SIR MYCOPLASMA 6278110 TESTSANTIBIOGRAMME DES MYCOPLASMES URO-GENITAUX

1- INTERET CLINIQUESIR MYCOPLASMA est un réactif conçu pour l'antibiogramme desmycoplasmes uro-génitaux : Ureaplasma spp (Ureaplasma urealyticum,Ureaplasma parvum) et Mycoplasma hominis (Mh). Aujourd’hui, lediagnostic différentiel d’identification entre Ureaplasma urealyticum etU. parvum est difficile à réaliser.C'est une microplaque contenant 8 antibiotiques actifs sur ces bactérieset couramment utilisés dans le traitement des infections génitales.L'apparition de souches résistantes, en particulier aux cyclines et auxmacrolides (antibiotiques utilisés en première intention) (10, 11, 18), rend lapratique de l'antibiogramme indispensable pour éviter les échecsthérapeutiques.L'inoculum standardisé confère à cette technique une très bonneconcordance avec la méthode de référence (9).

2- PRINCIPESIR MYCOPLASMA est un antibiogramme en milieu liquide où chaqueantibiotique est présent à deux concentrations différentes (doxycycline,tétracycline, azithromycine, josamycine, érythromycine, ofloxacine) ou àune seule concentration (clindamycine, pristinamycine). Son principe repose sur l'inhibition métabolique.La croissance des mycoplasmes est objectivée par leur activitémétabolique : hydrolyse de l'urée en bouillon U9 par Ureaplasma spp ethydrolyse de l'arginine en bouillon arginine par Mh, avec libérationd'ammoniaque qui alcalinise le milieu et fait virer du jaune au rougel'indicateur de pH (rouge de phénol).Si le germe est sensible à l'antibiotique testé, son métabolisme est inhibéet le milieu reste jaune.Si le germe est résistant, il se développe et le milieu vire au rouge.

3- PRESENTATIONSIR MYCOPLASMA comprend :• 10 microplaques SIR (le schéma des 16 cupules est reproduit sur une

étiquette permettant aussi l'identification du prélèvement).• 10 adhésifs.• 1 notice.Chaque microplaque est conditionnée sous sachet individuel enaluminium avec un adhésif et un sachet déshydratant.

4- CONSERVATIONConservé à + 2 - 8°C, SIR MYCOPLASMA peut être utilisé jusqu'à la datede péremption indiquée sur le coffret.

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5- MATERIEL NECESSAIRE NON FOURNI• Bouillon U9 : code 62762 (coffret de 10 ampoules de bouillon U9

lyophilisé Q.S.P. 2 ml)• Bouillon arginine : code 62763 (coffret de 10 ampoules de bouillon

arginine lyophilisé Q.S.P. 2 ml)• MYCOPLASMA DUO (coffret de 20 tests - code 62740)• Eau distillée stérile• Pipettes distribuant 2 ml, 200 µl, 100 µl, 20 µl• Etuve à 37°C• Récipient pour déchets contaminés

6- MODE OPERATOIRE

A) LA MICROPLAQUE SIRC'est une barrette constituée de 2 rangées de 8 cupules dans lesquellessont déposés les différents antibiotiques. Ils sont réhydratés au momentde la distribution de l'inoculum. Les concentrations dans les cupules sontalors voisines des concentrations critiques, ce qui permet d'attribuer auxsouches testées un profil de sensibilité traduit en : Sensible, Intermédiaireou Résistant, pour chaque antibiotique.

Témoin de croissance sans antibiotique

Doxycycline (4 mg/L et 8 mg/L)

Tetracycline (4 mg/L et 8 mg/L)

Azithromycin (2 mg/L et 4 mg/L)

Josamycin (2 mg/L et 8 mg/L)

Erythromycin (1 mg/L et 4 mg/L)

Clindamycin (2 mg/L)

Pristinamycin (2 mg/L)

Ofloxacin (1 mg/L et 4 mg/L)

B) LE CHOIX DES ANTIBIOTIQUESLe choix des antibiotiques à tester a été effectué selon la prescriptionthérapeutique conseillée pour les infections néonatales, et génitales àmycoplasmes (17). Il n’existe à ce jour aucune concentration critiquespécifique aux mycoplasmes; par conséquent, les concentrations critiqueschoisies dans la galerie SIR MYCOPLASMA se réfèrent à celles publiées dansdifférentes revues scientifiques et/ou recommandées par défaut par quelquessociétés savantes tels que le CA-SFM (Comité de l’antibiogramme – SociétéFrançaise de Microbiologie). En ce qui concerne le choix des concentrations

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Ureaplasma spp

Mycoplasma hominis

OFX 1

OFX 4PT 2

E 4JM 8 AZM 4

TE 8DO 8

CM 2E 1

JM 2 AZM 2TE 4

DO 4Tc

Tc

SIR MYCOPLASMA

d’azithromycine, il s’appuie sur une évaluation réalisée sur des souchescliniques (19).

Cyclines testées : tetracycline et doxycycline (aux concentrations de 4 et8 mg/L).Les souches de Mh et Ureaplasma spp. décrites comme résistantes à latétracycline sont détectées sans ambigüité puisque il a été publié que lesConcentrations Minimales Inhibitrices (CMI) étaient alors ≥ 8 mg/L aucontraire des souches sensibles (CMI ≤ 2 mg/L) (15, 18). Il existe desrésistances de bas niveau pour cette classe d’antibiotique qui nécessitentun délai d’incubation de 48 heures (19). Le taux de fréquence des souchesrésistantes aux cyclines varie selon le pays et le taux d’exposition auxantibiotiques (18).

Macrolides testés : erythromycine (aux concentrations de 1 et 4 mg/L),azithromycine (aux concentrations de 2 et 4 mg/L), josamycine (auxconcentrations de 2 et 8 mg/L).Les souches de Mh ont une résistance naturelle vis à vis del’érythromycine et l’azithromycine. La josamycine reste active. Parconséquent, les résultats obtenus pour ces antibiotiques doivent confortésl’identification déjà effectuée de la souche. La fréquence de la résistanceacquise aux macrolides chez les souches isolées en clinique de Mh etUreaplasma spp est inconnue mais probablement très basse (18).

Lincosamide testé : clindamycine (à une concentration de 2 mg/L).Les souches d’Ureaplasma spp ont une résistance naturelle vis à vis decet antibiotique (18).

Streptogramine testée : pristinamycine (à une concentration de 2 mg/L).Les souches de mycoplasmes sont très sensibles à cet antibiotique.

Fluoroquinolone testée : ofloxacine (aux concentrations 1 et 4 mg/L).C’est une molécule active sur Mh et Ureaplasma spp. La fréquence derésistance est peu connue, estimée moins de 1% pour Ureaplasma spp.(6, 18).

C) RÉALISATION DE L'ANTIBIOGRAMMEL'antibiogramme peut être réalisé à partir du contenu de la cupule X deMYCOPLASMA DUO (code 62740).Pour la durée et la température de conservation des échantillonsbiologiques, se référer aux recommandations en vigueur (13).

1) Standardisation de l'inoculumAfin d'ensemencer l'antibiogramme avec un inoculum contenant 103 à 105

UCC/ml (UCC = Unité Changeant la Couleur) il est indispensable de faireune pré-culture du milieu ensemencé avec le prélèvement.

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Cette pré-culture, réalisée selon les protocoles décrits ci-après, conduit àune multiplication des mycoplasmes jusqu'à un titre maximum de 106 à107 UCC/ml. Une dilution au 1/100e de cette pré-culture, en bouillon U9 ouen bouillon arginine suivant l'espèce isolée, réalise un inoculumstandardisé.

• A partir de MYCOPLASMA DUOLorsque l'on réalise l'antibiogramme à partir de MYCOPLASMA DUO, lecontenu de la cupule X à 24 ou 48 heures d'incubation pour Mh, à24 heures pour Ureaplasma spp, correspond à la pré-culture; il suffit dediluer le contenu de cette cupule en bouillon U9 ou arginine, selon leprotocole décrit ci-dessous pour obtenir l'inoculum standardisé.

1. Pour Mycoplasma hominisA partir de la cupule X (à 24 ou 48 h d'incubation), réaliser une dilutionau 1/100e en bouillon arginine (20 µl du contenu de la cupule X dans2 ml de bouillon arginine).

2. Pour Ureaplasma spp• A 24 h d'incubation : réaliser une dilution au 1/100e du contenu de la

cupule X en bouillon U9 (20 µl du contenu de la cupule X dans 2ml debouillon U9).

• A 48 h d'incubation : dans ce cas, il est impossible de repartir de lacupule X (les Ureaplasma risquant d'être autolysés): réaliser en bouillonU9, une dilution au 1/10e du milieu de suspension-transport qui a étéconservé à + 4°C (200 µl dans 2 ml de bouillon U9).

• A partir d’un bouillon de culture enrichi en mycoplasmesLe prélèvement uro-génital peut être déchargé dans un milieu de culturespécifique pour les mycoplasmes (15). Si il y a attente des résultats del’identification et de la numération, la réalisation de l’antibiogramme estalors différée et le milieu peut être conservé à +4°C (cf la notice du milieude culture utilisé). Par la suite, une incubation à 37 °C pendant 16 heuresdu milieu de culture est préconisée afin d’obtenir un inoculum enrichi enmycoplasmes. Le titre habituel est alors 106–107 UCC/ml. La réalisation del’antibiogramme selon les recommandations publiées (15) préconise uninoculum standardisé. Donc, 20 µL de ce milieu de culture enrichi sontalors repris dans 2 ml de bouillon U9 ou Arginine (dilution au 1/100ème )selon l’identification de la souche de mycoplasme obtenue.

2) Distribution de l'inoculum standardiséDistribuer 100 µl de l'inoculum standardisé (dilution au 1/100e de la pré-culture,en bouillon U9 ou arginine) dans chaque cupule de la microplaque SIRRecouvrir la microplaque avec l'adhésif et incuber à 37°C pendant 48 heures.

17

18

SIR

MY

CO

PLA

SM

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MIL

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SIO

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AN

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RT

- co

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rvé à

+ 4

°C

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D) PRÉLÈVEMENTS CONTENANT Ureaplasma spp et MhDans ce cas, ensemencer 2 microplaques SIR : l'une avec l'inoculumstandardisé réalisé en diluant dans un bouillon U9 (antibiogramme de lasouche d' Ureaplasma spp), l'autre avec l'inoculum standardisé réalisé endiluant dans un bouillon arginine (antibiogramme de la souche Mh).

7- INTERPRETATION DES RESULTATSL'interprétation de l'antibiogramme se fait dès que les cupules Témoin deCroissance ont viré du jaune au rouge.On réalise une lecture à 24 h et une autre à 48 h, la lecture à 48 hpermettant de déceler les résistances de bas niveau pour les cyclines (19),de confirmer tout résultat lorsque l’inoculum de départ peut s’avérer faible(103 UCC/ml) ou lorsque le virage est apparu douteux en 24 heures.

Pour la clindamycine et la pristinamycine (une seule concentration),2 résultats seulement sont possibles : Sensible ou Résistant.

Exemple :

jaune / jaune : S souche Sensible

rouge / jaune : I souche Intermédaire

rouge / rouge : R souche Résistante

Cas particulier : visualisation d’une couleur orangée.Un début de virage du jaune au rouge donnant lieu à une couleur orangéepeut être observé dans les cupules à faible concentration. Celui-ci doitêtre interprété comme positif et un virage franc peut être obtenu en48 heures.

8- CONTROLE QUALITE DU FABRICANTTous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Radsont placés sous un système d'assurance qualité de la réception desmatières premières jusqu'à la commercialisation des produits finis.

19

JM2

TE4

AZM2

JM8

TE8

AZM4

2 cupules jaunes :Absence de croissanceSouche sensible

2 cupules rouges :Croissance en présence d’antibiotiqueSouche résistante

La cupule à faible concentration d’antibiotique : rougeLa cupule à forte concentration d’antibiotique : jaune

Souche intermédiaire

Chaque lot de produit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'estcommercialisé que s'il est conforme aux critères d'acceptation. Ladocumentation relative à la production et au contrôle de chaque lot estconservée par le fabricant.

9- CONTROLE DE QUALITE INTERNELe contrôle de qualité peut être réalisé à partir d’une souche de collectionlyophilisée (Ureaplasma parvum ATCC 700970). Remettre en suspension lasouche lyophilisée avec 1 ml de milieu U9 reconstitué (référence 62762) aupréalable. Réaliser une dilution au 1/10 ème dans un nouveau milieu U9reconstitué au préalable.Incuber ce milieu U9 ensemencé à 37°C pendant 18 heures sousatmosphère aérobie.A partir de ce milieu U9 enrichi en Ureaplasmes, réaliser une dilution au1/100 ème (prélever 20 µl du milieu et les transférer dans un bouillon U9de 2 ml reconstitué).L’ensemencement de la galerie SIR MYCOPLASMA est réalisé selon leprotocole habituel à savoir 100 µl dans chaque cupule. Recouvrir la galerieavec un adhésif et incuber à 37°C pendant 48 heures. L’interprétation dela galerie est possible si les cupules du témoin de croissance ont viré dujaune au rouge.

Le profil attendu est le suivant :

10- PERFORMANCESUne première évaluation a été réalisée sur la galerie SIR MYCOPLASMA.Par la suite, le choix des antibiotiques testés a évolué en fonction dutraitement thérapeutique et l’antibiogramme SIR MYCOPLASMA a étéévalué une nouvelle fois sur les cupules modifiées à savoir l’azithromycine.

Pour les deux évaluations citées ci dessous, la méthode de référenceutilisée est celle des concentrations minimales inhibitrices en milieuliquide (CMI) (6, 15).

La première évaluation (sans les cupules d’azithromycine) a été réaliséesur 80 souches dont 60 souches de Ureaplasma spp et 20 souches deMycoplasma hominis (9).

20

Témoincrois-sance

Témoincrois-sance

DO4– 8

mg/L

TE4– 8

mg/L

JM2– 8

mg/L

AZM2– 4

mg/L

E1– 4

mg/L

CM2

mg/L

PT2

mg/L

OFX1– 4

mg/L

+ + S S S S S/I R S S/I

Avec les souches d’Ureaplasma spp :

Pour les tetracyclines, les pourcentages de concordance varient de 90 %[79,5-96,2 %]a à 95 % [86,1-99 %]a selon les antibiotiques.

Pour les macrolides, les pourcentages de concordance varient de 92 %[81,6-97,3 %]a à 100 % [95,1-100 %]a selon les antibiotiques.

Pour la clindamycine, le pourcentage de concordance est de 85 % [73,4-92,9 %]a

Pour la pristinamycine, le pourcentage de concordance est de 100 %[95,1-100 %]a.

Pour les fluoroquinolones, le pourcentage de concordance est de 93 %[83,8-98,2 %]a.

Avec les souches de Mycoplasma hominis :

La concordance est de 85 % [62,1-96,8 %]a avec la tetracycline et de100 % [86,1-100 %]a avec tous les autres antibiotiques.

La concordance totale pour l’ensemble des antibiotiques précédemmentcités est de 94,6 % [92,4-96,4 %]a avec 2.6 % de discordances majeures.Aucune souche n’a été rendue sensible avec la galerie SIRMYCOPLASMA alors qu’elle était résistante en méthode de référence(aucune discordance très majeure).

Une deuxième évaluation a été réalisée suite au remplacement descupules de minocycline par l’azithromycine aux concentrations 2 et4mg/L.

Une étude comparative a été réalisée entre la méthode de déterminationdes CMI en milieu liquide et la galerie SIR MYCOPLASMA pour lescupules d’azithromycine. Les souches testées sont des souches deréférence ainsi que des souches cliniques sauvages. Chaque inoculum aété standardisé et confirmé pour être dans les limites acceptables etrecommandées à savoir 104 et 105 UCC/ml (15). Les résultats des deuxméthodes sont interprétés en Sensible (S), intermédiaire (I), Résistant (R)selon les concentrations de la galerie.

Pour 15 souches de référence de mycoplasmes (13 souches ATCCUreaplasma spp et 2 souches ATCC Mycoplasma hominis ) , lepourcentage de concordance pour la catégorisation clinique S ou R est de100 % [81,9-100 %] a. Toutes les souches de Ureaplasma spp donnent unprofil sensible et les deux souches de Mycoplasma hominis ont un profilrésistant correspondant ainsi à la résistance naturelle de cette espèce.

Pour 15 isolats cliniques de Ureaplasma spp, la concordance est de 100%[81,9-100 %]a entre la catégorisation clinique donnée par la galerie SIRMYCOPLASMA et celle obtenue avec les CMI de référence.a : [IC 95%] = intervalle de confiance à 95%.

21

11- LIMITES DU TEST Un virage au rouge associé à un trouble traduit une croissancemicrobienne autre que celles de mycoplasmes (la croissance de cesderniers laissant un bouillon limpide) ; ce phénomène pouvant êtreobservé dans les bouillons de culture arginine et U9 s’ils ont été incubés à37 °C. Confirmer sur gélose chocolat la présence de bactéries autres.L’interprétation finale, comme pour toute interprétation biologique, ne peutêtre prise sur le résultat d’un seul test mais par un ensemble de donnéescliniques et de résultats biochimiques, cytologiques et immunologiques.Si l ’ inoculum nécessaire à l’ensemencement de la galerie SIRMYCOPLASMA est faible (<103 UCC/ml), le virage des cupules peut êtrealéatoire. Devant tout résultat aberrant, il est recommandé de refaire uninoculum standardisé et un antibiogramme avec une galerie SIRMYCOPLASMA.Si pour un antibiotique donnée, la cupule avec la plus forte concentrationest rouge et celle avec la plus faible concentration de couleur jaune, lerésultat est inexploitable. Il est recommandé de refaire un nouvelantibiogramme à partir d’un nouvel inoculum standardisé.Il est connu que les macrolides principalement l’érythromycine sontsensibles à l’influence du pH (14). En effet, un virage de la cupule de faibleconcentration peut être observé impliquant un rendu de résultatintermédiaire sous l’effet du pH et non de l’activité de l’antibiotique. Ce phénomène de virage peut être aussi constaté avec les cupulesd’azithromycine.

12- REFERENCES 1. BEBEAR C. Activité comparée de la minocycline et doxycycline sur les mycoplasmes pathogènes pour l'homme.

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