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Secuenciación y análisis del genoma de dos cepas de Stenotrophomonas sp.
degradadoras de xenobioticos.
Sequencing and genome analysis of two strains of Stenotrophomonas sp. xenobiotic
degraders.
1Temidayo Oluyomi Elufisan, 2Alejandro Sánchez Varela, 3Isabel Cristina Rodríguez Luna, y 4Xianwu Guo.
Laboratorio de Biotecnología Genómica, Centro de Biotecnología Genómica, Instituto Politécnico
Nacional, Boulevard del Maestro, con Elías Piña, Col. Narciso Mendoza, s/n, CP. 88710, Tel:
924327, Ext: 87760, [email protected], Reynosa Tamaulipas, México.
RESUMEN. Stenotrophomonas son bacterias Gram negativas metabólicamente versátiles.
Esta capacidad de sobrevivir en varios ambientes se ha asociado con su potencial para
utilizar una amplia gama de sustancias para su crecimiento, incluidos los xenobióticos.
Estos potenciales que posee Stenotrophomonas spp han sido estudiados con diversos fines
aportando grandes beneficios para el hombre, tales como la promoción del crecimiento
vegetal de plantas y sus aplicaciones en biorremediación. En este estudio aislamos dos
nuevas cepas de Stenotrophomonas spp de pozos y suelos contaminados crudos en
Tabasco, México, y evaluamos su potencial para tolerar y crecer en Hidrocarburos
PoliAromáticos (HPA), que es uno de los componentes principales del petróleo crudo. La
cuantificación cuantitativa y cualitativa de los productos de degradación se llevó a cabo
mediante el uso de espectrometría FTIR y análisis UPLC-MS. La capacidad de los aislados
para usar HPA se probó con siete HPA diferentes (Bifenilo, Xileno, Antraceno,
Antraquinona, Naftaleno, Fenantreno, Fenantidina) en un medio mínimo con HPA como
única fuente de sustrato. El aislamiento creció eficazmente en seis HPA, excepto en el caso
del xileno, y el análisis espectrofotométrico mostró que los aislamientos crecieron de forma
constante en la HPA hasta el séptimo día, cuando el crecimiento comenzó a disminuir. El
resultado del análisis cuantitativo y cualitativo mostró que los aislamientos podrían estar
degradando la HPA evaluada a través de la vía de degradación del catecol. La
secuenciación completa del genoma de los aislados se realizó utilizando la técnica de
secuenciación de nueva generación y el análisis de secuenciación reveló que los aislados
poseen varios genes funcionales que pueden estar implicados en la degradación y la
mineralización completa de los HPA.
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Palabras claves: Hidrocarburos, Aromáticos, Genes, Funcionales, Biorremediación.
INTRODUCCIÓN
Los hidrocarburos poliaromáticos son contaminantes ambientales comunes derivados de las
actividades antropogénicas. La naturaleza recalcitrante y el efecto peligroso de los HPA
hacen que la remediación sea importante. El uso de microorganismos para la remediación
de los HPA y otros hidrocarburos ha recibido más reconocimiento debido a la facilidad de
manipulación de bajo costo y pocos o ningún efecto secundario. Existen reportes donde
muestran a Stenotrophomonas como uno de los microorganismos con la capacidad de
crecer y degradar hidrocarburos. Stenotrophomonas spp es una clase de bacteria con
habilidades metabólicas versátiles, que se han asociado con diversas capacidades para
utilizar muchas sustancias complejas para su crecimiento, entre las cuales se encuentran los
hidrocarburos, compuestos organofosforados para su crecimiento (Iyer and Damania,
2016). Se ha reportado que varias cepas de Stenotrophomonas están asociadas con la
degradación de HPA y otros hidrocarburos (Chen et al., 2014) (Mangwani et al., 2014) (Ni
et al., 2013) (Nowak et al., 2016). Sin embargo, la elucidación de todo el mecanismo
empleado por Stenotrophomonas spp para la degradación de hidrocarburos aún es
incipiente. El análisis de la secuenciación del genoma completo se ha utilizado para
explicar muchos fenómenos en bacterias, incluida su capacidad para degradar
hidrocarburos. Recientemente se utilizó la secuencia del genoma completo para explicar a
detalle la vía metabólica implicada en la degradación de los HPA por Mycobacterium
vanbaalenii (Kim et al., 2008). El análisis completo de la secuencia del genoma podría
usarse para explicar las características fenotípicas de las especies de Stenotrophomonas con
respecto a la degradación de los HPA. Con este objetivo, el estudio se centró en la
evaluación de los potenciales de biodegradación de las especies de Stenotrophomonas
aisladas de contaminantes crudos y el análisis de la secuencia del genoma completo de las
cepas.
Se aislaron dos nuevas especies de Stenotrophomonas de sitios contaminados en crudo en
Tabasco México y se evaluó su capacidad para crecer en diversos hidrocarburos aromáticos
policíclicos (HPA) como la única fuente de carbono en medio bushnell Hass y se
determinaron los potenciales de degradación en un estudio de degradación. La base
genética para la tolerancia y degradación de los hidrocarburos asociados se determinó
mediante la secuencia completa del genoma de los aislados.
Los aislamientos fueron capaces de utilizar HPA para su crecimiento según lo revelado por
el aumento en la densidad óptica (DO) después de siete días de crecimiento en un medio
mínimo con hidrocarburo como única fuente de energía. La DO continúa aumentando
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diariamente hasta el séptimo día cuando comienza a disminuir. La degradación de
hidrocarburos se examinó por espectrofotometría infrarroja de transmisión de Fourier
(FTIR). Las especies de Stenotrophomonas aisladas fueron capaces de degradar los HPA a
través de la vía de degradación de catecol. El análisis del genoma completo reveló que los
aislados contienen genes que son importantes para la degradación de los HPA, tales genes
incluyen lactoilglutatión liasa, esencial para la conversión de salicilato en catecol.
METODOLOGÍA
Las Stenotrophomonas spp utilizadas en este estudio fueron aisladas del suelo contaminado
con petróleo crudo recolectado en Tabasco México, inicialmente se tomó 1 g de la muestra
de suelo y se adiciono en 10 ml de caldo Luria-Bertani y fue incubada la mezcla a 37°C.
Enseguida se tomó 1 ml del cultivo de bacteria crecida durante la noche y se diluyó en
forma serial a la potencia de ocho en solución tampón de fosfato y luego se extendió en
placas de medio selectivo (agar StenoVIA) para el aislamiento de especies de
Stenotrophomonas spp. Las colonias que aparecieron en las placas se identificaron
bioquímicamente con base en el manual de Bergey de bacteriología determinativa e
identificación molecular.
En cuanto a los HPA utilizados para este estudio fueron obtenidos del Laboratorio de
Biotecnología Farmacéutica (Laboratorio de Biotecnología Farmacéutica) del Centro de
Biotecnología Genómica, Instituto Politécnico Nacional de México.
Para la identificación molecular y análisis filogenético. Se extrajo ADN genómico a partir
de 5 mL de cultivo bacteriano cultivado en caldo de Luria usando el kit de purificación de
ADN genómico de Promega (Madison, EE UU) según las instrucciones del fabricante.
Los genes 16s rRNA fueron amplificados mediante PCR usando steno1 (21F) (5 'AGG
GAA ACT TAC GCT AAT ACC-3') y steno2 (1200R) (5 'CTC TGT CCC TAC CAT TGT
AG-3') de acuerdo a Pinnot et al., (2009). La mezcla de PCR contenía 2.5 μL de PCR
buffer, 0.75 μL (50mM) MgCl2, 0.5μL de 10mM d -NTP mix, 1 μL (0.5μM) de cada
primer, 0.5μL, 2.5 U Taq DNA polimerasa, 16.75 μL de agua destilada y 2 μL de ADN (10
ng / μL).
Los productos de PCR fueron purificados y secuenciados en el Centro de Biotecnología
Genómica, Instituto Politécnico Nacional, México. La secuencia obtenida se analizó con el
software Seqman versión 13 y se sometió a búsquedas de similitudes contra las secuencias
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del gen 16S rDNA obtenidas de NCBI utilizando el programa Blastn.
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Los aislados de Stenotrophomonas spp. a partir de tierra cruda contaminada se les evaluó su
capacidad para tolerar concentraciones variables de seis diferentes HPA.
La prueba de tolerancia a hidrocarburos se llevó a cabo utilizando medio Bushnell Hass
(BH) suplementado con HPA 1% y 5% de 100 mg en el caso de naftaleno, fenantridina,
antraquinonas, bifenilo, fenantreno y 40 mg con respecto al antraceno.
Todos los hidrocarburos fueron disueltos en cloruro de dimetilo, dejando evaporar el
disolvente, antes de introducir los hidrocarburos en dosis experimentales.
El diseño experimental tubo tres configuraciones que incluyeron el experimento de prueba
y dos controles. Todos los experimentos fueron por duplicados. Se inocularon 100 μL de
cultivo de toda la noche de las cepas de Stenotrophomonas spp, lavadas en tampón de
fosfato en 100 mL de cada medio BH que contenía 1% y 5% de la HPA. Antes mencionada
a una concentración de 100 mg / mL en matraz Erlenmeyer de 250 mL mientras que cada
medio BH no inoculado con hidrocarburo y medio BH con Stenotrophomonas sirvieron
como controles.
Todas las concentraciones experimentales se incubaron a 30°C en una incubadora rotatoria
con revolución de 200 rpm durante 7 días después de la inoculación con bacterias de
prueba. La tolerancia de Stenotrophomonas se verificó cada dos días utilizando el método
de recuento de colonias. Se extendieron 100 μL de cada medio inoculado diluido en serie
(10-4) sobre placas de agar Luria Bertani y se incubaron a 30ºC durante 24 horas, después
de lo cual se contaron las colonias formadas. El análisis espectrofotométrico se llevó a cabo
en el cultivo de todas las concentraciones experimentales para corroborar las observaciones
del método de recuento de colonias.
Ensayo de bioemulsificación
Las propiedades emulsionantes de los aislamientos se probaron según la descripción de
Panjiar et al., (2015) y Peter and Singh (2014).
Actividad de biodegradación de Stenotrophomonas spp.
Se analizaron cepas de Stenotrophomonas para la biodegradación de Naphthalene debido a
su capacidad para tolerar y crecer en los diferentes hidrocarburos probados.
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Se introdujeron 100 μL de inóculo de Stenotrophomonas (DO = 1) durante una noche en
medio Bushnell Hass líquido de 100 mL ya suplementado con Naftaleno v/v al 1% (100 mg
/ ml) y medio sin Naftaleno en un matraz Erlenmeyer de 250 mL mientras que el tercer
tubo contenía solamente Naftalina Medio de Bushnell Hass. Todas las concentraciones
fueron por triplicado y fueron incubados a 30°C en una incubadora rotatoria con una
revolución de 200 rpm. El valor OD de la concentración se verificó tres veces para
determinar la actividad de crecimiento de las bacterias. Esto se hizo el primer día del
experimento, el día 10 y el día 30, que es el último día del experimento.
Extracción de Hidrocarburos y análisis
El naftaleno se extrajo con el mismo volumen de hexano dos veces después de un período
de incubación. Cultivo líquido (100 mL) que contiene Stenotrophomonas spp. El inóculo de
Pemsol y el hidrocarburo se agitaron vigorosamente tres veces con el mismo volumen de
hexano. La mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora para la separación
adecuada de las emulsiones y luego se transfirieron a un embudo de separación para separar
la emulsión. La fase de hexano se recogió para el análisis del producto de HPA.
Para la identificación de intermedios de la degradación del naftaleno se utilizó UPLC-MS /
MS
Se optimizo con una solución estándar de 1.0 mg /L y una fase móvil (50% de H2O: 50%
de metano) en el espectrómetro de masas de forma continua en modo combinado. La
temperatura de la fuente se ajustó a 120 o C, para disolver la temperatura a 350 o C y el
flujo de gas fue a 50 L/ h. Se utilizó un flujo de gas disuelto de 500 L/ h y un flujo de gas
de colisión de 0.10 mL / min. El nitrógeno se usó como el cono y el gas de disolución,
mientras que el argón se usó como el gas de colisión y su presión en la celda de colisión se
mantuvo en 3.0 x 10 3 milibares. La separación por cromatografía se realizó con el sistema
Ultraperformance LC equipado con la columna BEHTM C18 (1.7 μm, 50 mm x 2.1 mm)
del naftaleno utilizando fases móviles de gradiente binario. Las fases móviles A y B se
fijaron como agua y metano respectivamente y los ácidos fórmicos se añadieron como
aditivo de fase móvil a una concentración de 0.001% (v / v). El flujo se ajustó a 0.4 mL/
min y la temperatura de la columna se mantuvo a 30 ° C. La proporción de fase móvil
inicial del 50% (H2O) y el 50% (metano) se mantuvo durante 1 minuto. La fase móvil luego
se redujo al 10% en 4.5 minutos y después de eso la fase móvil se redujo drásticamente al
0% en 0.1 min y se mantuvo durante 1 minuto para limpiar la columna usando 100% de
fase móvil orgánica ACN. Al final, se hizo pasar agua al 85% inicial por 0.1 min y se
mantuvo durante 1 min para equilibrar la columna antes de la siguiente inyección y una
carrera total de 7.7 minutos.
Identificación del intermediario con espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier
(FTIR). Los productos obtenidos de la extracción del compuesto de hidrocarburo se dejaron
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secar al aire y se verificó aproximadamente 1 mg en el espectrómetro Bruker Alpha FT-IR
(AXS Inc., Madison, WI, EE. UU.) Para determinar los grupos funcionales constituyentes.
Secuenciación y análisis del genoma completo.
Una vez que se extrajo el ADN genómico usando el kit de extracción de Promega, este
DNA genómico bacteriano fue enviado para la secuenciación del genoma completo en
MyGenomics USA. Los genomas fueron secuenciados con una secuenciación de nueva
generación usando Illumina miseq. La calidad de las lecturas se verificó con fastqc y las
lecturas sin procesar se recortaron con la versión 4.10 en abundancia, que también filtró las
lecturas con mala calidad. El ensamblaje del genoma de novo se llevó a cabo con un
ensamblador autónomo del genoma Spades 3.1.1 (Centro de biotecnología algorítmica,
Universidad Estatal de San Petersburgo, Rusia) Bankevich, et al., (2012). La calidad del
ensamblaje se verificó con la herramienta autónoma QUAST y el genoma se anotó usando
un software de anotación Prokka (Seemann, 2014). Los contigs ensamblados se redujeron a
uno con el uso de un scaffolder en línea MedusaCombo (Bosi et al., 2015) Pan y Core
genoma análisis se realizó con Bacterial Pangenome herramienta de análisis (BPGA)
(Chaudhari et al., 2016). Las islas genómicas se predijeron con un visor Island en línea4
Bertelli et al., (2017). El software PHAST fue empleado para la predicción de la posible
presencia de un profago (Zhou et al., 2011). Para la presencia de dos componentes del
sistema fue predicha por la webtool en línea PS2P Barakat et al., (2013),
mientras que la anotación funcional de los genes se realizó con WebMGA (http://weizhong-
lab.ucsd.edu/metagenomic-analysis) (Wu et al., 2011). La anotación del contenido
funcional de los genes asociados con la isla genómica y el gen único predicho para
Stenotrophomonas sp. Pemsol se hizo con blast2go (Conesa et al., (2005). El análisis
genómico comparativo de Stenotrophomonas sp. Pemsol se realizó utilizando MAUVE
(Darling et al., 2004), J speciesWS (Richter et al., 2016) y GGDH (Auch et al., 2010)
(Markowitz, 2011).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Fueron aisladas dos especies de Stenotrophomonas sp y designadas como ASS1 y SVIA2.
Las técnicas de identificación molecular y bioquímica confirmaron que los aislados son
miembros del género Stenotrophomonas sp (Figura 1 y Tabla 1).
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Figura 1 : Filogenia de las cepas y de otros cepas de Stenotrophomonas sp reportadas
Tabla 1. Características Bioquímicas de los Aislados.
Azucar/Sales SVIA2 ASS1
Manitol + +
Arabinosa + +
Glucosa + +
Sucrosa - -
Trehalosa + +
Lactosa - -
maltosa + +
Mannosa + +
S maltophilia strain KNUC360
Stenotrophomonas sp. RASOB4
Uncultured Steno sp. clone K2DN299
S pavanii LMG
ASS1
ASS2
StenoSVIA2
SVIA1
Pseudoxanthomonas japonensis 12-3
Xanthomonas campestris
Pseudoxanthomonas dokdonensis DS-16
Stenotrophomonas humi R-32729
Stenotrophomonas terrae R-32768
stenopemso
Lysobacter antibioticus
Lysobacter enzymogene DSM 2043T
Pseudomonas trivialis DSM 14937
Pseudomonas fluorescens CCM 2115
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Fructosa + +
Galactosa + +
Dulcitol - -
Lysina - +
Gelatina - -
Tween80 + +
Ureasa - -
Almidón - -
Esculina - +
Fenilalanina + +
El análisis de búsqueda del rRNA 16S parcialmente secuenciado de cepas aisladas mostró
una identidad del 99% con las cepas secuenciadas previamente de Stenotrophomonas
maltophilia recuperadas de la base de datos del NCBI. El análisis filogenético mostró que
los aislados se agruparon estrechamente con los miembros del género Stenotrophomonas
sp. Los aislamientos crecieron eficazmente en un medio mínimo con los hidrocarburos
probados excepto el xilenol. Este crecimiento fue confirmado por el recuento de colonias y
el análisis espectrofotométrico (Figura 2).
a : Crecimiento de ASS1 en Antraceno b: Crecimiento de SVIA2 en fenantreno
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c: Crecimiento de SVIA2 en mezcla de HPA
Figura 2: Crecimiento de cepas de los HPA seleccionados
Análisis de biodegradación
Se sabe que las Stenotrophomonas sp son un grupo muy versátil de bacterias Gram
negativas con diferentes potenciales metabólicos, entre las cuales está su potencial para
degradar xenobióticos, compuestos poli-aromáticos y organofosforados Ryan et al., (2009).
Varias cepas de Stenotrophomonas maltophilia con las capacidades mencionadas
anteriormente se han aislado de diferentes entornos que van desde entornos estables a
entornos extremos, como entornos altamente ácidos o básicos (Arulazhagan et al., (2017)
(Boonchan et al., 2000) (Gao et al., 2013) (Samanta et al., 2002) (Seemann, 2014)
(Tebyanian et al., 2013). Las especies de Stenotrophomonas sp que aislamos pudieron
tolerar 1% y 5% de 100mg / mL (≈ 1mg / mL y 5mg / mL) de cinco de los hidrocarburos
analizados ((bifenilo, fenantrenol, fenantridina, naftaleno y antraquinona) y 1% y 5 % de 40
mg / mL (geq 400 \ mu g / mL y 2 mg / mlL) de antraceno). Esto demostró que los aislados
tienen la tendencia a utilizar hidrocarburos como fuente de carbono a la concentración
evaluada.
El potencial de los aislados para degradar la HPA evaluada mediante el ensayo de emulsión
descrito por Peter and Singh, (2014) (Panjiar et al., 2015) reveló que poseen la capacidad
de utilizar la emulsificación como estrategia para atrapar los HPA de la superficie líquida
adherida. (Figura 3).
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Figura 3: Bioemulsificación aislados de Stenotrophomonas sp.
Se ha dicho que la degradación de hidrocarburos puede mejorarse mediante la bioemulsión,
que hace que los hidrocarburos hidrofóbicos estén disponibles para el uso de bacterias [8].
Aunque los resultados obtenidos del ensayo de bioemulsificación mostraron que los
aislamientos podían emulsionar HPA, otros mecanismos están implicados en la absorción y
degradación de los HPA y otros hidrocarburos por bacterias [22]. El ensayo de
biodegradación y el análisis con GC-MS o LC-MS se han utilizado para explicar la vía de
biodegradación de las bacterias que degradan la HPA. Del mismo modo, la secuenciación
del genoma completo ofrece una enorme ventaja en la comprensión del mecanismo de
degradación de los HPA bacterianos.
La capacidad de los aislados para degradar los HPA se evaluó en un estudio de degradación
y el compuesto resultante formado después de la degradación se evaluó usando un enfoque
tanto cuantitativo como cualitativo. El análisis cuantitativo utilizando espectrometría FTIR
después de los días 15 y 30 de incubación mostró que las bacterias tienen el potencial de
degradar naftaleno. La degradación de naftaleno por especies de Stenotrophomonas sp
parece seguir la vía de la catecol dioxigenasa como lo indica la introducción del grupo
hidroxilo a la estructura de Naftaleno y la presencia de varios grupos carbonilo e hidroxilo
en la estructura de Naftaleno después de 30 días. Este análisis cuantitativo, por lo tanto,
mostró que las cepas aisladas podrían degradar naftaleno (Figura 4).
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Figura 4: Análisis de la Biodegradación por FTIR
Cromatografía UPLC-MS
El análisis de los metabolitos intermedios formados después del análisis de biodegradación
reveló que la degradación de naftaleno siguió la ruta de degradación del catecol para
naftaleno como un pico correspondiente al peso molecular del catecol (figura 5).
Control
Muestra después de 15 días de tratamiento Muestra después de 30 días de tratamiento
Naftaleno
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Figura 5: Análisis de la degradación de productos después de 22 días, por UPLC-MS.
Estudios previos han demostrado que las especies de Pseudomonas sp pueden degradar
naftaleno utilizando diferentes enzimas a través de la vía de degradación de naftaleno-
catecol (Eaton and Chapman, 1992).
Análisis de secuenciación del genoma completo.
Pudimos reducir los genomas de los aislamientos a solo un contig de los 69 andamios
iniciales y 400 andamios generados por el ensamblaje de novo para ASS1 y SVIA2,
respectivamente. El contenido de GC del genoma fue de 66.59 y 65.62 respectivamente
(Tabla 2).
Características Genoma
SVIA2 ASS1
DNA total numero de bases 4497327 4613196
DNA contenido G + C (%) 65.62 66.59
Protein coding gene 4028 4108
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Pseudo genes 0 0
rRNA 5 7
5S rRNA 1 2
16S rRNA 2 4
23S rRNA 2 1
tRNA 76 75
Profagos 2 1
El genoma de la cepa ASS1 codifica para una proteína de 4108 (CDS) con una longitud de
secuencia de 4613196, 76 genes de ARNt y 7 genes de ARNr. La cepa SVIA2 en sí misma
tiene una longitud de secuencia total de 4497327 y codifica 4028 proteínas CDS. Tiene 77
tRNA y 5 rRNA. Ambos aislamientos mostraron mayor sintenia con Stenotrophomonas
maltophilia K279a en comparación con otros genomas de Stenotrophomonas sp.
El análisis funcional de los dos genomas reveló que ambos genomas contienen genes que se
han asociado con la degradación de hidrocarburos poliaromáticos. Los genes incluyen la
enzima COG0346 de la familia de lactoil-glutatión liasa, que se sabe que están asociados
con la biodegradación del Mesarca hidrocarbonado aromático
(Mesarch et al., 2000). Otros genes identificados en los genomas de las cepas aisladas
incluyen alcohol deshidrogenasa, alcano 1 monooxigenasa, haloalcano deshidrogenasa,
fosfolípido diacilglicerol acil transferasa, succinato deshidrogenasa y glutatión s
transferasa. Todos los cuales se ha informado que están involucrados en la degradación de
HPA y otros hidrocarburos. La presencia de estas enzimas en el genoma de los aislados
confirmó su capacidad potencial en la degradación de hidrocarburos.
CONCLUSIONES
Las cepas de Stenotrophomonas sp ASS1 y SVIA2 crecieron y degradaron los HPA
probados, además se encontró que codifica diversos genes asociados con la degradación de
los HPA, según se revelado en el análisis de secuenciación del genoma completo.
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La degradación de los Hidrocarburos Poli Aromáticos probados siguió la ruta de
degradación de los HPA que implica la producción de catecol y salicilatos.
Impacto del estudio
El estudio reveló la posibilidad de utilizar especies de Stenotrophomonas sp para la
degradación de los HPA, de ahí su uso como agente bioremediador para sitios
contaminados con HPA.
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Politécnico Nacional, a la Secretaria de Investigación y Posgrado del Instituto
Politécnico Nacional y a la Comisión de Operación y Fomento de Actividades Académicas,
así como por la Beca BEIFI otorgada.
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