Константа скорости SNP мутаций Y-хромосомы по данным полного секвенирования
Дмитрий Адамов Владимир Гурьянов Сергей Каржавин Владимир Таганкин Вадим Урасин
Абстракт
Накопление данных тестирования BigY, FGC, с одной стороны, публикация сиквенсов Y-хромосомы древних образ-цов Anzick-1, Ust-Ishim, K14, с другой, дает возможность оценить среднюю скорость однонуклеотидных (SNP) мутаций. Авторы разработали собственный метод отбора истинных мутаций в современных и древних образцах и несколькими способами определили с высокой точностью константу скорости SNP мутаций - 0.82 ∙ 10 в год на п.н.о. (95% CI: (0.70 − 0.94) ∙ 10 ).
Введение
Однонуклеотидная мутация или однонук-леотидный полиморфизм (ОНП) – отличие по-следовательности ДНК размером в один нук-леотид (A, T, G или C) в геноме (или в другой сравниваемой последовательности) предста-вителей одного вида или между гомологич-ными участками гомологичных хромосом. Здесь и далее по тексту статьи авторы ис-пользуют как синонимы термины «однонук-леотидная мутация», «однонуклеотидный по-лиморфизм», SNP и снип.
Замена нуклеотида одного вида на другой
(субституция) в процессе хромосомного мей-оза, происходит, по имеющейся совокупности генетических данных, достаточно случайным образом. Вероятность SNP мутации очень ма-ла, порядка одной замены на сто миллионов пар нуклеотидных оснований (сайтов) за один мейоз. То есть поток мутаций редкий (свойство ординарности) и факт появления очередной мутации не зависит от факта по-явления предыдущих мутаций (свойство от-сутствия последействия). Эти свойства опре-деляют поток мутаций как пуассоновский. Вероятность мутаций в последовательности мейозов за T поколений распределена по за-кону Пуассона:
푃 = ( )!푒 ,
где 푃 – вероятность обнаружить k мутаций за T поколений на одном и том же сайте (участке) хромосомы, 휇 – константа скорости однонуклеотидных мутаций.
На практике одновременно измеряется по-
следовательность, состоящая из B пар нук-леотидных оснований. Среднее число одно-нуклеотидных мутаций 푁 определяется соотношением:
푁 = 휇 푇퐵, (1)
где 휇 ≡ 휇 – константа скорости однонук-леотидных мутаций, которую в дальнейшем для краткости будем называть «скорость SNP мутаций (SNP mutation rate)» или «скорость мутаций».
Возможность измерять число мутаций
푁 для генеалогических целей появилась несколько лет назад после появления высо-копроизводительных машин NGS (Next Gen-eration Sequencing), позволяющих делать массовое параллельное чтение геномов по разумной стоимости.
Коммерческое тестирование образцов ин-тересующей нас Y-хромосомы началось с 2013 года. В Таблице 1 приведена сводка
данных о степени охвата последовательно-стей Y-хромосомы коммерческими и научны-ми лабораториями по технологии NGS.
Таблица 1. Общий размер и качество чтения участков Y-хромосомы
Исследование (тест) Область маппирования, Mbp Покрытие, Х раз
FTDNA Big Y до 11.38 60 FGC Elite ̴ 23 60
1000 Genomes Project ̴ 23 2-4 Personal Genome Project ̴ 23 нет данных
Poznik et al. (2013) 9.99 3.1 Wei et al. (2013) 8.97 28.4
Francalacci et al. (2013) 8.97 2.16 Yan et al. (2014) 3.90 10
Hallast et al. (2015) 3.72 51
Маппируемые последовательности Y-
хромосомы, прочитанные по технологии NGS, составляют в целом около 23 Mbp.
Еще в первых работах (Skaletsky et al.,
2003) отмечалось, что структура Y-хромосомы неоднородна. Эухроматин Y-хромосомы состоит из нуклеотидных после-довательностей следующих видов:
1) X-transposed, имеющие совпадающие
на 99% аналоги в Х-хромосоме, общая длина около 3.7 Mbp,
2) X-degenerate, - уникальные, легко мап-
пируемые последовательности, общая длина около 8.6 Mbp,
3) ampliconic, - участки, обнаруживающие
сходство (на 99.9%) с последовательностями, расположенными в других участках Y-хромосомы, общая длина около 10.2 Mbp, в том числе 8 палиндромных участков (5.7 Mbp).
В научных работах исследования ограни-
чиваются, как правило, областью X-degenerate. Исследователи стремятся избе-гать последовательности X-transposed и am-pliconic. Вот что пишут авторы работы Wei et al. (2013):
We identified unique regions within the
male-specific part of the Y chromosome refer-ence sequence … where we expected read mapping and variant detection to escape com-plications introduced by repeated sequences. This was achieved by excluding the pseudoau-
tosomal, heterochromatic, X-transposed, and ampliconic segments. (Мы установили уни-кальные участки в специфической части ре-ференсной последовательности Y-хромосомы, … для которых ожидали, что мы обойдем сложности при маппировании ридов и обна-ружении вариантов, связанные с повторяю-щимися цепочками. Это было достигнуто пу-тем исключения псевдоаутосомных, гетеро-хроматических, X-transposed и ampliconic сегментов).
В статье Poznik D. et al. (2013) были вы-
делены участки эухроматина, наиболее под-ходящие для маппирования коротких ридов (порядка 100 bp), общей длиной 9.99 Mbp. Эти участки, в основном, представляют обла-сти X-degenerate и, в меньшей степени, ampliconic. Палиндромные участки были ис-ключены.
Для оценки возраста мужской генеалоги-
ческой линии по числу обнаруженных произ-водных SNP вариантов соотношение (1) ис-пользуется следующим образом:
푇 = (2)
Размер маппированной области B вычис-
ляется по BED файлу. Средняя скорость мутаций вычисляется с
помощью различных методов калибровки (Wang, Gilbert, Jin, Li, 2014).
1. Авторы работы Kuroki et al. (2006)
сравнили Y-хромосомы человека и шимпанзе. В предположении о разделении видов 6 млн.
лет назад была получена оценка средней скорости мутаций 1.5 ∙ 10 в год на п.н.о., 95% CI: (0.767 − 2.10) ∙ 10 .
2. Одна из наиболее известных работ Xue
et al. (2009) использовала для калибровки мутаций образцы с известной генеалогией. По четырем мутациям, образовавшимся за 13 поколений в участках с общей протяженно-стью 10.15 Mbp, была получена оценка 1.0 ∙ 10 в год на п.н.о., 95% CI: (0.3 − 2.5) ∙10 .
3. Расчет по данным о скорости мутаций в
аутосомных хромосомах Mendez et al. (2013) привел к более низкой скорости 0.617 ∙ 10 в год на п.н.о., 95% CI: (0.439 − 0.707) ∙10 .
4. Исходя из времени заселения Америки
человеком 15 тысяч лет назад авторы работы Poznik et al. (2013) получили оценку средней скорости мутаций 0.82 ∙ 10 в год на п.н.о., 95% CI: (0.72 − 0.92) ∙ 10 .
5. Последние успехи, достигнутые в се-
квенировании древних человеческих костных останков, позволяют провести прямую калиб-ровку средней скорости мутаций по числу накопленных производных аллелей со вре-мени жизни древнего человека. В работе Fu et al. (2014) опубликованы данные по полно-му геному древнего Усть-Ишимского челове-ка, жившего около 45 тыс. лет назад в За-падной Сибири. Проанализировав область Y-хромосомы протяженностью 1.86 Mbp, авторы получили оценку скорости SNP мутаций 0.76 ∙ 10 в год на п.н.о., 95% CI: (0.67 −0.86) ∙ 10 .
Результаты
Отбор производных аллелей
Варианты производных аллелей, отлича-ющиеся от референсной последовательности, содержатся в VCF файлах. Не все они отра-жают реальные мутации. В силу особенно-стей технологии NGS, несовершенства мето-дов маппирования, наличия повторяющихся цепочек нуклеотидных последовательностей в Y-хромосоме, совпадения последовательно-стей с аналогами в других хромосомах, часть выявленных вариантов не соответствует ре-
альным мутациям. Доля ложных вариантов невысока для X-degenerate участков (при-мерно 15 – 25% от общего числа). В am-pliconic областях ложных вариантов может быть гораздо больше числа реальных мута-ций.
Метод отбора реальных мутаций, разрабо-
танный в настоящем исследовании, позволяет полностью устранить из анализа ложные ва-рианты. Описание метода содержится в раз-деле «Материалы и методы». Метод основан на отборе X-degenerate последовательностей. Для этого авторами был применен критерий отбора однонуклеотидных полиморфизмов combBED, созданный на основе координат (в системе hg19) начала и конца участков Y-хромосомы, внутрь которых должны попадать отбираемые производные варианты. В Табли-це 1 Приложения к настоящей статье указано расположение 857 «хороших» участков Y-хромосомы общей длиной 8 473 821 bp.
Калибровка скорости SNP мутаций была
проведена для этих участков, совокупность которых в дальнейшем будет именоваться «областью combBED». Калибровка по древнему образцу Anzick-1
Образец Anzick-1 был отобран из костных
останков мальчика, жившего около 12.6 тыс. лет назад на территории современного штата Монтана, США (Rasmussen et al., 2014). Об-разец прекрасно сохранился, что позволило авторам работы Rasmussen et al. (2014) по-лучить высококачественный сиквенс генома мальчика. Мутации Y-хромосомы мальчика Anzick-1 соответствуют гаплогруппе Q-L54. Возраст останков был определен с очень вы-сокой точностью радиоуглеродным методом. По утверждению авторов, он составляет 12707-12556 календарных лет. В среднем, это 12632 года назад.
В базе данных проекта YFull накоплена
уникальная совокупность образцов Q-L54, по которым авторами построено подробное ге-неалогическое дерево. Оно изображено на рис. 1. На дереве видно относительное рас-положение образца Anzick-1. На той же ветви Z780 располагается современный образец US1. 12.6 тыс. лет назад его предок был род-ственником мальчика Anzick-1, имея одни и те же мутации уровня Z780.
Эти особенности дерева Q-L54 определили замысел калибровки скорости мутаций в два этапа. На предварительном этапе оценива-лась продолжительность относительно не-большого отрезка времени, прошедшего с момента разделения ветвей L330 и М1107 до времени жизни мальчика Anzick-1. Основная калибровка средней скорости SNP мутаций проводилась по полученному времени разде-
ления ветвей L330 и М1107 гаплогруппы Q-L54. Время разделения этих ветвей близко ко времени заселения Америки АСЧ (анатомиче-ски современным человеком, homo sapiens sapiens) около 15 тыс. лет назад. В обоих ветвях есть образцы с результатами BigY и FGC в количестве, достаточном для достиже-ния высокой точности калибровки.
Рисунок 1. Генеалогическое дерево гаплогруппы Q-L54, построенное по однонуклеотидным мутациям 12 частных образцов и древнего образца Anzick-1.
Для предварительной калибровки, помимо Anzick-1, использовались данные образца US1. Донор образца US1 и мальчик Anzick-1 имели общих предков с мутациями уровня Z780. Позже произошло разделение их ли-ний, так как более поздние мутации, ото-бранные в области combBED, уже не совпа-дают. К настоящему времени в мужской ли-нии US1 накопилось 78 мутаций. В образце Anzick-1 зафиксирована всего одна мутация позже уровня Z780. Иcходя из радиоуглерод-ной датировки образца Anzick-1 средняя ско-рость однонуклеотидных мутаций оценивает-ся как 0.831 ∙ 10 в год на п.н.о., 95% CI: (0.66 − 1.04) ∙ 10 .
Эту оценку мы использовали только для
расчета интервала времени между моментом разделения ветвей L330 и М1107 и временем жизни мальчика Anzick-1. По числу мутаций, обнаруженных в образцах US1 и Anzick-1,
этот интервал времени составляет 2989 лет, 95% CI: 1814 − 4751лет. Общий возраст разделения ветвей L330 и М1107 - 15621 год назад, 95% CI: 14446− 17383года. Полу-ченная датировка является модельно незави-симой, так как опирается на данные радио-углеродной датировки образца Anzick-1 и на данные «молекулярных часов» в образцах US1 и Anzick-1.
В нашем распоряжении имелось 12 гапло-
типов BigY (11) и FGC (1), предоставленных частными лицами. Образцы группируются в четыре ветви, маркируемые мутациями Z780, L330, Y772, L804. С большой степенью точно-сти их можно считать независимыми (см. рис. 1). Это позволяет нам уменьшить относитель-ную погрешность. Результаты обработки при-ведены в Таблице 2.
Таблица 2. Число фактических мутаций в 12 образцах,
отобранных для калибровки средней скорости SNP мутаций по времени разделения ветвей L330 и М1107
Исходя из среднего числа мутаций 392 на 30.65 млн. п.н.о., возраста разделения вет-вей L330 и М1107 15621 год, получаем окон-чательную калибровку скорости SNP мутаций
. ∙ ∙= 0.819 ∙ 10 в год на п.н.о.
95% CI: (0.704 − 0.935) ∙ 10 .
Для пересчета средней скорости на одно
поколение примем средний интервал одного
мужского поколения равным 31.5 лет (Fenner, 2005):
0.819 ∙ 10 ∙ 31.5 = 2.58 ∙ 10 на поколение на п.н.о.
ской линии и имеют документальные сведе-ния о ближайшем общем предке. Это 41 об-разец, представляющих 14 генеалогий. Число поколений до ближайшего общего предка ва-рьируется от 1 до 23. Мы воспользовались тем, что сумма случайных чисел, распреде-ленных по Пуассону, сама является случай-ным числом, распределенным по Пуассону. В нашем случае это сумма накопленных мута-ций.
Преимуществом этой калибровки является
знание точного числа поколений, за которое произошли приватные мутации. Результат калибровки по современным генеалогиям:
2.56 ∙ 10 на поколение на п.н.о., 95% CI: (2.03 − 3.16) ∙ 10 .
Полученная скорость хорошо согласуется
с калибровкой по датировке Anzick-1, рассчи-танной для среднего интервала одного поко-ления 31.5 лет.
Средний интервал одного поколения по
использованной выборке современных генеа-логий сложился равным 32.1 года. Поэтому абсолютная калибровка на один год соответ-ствует
0.798 ∙ 10 в год на п.н.о.
Калибровка по образцу Усть-Ишимского человека
Усть-Ишимский (далее сокращенно УИЧ) человек жил около 45 тыс. лет назад по ра-диоуглеродной датировке (Fu et al., 2014). На генеалогическом дереве он расположился в начале ветви K-M2335, см. рис. 2. Авторы ра-боты Fu et al. (2014) провели исследование полного генома древнего образца и по нали-чию мутации М526 установили нахождение Y-хромосомы УИЧ в начале гаплогруппы K(xLT). При подробном рассмотрении производных вариантов обнаруживается более поздняя му-тация M2308/Z4842. От этой мутации отходит отдельная ветвь, сформированная из неиз-вестных в настоящее время SNP мутаций об-разца УИЧ. В результате просмотра ВАМ фай-ла авторами выявлено 11 мутаций (включая M2308), возникших позже мутации M526 в области combBED, общей длиной 8.463 Mbp. Их число было использовано для расчетов скорости мутаций.
Для калибровки подходят сиквенсы гапло-групп N, O, Q, R.
Из базы данных YFull были отобраны 35
образцов, которые имели как минимум одно-го, достаточно близкого, родственника. Это позволяло надеяться на сведение возможных
ошибок к минимуму. К ним добавили три об-разца из гаплогруппы О, не являющихся близкими родственниками (из-за отсутствия пар). Всего выборка составила 38 образцов (см. рис. 2). В Таблице 3 приведены данные о числе выявленных в этих образцах мутаций ниже уровня K(xLT).
Таблица 3. Число фактических мутаций в 38 образцах,
отобранных для калибровки средней скорости SNP мутаций по времени жизни Усть-Ишимского человека
Среднее число мутаций моложе уровня K(xLT) составляет 36.36 мут./Mbp.
Поправка на мутации УИЧ составляет:
.= 1.30 мут./Mbp.
Оценка скорости мутаций выглядит сле-
дующим образом: . .∙
= 0.781 ∙ 10 в год на п.н.о. 95% CI:(0.709 − 0.853) ∙ 10 .
Калибровка по образцу К14
Сохранность генетического образца К14 из Костенок (Seguin-Orlando A. et al., 2014), возрастом 37 тыс. лет по данным радиоугле-
родного анализа, хуже, чем образца Усть-Ишимского человека и, тем более, образца Anzick-1.
По опубликованным данным сиквенса
возможно только оценить верхний предел скорости мутаций. В образце К14 уверенно читаются два производных аллеля в локали-зациях снипов K29 и CTS6773 в области про-тяженностью 1.381 Mbp. Это – начало гапло-группы С1 по номенклатуре YFull. К сожале-нию, 15 других выявленных в образце канди-датур имеют слабое покрытие, в основном 3Х-5Х. Их нельзя использовать для калиб-ровки. По подтвержденным снипам можно рассчитать только верхний предел для скоро-сти мутаций.
В базе данных YFull четыре образца из
ветви С1-K29, сведения о них приведены в Таблице 4.
Таблица 4. Число фактических мутаций в 4 образцах,
отобранных для калибровки средней скорости SNP мутаций по времени жизни человека из Костенок (образец K14).
калибровками, но какой-либо практической ценности не имеет.
Коэффициенты для пересчета числа мутаций в возраст
Для практических целей удобно пользо-ваться коэффициентами, с помощью которых число фактических мутаций пересчитывается в соответствующую оценку возраста. Из со-отношения (2) легко вывести формулу для расчета таких коэффициентов:
푘 = (3)
Важно, чтобы исследователь знал размер области измерений B интересующих его му-таций. Для BigY средняя величина области измерений, рассчитанная по данным индиви-дуальных BED файлов, составляет 10.31 Mbp (Big Y White Paper, 2014), для FGC Elite – 23 Mbp. Расчет по средней скорости мутаций 0.82 ∙ 10 дает 118 лет для BigY и 53 года для FGC.
Если размер фактически измеренной об-
ласти отличается от приведенного, то следует пересчитать коэффициент. Например, изме-ренная BigY область составляет не 10.31 Mbp, а 11.0 Mbp. Тогда коэффициент будет равен
푘 = 118 ∙ . = 111 лет.
Для более эффективного отбора реальных
мутаций авторы настоящей работы рекомен-дуют ограничиваться областью исследований, располагающейся в пределах границ области
combBED. Размер прочитанной области combBED в индивидуальных образцах BigY варьируется и, в среднем, составляет 7.6 Mbp. Соответствующий коэффициент пере-счета равен 160 лет на одну мутацию.
Обсуждение
Результаты по калибровке средней скоро-сти SNP мутаций, полученные в настоящей работе четырьмя методами, в пределах по-грешности согласуются друг с другом.
Величины констант скоростей, получен-
ные по датировке древнего образца Anzick-1 и современным генеалогиям, находятся в прекрасном согласии. Это – наиболее точные калибровки.
Различие между результатами калибровок
по данным Anzick-1 и УИЧ составляет всего 5%. Вместе с тем необходимо отметить два обстоятельства для калибровки по сиквенсу УИЧ:
1) Датировка 45 тыс. лет УИЧ располага-
ется близко к пределу применимости радио-углеродного метода (50 тыс. лет).
Применение скорости 0.819 ∙ 10 (калиб-
ровка по образцу Anzick-1) дает возраст Усть-Ишимского человека 42800 лет (95% CI: 49800-37500). В работе Fu et al. (2014) воз-раст УИЧ ограничен 95.4% доверительным интервалом 46880–43210 календарных лет. Хотя среднее значение оценки 42800 лет вы-падает за пределы радиоуглеродной калиб-ровки, в пределах погрешности датировки согласуются друг с другом.
2) Нет ясности в оценке среднего интер-
вала одного поколения для мужчин, живших десятки тысяч лет назад.
Константа скорости SNP мутаций в расче-
те на один календарный год (휇 ) связана с константой скорости в расчете на одно поко-ление (휇 ) соотношением:
휇 = ̅ , где 푡̅ – средний интервал одного поколения (средний возраст отца).
Авторы работы Kong et al. (2012) на осно-вании анализа полных геномов трио «роди-тели-потомство» обнародовали данные о до-стоверном росте числа мутаций на один мей-оз с возрастом отца. Для целей настоящей работы рост числа однонуклеотидных мута-ций в гаметах отца с его возрастом t предста-вим в виде степенной зависимости
휇 ~푡 .
По пяти опубликованным трио родители-потомство (Kong et al., 2012) 훾 ≈ 1.02.
Если принять, что число мутаций в Y-
хромосоме сына растет пропорционально возрасту отца (훾 = 1), то средняя скорость SNP мутаций в расчете на один календарный год не будет зависеть от среднего интервала одного мужского поколения.
В общем случае скорость мутаций в расче-
те на один год будет описываться пропорци-ей
휇 ~푡̅ . (4)
Соотношение (4) полезно для понимания
зависимости между изменением среднего возраста отца и соответствующим изменени-ем скорости мутаций на один год. Предполо-жим, мы наблюдаем уменьшение константы скорости мутаций на один календарный год при переходе от одной калибровке к другой. При 훾 > 1 это снижение соответствует уменьшению среднего возраста отца. Если 훾 < 1, то снижение скорости мутаций указы-вает, наоборот, на увеличение интервала од-ного поколения.
Из общих соображений можно заключить,
что 12.6 - 45 тысяч лет назад (верхний па-леолит) средний интервал одного мужского поколения был меньше 31 - 32 лет. Калиб-ровки средней скорости мутаций по датиров-кам Anzick-1 и Усть-Ишимского человека не обнаруживают какого-то достоверного разли-чия. Это, скорее, указывает на линейный рост константы скорости мутаций на одно по-коление 휇 c возрастом отца. Во всяком слу-чае, скорость мутаций на один календарный год слабо зависит от размера интервала од-ного мужского поколения.
В целом наши результаты не противоречат имеющимся современным данным, в том чис-ле Poznik et al. (2013) 0.82 ∙ 10 , Fu et al. (2014) 0.76 ∙ 10 . Но наши скорости опреде-лены с лучшей точностью.
Скорость Poznik et al. (2013) модельно за-
висима от параметра возраста разделения линий образцов майя HGDP00856 и HGDP00877. Авторы приравняли этот возраст времени заселения Америки человеком 15000 лет назад. В нашей работе этот возраст не является произвольным параметром, он вы-числен по датировке образца Anzick-1 и со-ставляет около 15600 лет. Замена параметра снижает оценку скорости мутаций Poznik et al. (2013) до значения 0.79 ∙ 10 .
База расчета скорости мутаций в работе
Fu et al. (2014): 45000 ∙ 1.86 = 83700 Mbp∙year. Наша база расчета по датировке Anzick-1 в полтора раза больше: 15621 ∙ 7.7 = 120000 Mbp∙year. Область измерений 7.7 Mbp получена усреднением по BED файлам 12 современных образцов, использованных для калибровки (см. Таблицу 2). Качество данных образца Anzick-1 гораздо выше каче-ства сиквенса более древнего Усть-Ишимского человека.
Оценка скорости мутаций по времени раз-
деления предков человека и шимпанзе Kuroki et al. (2006) 1.5 ∙ 10 на 80% превышает наши данные.
Скорость 1.0 ∙ 10 в год на п.н.о. из пио-
нерской работы Xue et al. (2009) широко ис-пользовалась для оценки возрастов и внесла большой вклад в развитие генеалогических исследований по Y-хромосоме. В настоящее время эта калибровка, полученная по четы-рем производным аллелям, устарела.
Скорость 0.617 ∙ 10 из работы Mendez et
al. (2013) представляется нам заниженной. Критика метода пересчета скорости мутаций из данных по аутосомным хромосомам содер-жится в статье Sayres (2013).
В целом полученные в настоящей работе
результаты по константе скорости субститу-ций согласуются с выводами авторов обзора Wang, Gilbert, Jin, Li (2014).
О времени заселения человеком Америки.
Оно не совпадает с возрастом образования
ветвей L330 и М1107 15.6 тыс. лет назад. Это время можно оценить по структуре ветви М1107. В настоящее время известны две вет-ви, отходящие от M1107 – ветви Z780 и M930. Ветвь Z780 представлена исключи-тельно мужскими линиями коренных амери-канцев (индейцев). А подветви M930 имеют разное происхождение. Подветвь L804 состо-ит из европейских линий, в то время как под-ветвь Y772 – из потомков коренных амери-канцев, в том числе с мутацией M3 (см. рис.1). Предки носителей мутации L804 оста-лись в Евразии, тогда как предки линии М3 ушли в Америку. Мутаций одного уровня с М930 в области combBED всего четыре. По пяти образцам подветви Y772 и четырем об-разцам подветви L804, возраст разделения ветви M930 оценивается около 14800 лет назад. Эта датировка, на наш взгляд, наибо-лее близка ко времени заселения Америки. Полученная оценка 14.8 тыс. лет назад не противоречит результатам совокупности ра-бот по заселению Америки, которые говорят о том, что человек появился в Америке не позднее 14 тыс. лет назад (Barnosky et al., 2014). Отдельно отметим, что первые мужчи-ны-переселенцы в Америку не относились только к одной гаплогруппе М930. Мы видим, что были и носители мутации Z780, к кото-рым относились и предки мальчика Anzick-1.
О времени заселения человеком Австра-
лии. В работе Hallast et al. (2015) опублико-ваны однонуклеотидные мутации двух образ-цов аборигенного населения Австралии. В область измерений 3.7 Mbp попали мутации F3393 и K35, указывающие на принадлеж-ность образцов к гаплогруппе С1. Вместе с тем 129 других общих для этих двух образцов снипов не обнаруживаются среди 24 образ-цов C1a и C1b базы данных YFull. Таким об-разом, возраст австралийской аборигенной линии близок ко времени разделения гапло-группы С1 на субклады C1a и C1b. Расчет возраста по четырем современным образцам C-V20 (см. Таблицу 4) дает 49200 лет назад, 95% CI: 43900-54600 лет. Полученный ре-зультат находится в прекрасном соответствии с представлениями археологов о времени за-селения человеком Сахула около 50 тыс. лет назад (O’Connell and Allen, 2004; Hiscock, 2013).
Исходя из формулы (2) можно получить
оценку относительной погрешности возраста по числу наблюдаемых SNP мутаций N:
измерений можно добиться высокой точности в измерении средней скорости мутаций, что-бы выполнялось соотношение
( ) ≪ ( )
(6)
В этом случае точность оценки возраста
будет определяться числом мутаций:
( ) = ( ) = √ =√
(7)
Соотношение (7) позволяет оценить тео-
ретический предел точности определения возраста ветви по снипам. В Таблице 5 при-ведены относительные доверительные интер-валы для 95% вероятности (1.96σ/T) для примененного в настоящей работе метода:
휇 = 0.82 ∙ 10 (푦푒푎푟 ∙ 푏푝) , 퐵 = 8 ∙ 10 bp.
Таблица 5. Зависимость теоретического предела точности оценки возраста генеалогической линии по SNP мутациям от возраста
Возраст, лет 1.96σ/T
1000 76% 2000 54% 5000 34% 10000 24%
Возможностей для повышения точности
немного. Если удастся эффективно отбирать мутации в области ampliconic (+10 Mbp), в том числе в палиндромных участках, и ис-пользовать обе разделившиеся ветви (+N), то можно ожидать улучшения точности преде-лов, указанных в Таблице 5, примерно в два раза.
Материалы и методы
Для калибровки средней скорости SNP му-таций были использованы данные полного секвенирования Y-хромосомы приватных об-разцов, сделанные в коммерческих лаборато-риях FTDNA и Full Genome Corp. Образцы бы-ли предоставлены группой YFull с соблюде-нием требований конфиденциальности пер-сональных данных, на основании разрешений частных лиц об использовании их данных в научных исследованиях.
Данные об Y-хромосоме древних образцов
были взяты из открытых источников научных статей: Anzick-1 - Rasmussen et al. (2014), Усть-Ишимский человек - Fu et al. (2014), К14 - Seguin-Orlando et al. (2014).
Разработанный авторами настоящей рабо-
ты метод отбора позволяет с высокой эффек-тивностью исключать из рассмотрения лож-ные варианты с производными аллелями. От-бор кандидатур для выявления истинных му-
таций происходил в следующей последова-тельности критериев.
1. Критерий Reg. Различные варианты
производных, то есть отличающихся от рефе-ренсной последовательности аллелей, выяв-лялись по BAM файлам. Анализируемые участки нуклеотидных последовательностей Y-хромосомы имеют общую длину 13-15 Mbp для теста BigY и около 23 Mbp для теста FGC. Кратность чтения (покрытие) одного сайта – от 1Х до 8000Х. Среднее покрытие коммерче-ских образцов – около 60Х. Из этой совокуп-ности кандидатур отбирались только такие, координаты которых попадали внутрь участ-ков, ограниченных областью combBED. Об-ласть combBED была сконструирована авто-рами для отбора X-degenerate участков. Гра-ницы combBED участков образованы путем взаимного пересечения BED файла из работы Poznik et al. (2013) общей длиной 10.45 Mbp и обобщенного BED файла BigY (11.38 Mbp), опубликованного в BigY White Paper (2014). В результате образовались 857 непрерывных участков Y-хромосомы общей длиной 8 473 821 bp. Координаты начала и конца этих участков содержатся в Таблице 1 При-ложения.
2. Критерий Indel. Исключались варианты
инсерций и делеций (инделов), а также крат-ных нуклеотидных мутаций (более одной по-зиции с производными аллелями, MNP).
3. Критерий Locs. В некоторых случаях одни и те же кандидатуры выявляются в об-разцах из разных гаплогрупп, из разных суб-кладов. Одна из причин – отличие аллеля референсной последовательности, состав-ленной в основном по данным гаплогрупп R1b и G, от фактически наблюдаемого пред-кового аллеля. Другая причина – ошибки ма-ппирования. Эмпирическим путем было вы-явлено, что в случае, если один и тот же ва-риант был обнаружен не менее, чем в шести локализациях, то соответствующая кандида-тура однонуклеотидного полиморфизма мо-жет быть исключена из рассмотрения по ука-занным выше причинам. Под локализацией понимается группа образцов из базы данных YFull (2900 образцов на февраль 2015 года), принадлежащих одному субкладу и имеющих производный аллель изучаемой кандидатуры. Этот критерий достаточно мягкий, но весьма эффективный.
4. Критерий Reads. Исключаются кандида-
туры с общим числом прочтений менее трех раз, т.е. с одним или двумя ридами.
5. Критерий Qual. Качество определяется
стандартным образом, как средневзвешенное от показателя качества прочтений в одной и той же позиции, где правильные значения берутся с плюсом, а ошибочные значения с минусом. Отбор проходили кандидатуры с качеством 90% и более, кандидатуры с каче-ством менее 90% отклонялись.
6. Критерий Post mortal. Применяется
только в отношении древних образцов: ис-ключаются постмортальные повреждения в ДНК, выражающиеся в замене следующих пар оснований: C→T и G→A (Briggs et al., 2007). Для современных образцов критерий не применяется.
7. Критерий Single SNP. Из-за технических
особенностей применяемой программы обра-ботки часть кандидатур с двойной мутацией (Double Nucleotide Polymorphisms) проходила критерий Indel. Программа интерпретировала двукратный нуклеотидный полиморфизм как
две SNP мутации в соседних позициях. Этот вспомогательный критерий позволяет откло-нять оба варианта.
8. Критерий Trash. Исключаются кандида-
туры, вызывающие подозрение в том, что это ошибка выравнивания или чтения. В основ-ном, это мутации в палиндромных участках и участках, имеющих копии на других участках Y-хромосомы.
Варианты, удовлетворяющие всем крите-
риям отбора, являются реально произошед-шими в разное время однонуклеотидными (SNP) мутациями. Критерии 2 - 8 в совокуп-ности отклоняют до одной трети кандидатур, в среднем 20%.
Расчет общего размера области исследо-
вания для индивидуального образца произ-водится по всем позициям с числом ридов не менее трех. В отобранных для настоящего исследования современных образцах изучае-мая область варьировалась от 7.2 до 8.45 Mbp в зависимости от качества секвенирова-ния, отраженного в BAM файле (см. Таблицы 2 и 3). Внутрь области combBED попали раз-ные по величине участки нуклеотидных по-следовательностей древних образцов: Anzick-1 – 6.355 Mbp, Усть-Ишимский человек – 8.463 Mbp, K14 - 1.381 Mbp.
Единой формулы для подсчета скорости
мутаций нет из-за различий в методах калиб-ровки. Во всех расчетах использовали соот-ношение (1).
По этой же причине расчет 95% довери-
тельного интервала производился в каждом случае индивидуально, исходя из свойств распределения Пуассона. На рис. 3 приведе-но распределение оценки скорости мутаций для двухэтапной калибровки по древнему об-разцу Anzick-1. Распределение получено пу-тем компьютерного моделирования 5 ∙ 10 событий. Видно, что оно очень близко к нор-мальному распределению.
Рисунок 3. Гистограмма распределения оценок скорости мутаций по методу, использующему датировку древнего образца Anzick-1.
Сплошной линией показано нормальное распределение. Описание метода расчета вариаций для
более простых случаев одноэтапной калиб-ровки содержится в работе Poznik et al. (2013). Заключение
Разработанный авторами метод отбора
кандидатур в снипы из BAM файлов индиви-дуальных образцов позволяет с высокой эф-фективностью отбирать реальные SNP мута-ции и отклонять различные ложные вариан-ты.
Использование четырех независимых ка-
либровок, ранжирование их по степени до-стоверности и надежности позволили полу-
чить модельно независимую оценку констан-ты скорости SNP мутаций
0.82 ∙ 10 в год на п.н.о., 95% CI: (0.70 −0.94) ∙ 10 .
Произведенная оценка скорости мутаций совместно с накопленной в группе YFull базой данных коммерческих образцов BigY и FGC позволяют оценить время заселения Америки человеком в 14.8 тыс. лет назад, Австралии – в 49.2 тыс. лет назад.
1. Barnosky A. et al. (2014). Prelude to the Anthropocene: Two new North American Land Mammal Ages (NAL-MAs). The Anthropocene Review, 1–18. DOI: 10.1177/2053019614547433.
2. Big Y White Paper (2014). https://www.familytreedna.com/learn/y-dna-testing/big-y/white-paper/ https://www.familytreedna.com/documents/bigy_targets.txt
17. Briggs A. et al. (2007). Patterns of damage in genomic DNA sequences from a Neandertal. Proc Natl Acad Sci USA, 104: 14616–14621.
18. Fenner J.N. (2005). Cross-cultural estimation of the human generation interval for use in genetics-based population divergence studies. Am.J.Phys.Anthropol. 128(2): 415-423.
3. Francalacci P. et al. (2013). Low-pass DNA sequencing of 1200 Sardinians reconstructs European Y-chromosome phylogeny. Science 341: 565-569.
4. Fu Q. et al. (2014). Genome sequence of a 45,000-year-old modern human from western Siberia. Nature, 514: 445-449.
5. Hallast et al (2015). The Y-chromosome tree bursts into leaf: 13,000 high-confidence SNPs covering the majori-ty of known clades. Mol Biol Evol, 32, no. 3: 661-673.
6. Hiscock P. (2013). Occupying New Lands: Global Migra-tions and Cultural Diversification with Particular Refer-ence to Australia. In Kelly E Graf, Caroline V Ketron, Michael R Waters (Eds.), Paleoamerican Odyssey, (pp. 3-11). Texas: Center for the Study of the First Ameri-cans.
7. Kong A. et al. (2012). Rate of de novo mutations and the importance of father’s age to disease risk. Nature, 488 (7412): 471-475.
8. Kuroki Y. et al. (2006). Comparative analysis of chim-panzee and human Y chromosomes unveils complex evolutionary pathway. Nature Genetics 38: 158 – 167.
9. Mendez F. et al. (2013). An african american paternal lineage adds an extremely ancient root to the human y chromosome phylogenetic tree. Am. J. Hum. Genet. 92: 454-459.
10. O’Connell J. and Allen J. (2004). Dating the colonization of Sahul (Pleistocene Australia–New Guinea): a review of recent research. Journal of Archaeological Science 31: 835–853.
11. Poznik D. et al. (2013). Sequencing Y Chromosomes Resolves Discrepancy in Time to Common Ancestor of Males Versus Females. Science, 341: 562-565.
12. Rasmussen M. et al. (2014). The genome of a Late Pleistocene human from a Clovis burial site in western Montana. Nature, 506: 225-229.
13. Sayres M. (2013). Timing of ancient human Y lineage depends on the mutation rate: A comment on Mendez et al. arXiv preprint: arXiv:1304.6098.
14. Seguin-Orlando A. et al. (2014). Genomic structure in Europeans dating back at least 36,200 years. http://www.sciencemag.org/content/early/recent/ 6 November 2014/ Page 1/ 10.1126/science.aaa0114.
15. Skaletsky H. et al. (2003). The male-specific region of the human Y chromosome is a mosaic of discrete se-quence classes. Nature, 423(6942): 825-837.
16. Wang C.-C., Gilbert T., Jin L., Li H. (2014). Evaluating the Y chromosomal timescale in human demographic and lineage dating. Investigative Genetics, 5:12. http://www.investigativegenetics.com/content/5/1/12.
19. Wei W. et al. (2013). A calibrated human Y-chromosomal phylogeny based on resequencing. Ge-nome Res., 23(2): 388-395.
20. Xue Y. et al. (2009). Human Y chromosome base-substitution mutation rate measured by direct sequenc-ing in a deep-rooting pedigree. Curr. Biol. 19: 1453-1457.
21. Yan S. et al. (2014). Y Chromosomes of 40% Chinese Are Descendants of Three Neolithic Super-grandfathers. PLoS ONE 9(8): e105691. doi:10.1371/journal.pone.0105691.
Таблица 1. Начальные и конечные позиции (по Hg 19) 857 участков Y-хромосомы, применяемых для фильтрации однонуклеотидных полиморфизмов («область combBED»).
Начальная позиция не включается в отбор, конечная позиция включается в отбор.
