die Oxydations-Lösung wurde nach
dem Verdünnen mit 50 cm' Wasser mit Schwefelwas¬
serstoff vom Blei befreit, die filtrierte Flüs¬
sigkeit im Vakuum zur Trockene gedampft und der
Rückstand in 10 cm' Wasser aufgenommen. Im Papier-'
chromatogramm zeigten sich schwach Asparaginsäure
(Rp 0,16), Glycin (R^, 0,46) und Glycinamid (Rg0,90).
Die wässerige Lösung wurde zur Trockene
gedampft und der Rückstand nach Aufnehmen in 5 cm'
konstant siedender Salzsäure unter Normalbedin-
gungen hydrolysiert. Die Kydrolysen-Lösung zeig¬
te im Papierchromatogramm deutlich die Flecken
der Asparaginsäure (R_ 0,15) und des Glycins
(Rp 0,45). Brenztraubensäure liess sich nicht
nachweisen.
Page 91
-85-
S. OXYBATIOB VON lYCOliARASMIlï ÜHD SUBSTANZ J
MIT KALIUMP3BMAHGANAT.
Die Oxydation von gl -Aminosäuren mit Kalium¬
permanganat führt als ot -Oxydation unter Kohlen¬
dioxyd-Abspaltung zu den entsprechenden Nor-Pett-
säuren. So entsteht z.B. aus cC-Alanin Essigsäure,
aus Serin Oxalsäure und aus Valin i-Buttersäure usw.
(73). Diese Oxydationsmethode ist zum Abbau von
ot-Aminosäuren nicht sehr geeignet, die Ausbeu¬
ten sind schlecht, weil zahlreiche Nebenreaktionen
sich abspielen, und meistens führen andere Methoden
in besserer Ausbeute zum gleichen oder ähnlichen
Produkten.
Bei komplizierter gebauten Aminosäure-Deri¬
vaten, besonders solchen, in denen eine substituier¬
te ot-Aminosäure vorliegt, führt aber die Oxydation
mit Permanganat gelegentlich zu Reaktionsgemischen,
die freie Aminosäuren enthalten. Ein Beispiel da-
.für ist das Octopin, ein Bestandteil gewisser Mu¬
scheln, das bei der Behandlung mit Bariumpermanga-
nat y-Guanido-buttersäure ergibt (45):
KH-CH2CH2CH2-ÇH-C00H Ba(Mn0 ) NH-CH^CH^OOHC=NH KH 7 C=KH
HH2 GH3-CH-C00H NH2
Beim Lycomarasmin scheinen die Verhältnis¬
se ähnlich zu liegen, denn auch hier bilden sich
bei der Oxydation mit Permanganat Aminosäuren.
In Modellversuchen konnte festgestellt wer¬
den, dass bei der Oxydation von Glycyl-L-gluta-
minsäure und anderen, ähnlich gebauten Peptiden,
mit Kaliumpermanganat keine freien Aminosäuren
entstehen} die Peptid-Bindungen sind unter die-
Page 92
-86-
sen Bedingungen weitgehend stabil. Die Oxydation
von Serin und Isoserin verlief nicht sehr rasch,
auch nach 1-tägiger Reaktion konnten die beiden
Aminosäuren im Papierchromatogramn noch nachgewie¬
sen werden. Seryl-asparaginsäure dagegen entfärbte
Kaliumpermanganat rasch und nachher konnte im Pa-
pierchromatogramm Asparaginsäure nachgewiesen wer¬
den.
Lycomarasmin wurde unter analogen Bedingun¬
gen rascher oxydiert als gewöhnliche Peptide und
im Papierchromatogramm liessen sich nachher Aspa¬
raginsäure, Glycin und Glycinamid nachweisen. Von
diesen Verbindungen liessen sich bei einem grösse¬
ren Ansatz Asparaginsäure und Glycin als N-2,4-Di-
nitro-phenyl-Derivate isolieren (erstere Verbin¬
dung war wiederum optisch aktiv und stellte das
Derivat der I-Asparaginsäure dar), daneben Oxal¬
säure und ausserdem konnte die Bildung von Koh¬
lendioxyd beobachtet werden. Flüchtige Carbonyl-
Verbindungen konnten keine nachgewiesen werden,
das Glycinamid entzog sich leider der Isolierung;
es dürfte nur in geringen Kengen vorhanden gewe¬
sen sein.
Auch Substanz J wurde von Kaliumpermanganat
angegriffen, wenn auch unter analogen Bedingungen
erheblich langsamer. Dabei entstanden aber keine
Aminosäuren und nach der Hydrolyse konnten im Pa¬
pierchromatogramm Asparaginsäure und Glycin nach¬
gewiesen werden; der Angriff scheint an der Stel¬
le des Moleküls zu erfolgen, wo bei der Hydrolyse
Brenztraubensäure entsteht.
Experimenteller Teil.
Modellversuche^
Je 5 mg G-lycyl-L-glutairinsäure, I-Iysyl-
Page 93
-87-
glycin-sulfat, L-Lysyl-diglycyl-L-glutaminsäure
und Glycyl-D,L-asparaginsäure wurden in Wasser
gelöst und mit je 2,5 cm3 einer Lösung versetzt,
die 90 mg KMnO. in 30 cm3 Wasser enthielt. Nach
24-stündigem Stehen bei 20° wurde der Braunstein
abfiltriert, gut mit Wasser nachgewaschen, die
Lösungen im Vakuum zur Trockene eingeengt,die
Rückstände in je */2 cm-5 Wasser aufgenommen und
die Lösungen im Fapierchromatogramm untersucht.
Ausser den schon vor der Oxydation beobachteten
Flecken zeigten sich in keinem Falle neue, die
auf die Bildung von Aminosäuren hingewiesen hät¬
ten.
Je 5 mg Serin und Isoserin wurden analog
behandelt. Nach 24-stündiger Oxydation konnten
die beiden Substanzen im Papierchromatogramm
noch deutlich erkannt werden (IL, 0,37 resp. 0,44).
Bei der Oxydation von racemischer Seryl-
asparaginsäure, die auf Grund des Papierchro-
matogrammes frei von Asparaginsäure war, trat
sehr rasch Oxydation unter Bildung von Aspara¬
ginsäure (H_ 0,17) ein.
Vorv£r£u£h_mit_Ly_com£rasmi£.
40 mg Lycomarasmin wurden in 1-n. Natron¬
lauge gelöst und auf p„ 7 gebracht. Zugesetzt
wurden 25 mg KMnO., gelöst in 8 cm-' Wasser. Nach
2 Stunden wurde der Braunstein abfiltriert und
die Lösung auf 2 cm^ eingeengt. Im Papierchro-
matograitim zeigten sich drei Flecken: ein inten¬
siver, ioletter mit IL, 0,15, ein schwacher, röt¬
lich-violetter mit IL 0,46 und ein braun-violet¬
ter mit IL, 0,87.
Zur Identifizierung der drei mit Ninhydrin
reagierenden Substanzen 'wurde entsprechend der
Page 94
-88-
Technik von Gonsden et al.(16-18) auf die ganze
Breite eines Piltrierpapieres dieselbe Lösung
aufgebracht und nach dem Entwickeln und Trock¬
nen horizontale Streifen entsprechend den R_,-Wer-
ten der drei Substanzen ausgeschnitten und mit
Wasser die Verbindungen eluiert. Sie Lösungen
wurden hernach eingeengt und getrennt untersucht.
1. Desaminierung.
Alle drei Substanzen kamen nach der Desa¬
minierung mit nitrosen Gasen (vgl. S. 73) im Pa-
pierchromatogramm nicht mehr zum Vorschein. Auch
nach anschliessender Hydrolyse der desamihierten
Substanzen unter Normalbedingungen zeigten sich
im Papierchromatogramm keine Flecken; bei keiner
der drei Substanzen handelt es sich demnach um
ein Peptid.
2. Salzsaure Hydrolyse.
Die Substanz mit R_ 0,15 erschien nach der
salzsauren Hydrolyse unter Normalbedingungen wie¬
der an der gleichen Stelle (R_ 0,16), ebenso er¬
schien die Verbindung mit R_ 0,46 wieder bei IL,
0,47« Bei beiden Substanzen handelt es sich um
einfache Aminosäuren, bei der ersten um Asp'ara-
ginsäure, bei der letzten um Glycin.
Die Substanz mit R-, 0,87 verschwand dage¬
gen bei der salzsauren Hydrolyse; an deren Stel¬
le entstand Glycin (Rp 0,45). Es muss sich bei
dieser Verbindung um ein in der Carboxyl-Gruppe
substituiertes Glycin handeln.
3. Identifizierung der Substanz mit R_ 0,87 mit
Glycinamid.
In erster Linie wurde natürlich an die Iden¬
tität der Verbindung mit Glycinamid gedacht und
Page 95
-89-
in der Tat zeigten ein synthetisches Präparat
von Glycinamid und das isolierte Produkt im Pa¬
pierchromatogramm die gleichen IL,-Werte in ver¬
schiedenen Lösungsmitteln (vgl. Tabelle 9)«
Tabelle 9.
Rp-Werte von isoliertem und syntheti¬
schem Glycinamid in verschiedenen Lösungsmitteln.
Lösungsmittel synthetisch isoliert
Phenol 0,88 0,88
s-Collidin 0,33 0,33
Amylenhydrat 0,06 0,06
Senzylalkohol als Lösungsmittel ungeeignet
ïïine Isolierung von Glycinamid gelang nicht;
die Identität dürfte aber sichergestellt sein.
0xy_dati.on von Jjubst^anz^^
40 mg Substanz J wurden wie oben das Lyco-
marasmin oxydiert. Nach 14 Stunden war das Oxyda¬
tionsmittel noch nicht völlig verbraucht, es wur¬
de mit Aethanol zerstört. Die filtrierte Lösung
wurde auf 2 cm^ eingeengt. Im Papierchromatogramm
zeigten sich weder Aminosäuren noch Dipeptide.
Nach der Hydrolyse unter Normalbedingungen konn¬
ten im Verteilungs-Chromatogramm auf Filtrierpa¬
pier Asparaginsäure (R_, 0,18) und Glycin (R-, 0,46)
nachgewiesen werden. Brenztraubensäure liess sich
keine nachweisen.
£xy_dation von Ly^omarasjnin^
500 mg Lycomarasmin (1,82 mMol) wurden in
1-n. Natronlauge gelöst und bei p„ 7 mit 675 mg
KKnO., gelöst in 20 om3 Wasser, versetzt.
Page 96
-90-
1. Bestimmung des Kohlendioxyds.
Die Oxydation wurde im Stickstoff-Strom
ausgeführt, das gebildete COg wurde in titrier¬
ter, ca. 0,2-n. Bariumhydroxyd-Lösung (30 cm^)
aufgefangen. Nach 3-stündiger Oxydation wurde
die Reaktions-Lösung, die eher alkalisch ge¬
worden war, mit 20 cm3 1-n. Salzsäure versetzt
und während einer weiteren Stunde Stickstoff
durchgeleitet. Die acidimetrische Bestimmung
mit 0,1-n. Salzsäure (Indikator Phenolphthalein)
ergab 1,57 mMol G02 (86,5 % d.Th.).
2. Isolierung flüchtiger Garbonyl-Verbindungen.
Der Gasstrom wurde während der Oxydation
anschliessend an die Bariumhydroxyd-Lösung durch
eine Lösung von 200 mg 2,4-Dinitro-phenylhydra-
zin in Aethanol-Schwefelaäure geleitet. Auch
die titrierte Bariumfcydroxyd-Lösung und das
beim Einengen der Oxydations-Lösung angefallene
Kondensat wurden auf diese Weise auf Garbonyl-
Verbindungen geprüft. Eine solche liess sich aber
in keinem der drei Fälle fassen.
3. Versuch zur Isolierung von Glycinamid.
Der Rückstand der im Vakuum zur Trockene
eingeengten Oxydations-Lösung wurde in 10 cm3 Was¬
ser aufgenommen, mit 1-n. Katronlauge auf p„ 9
gebracht und wiederum im Vakuum zur Trockene ge¬
dampft. Der beim mehrmaligen Auskochen des Rück¬
standes mit Chloroform erhaltene Extrakt ( 5 mg)
kristallisierte auch nach längerem Stehen bei 0°
nicht, zeigte aber im Papierchromatogramm den ty¬
pisch braun-violetten Fleck von Glycinarrid mit
H_ 0,88-0,89. Daneben fand sich etwas Glycin (R^,
0,45-0,47).
Page 97
-91-
4. Isolierung von Oxalsäure.
Der nach der .Extraktion mit Chloroform ver¬
bleibende Rückstand wurde in 10 cm^ Wasser aufge¬
nommen und bei p^ 6 mit überschüssiger Calcium-n
chlorid-Lösung versetzt. Der Niederschlag wog
nach dem Trocknen im Vakuum 60 mg. Ausbeute 0,47
mmol = 25,7 °ß> d.Th. Er wurde in Salzsäure gelöst
und die filtrierte Lösung im Vakuum zur Trockene
gedampft. Den Rückstand sublimierte man im Hoch¬
vakuum bei 70°. Eine Probe des Sublimates schmolz
unter starker Sublimation bei 192°, der Misch¬
schmelzpunkt mit wasserfreier Oxalsäure (Smp.
190°) lag bei 189°. Der Nachweis auf Oxalsäure
mit Diphenylamin (Blaufärbung beim Zusammenschmel¬
zen) fiel positiv aus. Der Rest des Sublimates
wurde in alkoholischer Lösung mit Benzylamin ver¬
setzt und die Lösung bis zur Kristallisation ein¬
geengt. Das Benzylamin-Salz der isolierten Oxal¬
säure schmolz bei 193°, der Mischschmelzpunkt mit
synthetisch hergestelltem Salz (Smp. 195°) lag
bei 194°.
5. Identifizierung von Glycin.
Das Filtrat der Calciumoxalat-Pällung wurde
bei pH 7 mit Oxalsäure von überschüssigem Calcium
befreit und im Vakuum zur Trockene eingeengt.
Durch mehrmaliges Behandeln mit 90-prozentigem
warmem Aethanol konnte dem Rückstand das Glycin
weitgehend entzogen werden (im Papierchromato-
gramm deutlicher Glycin-Pleck R^ 0,46) und beim
Umsatz mit 2,4-Dinitro-fluor-benzol konnten ca.
3 mg 2,4-Dinitrophenyl-Derlvat von Glycin (Zersp.
des einmal aus Methanol-Wasser umkristallisierten
Produktes 195°; Lischprobe mit einem synthetischen
Page 98
-92-
Präparat vom Zersp. 196° zersetzte sich bei 194°)
isoliert werden.
6. Identifizierung der Asparaginsäure.
Der nach der Extraktion des Glycins verblei¬
bende Rückstand wurde ebenfalls mit 2,4-Dinitro-
fluor-benzol in Reaktion gebracht. Dabei liessen
sich 40 mg rohe 2,4-Dinitrophenyl-asparaginsäure
isolieren. Ausbeute 0,13 mMol = 7,3 # d.Th. Die
spezifische Drehung der Substanz in Peinsprit
stieg bei zweimaligem Umkristallisieren aus Aether-
Betrolaether von
[«t]J°°- + 15° auf [d]f°= + 18° Co = 0,66),
die Probe zersetzte sich bei 193-194°• Das aus
L-Asparaginsäure hergestellte Derivat zersetzte
sich bei 194-195°»die Mischprobe bei 194°. (vgl.
Tabelle 7, Nr.6 ,S. 67). Bei der isolierten Sub¬
stanz handelt es sich um das Derivat der L-Aspa¬
raginsäure .
T. OZ0NISATI0N VOK SUBSTANZ J.
Auf Grund der bisherigen Formulierungen
für Substanz J war es nicht ausgeschlossen, dass
diese Verbindung eine endständige Methylengruppe
besitzt. Ss zeigte sich nun, dass im Gegensatz
zum Glycyl-dehydroalanin, das als Lodellsubstanz
benutzt wurde und wo Formaldehyd in einer Ausbeu¬
te von 26 % als Dimedon^-Derivat gefasst werden
konnte, Substanz J bei der Ozon-Behandlung kei¬
nen Formaldehyd ergab, dass also eine Formulie¬
rung für Substanz J mit endständiger Kethylengrup-
pe sehr unwahrscheinlich ist. Trotzdem trat eine
Veränderung der Substanz ein, denn sie konnte
nicht mehr regeneriert werden. Im Papierchroma-
Page 99
-93-
togramm traten nach der Hydrolyse die beiden Ami¬
nosäuren, Asparaginsäure und Glycin zutage, aber
Brenztraubensäure liess sich nicht nachweisen.
Experimenteller Teil.
Ozo_nisation von Gly^l-dejiyjiroalanin^
2C0 mg Glycyl-dehydroslanin wurden in 10
cm3 Wasser gelöst und durch die gekühlte Lösung
leitete man während einer Stunde einen 2-prozen¬
tigen Ozon-Strom. Formaldehyd liess sich dabei
mit Dimedon nicht nachweisen. Anschliessend wur¬
de das Reaktionsgemisch während 1-Stunde im Stick¬
stoff-Strom am Rückfluss erhitzt und die Gase
leitete man durch Dimedon-Lösung. Es schieden
sich 80 mg (Ausbeute 26 # d.Th.) Formaldehyd-Di-
medon-Derivat, Smp. 190° (die Mischprobe mit ei¬
nem synthetischen Produkt vom Smp. 189-190° schmolz
bei 190°) ab. Die wässerige Lösung zeigte im Pa-
pierchromatogramm weder den für Glycyl-dehydro-
alanin charakteristischen Flecken (R_ 0,66) noch
einen Glycin-Flecken. Letzterer zeigte sich dage¬
gen nach Hydrolyse unter Normalbedingungen (R_ 0,45).
Aus dem Czonlsations-Gemisch Hessen sich keine
kristallisierten Produkte isolieren.
Einw^rkung_von_0_zon auf Sub_sjtanz_J_i
200 mg Substanz J wurden mit 1-n. Katronlau¬
ge in Lösung und auf p 7 gebracht. Die Ozonisa-
tion und die Zersetzung wurden wie oben durch¬
geführt . Mit Dimedon liess sich kein l?ormaldehyd
nachweisen, beim Ansr.uern und Stehenlassen bei 0°
fiel aber auch keine Substanz J mehr aus. Nach
Hydrolyse unter Kormalbedingungen konnte man im
Papierchromatogramm Asparaginsäure (li~ 0,17) und
Glycin (R„ C,43) in ungefähr gleicher Menge er-
Page 100
-94-
kennen. Brenztraubensäure konnte mit 2,4-Dinitro-
phenylhydrazin nicht nachgewiesen werden.
U. HYDRIERUflGS-VERSUCHE MIT LYCOMARASMIN UHD
SUBSTANZ J.
Nach den bisherigen Formulierungen für Sub¬
stanz J sollte diese eine der folgenden Gruppie¬
rungen enthalten (58,87):
CK-? CHo
• 3 II 2
-N=C oder -NH-Ci i
COOH COCH
Bei der Hydrierung müsste ein Dihydro-Deri-
vat entstehen, dass sich bei der Hydrolyse anders
verhalten würde als die Ausgangsverbindung.
Pur die Hydrierung von Substanz J diente
Glycyl-dehydroalanin als lodellsubstanz; denn es
ist bekannt, dass sich diese Verbindung mit Was¬
serstoff in Gegenwart von Palladium-Katalysator
bei Zimmertemperatur glatt zu Glycyl-D,I-oL-ala¬
nin hydrieren lässt (6).
Beim Versuch, unter analogen Bedingungen
eine Hydrierung von Substanz J durchzuführen,
fand keine Wasserstoff-Aufnähme statt; die Aus¬
gangssubstanz konnte unverändert zurückerhalten
werden. Bei Zimmertemperatur fand auch in Gegen¬
wart von Platin-Katalysator (saures Lledium) oder
Raney-Kickel-Katalysator (alkalisches medium)
keine Wasserstoff-Aufnähme statt. Eine Formulie¬
rung für Substanz J mit endständiger Kethylen-
gruppe dürfte demnach den Tatsachen nicht entspre¬
chen.
lycomarasmin lässt sich mit Wasserstoff in
Gegenwart von Palladium-Patalysator ebenfalls
Page 101
-95-
nicht hydrieren.
In Uebereinstimmung mit den erwähnten Be¬
funden zeigten Lycomarasmin und Substanz J auch
keine polarographisch reduzierbare Gruppen.
Experimenteller Teil.
Hydr^erung_v£n_G^yç_yl-dehydroalànin mit Waaser-
st£ff und Palladium.
200 mg Glycyl-dehydroalanin wurden in Ge¬
genwart von Palladium-Schwarz (hergestellt aus
50 mg Palladiumoxyd) in wässeriger Lösung hy¬
driert. Die Wasserstoff-Aufnahme war in 30 Minu¬
ten beendet.Die Lösung wurde vom Katalysator ab¬
getrennt und im Vakuum zur Trockene gedampft.
Die 200 mg Rückstand wurden dreimal aus Wasser-
Aethanol umkristallisiert, Zersp. 219°. In der
Literatur wird für Glycyl-D,L-ot-Alanin ein Zersp.
von 223° angegeben (6). Im Papierchromatogramm
zeigten sich nach der Hydrolyse die für Glycin
(Rp 0,46) und «i-Alanin (Rp, 0,58) charakteristi¬
schen Flecken.
-Versuche_zur_Hy_drierung von Subs^tanz_J_^und_L^c£-
mara£m^n_mi.t_Wassiers^off_und_Palladium_.
200 mg Substanz wurden mit 0,1-n. Natron¬
lauge in Lösung und auf p„ 6 gebracht. In Gegen¬
wart von Palladium-Schwarz (hergestellt aus 50 mg
Palladiumoxyd) schüttelte man während 8 Stunden
in einer Wasserstoff-Atmosphäre. Eine Aufnahme
konnte nicht beobachtet werden und aus der fil¬
trierten und angesäuerten Lösung schieden sich
beim Stehen 160 mg unveränderte Substanz J, Zersp.
272° ab.
Bei einem analogen Hydrierung3-versuch mit
100 mg Lycomarasmin, wo in 8 Stunden ebenfalls
Page 102
-96-
keine Wasserstoff-Aufnähme erfolgte, konnten 85 mg
unveränderte Ausgangssubstanz, Zersp. 226-228°
zurückgewonnen werden.
Versuch zpx I^d_rierung_vo_n_Substanz J mit Wa£se_r-
st£ff und Platin^
100 mg Substanz J wurden in möglichst wenig
2-n.Salzsäure gelöst und in Gegenwart von Platin-
Schwarz (hergestellt aus 30 mg Platinoxyd) in ei¬
ner Wasserstoff-Atmosphäre geschüttelt. Da in 16
Stunden keine Hydrierung erfolgte, wurde der Ver¬
such abgebrochen. £s liessen sich 75 mg Substanz J,
Zersp. 270° zurückgewinnen.
Versuch zur Hydri.erung_v£n_Subs_tan£ J mit_ jjtesser-
£t£ff und Sanev^-Nicjcejl^
150 mg Substanz J wurden in 5 cm' 1-n. Na¬
tronlauge gelöst und in Gegenwart von ca. 70 mg
Raney-Nickel unter Wasserstoff geschüttelt. Wäh¬
rend 16 Stunden fand keine Wasserstoff-Aufnähme
statt. 110 mg Ausgangsmaterial, Zersp. 269°, lies¬
sen sich unverändert zurückgewinnen.
Polarographische_Unte_r£U£hung von Ly£0marasmin
und j3ul)8t;anz_«K(*)
Zur polarographischen Untersuchung wurden
10~3 molare Lösungen von lycomarasmin und Sub¬
stanz J (p„ 6,2) verwendet. Als Grundelektrolytft
diente 10"£ -m. Tetramethyl-ammoniumbromid. Re¬
duzierbare Gruppen zeigten sich nicht.
(*) Die Versuche verdanke ich Herrn Dr.O.Häfliger.
Page 103
-97-
ZUR SYNTHESE EINER*********************************
WELKAKTIVEN VERBINDUNG DURCH*****************************************************
W 0 0 L L E Y .
***************
Yfoolley (87) erhielt durch Kondensation von
jt-Acetoxy-jt -brompropionsäure-aethylester mit
Glycin-asparagin-methylester in Gegenwart von Na-
triummethylat und anschliessender irilder Versei¬
fung der Ester-Gruppen mit Natronlauge eine Ver¬
bindung, die angenähert gleich welkaktiv war wie
Lycomarasmin. Leider unterliess er es, die amor¬
phe Verbindung, die zwar V3 ihres Stickstoff-Ge¬
haltes als Amid-Stickstoff enthielt und eine po¬
sitive Jodoform-Heaktion zeigte, mit lycomarasmin
zu vergleichen (Titrationskurve, Infrarot-Absorp¬
tionsspektrum, Kupfer-Salz).
Es wurde deshalb versucht, die Verbindung
entsprechend den Angaben von Woolley herzustellen.
Schon die Herstellung von eL-Acetoxy-«C-brompro¬
pionsäure-aethylester aus Acetyl-milchsäure durch
Einwirkung von Brom in Gegenwart von rotem Phos¬
phor und anschliessender Behandlung mit Aethanol
bereitete Schwierigkeiten; Es gelang nicht, ein
Produkt herzustellen, das bei der Behandlung mit
1-n. Katronlauge (1 Stunde bei 90°) Brenztrauben-
säure ergab. Aus diesem Grunde muaste vorläufig
von der Synthese der welkaktiven Verbindung Ab¬
stand genommen werden.
Page 104
-96-
BI0L0GISCH3 PRUEFUKG V 0 H
»»a**»*****»*********»**»*»*»****»******-**-*
VERGLEICHSSUBSÏANZEH .
A»*****»*»»****»***************»*******»»
In der Literatur finden sich zahlreiche An¬
gaben über die Welkwirkung der verschiedensten
anorganischen und organischen Verbindungen (1,34,
47,50,51,66,71,78). Da sich die Ergebnisse teil¬
weise widersprechen, nicht zuletzt weil auch die
Versuchsbedingungen, die ja einen wesentlichen
Einfluss haben, verschieden waren, wurden nach
der S. 12 erwähnten Methodik zahlreiche anorga¬
nische und organische Verbindungen auf ihre Welk¬
wirkung bei Tomatenblättern untersucht. Dabei in¬
teressierte auch die Abklärung der Frage, ob und
in welchem Masse dem Lycomarasmin eine besondere
Rolle zukomme und welche Versuchsbedingungen bei
der Isolierung anderer welkaktiver Substanzen am
günstigsten sind.
A. ANORGANISCHE VERBINDUNGEN.
Naturgemäss sind alle Verbindungen von ei¬
ner gewissen Konzentration an (10~* bis 10~3-m.
Lösungen bei Pj, 5-7) für die Pflanzen giftig,
weil die osmotischen Gleichgewichte so stark ge¬
stört werden, dass sich nicht von selbst wieder
normale Verhältnisse einstellen können.
Von den untersuchten anorganischen Salzen
ist mit Ausnahme von Hatriumfluorid und Kalium-
cyanid, wo bekanntlich vom Anion eine recht star¬
ke Wirkung ausgeht, keines ausgesprochen welkak¬
tiv (Tabelle 10). Weder sind gewisse Kationen
noch gewisse Anionen speziell wirksam. Auch Mi¬
schungen verschiedener Salze sind nicht wirksa-
Page 105
-99-
mer als die Komponenten.
Tabelle 10.
Welkwirkung anorganischer Salze.
Substanz keine Wirkung bei
Konz. (Mol /L)
ITaJÎOj, KH03, JfH4N03NaCl, HH.C1, MgCl2, CaClg
10-5
10-5
KCl, BaCl2 lu"4
Ha2S04, Z2S04, (HH4)2S04MgS04, CuS04, PeS04HaN02, NaC105, KBr, KJ
HaC104
lu"3
10-*
IC"5IQ"4
HaF, KCN 10-5
KH2K)4, Na2HP04PeS04 + MgS04 + GuS04MgCl2 + NaCl + KCl
10-5IQ"4
IC"5
Na2HP04 + KH2P04Lycomarasmin (ohne Fe *"*)
IQ"56.10"5
(mit Fe"') 8.1o-6
B. PUFFER, SAEÜEBK UND ALKALIEN.
Es interessierte auch, in welchem p„-Bereichn
Testlösungen geprüft werden können, ohne dass ei¬
ne Schädigung der Pflanzen eintritt. Bei ungepuf-
ferter Säure zeigt sich eine schwache Welkwirkung
bei pH 2, bei ungepufferter Lauge eine starke bei
p 13. Erstaunlich gross ist demnach der Bereich,
wo die Pflanze extreme p„-Bedingungen der Test¬
lösungen ausgleichen kann. Bei Pufferlösungen ist
der Bereich etwas kleiner. Boratpuffer können
nicht verwendet werden, weil das Anion eine star¬
ke Giftwirkung auch in fast neutraler Lösung zeigt
(v£l. Tab. 11). (Konz. der Puffer: 10-5 Mol /l).
Page 106
-1C0-
Tabelle 11.
Welkwirkung von Puffern, Säuren und Basen.
Substanz oder Mischung PH Wirkung
NaOH-Borat-Puffer 11,010,0
++++
++++
HCl-Borat-Puffer 9,08,0
++++
++++
NaOH-Glyc in-Puffer 12,011,010,09,0
0
0
0
0
HCl-Glycin-Puffer 3,53,02,01,1
+
+
++++
++++
HaOH-C itrat-Puffer 6,05,0
0
0
HCl-Citrat-Puffer 4,03,02,0
0
o
+++
H2S0., frei 1,02,03,0
++++
++
0
ZDH, frei 12,013,0
0
++++
C. AMINE.
Im Gegensatz zu den Untersuchungen von
Lüdtke und Ahmet (50) konnte festgestellt werden,
dass Amine in nahezu neutraler Lösung (als Hydro¬
chloride getestet) weniger wirksam sind als Ami¬
nosäuren' (vgl. Tab. 12).
D. ALIPHATISCHE SAEUEEN.
Die aliphatischen Garbonsäuren besitzen
in Form ihrer Natrium-Salze eine ziemlich star¬
ke Welkwirkung. Eine Wirkungssteigerung in Gegen-
Page 107
-101-
wart von Bisen(III)-lonen konnte weder bei Ae-
pfelsäure noch bei Weinsäure beobachtet werden
(vgl. Tab. 13).
fabeile 12.
Welkwirkung von Aminen,
(getestet als Hydrochloride)
Substanz keine Wirkung bei
Konz. (Mol /L)
Gadaverin 5.10"5
Di-i-Amylamin 2.5.10'3Histamin 10"2
Putrescin 5.10"5Creatinin 5.10"5
i-Amylamin 2,5.10"2Colamin 2.5.10'2Allylamin 2.5.10"2lycomarasmin (ohne Fe""*) 6.10"5
(mit Fe""") 8.10"6
Tabelle 13.
Welkwirkung aliphatischer Säuren.
(getestet als Natrium-Salze)
Substanz keine Wirkung bei
Konz. (Mol /L)
Essigsäure 10"4
Brenztraubensäure 10"4
Aepfelsäure 5.10"4Citronensäure 5.10"4
Weinsäure 5.10"4
lycomarasmin (ohne Fe"*") 6.10"5
(mit Fe"") 8.10"6
Page 108
-102-
B. AlilNOSAEUREN.
Gewisse Aminosäuren (L-oL-Alanin, Kethio-
nin, L-Arginin und Guanidin) sind recht welkak¬
tiv. Eine Wirkungssteigerung dieser aktivsten
Verbindungen in Gegenwart von Bisen(III)-Ionen
konnte aber nicht beobachtet werden. Die starken
Komplexbildner Nitrilo-triessigsäure (Komplexon I)
und Aethylendiamin-tetraessigsäure (Komplexon II)
zeigen dagegen nur geringe Welkwirkung, (vgl.
Tab. 14).
Tabelle 14.
Welkwirkung von Aminosäuren.
Substanz getestet als keine Wirkung bei
Konz. (Mol /I)
Glycin frei 5.10"5
I-ot-Alanin
ß -Alanin
h
n
10"45.10"4
Sarkosin « 2,5.10~4D-Valin n 2.5.10"4Betain Hydrochlorid 5.10~4
Cholin-chlorid 5.10"4
D,I-Asparaginsäure Natrium-Salz 2.5.10"4I-Asparagin frei 10"3
I-Glutaminsäure Natrium-Salz 2.5.10"4D,I-Lethionin frei 10"4
I-Gystein Hydrochlorid 2,5.10~4D»L-Histidin it 10"3
L-Arginin h 10"4
Guanidin » 10"4
L-Lysln h 5.10"4
Nicotinsäure frei 8.10"3
Komplexon I Natrium-Salz 5.10~3
Komplexon II h 5.10"3
Page 109
-103-
F. ORGANISCHE LOESUKGSKITTEL.
Zur Herstellung von Testlösungen ist die
Verwendung von organischen Lösungsmitteln oft
kaum zu umgehen. Bei der Testung dieser Flüssig¬
keiten zeigte es sich, dass sie eine starke Wir¬
kung auf den Stengel besitzen; dieser wird schlaff,
braun verfärbt und ganz dünn. Methanol, Aethanol
und Aceton zeigten in 5-prozentiger wässeriger
Lösung keine Wirkung mehr, Butanol, Propanol und
Methylaethylketon dagegen erst in 2-prozentiger
Lösung. Die Wirkung auf die Blattfläche ist viel
geringer.
G. WELEVEHSÜCHE VON WOOLLEY.
WooHey (88) untersuchte verschiedene Amino¬
säuren und synthetisch hergestellte Peptide auf
ihre Welkwirkung. Trotz des nicht sehr umfangrei¬
chen Vergleichsmaterials zog er aus seinen Ver¬
suchen folgende Schlüsse:
Allgemein veränderten kleine Variationen in
der Zusammensetzung der Aminosäuren in den unter¬
suchten Peptiden die Wirksamkeit sehr stark, wäh¬
rend beträchtliche Aenderungen in der Bindungs¬
weise der Aminosäuren gewöhnlich nur einen klei¬
nen Einfluss hatten. Verschiedene sich vom Aspa-
ragin ableitende Peptide erwiesen sich als etwas
aktiver als die entsprechenden Asparaginsäure
enthaltenden Verbindungen. Die optische Konfigu¬
ration schien die Aktivität nicht stark zu be¬
einflussen.
Die Unterschiede sind aber, wie wir das
auch bei einfachen Aminosäuren beobachten konnten,
Page 110
-104-
nicht sehr gross und es fragt sich, ob auf Gfrund
der Resultate der Welkversuche der eine oder an¬
dere Strukturtyp (z.B. eine Asparagin-Gruppierung)
für eine besondere Aktivität verantwortlich ge¬
macht werden kann.
Page 111
-105-
DISEUSSIOK DER ERGEBNISSE.**-><-*********#*****-l(-*****#******##********#*******
Pur Lyoomarasmin wurden bisher zwei Formeln
ernsthaft in Betracht gezogen, Formel (I) von
Plattner und Olauson-Kaas (57,58) und Formel (II)
von Woolley (87):
H00C-CH2 9H2"NH2CH-NH-C0-CHo-HH-CH I.I 2 I
HOOC COOH
HoK0C-CHo CH,2,2 ,3
CH-KH-C0-CH„-NH-C-0H II.I 2 I
HOOC COOH
Dabei wurde von beiden Seiten angenommen,
dass der Substanz die auf Grund der Analysen er¬
mittelte Bruttoformel CqH,(-07U, und nicht ein
Vielfaches davon zukomme. Diese Annahme liess
sich nun mit Hilfe von Diffusionsexperimenten
und von Röntgenuntersuchungen an Kristallen des
Kupfer-Salzes von Lycomarasmin bestätigen.
Die für Lycomarasmin vorgeschlagenen For¬
meln stützen sich in erster Linie auf die Resul¬
tate der energischen salzsauren Hydrolyse, wo
Asparaginsäure, Glycin, Brenztraubensäure und
Ammoniak in einer Ausbeute von maximal je 1 Mol
pro Mol Lycomarasmin entstehen. Die Ausbeute an
Brenztraubensäure ist zwar erheblich geringer,
aber dies beruht wahrscheinlich allein auf den
sehr energischen Hydrolysen-Bedingungen. Die Ver¬
mutung, dass die Brenztraubensäure im Lycomaras¬
min z.B.als Derivat des Serins vorliege, muss
auf Grund verschiedener Versuche fallen gelas¬
sen werden. Nach der Einwirkung von Salzsäure
Page 112
-106-
auf Serin und Isoserin unter den Bedingungen der
Hydrolyse konnten diese Verbindungen noch sehr
deutlich nachgewiesen werden, wenn auch daneben
teilweise Brenztraubensäure gebildet wurde. Wür¬
de es sich beim Lycomarasmin um eine Seryl- oder
Isoseryl-Verbindung handeln, so müsste auch die
Oxydation mit. Perjodsäure anders verlaufen als
dies in Wirklichkeit der Pall war. Dasselbe gilt
für eine d.,ß -Diaminopropionyl-Verbindung. Grup¬
pierungen wie:
CHgOH CH2HH2 ^2^2GH-HH0 CH-OH CH-NH0
CO- CO- C0-
kommen also für lycomarasmin nicht in Betracht.
Auch eine Formulierung des Lycomaraamina
als Tripeptid oder als Verbindung mit zwei Pep-
tid-Gruppen, wobei zwei Aminosäure-Reste und end¬
ständig eine andere Gruppierung peptidisch ver¬
knüpft sind, wie z.B. bei
R R'I I
CH-NH-CO-CH-NH-CO-R"I
HOOC
ist wenig wahrscheinlich, denn bei.einer milden
Hydrolyse sollte wenigstens teilweise ein DiPep¬
tid entstehen, das sich auch im Papierehromato-
gramm nachweisen lassen sollte.
Nun darf aber nicht ausser acht gelassen
werden, dass schon unter relativ milden Bedinun-
gen lycomarasmin in Substanz J übergeht. Dabei
stellt sich sofort die Präge: Findet dieser Ue-
bergang ohne Umlagerung des Kohlenstoff-Gerüstes
statt, sind also die bei der energischen Hydro-
Page 113
-107-
lyse erzielten Resultate, wo unzweifelhaft zuerst
ebenfalls die Umwandlung in Substanz J stattfin¬
det, auch für die Aufstellung einer Strukturfor¬
mel für Lycomarasmin verwendbar, oder findet da¬
bei eine Umlagerung statt und gelten die Resulta¬
te nur für Substanz J ? Bisher wurde diese Frage
verneint, und von beiden an der Aufklärung der
Lycomarasmin-Struktur beteiligten Seiten wurden
für Substanz J die Formeln (III) und (IV) in Vor¬
schlag gebracht :
H00C-CHo CH0 H00C-CHo CH,
CH-NH-C0-CHo-HH-C CH-NH-C0-CHo-H=C
I 2 I I 2 ,HOOC COOH HOOC COOH
III. IV.
Substanz J wäre demnach aus einer Verbin¬
dung (I) durch einfache Ammoniak-Abspaltung her¬
vorgegangen, während beim Uebergang von (II) in
(III) resp. (iv) neben einer Hydrolyse der Säure-
amid-Gruppe eine Wasserabspaltung erfolgen müss-
te. Bei der Ueberführung von lycomarasmin in Sub¬
stanz J kann Ammoniak in einer Ausbeute von 1 Mol
pro Mol eingesetztes Lycomarasmin nachgewiesen
werden, aber die Ausbeute an Substanz J überstieg
nie 55 #• Diese Tatsache läset vermuten, dass es
sich entweder nicht um eine so einfache Reaktion
handelt oder dass ein Gemisch von Substanzen ent¬
steht, die nur teilweise kristallin erhalten wer¬
den. In diesem Falle würde es sich wahrscheinlich
um sehr ähnliche Verbindungen handeln, denn bei der
Hydrolyse ergeben sich aus Substanz J und den Mut¬
terlaugen, die bei der Umwandlung von lycomaras¬
min in Substanz J erhalten werden, die gleichen
Spaltprodukte. Zieht man für Lycomarasmin Formel
(II) in Betracht, so könnte es sich um eine Mi-
Page 114
-108-
schung der Verbindungen (III) reap. (IV) mit sol¬
chen Substanzen handeln, wo nur die eine der bei¬
den Reaktionen, entweder Hydrolyse der Säureamid-
gruppierung (V) oder Wasserabspaltung (VI) resp.
(VII) eingetreten ist:
H00C-CH2 CH5 H2H0C-CH2 CH2CH-NH-C0-CHo-HH-C-0H CH-HH-CO-CH9-HH-C
I^ I I ^ I
)Cw
COOH HOOCvr
H2N0C-CH2 CH3CH-NH-CO-CH9-H=C
HOOCylI^
COOH
Für Substanz J kommen die drei Strukturfor¬
meln (V,VI und VII) schon allein der Analysenwer¬
te wegen nicht in Betracht, obwohl immer wieder
festgestellt werden konnte, dass die gefundenen
Zahlen nicht sehr genau auf die für die Verbin¬
dung angenommene Zusammensetzung CqH1207IT2 stim¬
men. Die Werte sind zwar bei verschiedenen Prä¬
paraten sehr konstant, aber die Prozentzahlen für
den Kohlenstoff-Gehalt liegen immer um ca. 0,5 £
zu tief, diejenigen des Wasserstoffs dagegen um
ca. 0,3 1° zu hoch. Auf Grund der Analysenresulta¬
te wäre eine Zusammensetzung CqH., .0„IT2 eher bes¬
ser fundiert, aber die daraus sich ergebende Struk¬
turformel (VIII) wäre zur Erklärung der Hydroly¬
sen-Resultate weniger geeignet.
HOOC-ÇHo CH.ÇH2 ÇH3
CH-NH-CO-CHo-NH-CH VIII.
HOOC COOH
Woolley (87) schlug für Lycomarasmin For¬
mel (II) auf Grund folgender Tatsachen vor: Bei
der energischen salzsauren Hydrolyse kam er zum
gleichen Ergebnis wie die vorliegende Arbeit.
Page 115
-109-
Weiter unterwarf er Lycomaraamin einem Abbau mit
Kaliumhypobromit und konnte dann nach saurer Hy¬
drolyse keine Asparaginsäure mehr nachweisen,
wohl aber nach analoger Behandlung von Substanz
J. Er nahm an, dass Lycomarasmin eine Säureamid-
Gruppierung besitzt, die er in Analogie zum na¬
türlich vorkommenden Asparagin der (3 -ständigen
Carboxyl-Gruppe zuordnete. Lycomarasmin gab aus¬
serdem eine positive Jodoform-Reaktion. Weil
nach der Einwirkung nitroser Gase und anschlies¬
sender Hydrolyse keine der beiden Aminosäuren
(Asparaginsäure und Glycin) verschwunden war,
rousste angenommen werden, dass bei keiner dieser
beiden Verbindungen die Amino-Gruppe frei vorlag.
Schliesslich erhielt er bei der Einwirkung von
p-Toluol-sulfochlorid auf Lycomarasmin eine To-
syl-Verbindung, die nach Hydrolyse mit einem Salz-
säure-Ameisensäure-Gemisch neben Asparaginsäure
Tosyl-glycin ergab. Zur Erklärung dieser letzten
Reaktion postulierte er, dass bei der Tosylie-
rung der Teil des Koleküls abgespalten werde,
der bei der Hydrolyse Brenztraubensäure ergibt,
dass also bei der Reaktion ein Derivat der Gly-
cyl-asparaginsäure erhalten wurde. Schliesslich
stellte Woolley eine welkaktive Verbindung her,
der Formel (III) zukommen soll. Leider unter-
liess er es, physikalische Methoden (Titrations¬
kurve, Infrarot-Absorptionsspektrum und röntge-
nographische Untersuchung eines möglicherweise
herstellbaren Kupfer-Salzes) zum Vergleich her¬
beizuziehen. Es können daher weder über die Iden¬
tität der synthetischen Verbindung mit Lycomaras¬
min noch über die physikalischen Sigenschaften
dieser Substanz Aussagen gemacht werden.
Page 116
-HO-
Zahlreiche Befunde yon Woolley sind zwei¬
fellos unanfechtbar, so die Jodoform-Heaktion,
die Einwirkung nitroser Gase und die Bildung von
Tosyl-glycin neben Asparaginsäure bei der Hydro¬
lyse eines Tosyl-Derivates aus Lycomarasmin, al¬
les Versuche, die auch in der vorliegenden Arbeit
durchgeführt wurden. In einigen Funkten gehen
aber die Resultate auseinander:
Bei der Ausführung der Oxydation von lyco¬
marasmin und Substanz J mit Hypobromit nach der
Vorschrift von Woolley konnten nach der salzsau¬
ren Hydrolyse im Papierchromatogramm keine Amino¬
säuren mehr nachgewiesen werden. Aminosäuren wur¬
den durch analoge Behandlung ebenfalls vollstän¬
dig zerstört. Bei Verwendung aequimolarer Mengen
Hypobromit und Lycomarasmin resp. Substanz J und
Aminosäuren blieben letztere weltgehend erhalten;
Asparagin ging teilweise in Asparaginsäure und
Lycomarasmin teilweise in Substanz J über. Sub¬
stanz J blieb unverändert. Nach der Hydrolyse
der ReaktionsprOdukte aus Lycomarasmin und Sub¬
stanz J konnten Asparaginsäure und Glycin im Pa¬
pierchromatogramm in ungefähr gleicher Menge nach¬
gewiesen werden und auch Brenztraubensäure liess
sich identifizieren. Bei Verwendung von 2 Mol
Reagens pro Mol Substanz Hessen sich die Amino¬
säuren nach der Reaktion nur noch ganz schwach
nachweisen. Nach der Hydrolyse der Reaktionspro¬
dukte aus Lycomarasmin und Substanz J Hessen
sich im Papierchromatogramm Asparaginsäure und
Glycin deutlich nachweisen. Dabei war der Gly-
cin-Gehalt deutlich geringer als die Asparagin-
säure-Menge.
Abgesehen davon, dass es uns nicht gelang,
nach den Angaben von Woolley die welkaktive Ver-
Page 117
-111-
bindung, der Struktur (II; zukommen soll, herzu¬
stellen, spricht auch das Ergebnis der Oxydation
von Lycomarasmin mit Kaliumpermanganat eher ge¬
gen Formel (II). Als Oxydationsprodukte konnten
nämlich L-Asparaginsäure, etwas Glycin und Oxal¬
säure isoliert und Kohlendioxyd und Glycinamid
nachgewiesen werden. In Modellversuchen zeigte
es sich, dass bei der Einwirkung von Kaliumper¬
manganat auf Peptide normalerweise keine Amino¬
säuren in Freiheit gesetzt werden, es sei denn,
es handle sich bei einer Peptid-Komponente um
eine leicht oxydierbare Aminosäure wie Serin o-
der Isoserin. Bei einer Verbindung (II) dürfte
die Oxydation zweifellos an der Hydroxyl-Gruppe
erfolgen und es sollte unter Kohlendioxyd-Ab¬
spaltung das Acetyl-Derivat von Glycyl-aspara-
gin (IX) entstehen. Möglicherweise könnte die
Oxydation auch direkt zum Glycyl-asparagin (X)
führen:
H,NOC-CH9 CH,2,2 , 3
CH-NH-C0-CHo-NH-G-0H
« 2 I
HOOCTT , COOH
H2NOC-CH2 » CH3 H2NOC-GH2CH-KH-CO-CH2-HH-CO CH-KH-CO-CHjjHHg
HOOC„A
HOOC
IX.+G°2 X.
Die Resultate der Oxydation mit Kaliumper¬
manganat könnten wohl am besten erklärt werden,
wenn man für Lycomarasmin eine Struktur annähme,
wo, wie z.B. in Formel (XI), die beiden Aminosäu¬
ren endständig, also der "Brenztraubensäure-Teil"
im Zentrum, angeordnet sind. Der Angriff des Oxy¬
dationsmittels müsste dann am quaternären Kohlen¬
stoff-Atom erfolgen:
Page 118
-112-
H00C-ÇH2 CH?CH-NH-C-NH-CHo-C0NHo XI.
Il22
HOOC COOH
Wie sich eine Substanz der Formel (XI) bei
der Jodoform-Reaktion verhalten würde, ist nicht
bekannt. Ein Angriff müsste am quaternären Koh¬
lenstoff-Atom erfolgen, ebenso bei der Oxydation
mit Blei(IV)-acetat. Andererseits fiel aber eine
C-Methyl-Bestimmung nach Kuhn-Roth beim Lycomaras-
min negativ aus.
Die Schwierigkeiten bei der Aufstellung ei¬
ner Strukturformel für Lycomarasmin werden noch
beträchtlich grösser, wenn man versucht, die Stick¬
stoff-Atome zuzuordnen. Einzig von dem dem Aspara-
ginsäure-Teil angehörenden Stickstoff-Atom lässt
sich mit einiger Sicherheit sagen, dass es zu ei¬
ner Peptid-Bindung gehört. Sicher enthält aber die
Verbindung, wie aus der Titrationskurve hervor¬
geht, nicht mehr als ein basisches Stickstoff-Atom.
Das dritte dieser Atome muss also ebenfalls in ei¬
ner neutralen Form, z.B. als primäres Säureamid
vorliegen. Zieht man nun in Betracht, dass Lyco¬
marasmin mit 2,4-Dinitro-fluor-benzol, das sonst
leicht mit primären und sekundären Aminen in Reak¬
tion tritt, kein Derivat ergibt, so müsste eigent¬
lich die Existenz eines tertiären Stickstoff-Atoms
angenommen werden. In diesem Falle liesse sich aber
die Umwandlung in Substanz J und auch die Hydroly¬
se nicht leicht deuten.
Die Titrationskurve des lycomarasmins liesse
sich am einfachsten erklären, wenn man das Vor¬
handensein von drei Carboxyl-Gruppen (wovon eine
als Carboxylat-Ion) und einer basischen Gruppe
Page 119
-113-
(als Ammonium-ion) annimmt. Eine Substanz der For¬
mel (II) müsste sich aber bei der Titration wie
eine Amino-dicarbonsäure verhalten. Es wäre aber
möglich, dass der zum Glycin gehörenden NH-Gruppe
infolge der Anwesenheit der Hydroxyl-Gruppe am
gleichen Kohlenstoff-Atom besondere Eigenschaften
zukommen, die sich in der Basizität und in der
Reaktionsträgheit des Wasserstoff-Atoms bei der
Reaktion mit 2,4-Dinitro-fluor-benzol äussern.
In diesem Falle würde sich eine Substanz der For¬
mel (II) wie eine Dicarbonsäure verhalten. Wollte
man die Titrationskurve damit in Einklang bringen,
so müsste man annehmen, dass der basische p^-Wertnicht reell ist, dass also die Kurve ebenfalls die
Titration einer Dicarbonsäure darstellt.
Nach Formel (III) resp. (IT) sollte Substanz
J entweder eine -C=C- oder eine -C=N- Doppelbindung
enthalten. Zur Abklärung dieser Frage wurde die
Verbindung der Ozonisation und der Hydrierung un¬
terworfen, wobei in beiden Fällen Glycyl-dehydro-
alanin (XII) als Modellsubstanz diente:
CH9
n 2HHo-CHo-C0-HH-C XII.
2 2 ,COOH
Verbindung (XII) gab bei der Ozonisation, wenn
auch in schlechter Ausbeute, Formaldehyd, liess
sich leicht mit Palladium und Wasserstoff zu Glycyl-
D,L-Alanin reduzieren und zeigte sowohl im Ul¬
traviolett- als auch im Infrarot-Absorptions¬
spektrum die auf Grund der Formel (XII) zu erwarten¬
den Charakteristika. Bei Substanz J fielen Ozo¬
nisation und Hydrierung negativ aus und auch in
Page 120
-lu¬
den Spektren fehlten alle Anzeichen für das Vor¬
liegen einer «L-substituierten Acrylsäure. Auf
Grund dieser Tatsachen kommt von den beiden For¬
meln nur noch (IV) in Betracht. Da nun aus Sub¬
stanz J sowohl mit 2,4-Dinitro-fluor-benzol als
auch mit p-Toluol-sulfochlorid Reaktionsproduk¬
te erhalten werden, muss, wenn Formel (IV) für
Substanz J als richtig angesehen wird, entspre¬
chend der Formulierung von Woolley angenommen
werden, dass bei diesen Reaktionen eine Abspal¬
tung des "Brenztraubensäure-Teils" erfolgt, denn
das in Reaktion tretende Stickstoff-Atom des Gly¬
cins trägt ja nach dieser Formel kein substituier¬
bares Wasserstoff-Atom. Struktur (VIII) für Sub¬
stanz J würde wohl die Analysenwerte, die nega¬
tiven Resultate beim Nachweis einer endständigen
Methylengruppe und die Bildung von Derivaten durch
Ersatz des Wasserstoff-Atomes am Glycin-Stick-
stoff zwangslos erklären, aber auch hier böte die
Deutung der Hydrolyse Schwierigkeiten.
Verestert man Substanz J nach den für Amino¬
säuren üblichen Methoden, so erhält man aus den
gebildeten Methyl- resp. Aethylestern kristalli¬
sierte Pikrolonate, deren Analysenwerte auf Deri¬
vate von Triestern einer Verbindung cqHTO07B2stimmen.Da es sich bei diesen Derivaten auf Grund
ihrer Zusammensetzung nicht um Derivate von Ab¬
bauprodukten der Substanz J handeln kann, also
insbesondere nicht um solche der Glycyl-aspara-
ginsäure, muss angenommen werden, dass es entwe¬
der Derivate von Substanz J oder einer dazu iso¬
meren Substanz sind. Die letztere Alternative
wurde nur deshalb in Betracht gezogen, weil es
nicht gelang, aus den Pikrolonaten durch Einwir¬
kung von Lauge Substanz J zurückzugewinnen.
Page 121
-115-
Sleht man von dieser Möglichkeit ab, so bestäti¬
gen die Analysen der Fikrolonate die Feststellung,
die aus dem Verlauf der Titration von Substanz J
mit Lauge hervorgeht, nämlich dass die Verbindung
drei Carboxyl-Gruppen enthält.
Schliesslich sei noch daran erinnert, dass
das Lycomarasmin eine starke Neigung zur Komplex-
Bildung besitzt, während der Substanz J jede Fä¬
higkeit dazu abgeht. Es dürfte aber schwerfallen,
allein auf Grund dieser Tatsache einen Entscheid
für oder gegen eine Formel für Lycomarasmin oder
Substanz J zu treffen.
Verschiedene Reaktionen von Lycomarasmin
und Substanz J sind weder durch die von Woolley
noch die von Plattner und Clauson-Kaas vorgeschla¬
genen Formeln (I) und (II) resp. (IV) zu deuten.
Es gelang bisher nicht, Strukturformeln zu fin¬
den, die alle Resultate zwangslos erklären lassen.
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-116-
ZUSAMMENPASSÜHG .
*#*#****##*#*#*»»#**#*•**##*#*#
Die Untersuchung des von Plattner und Clau-
son-Kaas aus dem Kulturfiltrat des Erregers der
Tomatenwelke, Fusarium lycopersici Sacc. isolier¬
ten Welkstoffes Lycomarasmin, CqEL,-07H,, wurde
in der Absicht durchgeführt, für diese Verbindung
eine befriedigende Strukturformel zu finden. Fol¬
gende Resultate wurden dabei erzielt:
1. Sie Substanz wurde in grösserem Masstabe
nach einem etwas vereinfachten Verfahren isoliert.
2. Lycomarasmin scheint eine einheitliche
Verbindung darzustellen, die eine ausgesprochene
Neigung zur Komplex-Bildung besitzt.
3. Das Molekulargewicht der Verbindung konn¬
te durch Röntgenuntersuchung am kristallisierten
Kupfer-Salz bestimmt werden. Messungen mit Hilfe
von Diffusionsversuchen führten zum gleichen Re¬
sultat .
4. Die Ueberführung von Lycomarasmin in das
kristalline Inaktivierungs-Produkt, Substanz J,
wurde untersucht. Die beim Erhitzen in alkalischer
neutraler oder saurer Lösung vor sich gehende Um¬
wandlung erfolgt mit maximal 55 ?6 Ausbeute an Sub¬
stanz J unter Abspaltung von 1 Mol Ammoniak pro
Mol Welkstoff.
5. Die energische salzsaure Hydrolyse von
Lycomarasmin liefert je 1 Mol Ammoniak, Glycin,
weitgehend racemisierte Asparaginsäure und Brenz-
traubensäure. Substanz J gibt analoge Hydrolysen-
Resultate.
6. Bei milder Hydrolyse des Welkstoffes
bilden sich keine Dipeptide.
Page 123
-117-
7. Bei der salzsauren Hydrolyse einer To-
syl-Verbindung aus Substanz J liess sich neben
Tosyl-glycin L-Asparaginsäure isolieren.
8. Die Resultate, die Woolley bei der Oxy¬
dation mit Hypobromit erzielte und die ihn zur
Formulierung des Lycomarasmins als Derivat des
Asparagins veranlassten, konnten nicht bestätigt
werden.
9. Bei der Oxydation von Lycomarasmin mit
Kaliumpermanganat Hessen sich neben L-Aspara¬
ginsäure Glycin und Oxalsäure isolieren; die Bil¬
dung von Kohlendioxyd und Glycinamid konnte nach¬
gewiesen werden.
10. Die Oxydation des felkstoffes mit Blei-
(IV)-acetat verläuft unter Verbrauch von 2 Mol
Oxydationsmittel und unter Bildung von 1 Mol Koh¬
lendioxyd.
11. Lycomarasmin und Substanz J werden durch
Perjodsäure nur sehr langsam oxydiert. Formalde¬
hyd bildet sich dabei nicht.
12. Substanz J enthält auf Grund von Ozoni-
sations- und Hydrierungs-Versuchen keine endstän¬
dige Kethylengruppe.
13. Die Synthese der von Woolley durch Kon¬
densation von ot-Acetoxy-o6-brompropionsäure-
aethylester mit Glycin-asparagin-methylester er¬
haltenen welkaktiven Verbindung konnte nicht re¬
produziert werden.
14. Die Welkwirkung zahlreicher anorganischer
und organischer Verbindungen wurde untersucht. Dem
Lycomarasmin kommt dabei, besonders in Gegenwart
von Eisen(III)-Ionen, eine besondere Wirkung zu.
15. Die früher für Lycomarasmin resp. Sub¬
stanz J vorgeschlagenen Strukturformeln werden
Page 124
-118-
anhand der erzielten Resultate diskutiert. Ob¬
wohl verschiedene Reaktionen dieser beiden Sub¬
stanzen durch die von WooHey vorgeschlagenen
Formeln (II) resp. (IV) nicht leicht zu deuten
sind, gelang es nicht, bessere zu finden, die
alle Resultate zwangslos erklären lassen.
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Berlin (1935)
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88. D.W. Woolley, J. Biol. Chem. 176, 1299 (1948)
89. D.W. Woolley, J. Biol. Chem. 166, 783 (1946)
90. D.W. Woolley, J, Biol. Chem. 162, 383 (1946)
91. D.W. Woolley, J. Biol. Chem. 172, 71 (1948)
92. D.W. Woolley, J. Exp. Med. 73, 487 (1941)
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Lebenslauf
Ich wurde am 19. März 1924 in Wallisellen geboren, be¬
suchte dort während 6 Jahren die Primarschule und trat 1936
in das Gymnasium der Kantonsschule Zürich ein. Nach Able¬
gung der Maturitätsprüfung Typus B im Herbst 1942 begannich meine Studien an der Abteilung für Chemie der Eidgenös¬sischen Technischen Hochschule und erwarb im Herbst 1946
das Diplom als Ingenieur-Chemiker. Darnach führte ich im or¬
ganisch-chemischen Institut von Herrn Prof. Dr. L. Ruzicka
unter Leitung von Herrn Prof. Dr. PI. A. Plattner die vorlie¬
gende Arbeit aus. Seit Oktober 1949 befasste ich mich mit der
Isolierung anderer Welkstoffe und Antibiotika.
Zürich, Mai 1951 Arthur Boller
