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Embrion de pollo

Date post:12-Jul-2015
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Diapositiva 1

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICOFACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZAINTEGRANTESLuis Islas JorgeMartnez Rojas Hugo Ponce de Len Veaz NoemiVargas Cisneros BereniceVargas Olvera Mireya

Embrin de PolloLaboratorio de Microbiologa General IIEquipo 3, 2752

Adiestrar al alumno en el manejo de la tcnica inoculacin de embrin de pollo por las vas ms utilizadas.

El alumno conocer las diversas partes del embrin de pollo de 9 das de inoculacin. OBJETIVOSEfecto CitopticoEfecto citopticoSe denomina efecto citoptico a los cambios bioqumicos y moleculares, morfolgicos y de viabilidad celular, visibles a microscopa ptica, causados durante el ciclo de replicacin viral.Aunque todos los virus lticos producen efecto citoptico, puede observarse una gran diversidad de manifestacionesEfecto citopticoLa mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en clulas infectadas en cultivo, en las que se aprecia: prdida de adherencia al sustrato, inhibicin por contacto, redondeamiento celular, formacin de sincitios, cuerpos de inclusin citoslicos, transformacin celular, lisis, etc. LisisEs la conclusin del conjunto de alteraciones celulares que se producen, secuencial o simultneamente en la clula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partculas virales.

Cuerpos de inclusin

Muchos tipos de virus inducen la aparicin de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmticas o pequeas.SinciciosLos sincicios son grupos de clulas fusionadas apreciables como una masa celular multinucleada

Transformacin celularEs una alteracin en el crecimiento normal de las clulas en cultivo con evidentes manifestaciones morfolgicas. Se asocia a una serie de cambio moleculares y est especialmente ligada a virus que insertan su genoma en el de la clula infectada, pudiendo causar mutagnesis insercional al interrumpir antioncogenes o activar pro-oncogenes, o alterando la correcta regulacin de la expresin gnica celular.Alteraciones bioqumicasLas alteraciones bioqumicas son muy diversas y especficas de cada virus, si bien pueden sealarse las ms importantes a nivel general.Algunos virus son capaces de mostrar esta inhibicin en etapas tempranas de la infeccin pero la mayora de los virus animales lo hacen en etapas tardas. El efecto ms drstico suele producirse en la inhibicin de la expresin de protenas celulares por traduccin preferente o casi exclusiva de protenas virales.

Alteraciones bioquimicas1.- Inhibicin de la sntesis de protenas celulares

2.- Inhibicin de la sntesis de DNA celular

3.- Inhibicin de la sntesis de RNA celularAlteraciones de las membranas celularesCambios en la actividad de enzimas presentes en las membranas. Modificaciones en la funcionalidad del sistema vesicular. Aumento de la permeabilidad de la membrana plasmtica.

Tcnicas de CultivoLos sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el laboratorio son:

1.Animales de experimentacin

2.Embriones animales

3.Cultivos celulares artificialesTcnicas para el cultivo de virus

Animales de experimentacin

La inoculacin en animales de experimentacin de muestras clnicas o de virus para su aislamiento o propagacin.

Poco usada

Se emplea nicamente cuando se trata de propagar virus cuya replicacin en los otros sistemas no es posible.

Los animales ms utilizados: monos, los cobayos y los ratones lactantesEmbriones de animales

Los ms utilizados son los embriones de pollo

los huevos fecundados se incuban hasta el momento de su inoculacin que suele oscilar entre 6 y 14 das.

Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrin (cavidad amnitica, saco vitelinol etc.).

Cultivos celulares

Se cultivan clulas de mamfero en una sola capa (monocapa) sobre la superficie de un recipiente de plstico y son inoculadas con la muestra estudiada.

Despus se observan a diario los cambios inducidos por virus (efectos citopticos), a veces tan caractersticos que no se requiere de ms investigacin para informarlos, sin embargo, a menudo son necesarias algunas pruebas confirmativas, como inmunofluorescencia.

Tipos de cultivos celulares

Lneas celulares semicontinuas : Estas clulas derivan de tejido fetal humano o animal. Poseen el cariotipo diplode normal y, por tanto, es posible utilizarlas en la produccin de vacunas. Tienen un periodo de vida limitado y slo es posible hacer subcultivos de unas 50 generaciones.

Lneas celulares continuas: Las ms utilizadas para el diagnostico. Derivan de un tumor o de clulas normales que, despus de cultivos repetidos, se transforman tanto que actan como clulas derivadas de tumor, es decir, poseen un nmero anormal de cromosomas, Estas clulas pueden propagarse de manera indefinida.

Cultivos de linfocitos: Los linfocitos B se dividen y continan la divisin de manera indefinida cuando estn infectados por VEB. Esta caracterstica es conocida como inmortalizacin y se puede aprovechar como marcador del aislamiento de VEB.Los linfocitos T crecen en presencia de una linfocina, IL-2, el descubrimiento de este fenmeno ha sido fundamental para el estudio de los retrovirus humanos (VIH y HTLV) que logran propagarse en cultivos celulares con la formacin de clulas gigantes sincitiales.

Tipo de cultivoCaractersticasEjemplosUso primarioPrimarioDiploide: Tipos celulares mezclados; 1 2 pasajesPrimario de rion de monoInfluenza; parainfluenza; algunos enterovirusLneas celularesDiploides: fibroblastos; pasajes limitados. (< 50-70)Fobroblastos dipliodes humanos (WI-38, MRC-5 o HRL)Herpes simplex: citomegalovirus; varicela zoster, rinovirus.Lneas celulares establecidasHeteroploides: pasajes continuos in vitro.GeLa; Hep-2Tadenovirus: RSVImportancia La inoculacin animal sigue siendo un mtodo de gran valor para estudiar:

La oncognesis viral La patologa de los padecimientos virales La respuesta inmune a los virus El efecto de los factores ambientales sobre infecciones virales

Cuerpo de Negri.

Corpsculos hallados por Negri en las clulas del sistema nervioso central de los animales muertos de rabia; son especficos de esta enfermedad. Se trata de reacciones de la clula contra el virus. No se hallan en los animales inoculados con la rabia experimental.

El virus de la Rabia en el cerebro de animales infectados produce Cuerpos de Negri de varias formas (menores de 1 micrmetro de dimetro, con masas redondas u ovales, y cintas de 2 a 10 micras de dimetro). Estos son inclusiones eosinoflicas intracitoplasmticas formadas por agregados de nucleocpside en las neuronas de cerca de 50 a 80% de los humanos infectados.

Cuerpos de Negri por Rabdovirus

Histopatologa de la rabia, cerebro. Cuerpos de Negri caractersticos estn presentes con una clula de Purkinje del cerebelo en este paciente que falleci por rabiaHistopatologa de la rabia, cerebro. Cuerpos de Negri caractersticos estn presentes con una clula de Purkinje del cerebelo en este paciente que falleci por rabiaVVV

Embrin de PolloEMBRIN DE POLLOSe reconoce el embrin que esta vivo porque en la transiluminacin se ven como telaraa venas que forman la membrana corioalantoidea y se observa que se desplaza un punto negro intermitente (el ojo).

EMBRIN DE POLLOAl morir, los vasos se desintegran y este yace fijo al polo superior del huevo.

A medida que aumenta de tamao disminuye el volumen de los lquidos extraembrionarios

Se emplean huevos con 5 a 14 das de incubacin, segn la va de inoculacin: Membrana corioalantoideaCavidades alantoidea y amnitica Saco vitelino Intracerebral Endovenosa.

CULTIVO VIRAL EN HUEVO EMBRIONADOUTILIDAD: Es una fuente de tejido vivo conveniente y fcil de manipular que se utiliza en la propagacin, titulacin e identificacin de virus, as como en la preparacin de algunas vacunas virales.

TIPOS DE VIRUS QUE SE PUEDEN INOCULAR EN EMBRION DE POLLOEmbrin de pollo

EMBRIN DE POLLO

Vas de InoculacinSelectividad que tienen algunos virus por determinados tejidos

Inoculacin por saco alantoideoCon colorante se observa: liquido alantoideo, albumina y cmara de aire teidosLiquido alantoideo: virus hemaglutinantes o produccin de hemaglutininasEmbrin de 9-12 das, inoculo de 0.1-0.2ml

Inoculacin por saco alantoideo

Inoculacin en saco amnitico Con colorante: lquido amnitico, cmara de airePrimoaislamiento de cepas de influenzaEmbrin de 7-15 das, inoculo de 0.1-0.2ml

Inoculacin en saco amnitico

Inoculacin en saco vitelino Con colorante: Saco vitelino, Cmara de aireCultivo de clamidias y ricketsiasEmbriones de 5-8das, inoculo de 0.2-1ml

Inoculacin en saco vitelino

Inoculacin de membrana corioalantoidea (MCA)Con colorante: membrana corioalantoideaPermite cuantificar aquellos grupos virales que producen lesiones localizadasEmbrion de 10-12 das, inoculo de 0.1-0.5ml

Inoculacin de membrana corioalantoidea (MCA)

Embrin de polloLa infeccin puede producir una lesin tisular local conocida como pstula (caracterstico de virus)

A veces se inyecta el virus directamente en el embrin en desarrollo: IV, intraperitoneal, o intracerebral.

Tambien influye: la dilucin, la cantidad del inculo, la temperatura y tiempo de incubacin tras la inoculacin

MEMBRANAVIRUSTIPO DE EMBRIN

CANTIDAD DE INOCULACINSIGNOS DE CRECIMIENTOSaco vitelinoHerpes simpleNeumona y Rickettsias Se emplean embriones de 5 8 das0.2 1 mlMuerteCariolantoesHerpes simplePoxvirusSarcoma de RousVaricelaVirus de Laringotraqueitis aviar Enfermedad de BeyerSe emplean embriones de 10 12 das0.1 0.5 mlMuertePstulasPstulas

Focos o pstulas fcilmente visiblesAlantoidesInfluenzaNew Castle Virus de la bronquitis infecciosaSe emplean embriones

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