A Gram-negative bacterial strain S1S-2 with antibacterial

activity was isolated from sediment collected from Osipcheon

in Yeongdeok-Gun. Phylogenetic analysis based on the 16S

rRNA gene sequences indicated that strain S1S-2 belonged to

the genus Rouxiella and shared 98.7~99.5% sequence similarity

with Rouxiella species. Based on the results of API kit testing

and some physiological characteristics, the strain was identified

and named Rouxiella sp. S1S-2. The strain revealed antibiosis

against pathogenic bacteria, including Bacillus cereus KCTC

3624, Escherichia coli KCTC 2443, and Staphylococcus aureus

KCCM 40510 (methicillin-resistant strain). The effects of

commercial culture media, temperature, and initial pH on the

cell growth and antibacterial activity were confirmed for

culture optimization of strain S1S-2. When the strain was

cultured in LB, NB, TSB, R2A media, the antibacterial activity

did not show. The optimal conditions for growth and antibacterial

activity of strain S1S-2 were found to be YPD medium and

25°C. We also isolated the antibacterial compound from ethyl

acetate fraction of the bacterial culture and its chemical

structure was identified as maculosin (1) by ESI-MS, 1H-NMR,

and 13C-NMR analyses. This study is the first report that newly

isolated strain Rouxiella sp. S1S-2 showed antibacterial activity

against pathogenic bacteria.

Keywords: Rouxiella sp., antibacterial activity, maculosin, optimal

culture condition

미생물이 생산하는 다양한 항균물질은 화장품, 효소, 식품

및 의약품 산업 등에 상업적으로 이용되고 있고, 미생물을 이

용한 물질 탐색과 응용연구는 지속적으로 이루어지고 있다.

미생물의 배양 조건(배지, pH, 온도 등)은 세포생장성과 항생

물질 생산에 영향을 줄 수 있다(Nam et al., 2018, 2020; Hwang

et al., 2020). 또한, 항생물질을 생산하는 미생물은 Burkholderia

sp., Bacillus sp., Brevibacillus sp., Streptomyces sp. 등 많은 종

이 널리 알려져 있다(Ayed et al., 2018; Fira et al., 2018; Choi

et al., 2019; Wang et al., 2020).

2015년에 최초 분류된 Rouxiella 속(genus)은 Enterobacteria-

ceae 과(family)에 해당되며 이 속에 해당되는 표준균주는 R.

chamberiensis DSM 28324T, R. badensis DSM 100043T와 R.

silvae DSM 103735T 총 3종으로 구성되어 있다(Le Flèche-

Matéos et al., 2015, 2017). 토탄지(Peat-bog) 흙에서 분리한

Rouxiella sp. DSM 100043은 당지질(glycolipids)과 생물계면

활성제(biosurfactant)를 생산하는 것을 확인하여 그 구조를 규

명하였다(Kügler et al., 2015). 이번 연구에서 분리한 S1S-2 균

주는 Rouxiella 속(genus)에 속하는 균주로 항균물질 maculosin

을 생산한다는 결과를 얻었다. 이전 연구에서 Rouxiella sp. 균

주가 항균물질을 생산한다는 보고는 없었다.

Korean Journal of Microbiology (2020) Vol. 56, No. 2, pp. 152-159 pISSN 0440-2413DOI https://doi.org/10.7845/kjm.2020.0040 eISSN 2383-9902Copyright ⓒ 2020, The Microbiological Society of Korea

항균활성 물질을 생산하는 세균 Rouxiella sp. S1S-2의 분리 및 특성

남영호† ･ 황병수† ･ 최아영 ･ 정유진*

국립낙동강생물자원관 담수생물연구본부

Isolation and characterization of strain Rouxiella sp. S1S-2 producing

antibacterial compound

Young Ho Nam† , Buyng Su Hwang† , Ahyoung Choi , and Eu Jin Chung*

Nakdonggang National Institute of Biological Resources, Sangju, Gyeongsangbuk-do 37242, Republic of Korea

(Received April 23, 2020; Revised May 26, 2020; Accepted May 28, 2020)

†These authors contributed equally to this work.

*For correspondence. E-mail: eujenee@nnibr.re.kr;

Tel.: +82-54-530-0870; Fax: +82-54-530-0879

Isolation and characterization of strain Rouxiella sp. producing antibacterial compound ∙ 153

Korean Journal of Microbiology, Vol. 56, No. 2

Maculosin은 미국 서북지방의 주요한 잡초인 Centauria

maculosa L.의 병원균인 Alternaria alternata에서 분리된 di-

ketopiperazine계의 제초성 항생물질이다. Streptomyces rochei

87015-3 균주에서 제초 활성물질 분리를 시도하여 maculosin

과 phenylacetic acid의 생산을 확인한 바 있다(Cho et al., 1993).

해양에서 분리한 Streptomyces sp. ZZ446 생산물질 maculosin

과 maculosin-O-α-L-rhamnopyranoside를 구조·동정하였으며,

이 두 화합물이 methicillin-resistant S. aureus, E. coli, Candida

albicans에 대해 항균활성을 보였다(Chen et al., 2020). 생물

학적 방제용 균주로 알려진 Pseudomonas aurantiaca PB-St2

에서 Lahoreoic acids, maculosin 등 11가지 물질을 분리 및 구

조·동정하였으며, 이 중 3가지 물질은 mycobacteria와 몇 가지

그람 양성균에 항균활성 효능을 가지고 있었다(Mehnaz et al.,

2013). 또한, Streptomyces sp.에서 cyclic dipeptide인 maculosin

이 분리되었고 작물생산성에 중요한 영향을 미치는 식물병원

균인 Xanthomonas axonopodis pv. citri, Ralstonia solanacea-

rum, Clavibacter michiganensis의 생장을 저해하는 항균활성

을 보유하고 있다(Wattana-Amorn et al., 2016). Metyl t-butyl

ether (MtBE)를 분해하는 미생물인 Starkeya novella도 maculosin

을 생산하고 Rhizoctonia solani에 대한 항균활성을 보유하고

있다(d’Errico et al., 2020).

본 연구는 항생물질을 생산하는 미생물을 동정하고, 그 균

주의 생리학적·배양학적 특성을 확인하여 생산 물질을 구조·

동정하였다.

재료 및 방법

사용 시약, 균주 및 기기

세균 배양용 Reasoner’s 2A agar (R2A), Tryptic Soy Broth

(TSA), Marine Broth (MA), Luria-Bertani Broth (LB), Nutrient

Broth (NB), Yeast Extract-Peptone-Dextrose (YPD), Bennett’s

배지는 Difco사의 제품을 사용하였다. Reasoner’s 2A (R2A)

broth는 MB Cell 제품을 사용하였다. 세균 측정용 분광광도계

는 Novaspec Spectrophotometer (Biochrom)를 사용하였다.

균주의 생화학적 활성 검정 실험은 API ZYM kit, API 20NE

kit, API 20E kit는 bioMérieux 사 제품을 사용하였다. 대조군

으로 사용된 Rouxiella 속 균주 R. badensis DSM 100043, R.

chamberiensis DSM 28324, R. silvae DSM 103735는 독일미

생물자원센터(DSMZ)에서 구매하여 사용하였다.

시료 채취 및 미생물 분리

이전 연구에서 2018년 3월 13일 영덕 강구면 금진리 오십천

기수역 부근 퇴적물(36°22'04.1''N 129°23'42.3''E)에서 시료

를 채취하여 S1S-2 균주를 순수분리하였다(Nam et al., 2020).

균주 배양 및 배양여액의 제조

분리균의 생육 및 항균활성의 비교는 YPD 배지를 사용하

여 30°C에서 48시간 진탕 배양(130 rpm)하였다. 분리세균의

적정 생육 조건 실험은 4~30°C 범위 및 4~10의 pH 범위에서

수행하였다. 세균의 생육은 600 nm의 탁도(OD600)로 결정하

였다. 배양액을 membrane filter (ADVANTEC, 0.22 μm)로 여

과하여 배양여액(culture filtrate)으로 사용하였다.

항균활성 측정

순수 분리한 미생물 중 항균활성 보유 미생물을 탐색하기

위해 3종의 표적 미생물 B. cereus KCTC 3624, E. coli KCTC

2443은 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture),

methicillin-resistant S. aureus KCCM 40510은 한국미생물보

존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에서 분양

받았다. 표적 미생물을 30°C, 24시간 R2A 배지에 액체 배양한

뒤, 배양액을 분광광도계를 이용하여 OD600값 0.4~0.5로 희석

후 100 μl를 R2A 고체배지에 도말하였다. 그 후 순수 분리한

균주를 도말배지 위에 streaking 한 후 28°C, 24시간 정치 배양

후 주변의 clear zone 관찰을 통해 1차로 항균활성 보유 미생물

을 확인하였다. 선발된 미생물을 30°C, 48시간, 130 rpm으로

진탕 배양한 후, 배양상등액을 Minisart® Syringe Filter (0.2

μm, Sartorius, SFCA)로 여과하였다. 배양 여액 400 μl를 항생

물질 검정용 여지(paper disc, ADVANTEC 49005010, 8 mm ×

1.5 mm)에 올려 완전 건조 후 표적미생물이 도말된 고체 배지

에 올려 28°C, 24시간 정치 배양 후 억제지대(inhibition zone)

를 확인하였다.

미생물 분리 및 16S rRNA 유전자 염기서열 분석

순수 분리한 Rouxiella sp. S1S-2 균주는 16S rDNA 염기서

열을 분석하였다(Nam et al., 2020). 분리 균주의 생리학적 특

성을 확인하기 위해 API ZYM, API 20NE, API 20E test를 이

용하였다. 분리 균주의 계통학적 분석을 위하여 EzBioCloud

(Yoon et al., 2017)를 사용하여 연관성이 높은 유전자 서열을 획

득, 비교 및 분석을 진행하였다. Multiple alignment는 CLUSTAL

X program을 사용하여 수행하였다(Thompson et al., 1997).

그 이후에 BioEdit program (Hall, 1999)을 사용하여 염기서열

154 ∙ Nam et al.

미생물학회지 제56권 제2호

들을 정렬하고, 계통수는 MEGA 7 program (Kumar et al.,

2016)에서 제공하는 neighbor-joining (Saitou and Nei, 1987),

algorithms 방법을 이용하여 그렸다. 순수 분리된 미생물의

16S rRNA 유전자의 상동성은 EzBioCloud를 통해 계산하였

다. Bootstrap values는 1,000 replicates를 만들어 계산하였다

(Felsenstein, 1985).

최적 배양조건 설정

항균 활성 보유균주의 생장 가능한 배양 조건 및 최적 생장

조건을 확인하기 위하여 배지, 온도, pH 테스트를 수행하였고

육안으로 생장도를 확인하였다. 또한, 최종 선발한 항균미생

물의 최적 배양 조건 설정을 위해 배지, 온도, 초기 pH별 생육

및 항균활성을 조사하였다. 생육은 OD값으로 확인하였다. 초

기 배양 조건은 선발된 항균미생물을 종균(seed culture)으로

3% (v/v)로 접종하여, 28°C, 100 rpm으로 2일간 배양하였다.

배지는 LB, NB, TSB, YPD, R2A, Bennett’s의 상용화된 배지

를 사용하여 배지 종류별 생육 및 항균활성을 확인하였다. 온

도는 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C에서 온도별로 배양하였으

며, pH는 5.5~8.5까지 0.5 간격으로 배지의 초기 pH를 조절한

후 각각의 최종 배양물의 생육 및 항균 활성을 확인하였다. 활

성 측정방법은 평판 디스크 측정법을 이용하였다.

항균물질의 순수 분리

항균물질을 분리하기 위해, Rouxiella sp. S1S-2를 배양 최

적화 조건(YPD, 25°C)을 이용하여 3일동안 30 L를 진탕 배양

하였다. 균체는 원심분리기를 사용하여 제거되었고, 상등액

30 L (10 L × 3)는 추출 용기에 나누어 담아 에틸아세테이트

(ethyl acetate) 12 L (4 L × 3)를 넣고 혼합하여 3회 추출하였다.

추출액은 진공회전농축기를 이용하여 농축한 후 동결건조하

여 추출물을 얻었다. 추출물에 3차 증류수 800 ml을 넣어 잘 용

해시킨 후, 2 L 분획 깔때기에 넣고 동일한 부피의 노르말 핵산

(Hx)을 넣어 핵산 분획을 얻었으며, 순차적으로 에틸아세테이

트(EA), 부탄올(BuOH)로 총 4개의 분획(Hx, EA, BuOH, water)

을 얻을 수 있었다. 4개의 분획을 항균활성 측정을 해본 결과

EA 분획(11.5 g)에서 효능이 나타났으며, 항균활성 화합물의

순수 분리를 시도하였다. 효능화합물을 효율적으로 분리하기

위해 먼저 관 컬럼 크로마토그래피(open column chromatography)

를 실시하였다. Glass column (150 × 250 mm)에 ODS-A gel

(Merck)을 충진하여 시료를 로딩하고 water-methanol 혼합용

매(9:1, 7:3, 1:1, 2:3, 3:7, 1:4, 0:10)를 극성에서 비극성으로 조

건을 달리하여 500 ml씩 흘려주어 소분획하였다. 7개의 소분

획층(Fr1-7)의 항균효능 재검증을 통해 Fr-3 (1.2 g) 소분획을

선별할 수 있었다. 선정된 Fr-3 소분획으로부터 순수화합물의

분리는 Prep-HPLC를 이용하였다. 기기는 Prep-HPLC (Agilent)

와 320 nm의 단일 UV 파장으로 진행하였고, 컬럼은 Pheno-

menex 사의 Kinetex 5u C18 (21.2 × 250 mm, 100 Å), 이동상은

water (A)와 MeCN (B)에 0.1% 포름산을 첨가하였다. 분리 조

건은 10%B (2분)~60%B (45분)의 기울기를 주었으며, 유량은

10 ml/min으로 머무름 시간 14분에 화합물 1 (4.1 mg)을 얻을

수 있었다. 화합물 1의 화학적 구조 분석을 위해 VARIAN 500

MHz 기기(VARIAN)로 methanol-d4 용매를 이용하여 NMR

실험을 하였으며, 실험과정에서 사용된 아세토니트릴(MeCN),

메틸알코올(MeOH), 초순수(water)는 모두 Merck사의 특급

시약을 사용하였다.

결과 및 고찰

분리균의 동정

이전 연구에서 2018년 3월 13일 영덕 강구면 금진리 오십천

기수역 부근 퇴적물에서 시료를 채취하여 S1S-2 균주를 순수

분리하였고, 균주의 배양여액이 methicillin-resistant S. aureus

KCCM 40510, B. cereus KCTC 3624에 대해 항균활성을 보였

다(결과 미제시). 분리균의 16S rRNA 유전자 염기서열은

Rouxiella silvae 213T, Rouxiella inusitata DSM 30078T,

Rouxiella badensis DSM 100043T, Rouxiella chamberiensis

130333T와 각각 99.5%, 99.3%, 99.0%, 98.7%의 상동성을 보

였다. 현재까지 보고된 Rouxiella 속(genus)에 해당되는 표준균

주(type strain)는 S1S-2의 근연종인 네 균주가 유일하며 계통

도 분석결과, S1S-2 균주는 Rouxiella 속에 속하는 종으로 판단

할 수 있다(Fig. 1). 탄소 이용성 검정 및 지방산 활성 검정을 위

해 S1S-2와 근연종 3종(R. silvae, R. badensis, R. chamberiensis)

을 선정하여 API 20NE, API 20E, API ZYM kit test와 생장테

스트를 수행하였다. 모든 균주는 그람 음성의 간균으로 glucose,

esculin, p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, arabionose, man-

nose, mannitol, N-acetyl-D-glucosamine, alkaline phosphatase,

leucine arylamidase, acid phosphohydrolase, β-galactosidase,

β-glucosidase를 탄소원으로 이용할 수 있다. S1S-2와 근연종

3종 모두 생장 범위는 배양 온도 4~30°C, 염 농도 0~3%였고,

생장 pH 범위는 약간 달랐다(결과 미제시). 또한, API kit 이용

결과, 분리 균주가 근연종과 차이나는 이용성 여부에 대해 정

리하여 표기하였다(Table 1). Rouxiella sp. S1S-2 균주의 polar

lipid 분석결과, diphosphatidylglycerol (DPG), phosphatidyl-

Isolation and characterization of strain Rouxiella sp. producing antibacterial compound ∙ 155

Korean Journal of Microbiology, Vol. 56, No. 2

Fig. 1. Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences showing the relationships among isolates belonging to the order Rouxiella sp.

S1S-2 and related taxa. Numbers at nodes indicated bootstrap percentage (above 50%) based on 1,000 resampled data sets. Bar, 0.01 substitutions per

nucleotide position.

Table 1. Differential characteristics of strain S1S-2 and closely related taxa

Characteristic S1S-2 Rouxiella silvae 213T Rouxiella badensis

DSM100043T

Rouxiella chamberiensis

130333T

Colony color white white white yellow

Growth pH range 5~10 4~10 4~10 5~9

API 20NE

Potassium nitrate + + + -

Maltose + + + -

Gluconate - + + +

Malate + + + -

Citrate + + + -

API ZYM

Trypsin - - + +

α-Chymotrypsin - + - -

α-Glucosidase + + - -

API 20E

2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside - - + -

Trisodium citrate - - + -

Sodium pyruvate + - - -

D-Glucose + + + -

D-Mannitol - - + -

D-Sucrose - - + -

D-Melibiose - - + -

Amygdalin - + + -

L-Arabinose - - + -

All data were obtained in this study. +, positive reaction; -, negative reaction

156 ∙ Nam et al.

미생물학회지 제56권 제2호

glycerol (PG), phosphatidylethanolamine (PE), 확인되지 않는

phospholipid 5개와 확인되지 않는 aminophospholipid 1개로

구성되어 있다(결과 미제시). 계통분류학적 분석을 볼 때

Rouxiella 속에 속하는 종으로 판단할 수 있다. 또한, 생리·생

화학적 분석결과 S1S-2 균주는 근연종들과는 다른 종으로 확

인할 수 있으며 그간 국내에서 발견된 적이 없는 미기록종이다.

항균활성을 위한 배양배지 종류 선정

상용배지 LB, NB, TSB, YPD, R2A, Bennett’s 배지에서

S1S-2 균주의 생육을 비교하기 위하여 균주 생육량과 pH를 측

정하였다. 가장 높은 생육을 보인 배지는 TSB, YPD 배지로

OD값이 각각 1.9, 1.4로 확인되었고, R2A 배지에서는 OD값

이 0.4로 가장 낮은 생육을 보였다(Fig. 2A). S1S 균주는 배지

에 따른 생육의 차이를 보였고, TSB, YPD, Bennett’s 배지에서

비교적 잘 생육하였다. S1S-2 균주의 S. aureus KCCM 40510,

B. cereus KCTC 3624, E. coli KCTC 2443 3종에 대하여 생장

억제 직경을 측정하였다. S1S-2 균주는 YPD 배지에서 높은

항균활성을 나타냈으며, LB, NB, TSB, R2A 배지를 이용한 배

양액은 항균활성이 전혀 없었다(Fig. 2B). S1S-2 균주의 생장

과 항균활성을 위한 최적 배지는 YPD로 선정하였다. 최적 배

지로 선정된 YPD 배지를 이용하여 온도별 생육을 비교하기

위해 생육량과 pH를 측정하였다. 균체성장은 20~25°C 범위

에서 가장 효율적이었으며, 각각의 온도별 조건에서 가장 높

은 생육을 보인 온도는 20°C로 OD값이 4.7이었다. 배양 온도

40°C에서는 생장이 급격히 떨어졌다. 온도에 따른 최종 배양

물의 pH는 3.3~5.7 범위로 확인하였다(결과 미제시). S1S-2

균주의 표적미생물 3종에 대한 온도별 항균활성 확인 결과,

20~35°C에서 4~6 mm의 억제 직경을 확인하였다. S1S-2 균주

는 20~35°C에서 배양했을 때 그 배양여액이 2종의 유해미생

물에 대해 고르게 활성이 높았으며, 25°C에서 활성이 가장 좋

았다(결과 미제시). 따라서, 항균활성 최적 배양 온도는 25°C

로 선정하였다.

항균화합물의 분리 및 구조 동정

분리된 화합물 1의 화학적 구조는 1D, 2D NMR 데이터와

AB Sciex사의 QTRAP4500 질량분석기(Framingham) 그리

고 참고문헌(Mehnaz et al., 2013)을 바탕으로 maculosin(1)으

로 결정되었으며, 수소와 탄소의 화학적 이동값을 기입하였다

(Figs. 3, 4, 5). 본 연구결과는 Rouxiella 종이 maculosin을 생산

하여 항균활성 효능을 가지고 있다는 최초의 보고이다.

(A)

(B)

Fig. 2. Growth, pH (A) and antibacterial activity pictures (B) of Rouxiella sp. S1S-2 according to commercial media.

Isolation and characterization of strain Rouxiella sp. producing antibacterial compound ∙ 157

Korean Journal of Microbiology, Vol. 56, No. 2

적 요

그람 음성, 항균활성 세균 S1S-2는 영덕군 오십천 부근의

퇴적물에서 분리되었다. 16S rRNA 유전자 분석 결과를 바탕

으로 한 계통분류학적 분석은 S1S-2 균주가 Rouxiella 종들과

98.7~99.5%의 유사도를 보였고, Rouxiella 속(genus)에 속하

는 것을 가리킨다. API kit 실험과 몇 가지 생리학적 특징 확

인 결과를 기반으로 S1S-2 균주는 Rouxiella sp. S1S-2로 명

명하고 동정하였다. 이 균주는 Bacillus cereus KCTC 3624,

Escherichia coli KCTC 2443, Staphylococcus aureus KCCM

Fig. 3. The 1H NMR spectrum of maculosin (1) in methanol-d4.

Fig. 4. The 13C NMR spectrum of maculosin (1) in methanol-d4.

158 ∙ Nam et al.

미생물학회지 제56권 제2호

40510 (메티실린 내성)을 포함하는 병원성 세균의 생장을 억

제하는 항균활성 효능을 보였다. S1S-2 균주의 배양 최적화를

위해 세균의 생장과 항균활성에 대한 상용배지, 온도와 초기

pH의 효과를 확인하였다. 이 균주는 LB, NB, TSB, R2A 배지

에 배양하였을 때 항균활성이 보이지 않았다. S1S-2 균주의 생

장과 항균활성을 위한 최적 조건은 YPD 배지와 배양 온도

25°C로 확인하였다. 또한, 우리는 균주 배양액의 에틸아세테

이트 추출층에서 항균활성 후보물질을 분리하였고, ESI-MS, 1H-NMR과 13C-NMR 분석을 통하여 화학구조를 maculosin(1)

으로 동정하였다. 이 연구는 병원성 세균에 대해 항균활성을

보이는 새롭게 분리된 세균 Rouxiella sp. S1S-2에 대한 최초의

보고이다.

감사의 말

본 논문은 환경부의 재원으로 국립낙동강생물자원관의 지

원을 받아 수행하였습니다(NNIBR202002103).

References

Ayed A, Slama N, Mankai H, Bachkouel S, ElKahoui S, Tabbene O,

and Limam F. 2018. Streptomyces tunisialbus sp. nov., a novel

Streptomyces species with antimicrobial activity. Antonie van

Leeuwenhoek 111, 1571–1581.

Chen S, Zhang D, Chen M, Zhang Z, and Lian XY. 2020. A rare

diketopiperazine glycoside from marine-sourced Streptomyces

sp. ZZ446. Nat. Prod. Res. 34, 1046–1050.

Cho H, Choi Y, Suh H, Shin K, Lee H, Kwon H, and Kim S. 1993.

Identification of herbicidal antibiotic maculosins-producing

Streptomyces rochei 87015-3. J. Korean Agric. Chem. Soc. 36,

476–480.

Choi A, Nam YH, Baek K, and Chung EJ. 2019. Brevibacillus

antibioticus sp. nov., with a broad range of antibacterial activity,

isolated from soil in the Nakdong River. J. Microbiol. 57, 991–

996.

d'Errico G, Aloj V, Ventorino V, Bottiglieri A, Comite E, Ritieni A,

Marra R, Bolletti Censi S, Flematti GR, Pepe O, et al. 2020.

Methyl t-butyl ether-degrading bacteria for bioremediation and

biocontrol purposes. PLoS One 15, e0228936.

Felsenstein J. 1985. Confidence limits on phylogenies: an approach

using the bootstrap. Evolution 39, 783–791.

Fira D, Dimkić I, Berić T, Lozo J, and Stanković S. 2018. Biological

control of plant pathogens by Bacillus species. J. Biotechnol.

285, 44–55.

Hall TA. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment

editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic

Acids Symp. Ser. 41, 95–98.

Hwang HJ, Mun HY, Hwang BS, Nam YH, and Chung EJ. 2020.

Optimal culture conditions for Penicillium rubefaciens NNIBRFG

5039 possessing antimicrobial activity. Korean J. Mycol. 48, 1–

13.

Kügler JH, Muhle-Goll C, Hansen SH, Völp AR, Kirschhöfer F, Kühl

B, Brenner-Weiss G, Luy B, Syldatk C, and Hausmann R. 2015.

Glycolipids produced by Rouxiella sp. DSM 100043 and isolation

of the biosurfactants via foam-fractionation. AMB Expr. 5, 82.

Kumar S, Stecher G, and Tamura K. 2016. MEGA7: molecular

evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets.

Mol. Biol. Evol. 33, 1870–1874.

Le Flèche-Matéos A, Kügler JH, Hansen SH, Syldatk C, Hausmann R,

Lomprez F, Vandenbogaert M, Manuguerra JC, and Grimont

PAD. 2017. Rouxiella badensis sp. nov. and Rouxiella silvae sp.

nov. isolated from peat bog soil and emendation description of

the genus Rouxiella. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 67, 1255–1259.

Le Flèche-Matéos A, Levast M, Lomprez F, Arnoux Y, Andonian C,

Perraud M, Vincent V, Ar Gouilh M, Thiberge JM, Vandenbogaert

M, et al. 2015. Rouxiella chamberiensis gen. nov., sp. nov., a

member of the family Enterobacteriaceae isolated from parenteral

nutrition bags. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 65, 1812–1818.

Mehnza S, Saleem R, Yameen B, Pianet I, Schnakenburg G, Pietraszkiewicz

H, Valeriote F, Josten M, Sahl H, Franzblau S, et al. 2013.

Lahorenoic acids A-C, ortho-dialkyl-substituted aromatic acids

from the biocontrol strain Pseudomonas aurantiaca PB-St2. J.

Nat. Prod. 76, 136–141.

Nam YH, Choi A, and Chung EJ. 2020. Antibacterial activities of strain

Pantoea sp. S3W-11 and optimization of culture conditions.

KSBB J. 35, 73–80.

Nam YH, Choi A, Hwang BS, and Chung EJ. 2018. Antimicrobial

activities of Burkholderia sp. strains and optimization of culture

conditions. Korean J. Microbiol. 54, 428–435.

Saitou N and Nei M. 1987. The neighbor-joining method: a new method

Fig. 5. Macluosin (1). White powder; 1H NMR (500 MHz, methanol-d4)

δH 7.03 (d, 2H, J = 8.6, H-10, -10’), 6.69 (d, 2H, J = 8.6, H-11, -11’), 4.36

(m, 1H, H-1), 4.04 (m, 1H, H-3), 3.54 (m, 1H, H-7a), 3.35 (m, 1H, H-7b),

3.07 (dd, 1H, J = 14.2, 4.9, H-8a), 3.00 (dd, 1H, J = 14.2, 4.6, H-8b), 2.08

(m, 1H, H-5a), 1.79 (m, 1H, H-6), 1.20 (m, 1H, H-5b); 13C NMR (125

MHz, methanol-d4) δC 170.7 (C-4), 166.9 (C-2), 157.7 (C-12), 132.1

(C-10, -10’), 127.6 (C-9), 116.2 (C-11, -11’), 60.1 (C-3), 57.9 (C-1), 45.9

(C-7), 37.7 (C-8), 29.4 (C-5), 22.7 (C-6); LC-ESIMS [M - H]− m/z 259.1,

calcd for (C14H15N2O3) 259.1083.

Isolation and characterization of strain Rouxiella sp. producing antibacterial compound ∙ 159

Korean Journal of Microbiology, Vol. 56, No. 2

for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4, 406–

425.

Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, and Higgins

DG. 1997. The CLUSTAL_X Windows interface: flexible

strategies for multiple sequence alignment aided by quality

analysis tools. Nucleic Acids Res. 25, 4876–4882.

Wang Y, Hoffmann JP, Chou CW, Höner Zu Bentrup K, Fuselier JA,

Bitoun JP, Wimley WC, and Morici LA. 2020. Burkholderia

thailandensis outer membrane vesicles exert antimicrobial

activity against drug-resistant and competitor microbial species.

J. Microbiol. doi: 10.1007/s12275-020-0028-1.

Wattana-Amorn P, Charoenwongsa W, Williams C, Crump MP, and

Apichaisataienchote B. 2016. Antibacterial activity of cyclo

(L-Pro-L-Tyr) and cyclo(D-Pro-L-Tyr) from Streptomyces sp.

strain 22-4 against phytopathogenic bacteria. Nat. Prod. Res. 30,

1980–1983.

Yoon S, Ha S, Kwon S, Lim J, Kim Y, Seo H, and Chun J. 2017.

Introducing EzBioCloud: a taxonomically united database of

16S rRNA gene sequences and whole-genome assemblies. Int. J.

Syst. Evol. Microbiol. 67, 1613–1617.