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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE FARMÁCIA
Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos
Mestrado em Ciência de Alimentos
FILMES DE FÉCULA DE MANDIOCA E GLICEROL,
REFORÇADOS COM NANOCELULOSE E ATIVADOS COM
PRÓPOLIS VERMELHA
SAMANTHA SERRA COSTA
Salvador
2013
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SAMANTHA SERRA COSTA
FILMES DE FÉCULA DE MANDIOCA E GLICEROL,
REFORÇADOS COM NANOCELULOSE E ATIVADOS COM
PRÓPOLIS VERMELHA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciência de Alimentos,
Faculdade de Farmácia, Universidade
Federal da Bahia, como requisito para a
obtenção do grau de Mestre em Ciência
de Alimentos.
Orientadora: Professora Dra. Alaíse Gil Guimarães
Co-Orientadora: Professora Dra. Janice Izabel Druzian
Salvador
2013
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Sistema de Bibliotecas da UFBA
Costa, Samantha Serra. Filmes de fécula de mandioca e glicerol, reforçados com nanocelulose e ativados com própolis vermelha / Samantha Serra Costa. - 2013. 125 f.: il. Inclui anexo. Orientadora: Profª. Drª. Alaise Gil Guimarães. Co-orientadora: Profª. Drª. Janice Izabel Druzian. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Farmácia, Salvador, 2013. 1. Alimentos - Embalagens. 2. Agentes antiinfecciosos. 3. Bacillus cereus. 4. Bactérias. I. Guimarães, Alaise Gil. II. Druzian, Janice Izabel. III. Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Farmácia. IV. Título. CDD - 664.09 CDU - 664
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AGRADECIMENTOS A Deus, pelo Dom da vida, e pela presença constante em todos os meus caminhos!
A toda minha Família! Meus pais, Jeovan e Tania, meus irmãos, Ariane e Jenilson, e minha sobrinha Tainá, pela presença constante em minha vida!
A minha orientadora prof. Dra. Alaíse Gil Guimarães, não somente por compartilhar todo seu conhecimento, mas pela sua confiança, dedicação e incentivo... Tenho certeza que o mestrado tornou-se mais leve por ter seu apoio!
A minha co-orientadora prof. Janice Druzian por dividir seus conhecimentos, pelo constante incentivo a pesquisa e por acreditar na minha capacidade, me fazendo almejar sonhos mais cada vez mais altos. Sua confiança no nosso trabalho foi fundamental para o sucesso da pesquisa! Muito obrigada!
A minha amiga Andréa Lôbo, por estar ao meu lado nos momentos fáceis e díficies, me incentivando, apoiando, deixando claro que nunca estive sozinha!
As amigas Lidia e Luciana, com as quais divide muitos momentos nesse período. Obrigada por compartilhar comigo as angústias, por transformar momentos díficies em risadas, pelas palavras e pelos infinitos momentos de descontração! Foi ótimo encontrar vocês!
A estagiária Palloma Souza pelo seu empenho e dedicação, fundamentais nesse processo.
A toda equipe do Lapesca pelo apoio, carinho e pelos momentos de descontração, que de forma muito direta contribuíram para realização desse trabalho!
A Luciane (Lu), por fazer mais que seu papel, sendo sempre atenciosa e amiga, uma verdadeira facilitadora do nosso trabalho. Sem você tudo seria muito mais difícil. Muito obrigada mesmo!
A Carol, Jânia, Tamara, Ingrid e Mariana que com todo conhecimento e muita paciência tornaram mais fácil o desenvolvimento desse trabalho. Vocês foram fundamentais!
A todos colegas de mestrado por compartilhar comigo momentos de alegria e dificuldades durante todo período.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação pelos ensinamentos!
À FAPESB pela bolsa de mestrado e a CAPES pelo financiamento do Projeto Nanobiotec- 757/09.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para realização desse trabalho!
Muito obrigada!!!
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ÍNDICE
Introdução Geral ............................................................................................. 16
Referências ..................................................................................................... 18
Objetivos ......................................................................................................... 20
Objetivo Geral .................................................................................................. 20
Objetivos Específicos ....................................................................................... 20
Capítulo I ......................................................................................................... 21
Revisão Bibliográfica ..................................................................................... 21
1- Embalagens de Alimentos ......................................................................... 22
1.1- Filmes Biodegradáveis .............................................................................. 23
1.2- Filmes Ativos ............................................................................................. 24
2- Amido .......................................................................................................... 26
2.1- Estrutura dos Grânulos ............................................................................. 28
2.2- Gelatinização e Retrogradação ................................................................. 30
2.3- Filmes a base de amido ............................................................................ 31
3- Nanocelulose .............................................................................................. 35
4- Glicerol ........................................................................................................ 38
5- Própolis ....................................................................................................... 39
5.1- Composição e Classificação ..................................................................... 39
5.2- Própolis Vermelha ..................................................................................... 42
5.2.1- Atividade Antimicrobiana ........................................................................ 43
5.2.2- Potencial Alergênico............................................................................... 45
Referências ..................................................................................................... 47
Capítulo II ........................................................................................................ 53
Desenvolvimento e avaliação da ação antimicrobiana de filmes de fécula
de mandioca e glicerol, adicionados de nanocelulose e própolis vermelha
......................................................................................................................... 53
Resumo ........................................................................................................... 54
Abstract ........................................................................................................... 55
1-Introdução .................................................................................................... 56
2- Ensaios Preliminares ................................................................................. 57
2.1- Determinação das Concentrações de Fécula de Mandioca e Glicerol ...... 57
7
2.2- Interferência da luz UV .............................................................................. 58
2.3- Concentração de Compostos Fenólicos ................................................... 59
2.4- Atividade Antimicrobiana ........................................................................... 59
3- Planejamento Experimental ...................................................................... 60
4- Material e Métodos ..................................................................................... 61
4.1- Obtenção da Nanocelulose (Nw) .............................................................. 61
4.2- Caracterização da Nanocelulose .............................................................. 64
4.2.1- Birrefringência da Supensão de Nanocelulose ...................................... 64
4.2.2- Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) ...................................... 64
4.2.3- Análise Termogravimétrica (TG) ............................................................ 64
4.3- Obtenção do Extrato de Própolis Vermelha .............................................. 65
4.4- Caracterização do Extrato de Própolis vermelha ...................................... 65
4.4.1- Concentração de Compostos Fenólicos Totais ...................................... 65
4.4.2- Teste de Difusão em Ágar ...................................................................... 66
4.4.3- Análise Termogravimétrica ..................................................................... 67
4.5- Elaboração dos Filmes .............................................................................. 68
4.6- Caracterização dos Filmes ........................................................................ 68
4.6.1- Concentração de Compostos Fenólicos Totais ...................................... 69
4.6.2- Espessura .............................................................................................. 69
4.6.3- Atividade de Água .................................................................................. 69
4.6.4- Umidade ................................................................................................. 69
4.6.5- Solubilidade em Água ............................................................................ 70
4.6.6- Permeabilidade ao Vapor de Água ........................................................ 70
4.6.7- Propriedades Mecânicas ........................................................................ 71
4.6.8- Propriedades Térmicas .......................................................................... 72
4.6.8.1- Análise Termogravimétrica (TG e DTG) .............................................. 72
4.6.9- Colorimetria ............................................................................................ 72
4.6.10- Atividade Antimicrobiana in vitro .......................................................... 72
4.6.11- Atividade Antimicrobiana em Queijo Coalho ........................................ 73
4.7- Análise Estatística ..................................................................................... 74
5- Resultados e Discussão ............................................................................ 75
5.1- Preparação da Nanocelulose .................................................................... 75
5.2- Caracterização da Nanocelulose .............................................................. 75
8
5.2.1- Birrefringência da Supensão de Nanocelulose ...................................... 75
5.2.2- Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) ...................................... 76
5.2.3- Análise Termogravimétrica (TGA) .......................................................... 77
5.3- Extrato de Própolis Vermelha .................................................................... 79
5.4- Caracterização do Extrato de Própolis Vermelha ...................................... 79
5.4.1- Concentração de Compostos Fenólicos Totais ...................................... 79
5.4.2- Teste de Difusão em Ágar ...................................................................... 80
5.4.3- Análise Termogravimétrica (TGA) .......................................................... 83
5.5- Caracterização dos Filmes ........................................................................ 84
5.5.1- Concentração de Compostos Fenólicos Totais ...................................... 84
5.5.2- Espessura .............................................................................................. 86
5.5.3- Atividade de Água, Solubilidade e Umidade .......................................... 89
5.5.5- Permeabilidade ao Vapor de Água ........................................................ 92
5.5.6- Propriedades Mecânicas ........................................................................ 93
5.5.7- Propriedades Térmicas .......................................................................... 98
5.5.7.1- Análise Termogravimétrica (TG e DTG) .............................................. 98
5.5.8- Colorimetria .......................................................................................... 102
5.5.9- Atividade Antimicrobiana in vitro .......................................................... 106
5.5.10- Atividade Antimicrobiana em Matriz Alimentícia ................................. 111
6- Conclusão ................................................................................................. 114
Referências ................................................................................................... 116
Considerações Finais .................................................................................. 123
ANEXO I......................................................................................................... 125
9
LISTA DE FIGURAS
Capítulo I ......................................................................................................... 21
Revisão Bibliográfica ..................................................................................... 21
Figura 1 – Esquema de apresentação dos grânulos de amido de trigo (a),
batata (b), milho (c) e mandioca (d) (SANTOS, 2009 apud HOOVER e
MANUEL, 1996). .............................................................................................. 27
Figura 2 – Estrutura da amilose (FENIMAM, 2004). ......................................... 29
Figura 3 – Estrutura da amilopectina (FENIMAM, 2004). ................................. 29
Figura 4 – Estrutura química dos flavonoides (OLDONI, 2007). ...................... 40
Figura 5 – Própolis vermelha (RODRIGUES, 2010). ........................................ 42
Figura 6 - Locais e mecanismos de ação que podem ser sítios para ação de
compostos naturais na célula bacteriana (BURT, 2004). ................................. 43
Capítulo II ........................................................................................................ 53
Desenvolvimento e avaliação da ação antimicrobiana de filmes de fécula
de mandioca e glicerol, adicionados de nanocelulose e própolis vermelha
......................................................................................................................... 53
Figura 1 – Halos de inibição formados pelos filmes para Bacillus cereus e
Staphylococcus aureus, respectivamente. ....................................................... 59
Figura 2 – Fibra de licuri moída utilizada para a obtenção de nanocelulose. ... 61
Figura 3 – Processos de lavagem das fibras.................................................... 62
Figura 4 – Etapa de branqueamento. ............................................................... 63
Figura 5 – Etapas de centrifugação, diálise, banho de ultrassom e solução de
nanocelulose, respectivamente. ....................................................................... 63
Figura 6 – Etapas da obtenção dos extratos de própolis vermelha. ................. 65
Figura 8 – Solução filmogênica dos filmes (a) e filmes após secagem em estufa
(b). .................................................................................................................... 68
Figura 9 – Análise de permeabilidade ao vapor de água dos filmes. ............... 71
Figura 10 – Birrefrigência da nanocelulose de licuri. ........................................ 76
Figura 11 - Micrografia obtida da solução de nanocelulose de licuri com a
presença dos nanocristais. ............................................................................... 76
Figura 12 – Curva TG/DTG para a nanocelulose de licuri. ............................... 77
10
Figura 13 – Extratos de própolis vermelha nas concentrações de 0; 0,5; 1; 3; 5;
7 e 10%. ........................................................................................................... 79
Figura 14 – Teste de difusão em discos para Bacillus cereus.......................... 82
Figura 15 – Parede celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas
(SILVA, 2009). .................................................................................................. 83
Figura 16 – Curva TG/DTG para a própolis vermelha. ..................................... 84
Figura 17 – Gráfico de pareto para análise de compostos fenólicos totais. ..... 85
Figura 18 – Gráfico de pareto para análise de espessura dos filmes. .............. 87
Figura 19 – Gráfico de pareto e superfície de resposta para a análise de
Atividade de água. ............................................................................................ 90
Figura 21 – Gráfico de pareto para análise de solubilidade em água. ............. 91
Figura 22 – Gráfico de pareto da análise de permeabilidade ao vapor de água.
......................................................................................................................... 92
Figura 23 – Gráficos de pareto das propriedades mecânicas dos filmes. ........ 94
Figura 26 – Curvas DTG das formulações dos filmes. ................................... 100
Figura 27 – Curvas TG e DTG do amido de mandioca. ................................. 101
Figura 28 – Curvas TG e DTG do glicerol. ..................................................... 101
Figura 29 - Curvas de DTG dos constituintes dos filmes. .............................. 102
Figura 30 – Gráfico de pareto e superfície de resposta do parâmetro L* de cor.
....................................................................................................................... 104
Figura 31 – Gráficos de pareto para os parâmetros de cor a* e b* dos filmes.
....................................................................................................................... 105
Figura 32 – Coloração das formulações dos filmes. ....................................... 105
Figura 33 – Gráfico de pareto e superfície de resposta do teste in vitro sobre
Staphylococcus aureus. ................................................................................. 107
Figura 34 – Gráfico de pareto e superfície de resposta do teste in vitro sobre
Listeria monocytogenes. ................................................................................ 108
Figura 35 – Gráfico de pareto e superfície de resposta do teste in vitro sobre
Bacillus cereus. .............................................................................................. 109
Figura 36 – Correlação linear entre os diâmetros de inibição e a concentração
de própolis de de compostos fenólicos dos filmes. ........................................ 110
11
Figura 37 – Amostras de queijo submetidas ao teste de atividade
antimicrobiana. Em (a), queijo exposto, (b) embalado no polietileno, em (c)
embalado no filme controle e em (d) embalado no filme com própolis. .......... 112
Figura 38 – Eficácia antimicrobiana do filme ativo reforçado selecionado (F9)
sob queijo coalho embalado ao longo de 28 dias de armazenamento a 7ºC, em
função da contagens de estafilococs coagulase positiva. .............................. 113
12
LISTA DE TABELAS
Capítulo I ......................................................................................................... 21
Revisão Bibliográfica ..................................................................................... 21
Tabela 1 – Classificação da própolis de acordo com o teor de flavonoides
(BRASIL, 2001). ............................................................................................... 41
Tabela 2 – Requisitos físico-químicos exigidos pela Legislação Brasileira para
amostras de própolis (BRASIL, 2001). ............................................................. 41
Capítulo II ........................................................................................................ 53
Desenvolvimento e avaliação da ação antimicrobiana de filmes de fécula
de mandioca e glicerol, adicionados de nanocelulose e própolis vermelha
......................................................................................................................... 53
Tabela 1 – Concentrações de fécula e glicerol utilizadas nos testes de
formação dos filmes. ........................................................................................ 58
Tabela 2 – Valores codificados e reais das variáveis independentes estudadas
no DCCR. ......................................................................................................... 60
Tabela 3 – Diâmetros médios de inibição (cm) obtidos no teste de difusão em
poços, utilizando extratos alcoólicos de própolis em diferentes concentrações.
......................................................................................................................... 80
Tabela 4 – Diâmetros médios (cm) de inibição encontrados para o teste com
Bacillus cereus, utilizando o método de difusão em discos e em poços. ......... 81
Tabela 5 - Médias (± desvio padrão) das análises de caracterização das
formulações dos filmes e do controle (sem própolis). E (espessura); aw
(atividade de água); U (umidade-%), Compostos fenólicos totais (mg AG/g de
filme), S (solubilidade em água-%) e TPVA (permeabilidade ao vapor de água -
gH2O.μm/m2.h.mmHg). ................................................................................... 88
Tabela 6 – Valores do módulo de elasticidade, tensão de ruptura e da
deformação de todas as formulações. ............................................................. 95
Tabela 7 – Parâmetros da análises de TG: Tonset (temperatura de inicio da
degradação), Td (temperaturas de degradação e perda de massa (%). .......... 99
Tabela 8 - Parâmetros de cor dos filmes de amido e glicerol, incorporados com
diferentes concentrações de nanocelulose e própolis vermelha (Média ± desvio
padrão). .......................................................................................................... 103
13
Tabela 9 – Halos médios de inibição encontrados sobre os micro-organismos
avaliados. ....................................................................................................... 106
Tabela 10 - Equações do modelo e R2 (coeficiente de determinação) para as
análises de atividade antimicrobiana dos filmes sobre Staphylococcus aureus,
Listeria monocytogenes e Bacillus cereus, X= própolis e Y= Nanocelulose. . 110
Tabela 11 – Contagens de estafilococos coagulase positiva das amostras de
queijo coalho embaladas no filme com própolis e os controles. ..................... 112
14
RESUMO
Filmes biodegradáveis amtimicrobianos são filmes obtidos a partir de polímeros naturais, adicionados de agentes que têm como objetivo aumentar a vida de prateleira dos alimentos quando em contato com o produto acondicionado. Dentre os polissacarídeos utilizados para produção desses filmes, o amido tem sido estudado devido a sua grande disponibilidade, baixo custo e capacidade de formar filmes facilmente. Apesar dessas características, os filmes de amido enfrentam como principal problema para sua utilização, a baixa resistência mecânica, comum aos filmes biodegradáveis. Com isso, têm sido realizados estudos que visem a incorporação de nanomateriais, como a nanocelulose, que melhoram as propriedades mecânicas dos filmes. Entre os agentes antimicrobianos adicionados aos filmes para torna-los ativos, têm-se um interesse acentuado pelos produtos naturais, como os extratos de própolis brasileira. Das variedades de própolis, a vermelha se destaca pelos elevados teores de compostos fenólicos. Com isso, o objetivo do trabalho é desenvolver, caracterizar e verificar a eficiência antimicrobiana de filmes elaborados à base de amido e glicerol, reforçados com nanocelulose e incorporados com própolis vermelha como agente antimicrobiano. Para elaboração dos filmes, foram realizados ensaios com concentrações fixa de fécula (4%) e glicerol (1%), e com concentrações de nanocelulose entre 0 e 1%, e própolis vermelha entre 0,4 e 1%, de acordo com o planejamento experimental (11 formulações). Os filmes foram obtidos pelo processo casting, e caracterizados através de análises físico-químicas, térmicas e de barreira. A ação antimicrobiana dos filmes foi avaliada in vitro através do teste de difusão em ágar, sendo que também foi avaliada a eficácia antimicrobiana dos filmes como embalagem de queijo coalho. A nanocelulose foi extraída da fibra de licuri. A presença dos nanocristais aumentou á resistência á tração dos filmes e o módulo de elasticidade dos filmes, e reduziu a atividade de água, solubilidade e a permabilidade ao vapor de água dos filmes. As curvas de TG/DTG dos filmes apresentaram dois eventos de decomposição, para todas formulações. Comparando-se as curvas TG dos filmes com as dos seus constituintes observa-se que o perfil de degradação foi alterado, embora seja semelhante ao do amido, seu constituinte principal. Todas as formulações tiveram ação antimicrobiana sobre as bactérias estudadas nos testes in vitro, sendo que para as formulações sem própolis não houve formação de halos de inibição. Os resultados obtidos para contagem de Estafilococos Coagulase Positiva durante os 28 dias de armazenamento do queijo coalho demonstraram que o filme com própolis provocou a redução de 1 ciclo logarítmico na contagem desses micro-organismos, quando comparados com todos os controles. Os resultados obtidos indicam que os filmes podem ser uma alternativa competitiva para redução no uso de filmes sintéticos no acondicionamento de alguns alimentos, podendo exercer um efeito antimicrobiano. A estrutura dos nanocristais de celulose conferem não somente alta resistência aos filmes, mas também mudanças significativas em algumas de suas propriedades que são importantes para indústria de alimentos.
Palavras-chaves: Embalagens; Teste de difusão; filmes biodegradáveis.
15
ABSTRACT
Active biodegradable films are films made from natural polymers, added agents that aim to increase the shelf life of foods when in contact with the packaged product. Among the polysaccharides used for production of these films, the starch has been studied because of its wide availability, low cost and ability to form films easily. Despite these characteristics, the films of starch as the main problem to face its use, low mechanical strength, common to biodegradable films. Thus, studies have been conducted aiming to incorporate nanomaterials such as nanocelulose, which improve the mechanical properties of the films. Among the antimicrobial agents added to movies to make them active, have a strong interest for natural products such as extracts of Brazilian propolis. Varieties of propolis, the red stands for the high levels of phenolic compounds. Thus, the objective is to develop, characterize and verify the effectiveness of antimicrobial films prepared starch-based and glycerol reinforced nanocelulose and incorporated with propolis as an active agent. For the preparation of films, tests were performed with concentrations of starch fixed (4%) and glycerol (1%), and nanocelulose concentrations between 0 and 1% propolis and from 0.4 to 1%, according to the experimental design (11 formulations). The films were obtained by casting process, and characterized by physico-chemical, thermal and barrier. The antimicrobial activity of the films was evaluated in vitro by the disk diffusion test, and also the efficacy of antimicrobial packaging films like cheese curds. The extracted fiber nanocelulose licuri. The presence of nanocrystals increased the tensile strength of the films and the elastic modulus of the films, and reduced water activity, solubility and water vapor permabilidade films. The curves of TG / DTG films showed two events of decomposition, for all formulations. Comparing the curves of the films to the TG of its constituents is observed that the degradation profile was altered, although it is similar to starch their main constituent. All formulations had antimicrobial activity on bacteria studied in vitro tests, whereas for formulations without propolis no formation of inhibition zones. The results obtained for coagulase positive staphylococci count during 28 days storage the cheese curd showed that the film with propolis, a decrease of one log cycle in the count of these microorganisms, when compared with all controls. The results indicate that the films can be a competitive alternative to reduce the use of synthetic films in the packaging of some foods, may exert an antimicrobial effect. The structure of cellulose nanocrystals confer not only high resistance to films, but also significant changes in some of its properties that are important for the food industry. Keywords: Package; Diffusion test; biodegradable films.
16
Introdução Geral
A indústria alimentícia procura desenvolver produtos com qualidade e
segurança para atender a um mercado consumidor cada vez mais exigente.
Assim, além da aplicação de boas práticas higiênico-sanitárias, é necessário o
acondicionamento do produto em embalagens adequadas para proteger e
conservar o alimento durante as fases de estocagem e comercialização,
assegurando ao consumidor a aquisição de um produto saudável (WEN-XIAN
DU et al., 2011).
Entre os principais tipos de embalagens para os alimentos estão os
filmes plásticos flexíveis, os quais apresentam excelentes propriedades
mecânicas e de barreira a gases e vapor de água. Entretanto, estes não são
facilmente reutilizáveis ou biodegradáveis permanecendo na natureza em
quantidades cada vez maiores (HABIBI et al., 2010; VEIGA-SANTOS et al.,
2007).
Ultimamente, inúmeros estudos vêm sido realizados no sentido de
proporcionar embalagens alternativas como os filmes biodegradáveis, obtidos a
partir de materiais agrícolas renováveis, como o amido. Os filmes a base de
amido são transparentes, atóxicos, possuem moderada permeabilidade ao
oxigênio e baixa barreira à umidade (HOLT et al., 2010). No entanto, a baixa
resistência mecânica e a sua alta sensibilidade a água restringe a utilização
desses filmes, especialmente em alimentos com alta umidade.
Nesse contexto, tem sido realizadas pesquisas buscando incorporar nas
matrizes biodegradáveis, nanopartículas orgânicas, como a nanocelulose, que
podem melhorar as propriedades mecânicas dos filmes (HABIBI et al., 2010;
HOLT et al., 2010). Essas nanopartículas podem ser obtidas de diferentes
fontes de fibras naturais como algodão, madeira, sisal, bambu, coco e bagaço
de cana-de-açúcar, entre outros (SILVA et al., 2012).
Além da possibilidade da aditivar filmes biodegradáveis com
nanopartículas, existe a tendência de aditivá-los com compostos bioativos,
resultando em filmes ativos reforçados mecanicamente com manutenção da
biodegradabilidade. Os filmes antimicrobianos e antioxidantes, por exemplo,
podem controlar o desenvolvimento de espécies específicas de micro-
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organismos e aumentar a estabilidade oxidativa dos produtos embalados,
respectivamente (KECHICHIAN et al., 2010; PELISSARI et al., 2009; WEN-
XIAN DU et al., 2011).
A demanda por ingredientes naturais antimicrobianos tem crescido
porque os consumidores estão mais conscientes sobre o risco potencial para a
saúde associados ao consumo de componentes sintéticos, apesar de sua
eficiência (CAREAGA et al, 2003; CHOI et al, 2006; MATAN et al, 2005;
MOREIRA et al., 2005).
Existem vários ingredientes naturais que apresentam atividade
antimicrobiana e antioxidante, tais como: canela (MATAN et al, 2005); pimenta
(CAREAGA et al, 2003); café (DAGLIA et al., 1998); mel (MUNDO et al., 2004),
e extrato de própolis (CHOI et al, 2006). Desses, a própolis vermelha tem
grande potencial para ser adicionado as embalagens, já que sua elevada
atividade antimicrobiana foi confirmada em diversos estudos. Filmes
biodegradáveis adicionados de própolis já foram desenvolvidos (BODINI, 2011;
CORRÊA, 2011), entretanto, geralmente, apresentaram propriedades
mecânicas insatisfatórias.
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Referências
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19
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20
Objetivos
Objetivo Geral
Desenvolver filmes flexíveis, utilizando uma matriz polimérica de fécula
de mandioca plastificada com glicerol, incorporados ou não com nanocelulose
e extrato de própolis vermelha, avaliando a eficácia da incorporação da
nanocelulose como reforço nas propriedades mecânicas, físico-químicas e de
barreira dos filmes obtidos, assim como o efeito da incorporação da própolis na
sua eficiência antimicrobiana.
Objetivos Específicos
1. Desenvolver filmes à base de fécula de mandioca e glicerol,
reforçado com nanocelulose e incorporado com própolis vermelha;
2. Verificar a atividade antimicrobiana do extrato de própolis
vermelha sobre diferentes micro-organismos;
3. Avaliar o uso da nanocelulose de licuri como reforço mecânico,
quando incorporados a matriz polimérica de fécula de mandioca por meio
de ensaios mecânicos de tração;
4. Avaliar a capacidade dos filmes resultantes desta pesquisa ser
utilizado como embalagens para alimentos, por meio das suas
propriedades físico-químicas, térmicas e de barreira;
5. Verificar a ação antimicrobiana, in vitro, dos filmes sobre Bacillus
cereus, Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus;
6. Verificar a ação antimicrobiana dos filmes, como embalagem do
queijo coalho
21
Capítulo I
Revisão Bibliográfica
22
1- Embalagens de Alimentos
A conservação de alimentos exige, normalmente, tratamentos físicos ou
químicos para manter ou aumentar a sua vida de prateleira. A utilização de
embalagem, rígida ou flexível, é imprescindível na manutenção da qualidade
dos produtos alimentícios, visto que esta tem que agir como uma barreira entre
o ambiente externo e o alimento sem afetá-lo. A adequação da embalagem ao
produto depende de fatores inerentes ao produto, como teor de lipídeos,
textura, pH e teor de umidade, e de características da embalagem, tais como,
permeabilidade ao vapor de água, transmitância a luz, entre outras (SILVEIRA,
2005).
Novas embalagens vêm sendo desenvolvidas, com funções especiais,
com destaque para as embalagens ativas e inteligentes. As embalagens
inteligentes são aquelas que monitoram as condições do alimento
acondicionado ou do ambiente externo à embalagem, comunicando-se com o
consumidor. Enquanto que, as embalagens ativas são aquelas que interagem
de maneira intencional com o alimento, visando melhorar algumas das suas
características (HAN et al., 2005).
Alguns sistemas de embalagens ativas já foram desenvolvidos e
encontram aplicação em produtos disponíveis no mercado. As mais
importantes concepções de embalagens ativas são os polímeros
antimicrobianos, os absorvedores de oxigênio e de etileno, os liberadores de
CO2 e as enzimas imobilizadas em suportes poliméricos (SILVEIRA, 2005).
Atualmente, a maioria das embalagens são produzidas a partir de
materiais sintéticos (plásticos), que apesar de possuírem excelentes
propriedades funcionais, não são facilmente reutilizáveis ou biodegradáveis,
permanecendo no ambiente por muitos anos e em quantidades cada vez
maiores, provocando danos ao meio ambiente (VICENTINI, 2003).
Com isso, houve um aumento no interesse e na necessidade do
desenvolvimento de embalagens biodegradáveis, que possam substituir ou
reduzir o descarte de materiais não renováveis no ambiente, que levam
milhares de anos para serem degradados (GONTARD e GUILBERT, 1996).
23
Uma das soluções encontradas para amenizar este problema,
particularmente na área de embalagens de alimentos, é o desenvolvimento de
filmes ou bioplásticos a partir de fontes renováveis que possam substituir os
materiais sintéticos. Os bioplásticos são preparados a partir de materiais
biológicos, que agem como barreira aos elementos externos e,
consequentemente, podem proteger os produtos e aumentar sua vida de
prateleira (KESTER e FENNEMA, 1986).
1.1- Filmes Biodegradáveis
Nos últimos anos, tem crescido o interesse em substituir os filmes
sintéticos por materiais biodegradáveis. O crescente interesse em melhorar a
qualidade do meio ambiente, aliado ao acúmulo de lixo não biodegradável, tem
incentivado pesquisas em todo o mundo no sentido de incrementar e
desenvolver embalagens biodegradáveis provindas de fontes renováveis.
(MACHADO, 2011).
Os filmes são estruturas utilizadas para envolver os produtos, sendo
denominados como biodegradáveis, quando são completamente degradados
por micro-organismos (BERTAN, 2003).
Os filmes são geralmente utilizados em alimentos com a finalidade de
proteção, inibindo ou minimizando a permeação de umidade, oxigênio, dióxido
de carbono, aromas e a migração de lipídeos, podendo, também, carregar
compostos antimicrobianos, proporcionando o aumento da vida de prateleira do
produto (MOURA, 2008).
As formulações de filmes comestíveis e/ou biodegradáveis devem incluir
pelo menos um componente capaz de formar uma matriz adequada, coesa
continua e aderente, onde estão envolvidas a utilização de diversos
componentes, cada qual com a sua finalidade específica. Tais formulações são
constituídas de pelo menos um agente formador de filme (macromoléculas),
solvente (água, etanol, água/etanol, entre outros) e um plastificante (glicerol,
sorbitol, entre outros) (BERTAN, 2003).
Os componentes macromoleculares são classificados em três
categorias: polissacarídeos, lipídeos e proteínas. Os polissacarídeos
24
apresentam boas propriedades para formação dos filmes, sendo eficientes
barreiras contra óleos e lipídeos. Os filmes à base de lipídios apresentam boas
propriedades de barreira ao vapor de água. Entretanto, apresentam pouca
resistência mecânica (força e resistência). Já os filmes à base de proteínas são
considerados melhores barreiras ao oxigênio que muitos filmes sintéticos
(RIGO, 2006).
Os filmes podem ser heterogêneos em natureza, constituindo de
misturas de polissacarídeos, proteínas e/ou lipídios, permitindo utilizar
vantajosamente as distintas características funcionais de cada classe de filme
formado (MOURA, 2008).
Para a formação dos filmes, pode ser utilizado o método de secagem por
moldagem, onde a suspensão formadora de filme é depositada sobre um
molde ou superfície e, posteriormente, seca, geralmente em estufas ou
secadores de bandeja (MOURA, 2008).
1.2- Filmes Ativos
As embalagens ativas são aquelas que interagem de maneira desejável
com o alimento, visando melhorar algumas das suas características físico-
químicas, microbiológicas e/ou sensoriais. Vários sistemas de embalagens
ativas têm sido desenvolvidos, entre os quais se destacam os filmes ativos que
possuem atividade antimicrobiana e antioxidante, e que surgem como uma
alternativa para o aumento da vida de prateleira dos produtos, com uma
redução no uso de aditivos e substâncias químicas (SOARES et al., 2009).
A embalagem antimicrobiana é uma forma de embalagem ativa que
pode aumentar a vida de prateleira dos produtos, além de fornecer maior
segurança aos consumidores. Os filmes antimicrobianos são filmes de resinas
sintéticas ou naturais, adicionados de agentes que têm como objetivo retardar
ou inibir o crescimento de micro-organismos quando em contato com o produto
acondicionado. A eficiência destes filmes pode ser devido a migração do
agente antimicrobiano para a superfície do alimento, ou podem atuar apenas
pelo contato do agente antimicrobiano com o alimento (MELO et al., 2006).
25
O uso de filmes contendo agentes antimicrobianos apresenta vantagens
sobre os métodos tradicionais de adição direta dos conservantes nos
alimentos. A tecnologia baseia-se no fato de que, na maioria dos alimentos
sólidos e semi-sólidos, o crescimento microbiano é superficial, daí um maior
contato entre o produto e o agente antimicrobiano. Vários compostos naturais e
sintéticos tem tido seu potencial antimicrobiano analisado dentro deste
contexto. Dentre os filmes incorporados com antimicrobianos, há grande
interesse pelos obtidos diretamente de material natural, por se tratar de um
filme biodegradável (MORAES et al., 2007).
Pesquisas vêm sendo realizadas com o objetivo de incorporar
substâncias antimicrobianas e antioxidantes a diferentes suportes poliméricos
(CHOI et al., 2004; LEE et al., 2004; MORAES et al., 2007), obtendo filmes
ativos, para aumentar a segurança, manter a qualidade e prolongar a vida de
prateleira dos alimentos. Esses filmes podem ser obtidos mediante fusão ou
solubilização em solvente (processo casting) do composto ativo no suporte
polimérico, sendo o método por solubilização o mais adequado quando se trata
de compostos sensíveis ao calor.
Moraes et al. (2011) desenvolveram filmes ativos com a adição de ácido
sórbico e de aroma de pizza, para aplicação em massa de pastel. Os
resultados demonstraram que esses filmes apresentaram atividade antifúngica,
sendo que essa atividade foi maior quando o composto aromático foi
incorporado. A presença do aroma de pizza também contribuiu para o aumento
da aceitação sensorial dos produtos, demonstrando que o desenvolvimento dos
filmes é uma alternativa para o aumento da qualidade das massas de pastel.
Moraes et al. (2007) também utilizaram o ácido sórbico como substância
ativa em filmes de base celulósica para conservação de manteiga. No trabalho
foram desenvolvidos filmes nas concentrações de 0% (controle) e 7% de ácido
sórbico, avaliando a redução da carga microbiana da manteiga durante o
armazenamento. Foi observada uma redução de 2 ciclos logaritmos na
contagem de bolores e leveduras no produto embalado com o filme
incorporado com ácido sórbico, mostrando eficiência na redução dos micro-
organismos estudados.
26
A eficiência de filmes ativos também foi avaliada por Melo (2010), que
incorporou óleo essencial de alecrim em filmes a base de acetato de celulose,
e avaliou a atividade antimicrobiana dos filmes utilizados como embalagens de
carne de frango resfriada. Os filmes foram obtidos pelo processo casting, e o
óleo foi adicionado nas concentrações de 10, 20, 30, 40 e 50%. Os resultados
sugeriram que os filmes tiveram atividade antimicrobiana sobre os micro-
organismos avaliados, sendo que não houve diferença significativa entre os
resultados obtidos para filmes nas concentrações de 20, 30, 40 e 50% de óleo.
2- Amido
O amido é carboidrato de reserva de várias plantas, ocorrendo nos
cloroplastos das folhas e nos amiloplastos dos órgãos de reserva (sementes,
tubérculos, raízes e rizomas). O amido é sintetizado nas células de cada
planta, onde adquirem tamanhos e forma prescritos pelo sistema biossintético
das plantas e pelas condições físicas impostas pelo contorno do tecido. Ocorre
sob forma de grânulos que ao microscópio são mais ou menos brilhantes,
apresentando forma e dimensões que variam de acordo com sua origem
(VICENTINI, 2003).
Pela Legislação Brasileira (BRASIL, 1978), esses polissacarídeos de
reserva são denominados de fécula ou amido, onde fécula refere-se à
substância amilácea extraída das raízes, tubérculos e rizomas e amido às
extraídas dos grãos de cereais. Em relação às propriedades gerais, denomina-
se simplesmente amido.
Os grânulos de amido apresentam certo grau de organização molecular,
o que confere aos mesmos um caráter parcialmente cristalino, ou
semicristalino, com graus de cristalinidade que variam de 20 a 45%
(VICENTINI, 2003).
O tamanho, a forma e a estrutura dos grânulos de amido variam,
substancialmente, entre as fontes botânicas. Os diâmetros dos grânulos podem
variar de menos de 1μm a mais do que 100μm, e os formatos podem ser
27
esférico, ovoide e angular ou ainda podem apresentar-se bastante irregulares
(THOMAS e ATWELL, 1999).
Na Figura 1, estão representados os grânulos de amido de trigo, de
batata, de milho e de mandioca, onde se percebe diferenças entre os tamanhos
e as formas dos grânulos (SANTOS, 2009).
Figura 1 – Esquema de apresentação dos grânulos de amido de trigo (a), batata (b), milho (c) e mandioca (d) (SANTOS, 2009 apud HOOVER e
MANUEL, 1996).
Os grânulos de amido são constituídos em grande parte por
carboidratos, no entanto, substâncias como lipídios, proteínas, cinzas, fibras
estão presentes em sua composição. A quantidade destes constituintes no
amido depende da composição da planta, sendo que quanto menor o teor
destas substâncias, melhor a qualidade do amido (THOMAS e ATWELL, 1999).
28
Depois dos carboidratos, os lipídios são relatados como a fração mais
importante associada ao grânulo de amido. Eles não são facilmente removidos
dos grânulos durante o processo de extração, permanecendo no amido, sendo
responsáveis pela fixação da cor e desenvolvimentos de aroma. Os amidos de
cereais possuem teores de lipídios mais elevados do que os amidos de
tuberosas, sendo, por isso, menos neutros e mais sujeitos a complexações
(MOURA, 2008).
Pesquisando amidos de mandioquinha-salsa e batata-doce, Cereda e
Leonel (2002), encontraram teores de lipídios de 0,13% e 0,14%
respectivamente, enquanto que em amido de gengibre, os autores encontraram
teores de lipídios de 0,24%, sendo que os mais baixos foram encontrados no
amido de gengibre, que não passou de 0,1%. Segundo Moorthy (2002), os
amidos de raízes e tubérculos são geralmente caracterizados pelo seu baixo
teor de lipídios (<1%), não tendo um efeito pronunciado nas propriedades
funcionais quando comparado aos amidos de cereais.
2.1- Estrutura dos Grânulos
O grânulo de amido é formado principalmente por dois polímeros de
glicose: a amilose e a amilopectina. Esses polímeros não existem livres na
natureza, estando presentes de forma agregada nos grânulos de amido. A
funcionalidade dos amidos está diretamente relacionada a essas duas
macromoléculas e também a organização física das mesmas, dentro da
estrutura granular (FENIMAN, 2004). Os teores em que essas substâncias
aparecem variam em função da origem botânica do amido (VICENTINI, 2003).
A amilose é um polímero essencialmente linear composto quase que
completamente de ligações α (1-4) de D-glucopiranose (Figura 2). A amilose
possui peso molecular de 105 a 106 unidades e com um número de resíduos de
glicose por molécula que varia de 500 a 5000. As moléculas de amilose tendem
a formar estruturas helicoidais, existindo evidências de que esta se apresenta
com uma dupla hélice em solução e que pode existir nesse estado nos
grânulos de amido (FENIMAM, 2004).
29
Figura 2 – Estrutura da amilose (FENIMAM, 2004).
A amilopectina é definida como uma grande molécula altamente
ramificada. É formada por ligações glicosídicas α(1→4) e α(1→6),
responsáveis pela estrutura ramificada (Figura 3). A molécula de amilopectina é
mais compacta que a da amilose, acarretando menor facilidade de penetração
de água e de enzimas, sendo, portanto, mais resistente ao processo de
hidrólise. Ela esta presente em todos os amidos conhecidos, constituindo em
torno de 75% dos amidos mais comuns e possui peso molecular de 107 a 109
unidades, dependendo da sua origem (FENINAM, 2004).
Figura 3 – Estrutura da amilopectina (FENIMAM, 2004).
A aplicação do amido na produção de filmes se baseia nas propriedades
químicas, físicas e funcionais da amilose para formar géis e na sua capacidade
para formar filmes. As moléculas de amilose em solução, devido à sua
linearidade, tendem a se orientar paralelamente, aproximando-se o suficiente
para que se formem ligações de hidrogênio entre hidroxilas de polímeros
adjacentes. Como resultado, a afinidade do polímero por água é reduzida,
favorecendo a formação de pastas opacas e filmes resistentes (OLIVATO et al.,
2006).
30
As moléculas de amilopectina são responsáveis pela expansão do
grânulo em meio aquoso, já que possui grande capacidade de retenção de
água. Assim, devido ao aumento esférico as moléculas de amilopectina não
têm tendência à recristalização e, portanto, possuem elevado poder de
retenção de água (MOURA, 2008).
2.2- Gelatinização e Retrogradação
Para a obtenção de um material termoplástico a base de amido, sua
estrutura granular semicristalina precisa ser destruída para dar origem a uma
matriz polimérica homogênea e essencialmente amorfa. Os fenômenos que
possibilitam a destruição da organização dos grânulos de amido para obtenção
de uma nova conformação são a gelatinização e a retrogradação (MALI et al.,
2010).
A gelatinização é a transformação irreversível do amido granular em
uma pasta viscoelástica, fenômeno que acontece na presença de excesso de
água e leva à destruição da cristalinidade e da ordem molecular do grânulo
através do rompimento das ligações de hidrogênio que, inicialmente,
mantinham a integridade deste. O processo de gelatinização exige uma
combinação de disponibilidade de água e temperatura adequada e inicia-se
com a transformação ocasionada na suspensão aquecida até certo limite,
levando a ligeiro entumecimento dos grânulos (MALI et al., 2010).
Medcalf (1973) caracteriza a geleificação, entre as propriedades
reológicas do amido, como sendo a relação entre o amido e água em excesso,
sob condições de aquecimento. Com o aumento da temperatura, ocorre
rompimento da estrutura do grânulo, extravasando os seus constituintes
(amilose e amilopectina) que se transformam em um substância gelatinosa,
denominada gel de amido. Admite-se que o gel é formado pela amilopectina,
retendo em sua estrutura a amilose. A temperatura na qual se dá a geleificação
varia com a fonte botânica do amido.
Após a gelatinização, com o resfriamento, ocorre a retrogradação do
amido, onde as moléculas de amido podem começar a se reassociar através
de ligações de hidrogênio, favorecendo a formação de uma estrutura maior e
31
mais ordenada, que, sob condições favoráveis, pode formar uma estrutura
novamente cristalina (FRANCO et al., 2001).
O nome retrogradação é dado porque o amido volta à sua condição de
insolubilidade em água fria. Considera-se que a retrogradação se origina da
tendência das moléculas ou de grupos de moléculas, de amido dissolvido, se
unir umas às outras através de pontes de hidrogênio, dando formação a
partículas de maior tamanho, numa tentativa de cristalização de moléculas
grandes e pesadas que, por essa razão, precipitam (FRANCO et al, 2001).
As mudanças que ocorrem nos grânulos de amido durante a
gelatinização e retrogradação são os principais determinantes do
comportamento das pastas de amido, fundamentais para elaboração de filmes
(MALI et al., 2010).
2.3- Filmes a base de amido
Os filmes de amido estão entre os primeiros filmes biodegradáveis e
comestíveis obtidos por serem uma alternativa mais viável economicamente às
resinas tradicionais e por advirem de fontes renováveis. A microestrutura e as
propriedades dos filmes de amido irão depender do tipo de material utilizado
para a sua produção. A aplicação do amido na produção de filmes se baseia
nas propriedades químicas, físicas e funcionais da amilose para formar géis e
na sua capacidade para formar filmes (MALI et al., 2010).
Os filmes de amido são caracterizados por serem insolúveis e
impermeáveis a lipídios, podendo ser empregados como embalagens de
alimentos com altos teores de lipídios sem qualquer alteração de sua estrutura.
Além disso, os filmes possuem moderada permeabilidade ao oxigênio, baixa
barreira à umidade e baixa resistência mecânica (OLIVATO et al., 2006),
podendo apresentar-se quebradiços representando assim um problema para a
sua aceitação no mercado. Com isso, substâncias, como os plastificantes,
devem ser adicionados aos filmes para melhorar suas propriedades mecânicas
(VEIGA e DRUZIAN, 2007).
A espessura é uma das características que mais influencia as
propriedades mecânicas, principalmente a força na perfuração, e a
32
permeabilidade ao vapor de água de filmes hidrofílicos, como os de amido. Ela
depende largamente da viscosidade da solução filmogênica. Quanto maior as
espessuras, mais resistentes à perfuração são os filmes e maior a sua
permeabilidade ao vapor de água (MALI et al., 2010).
As propriedades mecânicas dos filmes de amido podem ser
consideradas as mais restritivas, pois, em geral, estes materiais devem ser
resistentes à ruptura e à abrasão, para proteger e reforçar a estrutura dos
alimentos e, ainda, devem ser flexíveis, para adaptar-se a possíveis
deformações sem se romper. Elas dependem fortemente da formulação
(macromolécula, solvente, plastificante) e do processo de obtenção (MOURA,
2008).
Dentro da formulação, o teor de plastificante é um importante fator capaz
de alterar o perfil de propriedades mecânicas de um filme de amido. Filmes de
amido sem plastificantes são resistentes e elásticos e, à medida que se
aumenta o teor de plastificante, estes materiais se tornam mais flexíveis e
deformáveis e menos resistentes (BADER e GORITZ, 1994).
As propriedades mecânicas dos filmes de amido podem ser medidas
através de testes de perfuração, tração e relaxação. Nos testes de perfuração,
uma sonda cilíndrica desce perpendicularmente à superfície do filme, que está
fixado sobre um suporte de medida, até que ocorra o rompimento da amostra;
são medidas a força e deformação na ruptura através dos gráficos de força
versus deslocamento. As propriedades de tração são as mais relatadas e
expressam a resistência do material ao alongamento e ao rompimento, quando
submetido à tração. Dentre as propriedades de tração mais estudadas estão a
resistência máxima à tração, o alongamento na ruptura e o módulo de
elasticidade ou de Young (MALI et al., 2010).
Entre as propriedades de barreira estão a permeabilidade ao vapor de
água e a gases. A permeabilidade ao vapor de água é a medida da facilidade
com que um material pode ser penetrado pelo vapor de água. Essa
propriedade, nos filmes hidrofílicos como os de amido, é influenciada pela
umidade e pela temperatura a que são submetidos os filmes. Ao se aumentar a
umidade, produz-se um inchamento excessivo da matriz polimérica, que leva a
um incremento na difusão das moléculas de água e, consequentemente,
33
diminui as propriedades de barreira destes materiais. Com o aumento da
temperatura, a permeabilidade ao vapor de água também aumenta, e estas
variações são dependentes do teor de umidade do material (DONHOWE e
FENNEMA, 1994).
A permeabilidade a gases dos filmes de amido também é influenciada
pela atividade de água e pela temperatura de forma similar a permeabilidade
ao vapor d’água. De uma forma geral, os filmes formados por proteínas e
polissacarídeos apresentam boas propriedades de barreira ao oxigênio,
principalmente sob condições de baixa umidade relativa. Em algumas
condições, estes filmes podem ter permeabilidade tão baixa quanto filmes de
polietileno (MALI et al., 2010).
A solubilidade dos filmes biodegradáveis em água também é uma
característica de grande importância, uma vez que a grande maioria dos filmes
biodegradáveis, elaborados a partir de carboidratos, como o amido, possui
grande afinidade com a água (MOURA, 2008).
A obtenção de filmes a partir do amido é baseada na sua gelatinização,
que ocorre com aquecimento a 70ºC, seguido de resfriamento, ocorrendo,
então, a retrogradação, com consequente formação de um filme transparente,
com alto brilho, atóxico e de baixo custo (VEIGA e DRUZIAN, 2007).
Os filmes podem ser obtidos pela técnica casting, onde, após a
gelatinização térmica dos grânulos em excesso de água, a amilose e
amilopectina se dispersam na solução aquosa e, durante a secagem, se
reorganizam, formando uma matriz contínua que dá origem aos filmes.
Segundo Bader e Goritz (1994), a espessura e a estrutura cristalina dos filmes
de amido são fortemente influenciadas pelas condições de secagem dos filmes.
De acordo com Sobral (2000), quando se produzem filmes por casting,
deve ser feito um controle rigoroso da forma do suporte e do nível da estufa,
para evitar diferenças na espessura provocadas por desníveis durante a
secagem, que interferem nas propriedades mecânicas e de barreira dos filmes.
Para elaboração dos filmes de amido, a técnica casting tem sido a mais
empregada e discutida nas pesquisas, mostrando bons resultados dentro do
âmbito laboratorial. Porém, para a produção em escala industrial, apresenta
algumas desvantagens, como tempo de processo e custo elevados, esta última
34
em função do grande gasto energético para a secagem dos filmes. Alguns
estudos vêm sendo realizados utilizando o processo de extrusão, comumente
utilizado em escala industrial, com as vantagens de rapidez e menores custos
de produção (MALI et al., 2010).
A biodegradabilidade de alguns filmes a base de amido já foram
confirmadas em diversos estudos. Machado (2011) relatou uma perda de
massa de 80%, após 117 dias, no teste de biodegradabilidade de filmes a base
de amido adicionados de glicerol e nanocelulose de fibra de coco, sendo que
não houve diferenças significativas entre as formulações e o controle (sem
nanocelulose), demonstrando que os nanocristais não interferem na
biodegradação do material.
BELTRÃO et al. (2010), avaliaram a biodegradabilidade de filmes de
amido vazados com adição de diferentes concentrações de argila. Os filmes
apresentaram boa biodegradabilidade, mesmo com a máxima concentração de
argila estudada (5%), com uma perda de massa de 71% após 30 dias.
Apesar da fácil degradação natural, as embalagens à base de amido
apresentam algumas desvantagens. São relativamente caras quando
comparadas com as embalagens convencionais, não apresentam uma boa
flexibilidade e são pouco resistentes à umidade. Para isso, necessitam de
tratamentos especiais, como a adição de fibras, plastificantes e outros aditivos,
visando melhorar as características de tração, flexibilidade e do contato com a
água (SALGADO et al., 2008).
Nesse sentido, diversos estudos vêm sendo realizados na tentativa de
produzir, caracterizar e aplicar filmes à base de amido.
Souza (2010) desenvolveu filmes a base de fécula de mandioca,
utilizando como plastificantes o açúcar invertido e a sacarose e incorporando
polpa de manga e de acerola como agentes ativos. Os resultados sugeriram
que os filmes podem apresentar atividade antioxidante em alimentos lipídicos,
sendo que suas propriedades mecânicas foram melhoradas através da adição
dos plastificantes.
Machado (2011) produziu filmes a base de amido, utilizando como
plastificante o glicerol e incorporando, como reforço, a nanocelulose de fibra de
coco. A incorporação dos nanocristais contribui para melhorar
35
significativamente as propriedades mecânicas, como módulo de Young e
tensão máxima, e conseqüentemente diminuem o percentual de elongação dos
filmes.
3- Nanocelulose
Nanoceluloses são fibras celulósicas de dimensões nanométricas que
possuem alta razão aspecto (comprimento/diâmetro) capazes de atuarem
como agentes reforçantes em matrizes poliméricas. Essas fibras podem ser
obtidas através de diversas fontes de fibras naturais como: algodão, madeira,
sisal, bambu, planta curauá, bagaço de cana-de-açúcar e de alguns animais
marinhos. As fontes da fibra assim como o método de preparação interferem
nas suas propriedades e na cristalinidade (FAVIER et al., 1995).
As fibras naturais são constituídas basicamente por celulose,
hemicelulose e lignina. A celulose é o polímero natural mais abundante do
planeta, sendo o principal componente da parede celular das fibras. Sua
estrutura é formada por carbono, ligações de hidrogênio e hidroxilas, sendo um
polissacarídeo linear constituído por um único tipo de unidade de açúcar. As
moléculas de celulose tendem a formar ligações de hidrogênio intramoleculares
(entre unidades de glicose da mesma molécula) e intermoleculares (entre
unidades de glicose de moléculas adjacentes). As ligações intermoleculares
são responsáveis pela formação da fibra vegetal (LEÃO, 2008).
A celulose possui regiões cristalinas (altamente ordenada) e amorfas
(altamente ramificada e desordenada). Materiais gasosos, água e outros
líquidos podem penetrar facilmente nas fibrilas e nas microfibrilas devido aos
inúmeros capilares e pequenos orifícios encontrados nas regiões amorfas da
parede celular. O polímero por si é acessível à água e a agentes químicos
através das regiões amorfas e através da superfície das regiões cristalinas
(MOTA, 2010).
A hemicelulose é um carboidrato complexo de peso molecular inferior ao
da celulose, constituída de uma mistura de polissacarídeos de baixa massa
molar que varia entre 25000 a 35000, os quais estão em estreita associação
36
com a celulose e com a lignina nos tecidos vegetais. Sua estrutura é definida
como amorfa. A principal diferença com a celulose é que a hemicelulose tem
ramificações com cadeias curtas laterais constituídas por diferentes açúcares.
Em contraste com a celulose, são polímeros facilmente hidrolisáveis. A
hemicelulose é o componente responsável pela biodegradação, absorção de
umidade e degradação térmica da fibra (MOTA, 2010).
A lignina, depois da celulose, é o segundo polímero mais abundante na
natureza e está presente na parede celular, conferindo suporte estrutural,
impermeabilidade e resistência contra ataques microbianos e estresse
oxidativo. Estruturalmente, a lignina é um heteropolímero amorfo, não solúvel
em água e opticamente inativo, que consiste de unidades de fenilpropanos
unidos por diferentes tipos de ligações. É um polímero amorfo de composição
química complexa que confere firmeza e rigidez estrutural ao conjunto de fibras
de celulose, atuando como um agente permanente de ligação entre as células
(PEREIRA, 2010).
As três substâncias podem ser consideradas compósitos naturais, que
são constituídos principalmente de fibrilas de celulose incorporada numa matriz
de lignina. As fibrilas de celulose são alinhadas ao longo do comprimento da
fibra, o que resulta em máxima resistência à tração e flexão, além de fornecer
rigidez no eixo das fibras. A eficiência do reforço da fibra natural esta
relacionada com a natureza da celulose e sua cristalinidade (LEÃO et al.,
2009).
Para obtenção das nanoceluloses, são necessárias etapas que visem o
rompimento das cadeias, e consequentemente, a remoção da hemicelulose,
lignina e de outros componentes que podem estar presentes na fibra. Dessa
forma, o processamento da fibra pode interferir diretamente na estrutura das
nanofibras obtidas (LIMA et al., 2003).
Existem diversos tratamentos químicos que são utilizados para remoção
da hemicelulose e da lignina das fibras vegetais. Um deles é o tratamento
alcalino, onde a fibra é imersa em solução de NaOH, sob forte agitação.
Dependendo das condições a remoção pode ser desde branda até a
degradação. Fatores como concentração da solução, proporção fibra/solução,
37
tempo de exposição e temperatura podem interferir nos resultados (PEREIRA,
2010).
Outro tratamento comumente utilizado, principalmente pelas indústrias
de papel, é o branqueamento. Nesse processo, utiliza-se peróxido de
hidrogênio a fibra, previamente tratada com solução alcalina. Com isso, ocorre
a remoção dos componentes que conferem a cor natural à fibra. Vários fatores
podem interferir nos resultados como o uso de outra solução em parte com o
peróxido, a concentração das soluções, o tempo de exposição e a temperatura
utilizada no processo (PEREIRA, 2010). Esses procedimentos visam obter as
cadeias de celulose pura para posterior obtenção das nanoceluloses.
O principal processo para o isolamento das nanoceluloses a partir de
fibras de naturais é baseado na hidrólise ácida. No tratamento ácido, os íons
hidrônio atacam as regiões amorfas ou não-cristalinas das nanofibras,
liberando as regiões cristalinas, que por possuírem maior resistência ao ataque
ácido permanecem intactas (LEÃO et al., 2009).
O ácido sulfúrico é o mais comumente utilizado pois gera uma solução
coloidal estável, provocada pela repulsão eletrostática entre os nanocristais,
causada pela carga superficial negativa obtida da substituição dos grupos
hidroxila por grupos sulfatos, após hidrólise. Com o emprego do ácido sulfúrico,
os nanocristais não precipitam nem floculam. Alguns fatores podem determinar
o tamanho, o rendimento e a qualidade dos nanocristais obtidos, como o ácido
utilizado, a concentração do ácido e o tempo e temperatura de hidrólise
adotados (SOUZA, 2010).
Dentre as principais vantagens dos nanocristais estão a baixa
densidade, seu caráter renovável, biodegradabilidade, boas propriedades
mecânicas e baixo custo quando comparados com nanofibras sintéticas
(CHEN, et al., 2009).
Alguns estudos tem sido realizados com o objetivo de incorporar
nanopartículas em matrizes poliméricas biodegradáveis, dando origem a
materiais compostos, chamados de nanobiocompósitos. Mathew e Dufresne
(2002) conseguiram incorporar partículas de nanocelulose em biopolímeros
hidrosolúveis como o amido, utilizando o glicerol como plastificante. Trabalho
semelhante foi desenvolvido por Chen et al. (2009). Em ambos os casos, os
38
nanobiocompósitos resultantes apresentaram melhores propriedades, tais
como maior módulo de força e tensão, decréscimo da permeabilidade a gases,
aumento da resistência à água e aumento na biodegradabilidade do polímero,
quando comparados com polímeros de matriz pura.
Segundo Lima et al. (2003), os resultados obtidos no desenvolvimento
dos nanobiocompósitos, juntamente com o baixo custo e a grande
disponibilidade no Brasil de fontes de fibras naturais ricas em celulose
justificam os esforços para viabilizar o uso destas fibras como fontes de
matéria-prima para a obtenção de materiais biodegradáveis reforçados com
nanocelulose extraída destas fibras.
4- Glicerol
O glicerol é um plastificante hidrofílico, do tipo poliol, que esta entre os
mais empregados nos filmes de amido. O efeito dos plastificantes depende da
concentração e do tipo empregado, pois eles devem ser compatíveis com o
biopolímero utilizado. Os plastificantes reduzem as forças intermoleculares e
aumentam a mobilidade das cadeias dos polímeros, com aumento da
flexibilidade e diminuição de possíveis descontinuidades e zonas quebradiças
dos filmes, com influência direta nas propriedades funcionais e mecânicas
destes (MALI et al., 2010).
Shimazu et al. (2007) afirma que nos filmes de amido, o aumento na
concentração de glicerol provoca um incremento na permeabilidade a gases e
ao vapor d’água, pois o glicerol se liga às moléculas do biopolímero, diminuindo
a densidade entre as suas moléculas, facilitando a transmissão dos gases
através do materiale forma geral, dependendo da concentração em que são
empregados, os plastificantes podem causar um efeito chamado
antiplastificante, isto é, ao invés de aumentar a flexibilidade e hidrofilicidade,
podem causar um efeito contrário. Geralmente, isto ocorre quando são
empregadas pequenas concentrações de plastificante, então o plastificante
interage com a matriz polimérica, mas não em quantidade suficiente para
aumentar a mobilidade molecular, apenas aumenta o grau de interações e a
39
rigidez desta matriz, fenômeno este fortemente dependente das condições de
armazenamento (MALI et al., 2010).
5- Própolis
A própolis é uma resina produzida pelas abelhas, misturando
substâncias coletadas de diferentes partes das plantas, como brotos, botões
florais e exudados resinosos, com as secreções produzidas em seu organismo,
dando origem a um material de coloração e consistência variada, utilizada para
fechar pequenas frestas, embalsamar insetos mortos no interior da colmeia e
proteger contra a invasão de insetos e micro-organismos (GHISALBERTI,
1979).
Diversos estudos científicos atribuem a própolis uma infinidade de usos,
demonstrando ter potencial para atividades antinflamatória, antimicrobiana,
antitumoral, antioxidativa, entre outras. Entretanto, apesar das suas
propriedades biológicas e químicas serem conhecidas, o seu emprego
terapêutico ainda é pequeno, devido a grande variabilidade de sua composição
química, que sofre influência de fatores como origem geográfica, espécie
vegetal, período de coleta e técnica empregada para extração (MELANI, 2009;
BODINI, 2011). No Brasil, devido a grande diversidade brasileira, são
encontradas própolis com composições químicas, e consequentemente, com
propriedades biológicas distintas entre as diferentes partes do país (SILVA,
2009).
5.1- Composição e Classificação
Em geral, a própolis é composta por 50% de resina e bálsamo vegetal,
30% de cera, 10% de óleos essenciais e aromáticos, 5% de pólen e 5% de
outras substâncias variadas, incluindo resíduos orgânicos. Pelo menos 300
componentes diferentes já foram identificados em amostras de própolis de
origens diversas, dentre esses, ácidos graxos e fenólicos, ésteres, ésteres
fenólicos, flavonoides (flavonas, flavononas, flavonóis, di-hidroflavonóis, etc.),
40
terpenos, b-esteróides, aldeídos e álcoois aromáticos, sesquiterpenos e
naftaleno. Desses, os flavonoides, juntamente com os ácidos fenólicos são os
componentes responsáveis pela sua bioatividade (OLDONI, 2007).
A ingestão de flavonoides interfere em diversos processos fisiológicos,
auxiliando na absorção e na ação de vitaminas, atuando nos processos de
cicatrização como antioxidantes, além de apresentarem atividade
antimicrobiana e moduladora do sistema imune (BODINI, 2011).
Estruturalmente, os flavonoides constituem substâncias aromáticas com 15
átomos de carbono no seu esqueleto básico. Possuem nessa estrutura três
anéis aromáticos C6-C3-C6 (A, B e C) (Figura 4). Devido a sua estrutura
química, os flavonoides possuem atividade de sequestro de radicais livres, que
podem causar danos as células do organismo. Dessa forma, são apontados
como drogas terapêuticas promissoras para prevenir e tratar desordens clínicas
causadas por radicais livres (OLDONI, 2007).
Figura 4 – Estrutura química dos flavonoides (OLDONI, 2007).
A Legislação Brasileira através do Regulamento Técnico de Identidade e
Qualidade da Própolis (BRASIL, 2001) estabelece a classificação da própolis
brasileira, de acordo com o seu teor de flavonoides (Tabela 1). Além disso, o
regulamento também estabelece os requisitos mínimos de qualidade que a
própolis deve atender para comercialização em âmbito nacional e internacional
(Tabela 2).
41
Tabela 1 – Classificação da própolis de acordo com o teor de flavonoides (BRASIL, 2001).
Classificação da Própolis Teor de flavonoides (m/m)
Baixo teor Até 1,0%
Médio teor 1,0 - 2,0%
Alto teor > 2,0%
Tabela 2 – Requisitos físico-químicos exigidos pela Legislação Brasileira para amostras de própolis (BRASIL, 2001).
Qualidade da Própolis
Requisitos Limite Mínimo Limite Máximo
Perda por Dessecação (m/m) - 8%
Cinzas (m/m) - 5%
Cera (m/m) - 25%
Compostos Fenólicos (m/m) 5% -
Flavonoides (m/m) 0,5% -
Atividade de Oxidação (seg) - 22
Massa Mecânica (m/m) - 40%
Solúveis em Etanol (m/m) 35% -
Segundo Park et al. (2000), a própolis brasileira pode ser dividida em 12
grupos distintos de acordo com a sua coloração. Entre as variedades de
própolis, as mais conhecidas são a própolis marrom, que é caracterizada por
possuir elevada propriedade antioxidante, e a própolis verde, que possui
propriedades antinflamatória e antibiótica, sendo a mais aceita no mercado
internacional. Recentemente, foi descoberta mais uma variedade de própolis,
conhecida como própolis vermelha (Figura 5), que possui atividade
antimicrobiana e antioxidante, sendo encontrada apenas nas regiões Norte e
Nordeste (SILVA, 2009).
42
Figura 5 – Própolis vermelha (RODRIGUES, 2010).
5.2- Própolis Vermelha
A própolis vermelha é caracterizada pela sua coloração vermelha
intensa e por possuir isoflavonóides, substâncias que nunca haviam sido
isoladas nas amostras de própolis brasileira (RIGHI, 2008). Os isoflavonóides
são uma subclasse dos flavonoides e possuem uma distribuição limitada na
natureza, sendo frequentemente encontrados em plantas. Embora várias
plantas sintetizem isoflavonóides, a forma bioativa para o consumo humano
está presente em poucos vegetais. Dessa forma, estes compostos têm sido
úteis como marcadores químicos da própolis vermelha no Brasil e no mundo
(OLDONI, 2007).
Devido a presença de isoflavonóides e de outros constituintes químicos
diferenciados a própolis brasileira possui alto valor agregado. A presença
desses constituintes lhe confere características de maior qualidade como maior
quantidade de substâncias solúveis em água, atribuindo mais efeitos
terapêuticos, segurança e uma maior facilidade de absorção pelo corpo
humano. Com isso, o Brasil se destaca na produção mundial de própolis, sendo
o segundo maior produtor mundial, com uma produção anual de
aproximadamente 100 toneladas, ficando atrás apenas da China. O consumo
interno ainda é incipiante, sendo que cerca de 75% da produção é exportada. A
própolis brasileira atende cerca de 80% da demanda japonesa, país
responsável por 43% das patentes, relacionadas a atividades da própolis,
depositadas no mundo (RIGHI, 2008).
43
5.2.1- Atividade Antimicrobiana
Nos últimos anos vários estudos vêm reportando a ação da própolis no
combate a fungos e bactérias (CARDOSO, 2009; SILVA, 2009; BODINI, 2011).
Das variedades de própolis, a vermelha brasileira tem sendo reportada como
uma das variedades com maior potencial antimicrobiano. A atividade
antimicrobiana da própolis pode ser influenciada por vários parâmetros, com
destaque para o tipo, composição, concentração, processamento e estocagem
do produto (BODINI, 2011).
Os mecanismos de ação da própolis contra os micro-organismos ainda
não foram completamente elucidados, sendo que estudos apontam diferentes
modos de ação contra bactérias Gram positivas, Gram negativas e contra os
fungos.
Segundo Burt (2004), os locais, ou estruturas, da célula bacteriana que
são considerados sítios de ação para os componentes de produtos naturais
são ilustrados na Figura 6. Geralmente os mecanismos de ação de compostos
naturais são desintegração da membrana citoplasmática, desestabilização da
forca próton motriz (FPM), fluxo de elétrons, transporte ativo e coagulação do
conteúdo da célula. Nem todos os mecanismos de ação agem em alvos
específicos, podendo alguns sítios serem afetados em consequência de outros
mecanismos.
Figura 6 - Locais e mecanismos de ação que podem ser sítios para ação de compostos naturais na célula bacteriana (BURT, 2004).
44
De acordo com Santos et al. (2002), a ação antimicrobiana da própolis
está relacionada à inibição da população bacteriana e da RNA-polimerase do
micro-organismo, juntamente com a desorganização do citoplasma e da
membrana da bactéria. Takaisi-Kikuni e Schilcher (1994), por meio de micro-
calorimetria e de microscopia eletrônica, utilizando Streptococcus agalactiae,
demonstraram que a própolis inibiu o crescimento bacteriano por impedir a
divisão celular, desorganizando o citoplasma, a membrana citoplasmática e a
parede celular, causando uma lise bacteriana parcial e inibindo a síntese
protéica.
Endler et al. (2003), observaram que a própolis mostrou-se eficiente
antimicrobiano nas proporções de 30% e 15% para as bactérias Pseudomonas
sp e Staphylococcus aureus. Entretanto, com a bactéria Gram negativa
Escherichia coli não foi observado o aparecimento do halo de inibição,
demonstrando ser resistente ao princípio ativo da solução.
Esse resultado foi semelhante ao encontrado por Santos e Gonçalves
(2009), que avaliando o efeito antimicrobiano do extrato etanólico da própolis
verde, demonstraram que esse possui atividade microbicida contra as bactérias
Gram positivas Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis,
apresentando concentração inibitória mínima (CIM) de 21,43 mg/mL e
17,85mg/mL, respectivamente. Por outro lado, o mesmo extrato não
apresentou atividade antimicrobiana contra as bactérias Gram negativas,
Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli, além da levedura Candida
albicans. A ação antimicrobiana dos extratos alcóolicos de própolis sobre
Staphylococcus aureus também foi sugerida por Cardoso (2009).
Os resultados obtidos por Vargas et al. (2004) também sugeriram um
maior efeito da própolis contra bactérias Gram-positivas. Os autores avaliaram
a eficiência sobre 161 isolados bacterianos, sendo 81 Gram-positivas e 80
Gram-negativas. Do total de amostras, 67,7% foram sensíveis ao extrato
alcóolico de própolis em uma concentração de 50%, sendo que 92,6% dos
isolados Gram-positivos foram sensíveis, contra apenas 42,5% dos isolados
Gram-negativos, demonstrando uma resistência das bactérias Gram-negativas
ao mecanismo de ação dos compostos ativos da própolis.
45
Botre et al. (2010) afirmam que apesar da ação antimicrobiana in vitro de
vários agentes antimicrobianos naturais ser comprovada, são necessários
valores muito maiores de concentração para alcançar a mesma eficiência
quando aplicados em alimentos. A grande disponibilidade de nutrientes em
alimentos comparada com os meios de cultura permite às bactérias repararem
o dano celular rapidamente. Além dos fatores intrínsecos do alimento (gordura,
proteína, água, antioxidantes, pH, conservantes), os fatores extrínsecos
(temperatura, embalagem a vácuo, características do micro-organismo)
também influenciam a sensibilidade das bactérias (BOTRE et al., 2010 apud
GILL et al., 2002).
Os componentes dos alimentos como proteínas, gorduras, são
conhecidos por se ligar e/ou solubilizar compostos fenólicos, reduzindo sua
atividade antimicrobiana, demonstrando que a atividade antimicrobiana de
plantas codimentares pode ser menor em sistemas alimentares do que em
meios de cultura (BARBOSA, 2010).
5.2.2- Potencial Alergênico
Estudos tem chamado atenção para os efeitos alérgicos relacionados à
própolis. Fernandez et al. (2004) comprovaram, por meio de testes específicos,
dois casos de alergia de contato relacionados à própolis. No primeiro caso, a
utilização de uma solução de própolis a 25%, via oral, resultou em edema labial
progressivo, com dor e inchaço, em paciente de 64 anos de idade. Em outra
paciente de 65 anos, o uso de pastilhas de própolis como um suplemento
nutricional e estimulante do sistema imune provocou dor e inchaço na língua.
Giusti et al. (2004) investigaram, durante oito anos, a freqüência de
sensibilidade de contato a própolis em 1255 crianças (7 meses a 12 anos de
idade) com suspeita de alergia de contato. Os testes de alergia incluíram 30
alérgenos, incluindo própolis 20%. Os resultados demonstraram 5,9% de
reposta positiva à própolis, com freqüência significantemente maior em
meninos. A dermatite estava localizada principalmente na face, mãos e
membros. Os autores ainda sugeriram que a própolis não deveria ser usada
46
em produtos tópicos em crianças devido à alta taxa de sensibilidade em idade
pediátrica.
Algumas propriedades biológicas e toxicológicas da própolis européia
foram revisadas por Burdock (1998), onde chama a atenção para o grande
número de reações alérgicas que se agravam pelo uso da própolis também
como suplemento alimentar. Apesar deste relato em estudos com animais,
envolvendo camundongos, que receberam doses de própolis de até
1.400mg/Kg de peso, nenhuma resposta tóxica foi observada imediatamente
após o uso.
Rodrigues (2010) realizou uma investigação toxicológica do extrato de
própolis vermelha do Brasil, e demonstrou que o uso de concentração de até
1g/Kg do extrato etanólico não apresenta efeito tóxico significativo nos
parâmetros hematológicos e bioquímicos em camundongos.
Apesar dos relatos de reações adversas, as possibilidades terapêuticas
associadas à própolis e a diversidade de efeitos benéficos que esta resina
natural pode trazer, justifica o seu uso, ainda que com as ressalvas para um
pequeno grupo de indivíduos que apresentam reações adversas ou de
hipersensibilidade (RODRIGUES, 2010).
47
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Capítulo II
Desenvolvimento e avaliação da ação antimicrobiana de filmes de
fécula de mandioca e glicerol, adicionados de nanocelulose e
própolis vermelha
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Capítulo II
Desenvolvimento e avaliação da ação antimicrobiana de filmes de fécula
de mandioca e glicerol, adicionados de nanocelulose e própolis vermelha
Resumo
Filmes biodegradáveis ativos são obtidos de polímeros naturais e adicionados de substâncias com objetivo de aumentar a vida de prateleira dos alimentos através do contato com o produto acondicionado. Estudos apontam que a incorporação de nanocelulose a esses filmes melhoraram algumas de suas propriedades. Entre os agentes ativos incorporados, têm-se interesse pelos naturais, como os extratos de própolis vermelha. O objetivo do trabalho foi desenvolver, caracterizar e verificar a ação antimicrobiana de filmes elaborados à base de fécula e glicerol, reforçados com nanocelulose e incorporados com própolis vermelha. A nanocelulose foi extraída da fibra de licuri, através da hidrólise ácida. Para elaboração dos filmes, utilizou-se ensaios com concentrações fixas de fécula (4%) e glicerol (1%), e concentrações variáveis de nanocelulose (0-1%) e de extrato de própolis (0,4-1%) de acordo com o planejamento experimental. Os filmes foram obtidos pelo processo casting e caracterizados através de análises físico-químicas, térmicas e de barreira. A eficácia antimicrobiana foi verificada in vitro, através de teste de difusão em ágar, e como embalagem de queijo coalho, verificando o controle no desenvolvimento de Estafilococos coagulase positiva. A presença dos nanocristais aumentou em 110% á resistência á tração dos filmes, com o emprego de apenas 0,15% de nanocelulose. A atividade de água e a umidade dos filmes, assim como a solubilidade e a permeabilidade ao vapor de água diminuíram com a adição da nanocelulose. As formulações com as maiores concentrações de própolis ficaram mais escuras, apresentando os menores valores de luminosidade. As curvas de TG/DTG dos filmes apresentaram dois eventos de decomposição, para todas formulações. Os diâmetros médios alcançados pelos filmes no teste in vitro ficaram entre 1,07 a 2,07cm. As formulações FC e F0 (sem própolis) não apresentaram halos de inibição. As contagens de Estafilococos Coagulase Positiva nos 28 dias de armazenamento do queijo coalho demonstraram que o filme com própolis provocou a redução de 1 ciclo logarítmico na contagem desses micro-organismos nos períodos de 4, 12, 20 e 28 dias, quando comparados com todos os controles. Os resultados obtidos indicam que os filmes podem ser uma alternativa competitiva para redução no uso de filmes sintéticos no acondicionamento de alguns alimentos, podendo exercer um efeito antimicrobiano.
Palavras-chaves: Bacillus cereus; Concentração inibitória mínima;
filmes biodegradáveis.
55
Development and evaluation of the antimicrobial action films of starch
and glycerol added nanocellulose and propolis red
Abstract
Active biodegradable films are obtained from natural polymers and substances added in order to increase the shelf life of foods through contact with the packaged product. Studies show that the incorporation of these movies nanocelulose improved some of its properties. Among the active agents incorporated, have an interest in natural, as propolis extracts. The aim of the study was to develop, characterize and verify the antimicrobial films prepared starch-based and glycerol reinforced nanocelulose and incorporated with propolis. The fiber was extracted nanocelulose licuri by acid hydrolysis. For preparation of the films was used assays with fixed concentrations of starch (4%) and glycerol (1%) and varying concentrations of nanocelulose (0-1%) and from propolis extract (0.4 to 1%) of According to the experimental design. The films were obtained by casting process and characterized by physico-chemical, thermal and barrier. The antimicrobial efficacy was checked in vitro using diffusion test, and as packaging of cheese rennet, checking control the development of coagulase-positive staphylococci. The presence of nanocrystals increased 110% in the tensile strength of the films, with the use of only 0.15% nanocelulose. Water activity and moisture content of the films, as well as the solubility and permeability to water vapor decreased with the addition of nanocelulose. Formulations with the highest concentrations of propolis were darker, with the lowest values of brightness. The curves of TG / DTG films showed two events of decomposition, for all formulations. The mean diameters achieved by in vitro test films were between 1.07 to 2.07 cm. The formulations FC and F0 (without propolis) showed no inhibition zones. The counts of coagulase-positive staphylococci in 28 days of storage the cheese curd showed that the film with propolis, a decrease of one log cycle in the count of these microorganisms during periods of 4, 12, 20 and 28 days compared with all controls. The results indicate that the films can be a competitive alternative to reduce the use of synthetic films in the packaging of some foods, may exert an antimicrobial effect. Keywords: Bacillus cereus; Diffusion test; biodegradable films.
56
1- Introdução
A indústria alimentícia procura desenvolver produtos com qualidade e
segurança para atender a um mercado consumidor cada vez mais exigente.
Assim, além da aplicação de boas práticas higiênico-sanitárias, é necessário o
acondicionamento do produto em embalagens adequadas para proteger e
conservar o alimento durante as fases de estocagem e comercialização,
assegurando ao consumidor a aquisição de um produto saudável (WEN-XIAN
DU et al., 2011).
Entre os principais tipos de embalagens para os alimentos estão os
filmes plásticos flexíveis, os quais apresentam excelentes propriedades
mecânicas e de barreira a gases e vapor de água. Entretanto, estes não são
facilmente reutilizáveis ou biodegradáveis permanecendo na natureza em
quantidades cada vez maiores (HABIBI et al., 2010; VEIGA-SANTOS et al.,
2007).
Ultimamente, inúmeros estudos vêm sido realizados no sentido de
proporcionar embalagens alternativas como os filmes biodegradáveis, obtidos a
partir de materiais agrícolas renováveis, como o amido. Os filmes a base de
amido são transparentes, atóxicos, possuem moderada permeabilidade ao
oxigênio e baixa barreira à umidade (HOLT et al., 2010). No entanto, a baixa
resistência mecânica e a sua alta sensibilidade a água restringe a utilização
desses filmes, especialmente em alimentos com alta umidade.
Nesse contexto, tem sido realizadas pesquisas buscando incorporar
nessas matrizes, nanopartículas orgânicas, como a nanocelulose, que podem
melhorar as propriedades mecânicas dos filmes (HABIBI et al., 2010; HOLT et
al., 2010). Essas nanopartículas podem ser obtidas de diferentes fontes de
fibras naturais como algodão, madeira, sisal, bambu, coco e bagaço de cana-
de-açúcar, entre outros (SILVA et al., 2012).
Além da possibilidade da aditivar filmes biodegradáveis com
nanopartículas, existe a tendência de ativá-los com compostos bioativos,
resultando em filmes ativos reforçados mecanicamente com manutenção da
biodegradabilidade. Os filmes antimicrobianos e antioxidantes, por exemplo,
podem controlar o desenvolvimento de espécies específicas de micro-
57
organismos e aumentar a estabilidade oxidativa dos produtos embalados,
respectivamente (KECHICHIAN et al., 2010; PELISSARI et al., 2009; WEN-
XIAN DU et al., 2011).
A demanda por ingredientes naturais antimicrobianos tem crescido
porque os consumidores estão mais conscientes sobre o risco potencial para a
saúde associados ao consumo de componentes sintéticos, apesar de sua
eficiência (CAREAGA et al, 2003; CHOI et al, 2006; MATAN et al, 2005;
MOREIRA et al., 2005).
Existem vários ingredientes naturais que apresentam atividade
antimicrobiana e antioxidante, tais como: canela (MATAN et al, 2005); pimenta
(CAREAGA et al, 2003); café (DAGLIA et al., 1998); mel (MUNDO et al., 2004),
e extrato de própolis (CHOI et al, 2006). Desses, a própolis vermelha tem
grande potencial para ser adicionado as embalagens, já que sua elevada
atividade antimicrobiana e antioxidante foi confirmada em diversos estudos.
Filmes biodegradáveis adicionados de própolis já foram desenvolvidos
(BODINI, 2011; CORRÊA, 2011), entretanto, geralmente, apresentaram
propriedades mecânicas insatisfatórias.
Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da adição
de própolis vermelha e de nonocelulose nas propriedades mecânicas, físico-
químicas e na permeabilidade ao vapor de água de filmes biodegradáveis a
base de fécula de mandioca e glicerol, assim como, avaliar a ação
antimicrobiana dos filmes in vitro e como embalagem para queijo coalho.
2- Ensaios Preliminares
2.1- Determinação das Concentrações de Fécula de Mandioca e
Glicerol
As concentrações fixas de fécula e glicerol foram determinadas através
de ensaios preliminares de formação dos filmes, utilizando uma concentração
de nanocelulose e de própolis fixa (1,0%), equivalente a máxima utilizada no
trabalho, de acordo com o planejamento experimental. Foram utilizadas quatro
58
diferentes concentrações de fécula e glicerol (Tabela 1), e os filmes foram
avaliados visualmente.
Tabela 1 – Concentrações de fécula e glicerol utilizadas nos testes de formação dos filmes.
Formulações Teste
Concentrações (%)
Fécula Glicerol
1 3,6 0,9
2 4,5 0,5
3 4,0 1,0
4 4,0 1,5
A formulação 3 foi a selecionada para o trabalho, pois apresentou
melhores características visuais, onde a incorporação do extrato de própolis foi
mais uniforme.
2.2- Interferência da luz UV
Foram realizados testes preliminares para verificar a interferência da
incidência da luz UV na concentração de compostos fenólicos e na atividade
antimicrobiana dos filmes como forma de avaliar se essa etapa iria interferir de
forma significativa nos resultados.
Para isso, foram preparados filmes teste com uma concentração de
própolis de 1,0%, a máxima utilizada no trabalho, de acordo com os resultados
obtidos para a CIM do extrato de própolis. Esses filmes foram submetidos a
incidência da luz UV em câmara de fluxo laminar por 15 minutos, de forma a
simular o que foi feito no estudo. Filmes controle, sem incidência da luz UV,
também foram utilizados.
A análise estatística foi realizada utilizando o programa estatístico
STATISTICA® 7.0.
A análise estatística dos resultados demonstrou que não houve
diferença significativa entre os resultados obtidos para os dois tratamentos,
demonstrando que a luz UV não degradou os compostos fenólicos dos filmes e
59
não interferiu na atividade antimicrobiana, no tempo de incidência de 15
minutos que foi testado. Os resultados demonstraram que a luz UV pode ser
utilizada para descontaminar os filmes, sem interferências significativas
(p<0,05) nos resultados. A Figura 1 mostra os halos de inibição formados para
os micro-organismos testados.
Figura 1 – Halos de inibição formados pelos filmes para Bacillus cereus e Staphylococcus aureus, respectivamente.
2.3- Concentração de Compostos Fenólicos
Foi determinada a concentração de compostos fenólicos de 10 amostras
dos filmes submetidos a incidência da luz UV com seus respectivos controles.
As análises foram feitas em triplicata. Os resultados foram comparados,
verificando a existência de diferença significativa, através do teste de Tukey. A
determinação de compostos fenólicos totais dos filmes foi realizada conforme
Bodini (2011).
2.4- Atividade Antimicrobiana
Para avaliação da atividade antimicrobiana, discos de 6 mm de diâmetro
dos filmes foram inseridos em placas de petri, previamente inoculadas com
Bacillus cereus, Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus, micro-
organismos que foram utilizados no trabalho. As placas foram incubadas,
considerando o binômio tempo/temperatura de cada micro-organismo
(PINHEIRO, 2009). Em seguida os halos de inibição formados foram medidos,
60
verificando a existência de diferença significativa entre os resultados obtidos
para ambos os filmes. A análise foi realizada com 10 amostras, sendo realizado
em triplicata, obtendo-se uma média para cada amostra.
3- Planejamento Experimental
As formulações dos filmes foram calculadas através de um planejamento
experimental. O planejamento experimental adotado foi o Delineamento
Composto Central Rotacional (DCCR), com duas variáveis independentes e
com quatro pontos ortogonais, quatro pontos axiais e três pontos centrais,
resultando em 11 ensaios. Ele foi montado com ajuda do programa
STATÍSTICA 7.0. e com base nos resultados obtidos na caracterização do
extrato de própolis e nos testes preliminares.
As variáveis independentes foram a concentração de própolis vermelha (%) e a
concentração de nanocelulose (%). Os valores codificados e reais dessas
variáveis encontram-se na Tabela 2. Os limites dos valores reais foram
escolhidos com base nos resultados preliminares e na literatura. As
concentrações fixas de fécula de mandioca e glicerol foram determinadas
através de ensaios preliminares.
Tabela 2 – Valores codificados e reais das variáveis independentes estudadas
no DCCR.
Ensaios
Valores Codificados Valores Reais (%)
Própolis (x1)
Nanocelulose (x2)
Própolis Nanocelulose
1 -1,00 -1,00 0,50 0,15 2 -1,00 +1,00 0,50 0,85 3 +1,00 -1,00 0,90 0,15 4 +1,00 +1,00 0,90 0,85 5 -1,41 0 0,40 0,50 6 +1,41 0 1,00 0,50 7 0 -1,41 0,70 0,00 8 0 +1,41 0,70 1,00 9* 0 0 0,70 0,50
10* 0 0 0,70 0,50 11* 0 0 0,70 0,50 *pontos centrais
61
Para comparação dos resultados, foram desenvolvidos dois filmes
controles: um filme controle (F0), composto por fécula, glicerol e 0,5% de
nanocelulose, e outro filme composto, apenas, por fécula e glicerol (FC).
4- Material e Métodos
As folhas do licuri utilizadas para extração da nanocelulose foram
coletadas de fazendas do município de Cruz das Almas, no Estado da Bahia,
Brasil. A fécula foi, gentilmente, doada pela Cargill Agrícola SA (Porto Ferreira,
Brasil). A própolis vermelha foi doada por apiários de Aracaju, Sergipe. O
glicerol, juntamente com os reagentes, hidróxido de sódio, clorito de sódio,
ácido sulfúrico e ácido acético foram adquiridos comercialmente da Vetec
Química Fina. O polietileno foi gentilmente cedido pela Braskem, e o queijo
coalho foi adquirido comercialmente de supermercados locais da cidade de
Salvador, Bahia, Brasil.
4.1- Obtenção da Nanocelulose (Nw)
A nanocelulose foi obtida a partir da folha do licuri, seguindo as
metodologias propostas por Rosa et al. (2010), com adaptações. Inicialmente,
as folhas foram cortadas e moídas (Figura 2).
Figura 2 – Fibra de licuri moída utilizada para a obtenção de nanocelulose.
62
As folhas moídas foram lavadas com solução de NaOH 2%, durante 4
horas a uma temperatura de 80ºC, sob agitação constante. O procedimento foi
repetido quatro vezes, para total remoção da hemicelulose, lignina e de outros
componentes da fibra (Figura 3).
Figura 3 – Processos de lavagem das fibras.
Posteriormente, foi iniciada a etapa de branqueamento, onde ocorre a
remoção de alguns componentes remanescentes responsáveis pela coloração
da fibra, usando uma solução de clorito de sódio 1,7% e uma solução tampão,
composta por hidróxido de sódio e ácido acético. O procedimento foi repetido 2
vezes, empregando-se uma temperatura de 80ºC por 6 horas, sob agitação
constante. Depois dos tratamentos de branqueamento, as fibras foram filtradas,
lavadas com água destilada, secas e pulverizadas em moinho Cadense (Figura
4).
Após esses procedimentos, foi iniciada a etapa de hidrólise ácida onde a
polpa moída foi dispersa em uma solução de ácido sulfúrico 55% a 55ºC por 30
minutos, tomando-se a proporção de 9mL de ácido para cada grama de polpa
1ª lavagem
2ª lavagem
3ª lavagem
4ª lavagem
63
branqueada. Nesse processo são produzidos os nanofios de celulose, pois o
ácido quebra as regiões amorfas das microfibras de celulose. A amostra foi,
então centrifugada a 4400 rpm (centrífuga marca Eppendorf, modelo 5702R)
por 10 minutos a 10ºC, recolhendo-se o sobrenadante. Este procedimento foi
repetido até não apresentar mais sobrenadante. Posteriormente, as
suspensões foram submetidas a diálise, utilizando membranas de celulose até
a suspensão atingir um pH maior ou igual a 6. Essa etapa permite a remoção
do ácido livre na suspensão.
Figura 4 – Etapa de branqueamento.
A etapa final é a dispersão da solução de nanocelulose em banho de
ultrassom por 10 minutos. A Figura 5 ilustra as últimas etapas do processo.
Figura 5 – Etapas de centrifugação, diálise, banho de ultrassom e solução de nanocelulose, respectivamente.
A concentração das suspensões de nanocelulose foram determinadas
através da secagem de 10mL da suspensão em estufa até peso constante.
Branqueamento
64
4.2- Caracterização da Nanocelulose
4.2.1- Birrefringência da Supensão de Nanocelulose
A birrefringência das suspensões de nanocelulose em água foi
determinada utilizando filmes polarizadores cruzados, perpendiculares entre si,
com incidência de luz direta sobre um deles, sendo a amostra interpolada entre
os filmes (VAN-DER-BERG et al., 2007).
4.2.2- Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)
A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi usada para
caracterizar a nanocelulose, determinando o comprimento das fibras (L),
largura (D), relação de aspecto (L/D) e indicando o estado de agregação dos
cristais. Suspensões aquosas diluídas de nanocelulose (0,01% p/v) foram
depositados em uma grade de cobre (300 mesh), deixada em repouso por 60
segundos. As amostras foram subsequentemente coradas com uma solução a
2% de acetato de uranilo. A grade foi seca e visualizada através de um Tecnai
FEI G2-Espírito com uma tensão de aceleração de 120 kV. Os comprimentos e
larguras foram medidos diretamente das micrografias eletrônicas de
transmissão usando o programa Image Tool 6.3 com 30 medições para
determinar os valores de média e desvio padrão.
4.2.3- Análise Termogravimétrica (TG)
A análise termogravimétrica da nanocelulose foi realizada em um
analisador térmico (TGA) Perkin Elmer, modelo Pyris, utiliando uma massa de
aproximadamente 5 mg, cadinho de alumínio, atmosfera inerte de nitrogênio de
50 mL min-1, com taxa de aquecimento de 10 ºC min-1, no intervalo de
temperatura de 25 a 700 ºC. A temperatura em que ocorreu a maior
degradação das amostras obtida por meio da derivada das curvas
termogravimétricas obtidas (DTG).
65
4.3- Obtenção do Extrato de Própolis Vermelha
Os extratos de própolis vermelha foram obtidos de acordo com
metodologia proposta por Silva (2009) com adaptações. Inicialmente, 30 g de
própolis bruta foi triturada e moída. Então, adicionou-se 100 mL de álcool de
cereais a 70%, e a mistura foi mantida em banho-maria a temperatura de 70
ºC, sob agitação constante, por um período de 30 minutos. Os extratos obtidos
foram centrifugados a 4400 rpm (centrífuga marca Eppendorf, modelo 5702R),
a temperatura de 10ºC, por 10 minutos. O sobrenadante foi filtrado e,
posteriormente, armazenado em frasco âmbar a temperatura de 10ºC,
obtendo-se, assim, o extrato de própolis.
Para obtenção de extratos com concentração inferiores, foram
realizadas diluições em álcool de cereais a 70%. A Figura 6 ilustra etapas da
preparação dos extratos.
Figura 6 – Etapas da obtenção dos extratos de própolis vermelha.
4.4- Caracterização do Extrato de Própolis vermelha
4.4.1- Concentração de Compostos Fenólicos Totais
A determinação de compostos fenólicos totais foi realizada em triplicata,
utilizando o método espectrofotométrico segundo Bodini (2011), utilizando o
ácido gálico como padrão de referência.
Inicialmente, o extrato de própolis na concentração de 5% foi diluído
(1:100) em álcool etílico (80%) imediatamente antes da análise. Uma alíquota
de 0,5 mL de extrato diluído foi distribuída em tubos de ensaio, sendo
adicionado 2,5 mL do reagente Folin Ciocalteau diluído (1:10), agitando-se a
66
mistura por 5 minutos. Em seguida foi adicionado 2,0 mL da solução de
carbonato de sódio a 4%, homogeneizando a mistura, mantendo-a em repouso
por 2 horas, em ambiente sem luminosidade. A leitura espectrofotométrica foi
realizada utilizando-se comprimento de onda de 740 nm. O branco foi
conduzido nas mesmas condições. O resultado foi expresso como equivalente
de ácido gálico (mg AG/g), calculado por meio de uma curva construída com
concentrações de ácido que variaram de 25 a 300 µg/mL. A equação da curva
padrão foi obtida utilizando o software Origin 8.1, com um coeficiente de
correlação positivo (R=0,99491).
4.4.2- Teste de Difusão em Ágar
Para avaliação da ação antimicrobiana do extrato de própolis vermelha
foram utilizados extratos nas concentrações de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1; 2; 3; 4;
5; 6; 7; 8; 9 e 10%. Foram realizados testes de inibição para as bactérias
Gram-negativas Salmonella spp. e Escherichia coli, sobre as Gram-positivas
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Listeria monocytogenes, e sobre
Bolores (Aspergillus niger) e Leveduras (Saccharomyces sp), utilizando os
métodos de Difusão em Discos (CLSI, 2011; GELINSKI et al., 2007) e Difusão
em poços (PINHEIRO, 2009).
As cepas de Bolores, Leveduras, Salmonella spp., Escherichia coli e
Bacillus cereus foram obtidas da bacterioteca do Laboratório de Pesquisa em
Microbiologia de Alimentos, da Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal da Bahia. Já as cepas de Staphylococcus aureus e Listeria
monocytogenes, foram obtidass do Laboratório de Controle de Qualidade de
Alimentos, da Escola de Nutrição da Universidade Federal da Bahia. Todas as
cepas foram armazenadas em criotubos, contendo caldo Infusão de Cérebro
Coração (BHI), com 20% de glicerol e mantidas a -20ºC, para posteriores
análises.
Inicialmente, as culturas dos micro-organismos foram ativadas em ágar
Tripitona de Soja (TSA), para as bactérias, e em ágar Batata Dextrose
Acidificado (BDA), para os fungos, considerando as temperaturas específicas
de crescimento para cada micro-organismo. Com as culturas ativas, foram
67
preparadas suspensões em solução salina a 0,85% para servir como inóculos.
As suspensões foram ajustadas, em densitômetro DEN 1 (Biosan) até atingir
0,5 na escala McFarland, correspondendo a 1,0x108 UFC/mL. As suspensões
foram, então, plaqueadas uniformemente, com o auxílio de um swab estéril,
(marca Absorve), em placas de petri, com ágar Muller-Hinton para o teste com
as cepas bacterianas, e com ágar batata dextrose (BDA) acidificado para o
teste com as cepas fúngicas.
Os meios de cultura TSA, BHI e Muller-Hinton utilizados nas análises
foram da marca Acumedia. Já o meio BDA foi da marca Himedia.
Para o método de Difusão em Discos, foram preparados discos de papel
filtro estéreis de 6 mm de diâmetro que foram impregnados com os extratos de
própolis vermelha nas concentrações a serem testadas, e então colocados
sobre o ágar com auxílio de uma pinça estéril (GELINSKI et al., 2007).
Para o método de Difusão em Poços, foram realizadas perfurações de 9
mm de diâmetro no Agar Muller Hinton, onde foram inseridos volumes de 80 µL
dos extratos de própolis nas concentrações a serem testadas (PINHEIRO,
2009).
As placas com os discos ou poços, foram, então, incubadas
considerando o binômio tempo/temperatura de cada micro-organismo. Para
todo tratamento foi realizado o teste controle, obtido através da utilização da
solução de álcool de cereais a 70%.
No teste de difusão em discos, considerou-se com capacidade
antimicrobiana os extratos que provocaram o desenvolvimento de um halo de
inibição maior ou igual a 10 milímetros de diâmetro (GELINSKI et al., 2007). Já
para o teste de difusão em poços, para serem considerados antimicrobianos,
os extratos deveriam provocar o aparecimento de um halo de inibição igual ou
superior a 15 milímetros de diâmetro (PINHEIRO, 2009).
4.4.3- Análise Termogravimétrica
A análise termogravimétrica da própolis vermelha foi realizada em um
analisador térmico (TGA) Perkin Elmer, modelo Pyris, utiliando uma massa de
aproximadamente 4 mg, cadinho de alumínio, atmosfera inerte de nitrogênio de
68
50 mL min-1, com taxa de aquecimento de 10ºC min-1, no intervalo de
temperatura de 25 a 700ºC. A temperatura em que ocorreu a maior degradação
das amostras obtida através da derivada das curvas termogravimétricas
obtidas (DTG).
4.5- Elaboração dos Filmes
Os filmes foram obtidos através da técnica casting conforme Veiga-
Santos et al. (2007) e Souza et al. (2011). As suspensões filmogênicas foram
obtidas, misturando-se os componentes com água e aquecendo-os a 70ºC, sob
agitação constante, para total gelatinização do amido. Após esfriar, as soluções
foram colocadas em placas de poliestireno (45 gramas por placa), e levadas à
estufa a 35°C por 24 horas, para a total evaporação da água e formação dos
filmes, conforme Figura 8 (OLIVEIRA et al., 1996). Posteriormente, os filmes
foram acondicionados em dessecadores com umidade relativa de 56 ± 2% a
uma temperatura de 21 ± 3ºC, por 10 dias, para posterior caracterização.
Figura 8 – Solução filmogênica (a) e filmes após secagem em estufa (b).
4.6- Caracterização dos Filmes
As análises de caracterização foram realizadas nos mesmos períodos de
armazenamento para que eventuais diferenças de degradação do material não
alterassem o resultado final de avaliação.
a b
69
4.6.1- Concentração de Compostos Fenólicos Totais
A determinação de compostos fenólicos totais dos filmes foi realizada
conforme item 4.4.1, sendo necessária uma etapa de pré-tratamento dos
filmes.
Amostras dos filmes de 11 a 12 miligramas foram solubilizadas em 6 mL
de água destilada a 50ºC por 50 minutos. Em seguida, as soluções foram
agitadas, adicionando-se 4mL de álcool de etílico (80%), mantendo-as a 50ºC
por 10 minutos (BODINI, 2011). Após esse período, as soluções foram
novamente agitadas e então resfriadas a temperatura ambiente para posterior
análise.
4.6.2- Espessura
Para a determinação da espessura, foram utilizados oito retângulos dos
filmes, previamente recortados, com medidas aproximadas de 8 cm x 2,5 cm.
Em cada retângulo, foi realizada três leituras aleatórias, tomando-se a média.
Para determinação da espessura, foi utilizada a média obtida das leituras
realizadas nos oito retângulos. As leituras foram feitas utilizando um
micrômetro digital da marca Digimess, com uma resolução de 0,001 milímetros.
STMA
4.6.3- Atividade de Água
A atividade de água (Aa) foi determinada utilizando um decágono,
Aqualab Lite. A água pura (Aa de 1,000 ± 0,001) e LiCl (Aa de 0,500 ± 0,015)
foram utilizados para calibração do equipamento. As análises foram realizadas
em triplicata.
4.6.4- Umidade
A umidade dos filmes foi medida através da secagem da amostra no
infravermelho, utilizando o equipamento Moisture Analyzer, modelo AND MX-
70
50. A intensidade da radiação emitida será ajustada de modo que a amostra
alcance a temperatura de 110ºC. As análises foram realizadas em triplicata.
4.6.5- Solubilidade em Água
A solubilidade em água dos filmes foi determinada conforme Bodini
(2011) com adaptações. Amostras dos filmes no formato de discos, com
diâmetro de dois centímetros foram pesadas (mi) e imersas em 50 mL de água
destilada, mantidas sob agitação mecânica por 24 horas, à 25ºC. Após esse
período, as amostras foram secas (105ºC, 24 horas), e então pesadas
novamente, determinando-se a massa final seca das amostras (mf). A
solubilidade foi expressa em termos de massa seca dissolvida, sendo calculada
de acordo com a equação [1].
Sol = (mi – mf) * 100 / mi (Equação 1)
Onde: Sol = solubilidade em água (g/100g de filme), mi = massa inicial
da amostra (g), mf = massa seca final da amostra (g) após solubilização.
4.6.6- Permeabilidade ao Vapor de Água
A permeabilidade ao vapor da água nos filmes foi determinada
gravimetricamente segundo metodologia proposta pela ASTM método E96-80
(2005). Amostras de filmes foram dimensionadas em formato circular com 36
mm de diâmetro e aplicadas em células de permeação contendo água
destilada. Estas células foram colocadas em dessecador contendo sílica gel, de
forma a assegurar um gradiente hídrico no sistema, e o conjunto foi
armazenado a 25 °C (Figura 9). Ao longo de cinco dias, houve monitoramento
do peso das células e filmes em intervalos de 12 h, de forma a acompanhar a
variação de peso no período.
71
Figura 9 – Análise de permeabilidade ao vapor de água dos filmes.
O cálculo da permeabilidade ao vapor de água foi realizado por meio de
regressão linear entre os pontos de perda de peso, segundo a Equação [2].
Foram feitas três repetições para cada amostra.
P = (g * x) / t * A * ΔP (Equação 2)
Onde:
P é permeabilidade ao vapor de água (g/(Pa*s*m));
g é a perda de peso dos filmes;
t é o tempo total em horas;
A é a área de permeação;
x é a espessura média do filme (mm);
ΔP é a diferença de pressão de vapor do ambiente contendo sílica gel (kPa, a
25 °C) e da água pura (3,167 kPa, a 25 °C) g/t.
O ΔP também foi calculado por regressão linear entre os pontos de
ganho de peso e tempo (regime permanente).
4.6.7- Propriedades Mecânicas
Foram realizados nos filmes, ensaios de tração, utilizando uma Máquina
Universal de Ensaio, EMIC – Linha DL 200 MF, com carga máxima de 20KN,
operada conforme as especificações da ASTM método padrão D882-00
(ASTM, 2001), de acordo com Veiga-Santos et al. (2007). Tiras dos filmes nas
72
medidas de 8 cm x 2,5 cm foram cortadas sob as condições de pré-
acondicionamento (56%UR, 21°C) e montadas entre as garras do
equipamento. A posição inicial e a velocidade de separação das garras foram
fixadas a 50 mm e 12,5 mm/min, respectivamente. Dez medidas foram feitas
para cada amostra. Foram analisados os valores do módulo de elasticidade,
tensão máxima e da porcentagem de deformação dos filmes.
4.6.8- Propriedades Térmicas
4.6.8.1- Análise Termogravimétrica (TG e DTG)
As análises termogravimétricas dos filmes foram realizadas em um
analisador térmico (TGA) Perkin Elmer, modelo Pyris. Nos ensaios foram
usadas massas de aproximadamente 5 mg, cadinho de alumínio, atmosfera
inerte de nitrogênio de 50 mL min-1, com taxa de aquecimento de 10 ºC min-1,
no intervalo de temperatura de 25 a 600 ºC. A temperatura em que ocorreu a
maior degradação das amostras obtida através da derivada das curvas
termogravimétricas obtidas (DTG).
4.6.9- Colorimetria
Os ensaios foram realizados em um Espectrofotômetro, marca Perkin
Elmer, UV/VIS, Lambda 35. No equipamento, após calibração, folhas dos
filmes foram colocadas no disco de abertura do espectrofotômetro e analisadas
apos a incidência de luz visível. O equipamento forneceu os valores dos
parâmetros de cor L*, a* e b*.
4.6.10- Atividade Antimicrobiana in vitro
A atividade antimicrobiana in vitro dos filmes foi realizada de acordo com
o teste de difusão em disco utilizando discos do filme de 6mm de diâmetro,
seguindo as metodologias descritas por CLSI (2011) e Gelinski et al. (2007)
com adaptações.
73
Para avaliação da atividade antimicrobiana, os filmes foram previamente
mantidos sob luz ultravioleta (UV) por 15 minutos, em câmara de fluxo laminar,
visando à descontaminação inicial dos mesmos, evitando a interferência nos
resultados.
As placas de petri com as culturas dos micro-organismos para os testes
de difusão em discos foram obtidas conforme descrito no item 4.4.2, sendo
verificada a ação sobre as bactérias Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e
Listeria monocytogenes.
A leitura dos testes foi realizada com auxílio de uma régua milimetrada,
utilizando-se a medida do tamanho do diâmetro dos halos de inibição em volta
de cada disco do filme, sendo incluído na medição o próprio disco de 6mm.
Foram considerados com ação antimicrobiana os filmes que apresentaram a
formação de um halo de inibição igual ou superior a 10mm de diâmetro
(GELINSKI et al., 2007).
4.6.11- Atividade Antimicrobiana em Queijo Coalho
O queijo do tipo coalho foi fatiado e submetido a luz UV em câmara de
fluxo laminar por 15 minutos, visando a redução da carga microbiana inicial. As
amostras foram embaladas com filme ativo (formulação 9 – ponto central), e
armazenadas sob refrigeração, (temperatura de 7 ± 2ºC), juntamente com os
controles: amostras embaladas no filme sem própolis (filme com amido, glicerol
e 0,5% de nanoculose) e em filme de polietileno puro, além das amostras de
queijo que foram mantidas expostas. Os filmes de polietileno (0,089 ± 0,011
mm) foram obtidos por extrusão, utilizando uma extrusora dupla rosca, marca
AXPlásticos.
A formulação 9 foi escolhida por apresentar propriedades mecânicas e
características físico-químicas mais satisfatórias, além de possuir ação
antimicrobiana nos testes in vitro.
As amostras foram analisadas quanto à contagem de Estafilococcos
Coagulase Positiva, nos tempos 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24 e 28 dias. As análises
foram realizadas conforme metodologias recomendadas pelo APHA (2001).
Esse micro-organismo foi escolhido pois o gênero Staphylococcus sp.
74
apresentou baixa resistência ao princípio ativo da própolis nos testes in vitro,
além de estar frequentemente associado a surtos alimentares referentes ao
consumo de queijo coalho.
4.7- Análise dos Resultados
A análise estatística dos resultados foi realizada por meio da
Metodologia de Superficie de Resposta, utilizando o software STATISTICAR
7.0. Os efeitos das variáveis independentes sobre as dependentes foram
avaliados pelo puro erro, considerando um nível de confiança de 95% para
todas as variáveis. Os dados gerados foram tratados pela ANOVA (Análise de
Variância), calculando-se os valores de F e verificando o ajuste do modelo e a
qualidade desse ajuste. Além disso, obteve-se o coeficiente de determinação (R2),
para avaliar a variação dos resultados obtidos. Os gráficos de Pareto foram
avaliados para verificar a influência das variáveis independentes nos parâmetros
estudados e as superfícies de respostas foram obtidas para definir as faixas ótimas
de concentração de cada variável na elaboração dos filmes.
A análise estatística também permitiu obter os modelos matemáticos
para as respostas que apresentaram melhor ajuste dos resultados
experimentais ao modelo de segunda ordem descrito na equação [3], tendo
como critérios a porcentagem de variação explicada pelo modelo (R2) e o Teste
F na analise de variância (ANOVA).
Y =b0 +b1X1 +b2X2 +b11X12 +b22X2
2 +b12X1X2 (Equação 3)
Onde:
Y = Variável dependente;
X1 e X2 = Variáveis independentes;
b0 = Termo de compensação;
b1 e b2 = Termos lineares;
b11 e b22 = Termos quadráticos;
b12 = Termo de interação entre as variáveis independentes.
75
. Nos parâmetros em que os resultados não apresentaram um bom ajuste
ao modelo, foram avaliados os gráficos de pareto e as curvas de contorno,
observando a interferência significativa de cada variável nos resultados obtidos.
Os resultados dos ensaios preliminares, de caracterização da
nanocelulose e do extrato de própolis vermelha e da atividade antimicrobiana
em matriz alimentícia foram analisados através do Teste de Tuckey, verificando
a existência de diferenças significativas entre os resultados a 95% de
confiança.
5- Resultados e Discussão
5.1- Preparação da Nanocelulose
A fibra de licuri utilizada na extração da nanocelulose possuía um teor de
aproximadamente 68% de celulose, 15,9% de lignina e de 8% de hemicelulose.
A nanocelulose foi obtida em suspensão aquosa com uma concentração
de 0,0117 g/10 mL, sendo que a extração resultou em um rendimento de 33%
em relação a massa de polpa de celulose utilizada e de 5,7% em relação a
massa das folhas de licuri moídas.
5.2- Caracterização da Nanocelulose
5.2.1- Birrefringência da Supensão de Nanocelulose
Em relação à birrefringência, a suspensão de nanocelulose apresentou
uma fase nemática, considerada como uma indicação da presença de
nanocristais isolados em suspensão, ou seja, uma fase líquido-cristalina
(Figura 10).
76
Figura 10 – Birrefrigência da nanocelulose de licuri.
Segundo Van-Den-Berg et al. (2007), as suspensões de nanocelulose
apresentam tendência em se alinharem devido a sua alta rigidez e elevada
relação comprimento/diâmetro. Essa tendência causa a birrefringência da
dispersão, que pode ser visualizada diretamente através de polarizadores, e
que indica a boa dispersividade da suspensão, necessária para incorporação
nas matrizes poliméricas.
5.2.2- Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)
A micrografia obtida por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)
dos nanocristais de celulose de licuri esta apresentada na Figura 11.
Figura 11 - Micrografia obtida da solução de nanocelulose de licuri com a presença dos nanocristais.
77
A imagem evidencia a obtenção dos nanocristais em solução,
constituídos, principalmente, por fibrilas, na forma individual e agregada. O
resultado foi semelhante ao encontrado por Rosa et al. (2010) e Pereira (2010),
que obteve nanocristais a partir da casca de coco e da fibra de bananeira,
respectivamente.
Os nanocristais apresentaram comprimento médio de 157±24 nm e uma
largura média de 5,7±1,6 nm. A relação de comprimento e largura (L/D)
apresentou um valor médio de 27±1,4 nm. Segundo Rosa et al. (2010) este
valor está na faixa da nanocelulose que têm grande potencial para serem
usados como reforço em filmes biodegradáveis.
5.2.3- Análise Termogravimétrica (TGA)
Através da análise das curvas de TG e DTG da nanocelulose de licuri
(Figura 12), pode-se verificar duas etapas de perda de massa. A primeira
ocorreu entre 32 e 108ºC, equivalente a eliminação de água superficial e da
umidade da nanofibra, e a segunda entre 240 e 469ºC, devido a degradação
majoritária da celulose e de lignina residual, além da oxidação e quebra dos
resíduos da degradação da celulose em produtos de baixo peso molecular.
100 200 300 400 500 60020
40
60
80
100
Per
da d
e M
assa
(%
)
Temperatura (ºC)
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
Curva TG Curva DTG
Der
ivad
a pr
imei
ra d
a pe
rda
de m
assa
(%
)ºC
-1
Figura 12 – Curva TG/DTG para a nanocelulose de licuri.
78
Os resultados encontrados por Leão (2008), também analisando
nanocelulose de licuri, foram semelhantes ao encontrado nesse estudo. Os
autores evidenciaram eventos de perda de massa nas temperaturas entre 40 e
150ºC, e 282 e 456ºC. Observou-se que a partir da temperatura de 282ºC,
ocorreu uma maior oscilação na perda de massa, com uma queda mais
acentuada em torno de 282ºC, com o inicio da degradação da celulose e
328ºC, com o inicio da degradação da lignina residual.
Pereira (2010), analisando nanocelulose de fibra de bananeira, verificou
a perda de massa em três etapas. A primeira entre 35 e 87ºC, a segunda entre
289 e 335ºC, e a terceira entre 461 e 491ºC. Os autores atribuíram essas
etapas, respectivamente a, perda de água, degradação da celulose com grupos
sulfatos ácidos adquiridos na etapa de hidrólise, e quebras de ligação das
moléculas de celulose mais internas, que não fizeram contato com o ácido
sulfúrico, além da degradação da lignina residual.
Corrêa et al. (2009), em seu trabalho, já havia verificado a influência da
hidrólise ácida na estabilidade térmica das nanopartículas. Os autores afirmam
que os grupos sulfatos introduzidos na superfície das nanofibras após a hidrólise,
exercem efeito catalítico nas reações de degradação térmica da celulose,
reduzindo sua estabilidade.
Com relação a lignina residual, Rosa et al. (2009) acreditam que sua
presença promove maior estabilidade térmica as nanoceluloses, pois estudos
apontam que sua temperatura de degradação é superior a da celulose pura. De
acordo com Moran et al. (2008), a hemicelulose e a lignina são os primeiros a
se degradar, por volta dos 200°C, sendo que a lignina persiste até a
temperatura de 700°C, enquanto que a hemicelulose pirolisa completamente
aos 315°C. Já a celulose começa aos 315°C e chega até aos 400°C. Dessa
forma, autores acreditam que a etapa de branqueamento pode ser controlada,
de que forma a permitir a presença da lignina residual e do benefício provocado
por ela.
79
5.3- Extrato de Própolis Vermelha
Os extratos de própolis vermelha foram obtidos em concentrações que
variaram de 0,5% a 10%. Eles possuíam uma coloração vermelho-alaranjada,
na qual a intensidade da cor era proporcional a concentração dos extratos
(Figura 13).
Figura 13 – Extratos de própolis vermelha nas concentrações de 0; 0,5; 1; 3; 5;
7 e 10%.
5.4- Caracterização do Extrato de Própolis Vermelha
5.4.1- Concentração de Compostos Fenólicos Totais
A concentração de compostos fenólicos totais obtida para o extrato de
própolis a 5% foi de 79,51 mg de ácido gálico/g de extrato. Esse resultado foi
superior ao encontrado por Bodini (2011) que obteve uma concentração de
compostos fenólicos totais de 51,9 mg de ácido gálico/g de extrato, utilizando a
própolis verde. Resultados superiores foram encontrados por Moraes et al.
(2007), que encontrou valores próximos a 99,7 mg de ácido gálico
equivalente/g própolis, para a própolis vermelha, e de 84,3 mg de ácido gálico
equivalente/g própolis, para a própolis verde. Já Cabral et al. (2009), utilizando
um extrato etanólico de própolis vermelha, encontrou uma concentração de
257,98 mg de ácido gálico/g de extrato. Os autores ainda afirmam que esse foi
o maior valor encontrado em amostras de própolis brasileira.
Os resultados demonstram que a concentração de compostos fenólicos
nas amostras de própolis apresenta grande variabilidade, podendo variar com o
tipo de própolis, e consequentemente, com a sua localização geográfica.
80
5.4.2- Teste de Difusão em Ágar
A Tabela 3 apresenta os diâmetros médios dos halos de inibição
formados nas concentrações testadas de extrato alcoólico de própolis
vermelha, utilizando o método de difusão em poços. Foi observado que a
própolis inibiu com maior intensidade o desenvolvimento das bactérias Bacillus
cereus, Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus, ambas Gram-
positivas. Para essas bactérias, a utilização do extrato alcoólico de própolis a
0,4% foi suficiente para provocar a inibição, com um diâmetro médio de 1,5 cm
para os três micro-organismos. A própolis também foi capaz de inibir o
desenvolvimento de Salmonella spp. e de leveduras, sendo que para esses
micro-organismos foi necessário o emprego do extrato em uma concentração
maior, equivalente a 6% para Salmonella spp., e 8% para Leveduras, com os
mesmos diâmetros de inibição (Tabela 3).
Tabela 3 – Diâmetros médios de inibição (cm) obtidos no teste de difusão em poços, utilizando extratos alcoólicos de própolis em diferentes concentrações.
Concentrações do extrato (%)
Micro-organismos
Bacillus cereus
Listeria monocytogenes
Staphylococcus aureus
Salmonella sp. Levedura
0,0 0a 0a 0a 0a 0a 0,1 1,20b 1,13b 1,10b 0a 0a 0,2 1,20b 1,17b 1,10b 0a 0a 0,3 1,25b 1,37b 1,20b 1,00b 0a 0,4 1,50c 1,63c 1,50c 1,00b 1,00b 0,5 2,00d 1,63c 1,50c 1,20b 1,00b 1,0 2,25d 1,93d 2,20d 1,15b 1,15b 2,0 2,60e 2,23e 2,60e 1,15b 1,10b 3,0 2,60e 2,43e,f 2,55e 1,35c 1,10b 4,0 2,70e 2,63f,g 2,60e 1,40c 1,20b 5,0 2,70e 2,63f,g 2,90f 1,35c 1,35c 6,0 2,85f 2,77g,h 2,90f 1,50d 1,35c 7,0 2,90f 2,80g,h 2,85f 1,70d 1,40cd 8,0 2,90f 2,87g,h 3,00f 1,75d 1,50d 9,0 2,85f 2,83g,h 2,95f 1,70d 1,55d 10,0 2,90f 2,90h 2,90f 1,75d 1,50d
Diferentes letras, em uma mesma coluna, indicam que existe diferença (p<0,05) significativa entre as amostras.
Os resultados demonstraram que não houve diferença significativa entre
os diâmetros de inibição alcançados com a utilização dos extratos entre 6 e
81
10%, para Bacillus cereus e Listeria monocytogenes, entre 5 e 10% para
Staphylococcus aureus e entre 7 e 10% para Salmonella spp. e levedura
(Tabela 3), demonstrando que ambos extratos possuem a mesma capacidade
antimicrobiana.
Os resultados obtidos utilizando o método de difusão em discos
demonstraram a mesma tendência que os obtidos com o método de difusão em
poços, entretanto apresentando halos de inibição menores (Tabela 4),
sugerindo que a ação da própolis em solução é maior. A Figura 14 ilustra os
halos de inibição obtidos sobre Bacillus cereus no método de difusão em
discos.
Não foi observada a formação de halos de inibição para Escherichia coli
(Gram negativa) e para os bolores, mesmo com a aplicação dos extratos na
concentração máxima testada de 10%, mostrando que esses micro-organismos
foram resistentes ao princípio ativo da própolis.
Tabela 4 – Diâmetros médios (cm) de inibição encontrados para o teste com Bacillus cereus, utilizando o método de difusão em discos e em poços.
Concentrações (%) Diâmetros de inibição (cm)
Discos Poços 0,0 0a 0a 0,5 0,80b 2,00d 1,0 0,85bc 2,25d 2,0 1,05bc 2,60e 3,0 1,10cd 2,60e 4,0 1,25de 2,70e 5,0 1,60e 2,70e 6,0 1,85e 2,85f 7,0 1,80e 2,90f 8,0 1,85e 2,90f 9,0 1,80e 2,85f 10,0 1,85e 2,90f
Diferentes letras, em uma mesma coluna, indicam que existe diferença (p<0,05) significativa entre as amostras.
82
Figura 14 – Teste de difusão em discos para Bacillus cereus.
Esses resultados foram semelhantes ao encontrado em trabalho
realizado por Moraes et al. (2007), onde a própolis vermelha inibiu com maior
intensidade as bactérias Gram-positivas Staphylococcus aureus e Clostridium
perfringens, e com menor intensidade as bactérias Gram-negativas Salmonella
Typhimurium e Escherichia coli.
Daugsch (2007), também demonstrou em seu estudo, que a própolis
possui elevado potencial antimicrobiano sobre a bactéria Staphylococcus
aureus. Os resultados demonstraram que a eficiência antimicrobiana da
própolis é diretamente proporcional a quantidade de compostos fenólicos
presentes nos extratos, atribuindo a atividade biológica a essas substâncias.
A resistência da Escherichia coli ao princípio ativo da própolis, também
foi reportada por Endler et al. (2003), que não conseguiram halos de inibição
sobre a bactéria empregando extratos alcoólicos de própolis nas concentrações
de 15 e 30%. Diâmetros de inibição entre 7 e 20 milímetros foram encontrados
para Pseudomonas sp. e Staphylococcus aureus, respectivamente.
De acordo com Marcucci et al. (2001), a atividade antibacteriana da
própolis é maior frente as bactérias Gram-positivas, devido a presença de
flavonoides, ácidos e ésteres aromáticos, os quais atuariam sobre a estrutura
da parede celular desses micro-organismos através de um mecanismo de ação
ainda não elucidado.
Segundo Silva (2009), as diferenças encontradas entre a ação para as
bactérias Gram negativas e positivas deve-se as diferenças marcantes na
constituição química da parede celular desses micro-organismos (Figura 15).
83
Figura 15 – Parede celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas (SILVA, 2009).
A estrutura química da parede celular das bactérias Gram-negativas é
mais complexa quando comparada com a das Gram-positivas, apresentando
grandes quantidades de lipídios, proteínas e polissacarídeos. Sendo assim, é
provável que os compostos fenólicos da própolis, indicados como responsáveis
pela inibição do crescimento bacteriano, tenham mais dificuldade em interagir
com a parede celular das bactérias Gram-negativas (SILVA, 2009).
5.4.3- Análise Termogravimétrica (TGA)
As curvas de TG e DTG da própolis vermelha (Figura 16) demonstraram
a existência de dois eventos de perda de massa. O primeiro teve inicio em
46ºC e finalizou em 187ºC, quando já começou o segundo evento que finalizou
em 447ºC, onde ocorreu a maior perda de massa.
84
100 200 300 400 500 6000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Per
da d
e M
assa
(%
)
Temperatura (ºC)
Curva TG
-1,00
-0,75
-0,50
-0,25
0,00
Curva DTG
Der
ivad
a pr
imei
ra d
a pe
rda
de m
assa
(%
)ºC
-1
Figura 16 – Curva TG/DTG para a própolis vermelha.
5.5- Caracterização dos Filmes
5.5.1- Concentração de Compostos Fenólicos Totais
A determinação de compostos fenólicos totais nos filmes variou de 61,28
mg AG/g de filme, para a formulação 5 (0,4% de própolis), atingindo 98,33 mg
AG/g de filme para a formulação 6 (1% de própolis) (Tabela 5). Os resultados
obtidos apresentaram um bom ajuste ao modelo, podendo representar de
forma significativa (R2=0,94) e preditiva (Fcalc>Ftab) o efeito das variáveis
independentes, concentração de própolis e nanocelulose, no teor de
compostos fenólicos totais dos filmes.
O gráfico de pareto e a superfície de resposta gerados para esse
parâmetro evidenciam (Figura 17) a influência significativa (p<0,05) da
concentração de própolis e também da nanocelulose dos filmes sobre a
quantidade de compostos fenólicos totais presentes. Entretanto, como
esperado, observa-se que a concentração de própolis tem uma interferência
mais significativa nesse parâmetro, apresentando uma maior correlação linear.
Com o aumento da concentração de própolis dos filmes, ocorre um
incremento, praticamente linear, do teor de compostos fenólicos totais dos
85
mesmos (Figura 17), demonstrando uma boa incorporação da própolis e dos
seus compostos ativos no filme. A Equação 4 apresenta a fórmula gerada para
o modelo, onde observa-se que tanto a concentração de própolis quanto a de
nanocelulose contribuem linearmente no teor de fenólicos presentes no filme.
Fenólicos
1,009598
-5,44407
-6,79514
-7,78771
51,32006
p=,05Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
1Lby2L
Nanocelulose(Q)
(2)Nanocelulose(L)
Própolis(Q)
(1)Própolis(L)
Fenólicos
90 80 70 60 50
Figura 17 – Gráfico de pareto para análise de compostos fenólicos totais.
Fenólicos = 21,59 +117,11X – 46,33X2 +4,14Y – 11,50Y2 (Equação 4)
86
A concentração de compostos fenólicos totais encontrada, nesse
trabalho, para o extrato alcoólico de própolis a 5% foi de 79,51 mg,
encontrando-se dentro da faixa alcançada para os filmes. Isso sugere que
esses compostos foram incorporados na matriz, sem grandes perdas.
Bodini (2011), utilizando filmes plastificados com sorbitol e adicionados
de própolis vermelha, encontrou valores entre 8,8 e 50,3 mg AG/g de filme,
sendo que, a matriz polimérica empregada foi capaz de preservar os fenólicos
durante 177 dias de armazenamento, demonstrando a existência de interações
fortes entre os constituintes.
5.5.2- Espessura
A média das espessuras obtidas para as formulações dos filmes variou
de 0,076 a 0,099 mm (Tabela 5). A análise estatística demonstrou que os
resultados obtidos não apresentaram um bom ajuste ao modelo utilizado
(Fcalc<Ftab), não podendo ser empregado para representar adequadamente
as relações entre as variáveis independentes e a espessura obtida nos filmes.
Verifica-se, através do gráfico de pareto gerado (Figura 18) que apenas a
concentração de nanocelulose interferiu significativamente (p<0,05) na
espessura dos filmes (Figura 18). Através do gráfico de contorno (Ffigura 18),
observa-se que maiores concentrações de nanocelulose e de própolis seriam
necessárias para obter um modelo matemático adequado.
Souza et al. (2011), encontraram valores de espessura entre 0,123 e
0,141 mm para filmes a base de amido, elaborados por casting, e plastificados
com açúcar invertido e sacarose, com incorporação de polpa de manga e acerola,
sem diferenças significativas entre as diferentes formulações (p>0,05). Reis
(2011), avaliando filmes a base de amido e glicerol e incorporados de extrato de
erva mate e polpa de manga, encontrou espessuras que variaram de 0,111 a
0,125 mm, também não existindo diferença significativa (p>0,05) entre as
formulações.
Segundo Mali et al. (2010), o controle da espessura dos filmes
produzidos por casting é uma etapa que merece atenção, pois interfere nas
demais características dos filmes. Gennadios et al. (1994) afirmam que o
87
controle da espessura dos filmes é importante para definir a uniformidade
desses materiais, para a repetibilidade das medidas das propriedades e
validade das comparações entre propriedades dos filmes. De acordo com
Galdeano (2007), este parâmetro influencia largamente as propriedades
mecânicas, principalmente a força na perfuração e a permeabilidade ao vapor
de água de filmes hidrofílicos.
A influência da espessura na permeabilidade ao vapor de água dos
filmes já foi apontada por diversos autores (GALDEANO, 2007; HENRIQUE et
al., 2008; MALI et al., 2010), que relataram a ocorrência de filmes com
diferentes capacidades de se ligar à água e, consequentemente, com
diferentes permeabilidades, sendo formados a diferentes espessuras.
Normalmente, a escolha da matriz e do plastificante, assim como, a sua
concentração nos filmes interfere na espessura dos materiais obtidos. Shimazu
et al. (2007) confirmaram a interferência do plastificante na espessura dos
filmes. Eles formularam, por casting, filmes de amido com diferentes
concentrações de glicerol e verificaram que a espessura dos filmes variou de
0,07 a 0,10 mm e observaram um aumento na espessura dos filmes com o
incremento no teor do plastificante.
Espessura
,8536116
-1,86651
-2,28236
3,54329
4,86599
p=,05Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
(1)Própolis(L)
1Lby2L
(2)Nanocelulose(L)
Própolis(Q)
Nanocelulose(Q)
Espessura
0,14 0,13 0,12 0,11 0,1 0,09 0,08 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
Própolis
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Nan
ocel
ulos
e
Figura 18 – Gráfico de pareto para análise de espessura dos filmes.
88
Tabela 5 - Médias (± desvio padrão) das análises de caracterização das formulações dos filmes e do controle (sem própolis). E (espessura); aw (atividade de água); U (umidade-%), Compostos fenólicos totais (mg AG/g de filme), S (solubilidade em
água-%) e TPVA (permeabilidade ao vapor de água - gH2O.μm/m2.h.mmHg).
Formulação Própolis
(%) Nanocelulose
(%) Fenólicos ± dp E ± dp Aw ± dp U ± dp S ± dp TPVA ± dp
F controle 0 0 0( 0,081 ± 0,005 0,522 ± 0,002 10,61 ± 0,67 25,70 ± 0,93 4,16E-08 ± 0,07
F 0 0 0,5 0 0,082 ± 0,005 0,462 ± 0,002 11,01 ± 0,97 22,80 ± 0,53 1,86E-08 ± 0,06
F 1 0,5 0,15 68,42 ± 1,09 0,081 ± 0,005 0,487 ± 0,004 10,23 ± 1,09 25,49 ± 0,96 2,43E-08 ± 0,02
F 2 0,5 0,85 64,53 ± 0,41 0,078 ± 0,011 0,441 ± 0,003 9,55 ± 0,98 20,33 ± 0,95 1,77E-08 ± 0,04
F 3 0,9 0,15 86,32 ± 0,48 0,097 ± 0,007 0,488 ± 0,004 10,08 ± 0,73 26,31 ± 1,70 2,47E-08 ± 0,01
F 4 0,9 0,85 83,68 ± 0,39 0,082 ± 0,006 0,439 ± 0,006 10,43 ± 1,49 19,36 ± 0,06 1,77E-08 ± 0,03
F 5 0,4 0,5 61,28 ± 0,56 0,098 ± 0,006 0,466 ± 0,003 11,46 ± 0,91 22,63 ± 1,78 2,42E-08 ± 0,03
F 6 1 0,5 98,33 ± 0,44 0,090 ± 0,006 0,471 ± 0,009 10,75 ± 0,67 23,48 ± 0,70 1,95E-08 ± 0,03
F 7 0,7 0 83,24 ± 0,97 0,099 ± 0,010 0,494 ± 0,004 10,09 ± 1,07 17,71 ± 1,08 3,10E-08 ± 0,07
F 8 0,7 1 79,44 ± 0,71 0,097 ± 0,011 0,438 ± 0,002 9,38 ± 0,55 10,41 ± 0,58 1,71E-08 ± 0,05
F 9 0,7 0,5 81,15 ± 0,78 0,081 ± 0,011 0,464 ± 0,001 11,27 ± 0,76 21,93 ± 1,33 2,06E-08 ± 0,03
F 10 0,7 0,5 82,26 ± 0,15 0,076 ± 0,012 0,464 ± 0,001 11,44 ± 1,53 21,42 ± 0,81 2,11E-08 ± 0,01
F 11 0,7 0,5 82,18 ± 0,59 0,082 ± 0,014 0,471 ± 0,004 11,60 ± 1,38 21,14 ± 1,53 2,07E-08 ± 0,03
Formulações (F); * Pontos Centrais.
89
5.5.3- Atividade de Água, Solubilidade e Umidade
Os valores encontrados para a atividade de água dos filmes ficaram
entre 0,438 e 0,522, enquanto que os resultados obtidos para umidade
variaram de 9,38 a 11,60% (Tabela 5). O valor mais baixo alcançado para
solubilidade em água foi de 10,41%, para a F8 (Tabela 5). Os resultados
obtidos para atividade de água dos filmes apresentaram um bom ajuste ao
modelo matemático empregado (Fcalc>Ftab; R2=0,97), e mostraram um efeito
significativa (p<0,05) da função linear da concentração de nanocelulose nesse
parâmetro. A Equação 5 apresenta a fórmula gerada para o modelo, onde
verifica-se que com o aumento do teor de nanocelulose adicionado aos filmes
ocorre uma redução da atividade de água dos mesmo. A interferência não
significativa (p>0,05) da concentração de própolis nesse parâmetro pode ser
verificada através do gráfico de pareto e da superfície de resposta gerada
(Figura 19).
Com relação a umidade e a solubilidade dos filmes, os resultados
obtidos não apresentaram um bom ajuste ao modelo matemático empregado
(Fcalc<Ftab) (R2=0,97), entretanto os gráficos de pareto e os gráficos de
contorno gerados (Figuaras 20 e 21) serviram para demonstrar a tendência dos
resultados obtidos. Os resultados de umidade demonstram um efeito
significativo (p<0,05) da função linear da concentração de nanocelulose nos
valores obtidos. Para a solubilidade em água, observa-se uma interferência
significativa (p<0,05) também da função linear da própolis nos resultados
alcançados.
Os nanocristais de celulose reduzem a disponibilidade de água dentro
da matriz, tendo um papel relevante no controle da atividade de água e da
umidade dos filmes. Esses resultados foram similares ao encontrado por Silva
et al. (2012) utilizando filmes a base de amido adicionado de nanocelulose
extraída do eucalipto, onde a adição dos nanocristais também reduziu a
disponibilidade de água dentro dos filmes. Os autores afirmam que as
nanopartículas de celulose podem colaborar para aumentar a vida de prateleira
dos filmes, tornando-os mais competitivos aos sintéticos.
90
Atividade de Água
,2074836
-,371154
,5516536
-,562426
-15,2318
p=,05Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
Própolis(Q)
1Lby2L
(1)Própolis(L)
Nanocelulose(Q)
(2)Nanocelulose(L)
Atividade de Água
0,5 0,48 0,46 0,44 0,42
Figura 19 – Gráfico de pareto e superfície de resposta para a análise de Atividade de água.
Aw = 0,493 – 0,047Y (Equação 5)
O controle da atividade de água dos filmes é fundamental para sua
utilização pela indústria de alimentos, visto que o contato direto da embalagem
com o produto pode ocasionar o desenvolvimento de micro-organismos ou de
reações químicas indesejáveis, interrompendo sua funcionalidade (GONTARD
e GUILBERT, 1996; VEIGA-SANTOS et al., 2007).
91
Umidade
-,696282
-2,86544
3,120735
-3,46716
-13,381
p=,05Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
(1)Própolis(L)
(2)Nanocelulose(L)
1Lby2L
Própolis(Q)
Nanocelulose(Q)
Umidade
11 10 9 8 7 6 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
Própolis
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Nan
ocel
ulos
e
Figura 20 – Gráfico de pareto e superfície de resposta para a análise de
Umidade.
Solubilidade em Água
,9633759
-2,23448
9,821236
-15,7579
-19,7938
p=,05Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
(1)Própolis(L)
1Lby2L
Própolis(Q)
Nanocelulose(Q)
(2)Nanocelulose(L)
Solubilidade em Água
28 24 20 16 12 8 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
Própolis
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Nan
ocel
ulos
e
Figura 21 – Gráfico de pareto para análise de solubilidade em água.
Os resultados obtidos para a solubilidade em água sugerem que os
nanocristais de celulose aumentam a resistência dos filmes à água, pois se
observou uma redução significativa da solubilidade com o incremento da
concentração de nanocelulose. De Paula et al. (2011) afirmam que os
nanocristais proporcionam o desenvolvimento de uma barreira física, inibindo a
absorção de água pelos filmes, podendo ser utilizados vantajosamente para
controlar a degradação hidrolítica dos biopolímeros.
Silva et al. (2012) relatam que o efeito dos nanocristais como barreira
física à penetração pode ser explicado pelo elevado grau de cristalinidade das
nanopartículas e das rígidas ligações de hidrogênio formadas no interior da
92
matriz, que dificultam o acesso e, consequentemente, a interação da água com
as moléculas de amido.
5.5.5- Permeabilidade ao Vapor de Água
Os valores encontrados para permeabilidade ao vapor de água (TPVA)
variaram de 1,71x10-8 a 3,10x10-8 gH2O.μm/m2.h.mmHg (Tabela 5). O gráfico
de pareto confirmou a interferência significativa (p<0,05) das duas variáveis
independentes (nanocelulose e própolis) na permeabilidade ao vapor de água
dos filmes (Figura 22). As formulações 8, 2 e 4, que possuíam as maiores
concentrações de nanocelulose, alcançaram as menores taxas de
permeabilidade, enquanto que a formulação 7 (0%) apresentou a maior taxa.
Permeabilidade ao Vapor de Água
-,755929
1,312963
-8,62111
10,70306
-44,4826
p=,05Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
1Lby2L
Própolis(Q)
(1)Própolis(L)
Nanocelulose(Q)
(2)Nanocelulose(L)
Permeabilidade ao Vapor de Água
3,4E-8 3E-8 2,6E-8 2,2E-8 1,8E-8 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
Própolis
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Nan
ocel
ulos
e
Figura 22 – Gráfico de pareto da análise de permeabilidade ao vapor de água.
Os resultados demonstraram que a presença dos nanocristais de
celulose, em qualquer concentração, é capaz de promover uma redução na
permeabilidade ao vapor de água dos filmes, agindo como uma barreira,
diminuindo os espaços livres na matriz polimérica, dificultando a passagem do
vapor.
A interferência da própolis na taxa de permeabilidade ao vapor de água
dos filmes já foi evidenciada em outros estudos (BODINI, 2011; REIS, 2011).
Segundo Rohn et al. (2004), os compostos fenólicos podem ser capazes de
estabelecer interações com a matriz polimérica, e ligações de hidrogênio e/ou
93
covalentes com os grupos reativos da matriz. Dessa forma, ao elevar as
interações intermoleculares com a cadeia polimérica, eleva-se a densidade do
filme e diminui-se a taxa de permeação de agua, devido a limitação da
disponibilidade de grupos de hidrogênio para formar ligação hidrofílica com a
água, resultando em uma diminuição da afinidade do filme pela água
(SIRIPATRAWAN E HARTE, 2010).
Wang et al. (2006) e Cao et al. (2008), utilizando, respectivamente,
nanocelulose de fibra de algodão e de cânhamo em matrizes de amido,
encontraram resultados semelhantes, com melhoras significativas na
permeabilidade ao vapor de água dos filmes, através da adição da nanocelulose.
5.5.6- Propriedades Mecânicas
Os resultados obtidos para as propriedades mecânicas dos filmes não
tiveram um bom ajuste ao modelo matemático adotado (Fcal<Ftab), não
podendo ser utilizados para representar as relações entre as concentrações de
nanocelulose e própolis vermelha e os valores de tensão máximo, módulo de
elasticidade e deformação dos filmes. Entretando, os gráficos de pareto
mostraram que as propriedades mecânicas avaliadas foram significativamente
afetadas (p<0,05) pela concentração de nanocelulose e de própolis nos filmes
(Figura 23). O módulo de elasticidade, que mostra a rigidez dos filmes, atingiu
um aumento de 270%, na F8 (1,0% de nanocelulose), em relação a FC (0% de
própolis e nanocelulose). Um aumento superior de 276% foi alcançado para a
F0 (0,5% de nanocelulose, sem própolis) (Tabela 6).
A presença dos nanocristais aumentou em 110% á tensão máxima dos
filmes, com o emprego de apenas 0,15% de nanocelulose (F3 em relação a
F7). Um aumento de 211% da tensão máxima foi alcançado para a F0, onde
não ocorreu a adição de própolis, demonstrando que a própolis interfere na
dispersão dos nanocristais dentro da matriz.
Os gráficos de contorno confirmam que o aumento da concentração de
nanocelulose nas formulações provocou o incremento do módulo de
elasticidade e da tensão máxima alcançados para os filmes (Figura 23).
Através desse gráfico também observa-se que, enquanto a nanocelulose
provocou o aumento na tensão máxima dos filmes, a própolis contribuiu para
94
redução desse parâmetro. A tensão máxima pode ser definida como a
resistência máxima oferecida pelos filmes quando submetidos a tração e seu
aumento pode estar relacionado a interação entre as cadeias do polímero com
os nanocristais de celulose, formando uma estrutura mais resistente à tração.
Módulo de Elasticidade
-79,4645
-124,199
-151,063
227,3
440,0156
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
Própolis(Q)
(1)Própolis(L)
Nanocelulose(Q)
1Lby2L
(2)Nanocelulose(L)
Módulo de Elasticidade
300 200 100 0 -100 -200 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
Própolis
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Nan
ocel
ulos
e
Tensão Máxima
-5,3468
6,928203
-26,2496
-39,6488
49,43805
p=,05
Standardized Effect Estimate (AbsoluteValue)
(1)Própolis(L)
1Lby2L
Nanocelulose(Q)
Própolis(Q)
(2)Nanocelulose(L)
Tensão Máxima
6 4 2 0 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
Própolis
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Nan
ocel
ulos
e
Deformação
,2970443
1,732051
72,1181
94,40284
-103,228
p=,05Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
(1)Própolis(L)
1Lby2L
Nanocelulose(Q)
Própolis(Q)
(2)Nanocelulose(L)
Deformação
110 100 90 80 70 60 50 40 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
Própolis
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Nan
ocel
ulos
e
Figura 23 – Gráficos de pareto das propriedades mecânicas dos filmes.
95
Tabela 6 – Valores do módulo de elasticidade, tensão de ruptura e da deformação de todas as formulações.
Formulações Módulo de elasticidade (MPa)
Tensão Máxima (MPa)
Deformação (%)
F C 107,20 ± 9,43 3,70 ± 0,34 68,00 ± 5,67 F 0 296,20 ± 14,86 7,80 ± 0,45 22,80 ± 5,22 F 1 217,80 ± 32,51 5,40 ± 0,89 52,80 ± 6,10 F 2 257,20 ± 44,06 6,20 ± 0,84 46,80 ± 5,02 F 3 190,80 ± 42,76 4,40 ± 0,55 54,00 ± 7,35 F 4 264,00 ± 38,12 6,00 ± 1,41 48,80 ± 8,90 F 5 221,40 ± 19,51 5,20 ± 0,84 52,00 ± 8,60 F 6 237,00 ± 34,66 5,40 ± 0,55 50,00 ± 7,35 F 7 122,40 ± 8,73 4,00 ± 0,71 66,00 ± 6,93 F 8 290,20 ± 58,52 8,00 ± 0,71 26,40 ± 6,54 F 9 246,60 ± 32,44 7,20 ± 0,84 33,20 ± 7,69 F 10 247,00 ± 34,73 7,20 ± 1,64 33,60 ± 8,05 F 11 246,20 ± 15,35 7,10 ± 1,30 33,60 ± 9,21
Segundo Melo (2010), a redução na resistência dos filmes pelo
incremento da concentração de óleos e extratos de produtos naturais pode
estar relacionada à substituição exagerada dos componentes dos polímeros
pelos componentes naturais, resultando em uma matriz menos resistente.
Batista et al. (2005) verificaram, que ao incorporar ácido lático em filmes
a base de pectina, ocorreu um ligeiro aumento na tensão dos filmes quando a
concentração de ácido passou de 6% para 12%. Entretanto, quando a
concentração passou a 18% houve uma redução na resistência dos filmes.
Resultado semelhante foi encontrado por Arvanitoyannis et al. (1999),
que verificaram que a incorporação de grande quantidade de plastificante
resultou em uma interação excessiva de compostos com a matriz dos filmes,
enfraquecendo-a e resultando em baixa resistência a tração.
Os nanocristais de celulose também apresentaram efeito significativo
(p<0,05) sobre a deformação dos filmes. Observa-se que com o aumento da
concentração de nanocelulose ocorre uma redução da porcentagem de
deformação dos filmes (Figura 23). Esse fato provavelmente é resultado da
formação de uma estrutura mais compacta, que reduz a flexibilidade e aumenta
a rigidez dos filmes. Segundo Gomes (2006), quanto maior o módulo de
96
elasticidade, maior a tensão necessária para produzir uma deformação, o que
caracteriza filmes mais rígidos.
Esse comportamento foi reportado em outros estudos, e pode ser
utilizado como indicação de uma boa interação entre os componentes do filme
(AZEREDO et al., 2009), com a formação de uma rede contínua de
nanocelulose, unidas por ligações fortes de hidrogênio (SAMIR et al., 2005). A
deformação também é chamada de elongação, e mostra a capacidade do filme
de esticar antes de romper.
Além disso, observa-se que a redução da deformação dos filmes
provocada pela adição de nanocelulose, não foi considerável quando
comparada a redução relatada em outros estudos (AZEREDO et al., 2009;
SILVA et al., 2012; VEIGA-SANTOS et al., 2007), pois a própolis desempenhou
um efeito contrário e significativo (p<0,05) ao da nanocelulose, que é
confirmado através do gráfico de contorno (Figura 23). Os valores máximos
alcançados foram de 68% para a FC (sem própolis e nanocelulose) e 66% para
a F7 (0% de nanocelulose).
Os gráficos da Figura 24 apresentam os valores do módulo de elasticidade,
da tensão e da deformação das 11 formulações dos filmes e dos controles. Através
dos gráficos é possível observar a existência de diferenças entre os valores
alcançados para as amostras.
Cao et al. (2008) desenvolveram filmes biodegradáveis de amido e
nanocelulose, extraída de fibras de cânhamo e encontrou resultados para as
propriedades mecânicas superiores ao encontrado nesse estudo. A tensão
máxima e o módulo de elasticidade tiveram um aumento de mais de 2000%,
com o emprego de 30% de nanocelulose.
Já Rosa et al. (2009), avaliando filmes de borracha natural reforçados
com nanocristais de celulose de coco, encontraram resultados inferiores com a
adição de 10% de nanocelulose. Houve um aumento de 50% e 40% para a
tensão máxima e para o módulo de elasticidade, respectivamente.
Silva et al. (2012), desenvolveu filmes a base de amido, plastificados
com açúcar invertido e sacarose, e reforçados com nanocelulose extraída da
polpa de eucalipto, e obteve uma aumento de 92% e 400% para tensão na
ruptura e para a deformação, respectivamente, com adição de apenas 0,2% de
nanocelulose. Os autores concluíram que baixas quantidades de nanocelulose
97
(0,1-0,3%) são capazes de reforçar consideravelmente as propriedades
mecânicas dos filmes biodegradáveis.
Figura 24 - Comportamento do módulo de elasticidade, da tensão e do
alongamento na ruptura das diferentes formulações dos filmes e controle.
98
5.5.7- Propriedades Térmicas
5.5.7.1- Análise Termogravimétrica (TG e DTG)
A Figura 25 mostra as curvas de TG dos filmes, onde pode-se verificar
que todas as formulações apresentaram dois eventos de decomposição. O
primeiro evento ficou no intervalo de 31 e 130ºC, com uma perda de massa
discreta, entre 5,65 e 9,11%, atribuído a perda de água e de umidade dos
filmes. O segundo evento ficou no intervalo entre 261 e 389ºC (Tabela 7), com
uma perda de massa entre 56,40 e 73,72%, associado a decomposição da
matriz dos filmes, que apresentou-se bastante uniforme.
Figura 25 – Curvas TG das formulações dos filmes.
Os filmes controles (FC e F) apresentaram comportamentos
semelhantes aos demais, o que confirma uma ótima interação entre os
componentes do sistema, evidenciando a formação de um novo material.
Os filmes apresentaram-se estáveis nas temperaturas entre 130 e
261ºC. Os valores da temperatura inicial de degradação térmica são importantes,
pois indicam o limite máximo da temperatura de processo ou manufatura térmica
dos materiais.
99
Tabela 7 – Parâmetros da análises de TG: Tonset (temperatura de inicio da degradação), Td (temperaturas de degradação e perda de massa (%).
Material
TG
1º evento 2º evento
Tonset(ºC) Td1 (ºC) Perda de
Massa (%) Tonset(ºC) Td2 (ºC)
Perda de Massa (%)
amido 32 158 11,12 274 458 74,69 glicerol 149 308 96,68 - - -
nanocelulose 32 108 11,00 240 469 48,63 própolis 46 187 4,55 187 447 80,75
FC 32 115 7,96 279 387 66,52 F0 31 109 6,02 268 370 63,24 F1 32 107 5,98 275 377 73,72 F2 32 130 9,11 268 389 64,08 F3 31 108 6,82 261 363 61,85 F4 31 117 7,83 266 376 63,37 F5 32 116 7,80 282 368 62,80 F6 32 100 5,80 279 367 58,91 F7 31 104 5,65 265 361 56,91 F8 32 108 6,94 263 372 67,20 F9* 32 110 7,77 272 374 58,91 F10* 32 106 7,63 274 371 63,05 F11* 32 106 7,45 273 372 56,40
Formulações (F); *Pontos centrais; Controle (C). Valores que apresentam a mesma letra, numa mesma coluna, não apresentam diferenças significativas (p>0,05) pelo Teste de Tukey a 95% de confiança.
As curvas de DTG dos filmes apresentaram comportamento semelhante
para as diferentes formulações (Figura 26), com pouca mudança na
temperatura de velocidade máxima de degradação, que ficou em torno de
324,0 ºC.
Nas curvas de TG/DTG encontradas para o amido (Figura 27), também
verificou-se a ocorrência de dois eventos de perda de massa. O primeiro entre
32 e 158ºC, e o segundo entre 274 e 458ºC (Tabela 8). A temperatura da taxa
máxima de degradação foi aproximadamente 341ºC. Já para o glicerol, as
curva TG/DTG (Figura 28) evidenciaram a formação de apenas um evento de
perda de massa, entre 149 e 308ºC (Tabela 8), com uma temperatura da taxa
máxima de degradação em torno de 261ºC.
Segundo Bona (2007) na curva de TGA característica do amido de
mandioca ocorre a presença de dois estágios de decomposição. O primeiro
ocorre entre 60 e 183,8 ºC, característico da umidade presente na amostra. A
100
partir desta temperatura inicia-se o segundo estágio, que consiste na variação
de massa, que é concluído na faixa de temperatura de 595,2 ºC, quando a
curva apresenta praticamente uma fase constante de não variação de massa.
A temperatura da taxa máxima de decomposição térmica do amido é em torno
de 354,0 ºC.
Figura 26 – Curvas DTG das formulações dos filmes.
Silva et al. (2012), também verificaram nas curvas de TG, a presença de
dois eventos de perda de massa em filmes de amido de mandioca contendo
nanocelulose de eucalipto e utilizando açúcar invertido como plastificante.
Entretanto, os autores verificaram que a presença de elevadas concentrações
dos nanocristais (3,0 a 5,0%) promoveu a ocorrência de mais um evento
térmico, sugerindo que a estabilidade térmica dos filmes diminuiu com o
aumento da incorporação destas nanopartículas.
101
0 100 200 300 400 500 600
20
40
60
80
100
Per
da d
e m
assa
(%
)
Temperatura (oC)
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
Curva TG Curva DTG
Der
ivad
a pr
imei
ra d
a pe
rda
de m
assa
(%
).o C
-1
Figura 27 – Curvas TG e DTG do amido de mandioca.
100 200 300 400 500 600
0
20
40
60
80
100
Per
da d
e M
assa
(%
)
Temperatura (ºC)
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
TG DTG
Der
ivad
a pr
imei
ra d
a pe
rda
de m
assa
(%
).ºC
-1
Figura 28 – Curvas TG e DTG do glicerol.
Comparando-se as curvas DTG dos filmes com as dos seus
constituintes observa-se que o perfil de degradação foi alterado, embora seja
semelhante ao do amido, seu constituinte principal (Figura 29).
102
100 200 300 400 500 600-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
Der
ivad
a pr
imei
ra d
a pe
rda
de m
assa
(%
).ºC
-1
Temperatura (ºC)
Própolis Nanocelulose Amido Glicerol
261ºC 341ºC
384ºC
343ºC
Figura 29 - Curvas de DTG dos constituintes dos filmes.
5.5.8- Colorimetria
Os resultados dos índices de cor, luminosidade (L*), croma a* (a*) e
croma b* (b*) para os filmes estão apresentados na Tabela 8. Os gráficos de
pareto gerados para esses parâmetros demonstraram que a própolis interferiu
significativamente (p<0,05) nos índices de cor estudados (Figura 30).
O valor L* representa a luminosidade e a* e b* são as coordenadas
cromáticas. Um valor de L* igual a 100 é equivalente ao branco perfeito
(luminosidade total), enquanto um valor igual a zero significa total ausência de
reflexão (negro perfeito). Sendo assim, como L* varia de branco (máximo) a
preto (mínimo), a formulação do filme controle (sem adição de própolis)
apresentou o mais alto valor de L* encontrado, estando próximo ao limite
superior. As formulações 7, 9, 10 e 11 apresentaram os menores valores de
luminosidade (Tabela 9).
103
Tabela 8 - Parâmetros de cor dos filmes de amido e glicerol, incorporados com diferentes concentrações de nanocelulose e própolis vermelha (Média ± desvio
padrão).
Formulação Parâmetros de Cor (médias ± dp)
L* a* b*
F controle 98,12 ± 0,31 0,14 ± 0,10 0,25 ± 0,11 F 0 99,63 ± 0,41 0,12 ± 0,10 0,25 ± 0,19 F 1 77,32 ± 1,36 4,49 ± 0,44 59,20 ± 1,83 F 2 69,43 ± 1,12 7,82 ± 1,32 56,20 ± 9,77 F 3 46,02 ± 0,97 15,79 ± 1,10 56,70 ± 3,07 F 4 63,57 ± 0,92 11,08 ± 1,94 49,60 ± 0,94 F 5 83,30 ± 1,36 7,50 ± 0,45 50,52 ± 9,88 F 6 67,36 ± 0,80 12,52 ± 0,60 70,98 ± 0,73 F 7 50,33 ± 1,60 13,86 ± 2,45 56,04 ± 1,73 F 8 41,33 ± 2,03 4,18 ± 1,67 38,16 ± 1,08 F 9 39,65 ± 0,31 10,01 ± 0,80 45,26 ± 0,85
F 10 40,28 ± 1,01 9,38 ± 0,11 45,88 ± 1,46 F 11 41,78 ± 1,24 10,53 ± 4,45 44,71 ± 2,09
Os resultados obtidos para a luminosidade dos filmes apresentaram um
bom ajuste ao modelo matemático empregado (Fcalc>Ftab; R2=0,94), e
mostraram um efeito significativa (p<0,05) da concentração de própolis (função
linear e quadrática), da concentração de nanocelulose (função quadrática) e da
interação dos dois componentes nesse parâmetro (Figura 30). A superfície de
resposta obtida demonstra que o emprego de maiores concentrações de
própolis resultam em filmes mais escuros e, consequentemente, com menores
valores de L*. A equação do modelo é apresentada através da equação 6.
Os valores de a* situam-se entre –120 e +120, que indicam,
respectivamente, a variação entre os valores relativos ao verde perfeito (-a*) e
ao vermelho perfeito (+a*). O eixo b* também admite valores entre –120 a +120
que representam os valores relativos ao azul perfeito e ao amarelo perfeito,
respectivamente. A análise de variância identificou influência significativa
(p<0,05) das variáveis independentes sobre as cordenadas de cor croma a* e
b* (Figura 31).
104
Luminosidade L*
-1,02781
8,427029
11,6248
-19,1433
39,20299
p=,05
Standardized Effect Estimate (AbsoluteValue)
(2)Nanocelulose(L)
Nanocelulose(Q)
1Lby2L
(1)Própolis(L)
Própolis(Q)
Luminosidade L*
160 140 120 100 80 60
Figura 30 – Gráfico de pareto e superfície de resposta do parâmetro L* de cor.
L* = 308,18 – 658,44X + 412,21X2 + 31,46Y2 + 90,86XY (Equação 6)
Os gráficos de contorno obtidos para esses parâmetros confirmaram
uma alteração das intensidades das cores das formulações com a incorporação
105
da própolis aos filmes (Figura 31). O parâmetro a* variou de 0,12 a 13,86,
enquanto que o parâmetro b* variou de 0,25 a 70,98 (Tabela 9). Os resultados
confirmaram a tendência dos filmes em apresentar uma coloração amarelo-
alaranjada, que se intensifica com o aumento da concentração de própolis
(Figura 32). Essa coloração é devido a presença dos compostos fenólicos da
própolis, que contribuem para o surgimento de cores avermelhadas ou
amareladas (BODINI, 2011).
Croma a*
,3067587
-1,67768
-6,98067
-9,28987
13,15701
p=,05Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
Própolis(Q)
Nanocelulose(Q)
1Lby2L
(2)Nanocelulose(L)
(1)Própolis(L)
Croma a*
24 20 16 12 8 4 0 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
Própolis
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Nan
ocel
ulos
e
Croma b*
-3,50218
5,89857
12,6511
-21,4194
32,55335
p=,05Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
1Lby2L
Nanocelulose(Q)
(1)Própolis(L)
(2)Nanocelulose(L)
Própolis(Q)
Croma b*
90 80 70 60 50 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
Própolis
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Nan
ocel
ulos
e
Figura 31 – Gráficos de pareto para os parâmetros de cor a* e b* dos filmes.
Figura 32 – Coloração das formulações dos filmes.
106
5.5.9- Atividade Antimicrobiana in vitro
Os diâmetros médios dos halos de inibição formados pelos filmes sobre
as bactérias estão inseridos na Tabela 9. A análise estatística demonstrou que
o modelo matemático utilizado pode ser empregado para representar de forma
significativa e preditiva (Fcalc>Ftab) o efeito das variáveis independentes,
concentração de própolis e nanocelulose, sobre os halos de inibição alcançados
para os três micro-organismos analisados.
Tabela 9 – Halos médios de inibição encontrados sobre os micro-organismos avaliados.
Formulações Halos de Inibição ± dp (cm)
Própolis - X1
(%) Nanocelulose –
X2 (%) Staphylococcus
aureus Bacillus cereus
Listeria monocytogenes
F C 0,00 0,00 0 0 0 F 0 0,00 0,50 0 0 0 F 1 0,50 0,15 1,23 ± 0,06 1,37 ± 0,06 1,27 ± 0,06 F 2 0,50 0,85 1,27 ± 0,06 1,23 ± 0,06 1,23 ± 0,06 F 3 0,90 0,15 1,83 ± 0,06 2,00 ± 0,10 2,07 ± 0,06 F 4 0,90 0,85 1,77 ± 0,06 1,97 ± 0,06 2,00 ± 0,10 F 5 0,40 0,50 1,07 ± 0,06 1,27 ± 0,06 1,27 ± 0,06 F 6 1,00 0,50 1,77 ± 0,06 2,00 ± 0,10 2,07 ± 0,06 F 7 0,70 0,00 1,47 ± 0,06 1,50 ± 0,10 1,50 ± 0,10 F 8 0,70 1,00 1,47 ± 0,06 1,53 ± 0,06 1,53 ± 0,06 F 9* 0,70 0,50 1,47 ± 0,06 1,57 ± 0,06 1,57 ± 0,06 F 10* 0,70 0,50 1,47 ± 0,06 1,50 ± 0,10 1,50 ± 0,10 F 11* 0,70 0,50 1,53 ± 0,06 1,57 ± 0,06 1,57 ± 0,06 * Pontos Centrais.
Os gráficos de pareto e as superfícies de resposta (Figuras 33, 34 e 35)
geradas para cada micro-organismo, evidenciam a influência significativa
(p<0,05) da concentração de própolis na atividade antimicrobiana dos filmes.
Através dos gráficos observa-se que a nanocelulose apresenta nenhuma
interferência significativa (p>0,05) no efeito antimicrobiano dos filmes obtidos. A
Tabela 10 apresenta as equações do modelo obtidas para cada micro-
organismo, onde observa-se uma correlação linear da concentração de própolis
com os halos de inibição alcançados.
Os diâmetros de inibição médios alcançados ficaram entre 1,07 a
2,07cm. A Listeria monocytogenes foi a bactéria mais susceptível a ação dos
filmes, enquanto que Staphylococcus aureus foi o micro-organismo que
107
apresentou os menores halos de inibição. Todas as formulações tiveram ação
antimicrobiana sobre as bactérias estudadas, sendo que para a FC e F0 (sem
própolis) não houve formação de halos de inibição. A formulação 6 (maior teor
de própolis) apresentou os maiores diâmetros de inibição, sendo que as
formulações F1, F2 e F6 (menores teores de própolis) apresentaram os
menores halos.
Staphylococcus aureus
-,203091
,5422951
-1,25687
-1,44338
21,28817
p=,05Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
(2)Nanocelulose(L)
Nanocelulose(Q)
Própolis(Q)
1Lby2L
(1)Própolis(L)
Staphylococcus aureus
2 1,8 1,6 1,4 1,2 1
Figura 33 – Gráfico de pareto e superfície de resposta do teste in vitro sobre Staphylococcus aureus.
108
Listeria monocytogenes
-,14038
-,371154
-,584404
4,217827
23,50893
p=,05Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
Nanocelulose(Q)
1Lby2L
(2)Nanocelulose(L)
Própolis(Q)
(1)Própolis(L)
Listeria monocytogenes
2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2
Figura 34 – Gráfico de pareto e superfície de resposta do teste in vitro sobre
Listeria monocytogenes.
Os resultados alcançados por Bodini (2011), ao analisar filmes a base de
gelatina adicionados de extrato de própolis vermelha, sugeriram uma ação
inibitória maior dos filmes sobre a bactéria Gram-positiva Staphylococcus
aureus. Nos estudos realizados por Pranoto et al. (2005) e por Seydim e
Sarikus (2006) também sugeriram uma menor resistência do Staphylococccus
aureus aos compostos fenólicos.
109
Bacillus cereus
,0737683
-1,10664
1,360897
3,406096
20,9204
p=,05Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
Nanocelulose(Q)
(2)Nanocelulose(L)
1Lby2L
Própolis(Q)
(1)Própolis(L)
Bacillus cereus
2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2
Figura 35 – Gráfico de pareto e superfície de resposta do teste in vitro sobre
Bacillus cereus.
A ação antimicrobiana da própolis sobre as bactérias Gram- positivas já
foram relatadas em diversos estudos (CASTRO et al., 2009; CAVALCANTE et
al., 2011; PARK et al., 2000). De acordo com Santos et al. (2002), a ação
antimicrobiana da própolis está relacionada à inibição da população bacteriana
e da RNA-polimerase do micro-organismo, juntamente com a desorganização
do citoplasma e da membrana da bactéria.
110
Tabela 10 - Equações do modelo e R2 (coeficiente de determinação) para as análises de atividade antimicrobiana dos filmes sobre Staphylococcus aureus,
Listeria monocytogenes e Bacillus cereus, X= própolis e Y= Nanocelulose.
Parâmetros Equação R2
Staphylococcus aureus 0,30 + 2,03X 0,97
Listeria monocytogenes
1,18 - 0,61X 0,95
Bacillus cereus 1,34 - 0,59X 0,95
A Figura 36 mostra a correlação linar dos diâmetros de inibição
alcançados pelas formulações e a concentração de própolis e de compostos
fenólicos existentes nos filmes. Observa-se uma correlação linear dos halos de
inibição com o incremento da concentração de própolis e de compostos
fenólicos das formulações. Entretanto, verifica-se uma correlação maior dos
diâmetros de inibição alcançados com a quantidade de compostos fenólicos
presentes nos filmes (R2=0,95), o que confirma que esses compostos são,
realmente, os responsáveis pela biatividade da própolis.
Figura 36 – Correlação linear entre os diâmetros de inibição e a concentração de própolis de de compostos fenólicos dos filmes.
111
Melo (2010) ao avaliar a atividade antimicrobiana in vitro de filme a base
de acetato de celulose adicionado de óleo essencial de alecrim sobre
mesófilos, não verificou a formação de halos de inibição, mesmo com uma
concentração de 50% de óleo essencial. Os resultados sugeriram que não
ocorreu uma difusão dos agentes antimicrobianos pelo ágar.
Brody et al. (2001), ao analisarem a atividade antimicrobiana de filmes
de quitosana também não relataram a formação de halos de inibição. Os
autores acreditam que por esses resultados não se pode afirmar que não
houve atividade antimicrobiana, já que esta pode ocorrer sem migração dos
compostos ativos, resultando em uma inibição dos micro-organismos em
contato direto com a superfície dos filmes. Segundo Cagri et al. (2001), uma
interação entre grupamentos de polímero e os compostos ativos do agente
incorporado pode reduzir ou até impedir a migração de compostos ativos para
o sistema. Com isso, fica evidente que o efeito inibitório do bioativo também
parece estar associado à macromolécula utilizada na formulação dos filmes.
Pranoto et al. (2005), avaliaram filmes a base de quitosana incorporados
com quatro diferentes concentrações de sorbato de potássio, e identificaram
um aumento na atividade inibitória quando a concentração de sorbato passou
de 50mg/g para 100 mg/g. Entretanto, não houve uma melhora significativa na
resposta, quando os filmes foram incorporados com 150 mg/g ou 200 mg/g. Os
autores acreditam que isso pode ter ocorrido porque os polímeros possuem
uma capacidade máxima de transporte de grupos funcionais para o sistema.
5.5.10- Atividade Antimicrobiana em Matriz Alimentícia
Os resultados obtidos para contagem de Estafilococos coagulase
positiva durante os 28 dias de armazenamento do queijo coalho estão
apresentados na Tabela 11. A Figura 37 mostra a imagem do queijo embalado
nos quatro filmes utilizados. O filme com própolis provocou a redução de 1 ciclo
logarítmico na contagem desses micro-organismos nos períodos de 4, 12, 20 e
28 dias, quando comparados com todos os controles. Como esperado, o queijo
exposto apresentou as maiores contagens em todos os períodos analisados.
112
Tabela 11 – Contagens de estafilococos coagulase positiva das amostras de queijo coalho embaladas no filme com própolis e os controles.
Dias Contagens (UFC/g)
Exposto Polietileno Filme controle Filme com própolis
0 4,5E+02(a) 4,5E+02(a) 4,5E+02(a) 4,5E+02(a)
4 2,1E+03(a) 1,8E+03(a) 1,1E+03(a) 7,5E+02(b)
8 8,3E+03(a) 7,4E+03(b) 6,5E+03(b) 1,1E+03(c)
12 3,2E+04(a) 1,9E+04(b) 1,7E+04(b) 4,7E+03(c)
16 7,4E+04(a) 5,1E+04(b) 4,6E+04(b) 2,3E+04(c)
20 1,2E+05(a) 9,8E+04(b) 8,7E+04(b) 4,8E+04(c)
24 4,7E+05(a) 1,9E+05(b) 1,5E+05(b) 7,2E+04(c)
28 5,9E+05(a) 4,5E+05(b) 4,1E+05(b) 8,4E+04(c)
Valores que apresentam letras diferentes, na mesma linha, apresentam diferenças significativas (p<0,05) pelo Teste de Tuckey a 95% de confiança.
Figura 37 – Amostras de queijo submetidas ao teste de atividade antimicrobiana. Em (a), queijo exposto, (b) embalado no polietileno, em (c)
embalado no filme controle e em (d) embalado no filme com própolis.
Não foram observadas diferenças significativas (p>0,05) entre as
contagens alcançadas para os queijos embalados nos filmes com polietileno e
nos filmes controle (amido, glicerol e nanocelulose), demonstrando que esses
filmes desempenham papéis equivalentes na proteção dos queijos no que se
refere a contaminação por Estafilococos coagulase positiva (Figura 38).
113
Figura 38 – Eficácia antimicrobiana do filme ativo reforçado selecionado (F9) sob queijo coalho embalado ao longo de 28 dias de armazenamento a 7ºC, em
função da contagens de estafilococs coagulase positiva.
Apesar do aumento na contagem de estafilococos coagulase positiva
dos queijos durante a vida de prateleira (Figura 38), o filme com própolis
desempenhou um papel importante na inibição do desenvolvimento desses
micro-organismos, pois alcançou as menores contagens nos períodos
analisados, comprovando um efeito antimicrobiano sobre o micro-organismo na
matriz estudada.
A elevada carga inicial de estafilococos no queijo (4,5E+02UFC/g), já
caracterizava o produto como impróprio para o consumo (BRASIL, 2001), e
pode ter influenciado na eficácia dos filmes. Além disso, os fatores intrínsecos
do alimento (gordura, proteína, água, antioxidantes, pH, conservantes), bem
como os fatores extrínsecos (temperatura, embalagem a vácuo, características
do micro-organismo) também podem influenciar a sensibilidade das bactérias e
reduzir o efeito dos filmes (GILL et al., 2002).
Melo (2010) não conseguiu prolongar a vida de prateleira da carne de
frango resfriada através do armazenamento em filme de base celulósica
adicionado de 20% de óleo essencial de alecrim, no período de nove dias de
estocagem, apesar da inibição ter sido comprovada nos dos testes in vitro. Os
autores acreditam que o sistema alimentício é um fator importante que pode
114
interferir nesse processo, pois podem ocorrer interações entre os compostos
antimicrobianos e os componentes dos alimentos, como proteínas e gorduras,
que podem influenciar na eficácia desses compostos. Segundo Burt (2004), é
possível que moléculas de gordura e/ou proteínas ajam como barreira física
aos agentes antimicrobianos, protegendo os micro-organismos da ação dos
mesmos.
Gill et al. (2002) sugerem que uma maior disponibilidade de nutrientes
no sistema alimentício em relação aos meios de cultura permite que as células
bacterianas danificadas se recuperem mais rápido, e consequentemente, o
crescimento seria mais efetivo. Dessa forma, podem ser necessárias
concentrações maiores de composto ativo em sistemas alimentícios, para que
se consigam resultados similares ao observado in vitro.
Segundo Moreira at al. (2005), além do sistema alimentício, o tempo de
contato, a temperatura e o pH podem influenciar na ação antimicrobiana in
vivo. O armazenamento em baixas temperaturas pode alterar de forma
significativa a estrutura dos filmes de forma a impedir a ação dos agentes
ativos sobre os micro-organismos. Em temperaturas muito abaixo da
temperatura de transição vítrea, pode ocorrer a imobilização das cadeias
poliméricas, que reduz a mobilidade das moléculas uma vez que o polímero
está se comportando como um material vítreo e, por isso, rígido.
Com relação ao pH dos alimentos, Han (2000) acredita que ele pode
alterar o grau de ionização (dissociação/associação) de alguns compostos
ativos e, consequentemente, sua atividade.
6- Conclusão
Os resultados obtidos indicam que os filmes biodegradáveis a base de
amido e glicerol, adicionados de nanocelulose e própolis pode ser uma
alternativa competitiva para redução no uso de filmes sintéticos no
acondicionamento de alguns alimentos, podendo exercer um efeito
antimicrobiano.
115
A estrutura altamente ordenada dos nanocristais de celulose aumenta a
resistência dos filmes, mas também ocasiona mudanças significativas em
algumas propriedades que são importantes para indústria de alimentos.
Os filmes simultaneamente inibiram o desenvolvimento de Bacillus
cereus,Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes nos testes in vitro e
exerceu um controle no desenvolvimento de estafilococos coagulase positiva
nos embalados. Entretanto existe a necessidade de estudos adicionais, que
avaliem a ação desses filmes em outras matrizes alimentares, onde as
condições de armazenamento, juntamente com as características dos produtos
e suas possíveis interações com os filmes, irão demonstrar a eficácia real da
embalagem ativa.
116
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123
Considerações Finais
Os filmes a base de fécula de mandioca e glicerol, adicionados de
nanocelulose e própolis vermelha apresentaram-se homogêneos, com
características mecânicas, térmicas, físico-químicas e de barreira satisfatórias.
Os resultados demonstraram uma ótima interação entre os constituintes dos
filmes.
A nanocelulose de licuri demonstrou possuir grande potencial para ser
utilizada como reforço em matrizes poliméricas biodegradáveis. A atividade de
água dos filmes, assim como a permeabilidade ao vapor de água e a
solubilidade foram reduzidas com a adição de apenas 0,15% de nanocelulose,
evidenciando que os nanocristais interferem positivamente na disponibilidade
de água dentro da matriz.
O extrato alcoólico de própolis vermelha inibiu o desenvolvimento das
bactérias gram-positivas Bacillus cereus, Listeria monocytogenes e
Staphylococcus aureus com uma concentração de 0,4%. Uma concentração de
6% foi necessária para provocar a mesma inibição sobre a bactéria gram-
negativa Salmonella spp., demonstrando maior eficácia sobre as gram-
positivas.
Nos testes in vitro, os filmes adicionados de própolis apresentaram efeito
inibitório sobre as bactérias gram-positivas Bacillus cereus, Listeria
monocytogenes e Staphylococcus aureus. Filmes com maiores teores de
compostos fenólicos apresentaram maiores halos de inibição, evidenciando
que esses compostos são os responsáveis pela bioatividade da própolis.
O filme com desempenhou um papel importante na inibição do
desenvolvimento de Estafilococos coagulase positiva durante a vida de
prateleira do queijo coalho, pois alcançou as menores contagens nos períodos
analisados, comprovando um efeito antimicrobiano sobre o micro-organismo na
matriz estudada.
Os filmes apresentaram características satisfatórias e demonstraram
potencial antimicrobiano, entretanto existe a necessidade de estudos
adicionais, que avaliem a ação desses filmes em outras matrizes alimentares,
onde as condições de armazenamento, juntamente com as características dos
124
produtos e suas possíveis interações com os filmes, irão demonstrar a eficácia
real da embalagem ativa.
125
ANEXO I
Análises estatísticas dos resultados obtidos para as 11 formulações de
filmes. Para validar a equação do modelo, foi analisada a ANOVA presente na
Tabela 1. O Fcalc mostra um ajuste do modelo desde que Fcalc>Ftab indicando
que o modelo é valido. O gráfico de Pareto e o erro puro também foram
utilizados para validar o modelo (p<0.05).
Tabela 1- ANOVA para o modelo quadrático das análises de caracterização
dos filmes.
Parâmetros Coeficientes de Variação
Soma Quadrática
(SS)
Grau de Liberdade
(Df)
Média Quadrática
(MS) Fcalc R2
Compostos Fenólicos Regressão 1054,338 5 210,868
15,376 0,94 Resíduo 73,340 5 14,668
Total (SS) 1127,679 10
Espessura Regressão 0,000387 5 0,000077
0,944 0,48 Resíduo 0,000410 5 0,000082
Total (SS) 0,000797 10
Atividade de água Regressão 0,004000 5 0,001000
38,208 0,97 Resíduo 0,000000 5 0,000000
Total (SS) 0,003904 10
Umidade Regressão 5,400400 5 1,080088
6,801 0,87 Resíduo 0,794000 5 0,158800
Total (SS) 6,194491 10
Solubilidade em água Regressão 143,4696 5 28,69300
3,5156 0,78 Resíduo 40,8080 5 8,16100
Total (SS) 184,2780 10
Permeabilidade ao vapor de água
Regressão 0,000000 5 0,000000
8,98 0,90 Resíduo 0,000000 5 0,000000
Total (SS) 0,000000 10
Módulo de Elasticidade
Regressão 45531,97 5 9106,39
7,58 0,88 Resíduo 6006,03 5 1201,21
Total (SS) 51538,01 10
Tensão Máxima Regressão 14,31500 5 2,863000
8,255 0,90 Resíduo 1,73400 5 0,346800
Total (SS) 16,04990 10
Deformação Regressão 1146,965 5 229,3930
4,213 0,81 Resíduo 272,234 5 54,4469
Total (SS) 1419,200 10
126
Continuação Tabela 1
Parâmetros Coeficientes de Variação
Soma Quadrática
(SS)
Grau de Liberdade
(Df)
Média Quadrática
(MS) Fcalc R2
Luminosidade Regressão 2465,912 5 493,182
15,17 0,94 Resíduo 162,511 5 32,502
Total (SS) 2628,423 10
Croma a* Regressão 103,3890 5 20,67700
3,729 0,79 Resíduo 27,7180 5 5,54300
Total (SS) 131,1076 10
Croma b* Regressão 587,4850 5 117,4970
2,719 0,73 Resíduo 216,0260 5 43,2050
Total (SS) 803,5121 10
Staphylococcus aureus
Regressão 0,549470 5 0,109890
29,89 0,97 Resíduo 0,018380 5 0,003676
Total (SS) 0,567855 10
Listeria monocytogenes
Regressão 0,936600 5 0,187300
20,138 0,95 Resíduo 0,046510 5 0,009300
Total (SS) 0,983164 10
Bacillus cereus Regressão 0,740700 5 0,148100
18,147 0,95 Resíduo 0,040818 5 0,008160
Total (SS) 0,781560 10 Ftab (5:5; 0,95) = 5,05
Fcalc>Ftab, teve efeito significativo
