Gli enzimi – strategie catalitiche
RIBONUCLEASI A (RNAsi) (E.C. 3.1.27.5)
(nucleasi = fosfodiesterasi)
His119
His12
Lys41
Un piccolo enzima digestivo che idrolizza RNA ma non DNA (utilizzato da Anfinsen per
i suoi studi sul ripiegamento spontaneo di proteine)
substratosito di legame
sito catalitico
acting on ester bonds
endoribonucleases producing 3'-phosphomonoesters
pancreatic ribonucleases
His119
(protonato)
His12
(deprotonato)
Lys41
++
+
HO
H
O P
O
O
O
O
3'
2'
5'
+-
-
+
OC OC
OC
H
5’
3’ 2’
Ribonucleasi - meccanismo d’azione
H
Glu35 Asp52
legame
-(1-4)glicosidico
sito di legame
LISOZIMA (E.C. 3.2.1.17)
(una glicosidasi)
(enzima protettivo)
glycosilase
glycosidase hydrolysing O- and S-glycosyl bond
lisozyme
-Nag-Nam-Nag-Nam-Nag-Nam-Nag-
Peptidoglicano batterico
Meccanismo d’azione del lisozima
sito catalitico
substrato transizione (TS) analogo stabile del TS
(inibitore)
HO
OOO
OO
OOO
H+
OOO
stato di
substrato
distorto
H
H2O
H H
Meccanismo proposto originalmente
Meccanismo SN2 Meccanismo SN1
Meccanismo alternativo
CHIMOTRIPSINA (EC: 3.4.21.1)
(serina proteasi, endo peptidasi)
(enzima digestivo)
Asp102
His57Ser195
acting on peptide bonds (peptidases)
serine endopeptidases
chymotripsin
triade catalitica
Meccanismo d’azione della chimotripsina
FASE DI ACILAZIONE
His57
tasca per il legame
specifico del substrato
triade catalitica
cavità
ossianionicasito di legame nella chimotripsina
la tasca è profonda
ed idrofobica, adatta
ad accettare un residuo
di fenilalanina
C
-O
NH
C
OSer195
NH
NH
Gly193
H
HN
N
C
O
O
Asp102
+
Ser195
C
R-C
O
His57
O–H
NH
NH
Gly193
C
HN
N
C
O
O
Asp102
R-C
FASE DI DEACILAZIONE
His57 His57
H
C
-O C
OSer195
N H
NH
Gly193
OH
HN
N
C
O
O
As
p102
+
C
O C
OSer195
R
|
C
NH
NH
Gly193
His57
HN
N
C
O
O
As
p102
H
O
H
CO
C
OHSer195
N H
NH
Gly193
OH
HN
N
C
O
O
Asp
102
Le serina proteasi tagliano il legame peptidico dopo specifici residui
Questa specificità deriva dalle caratteristiche delle tasche per il
riconoscimento specifico del substrato
Tripsina: dopo Arg o Lys
Chimotripsina: dopo Phe (Trp, Tyr, Leu, Met)
Elastasi: dopo Ala (Val > Ile, Leu, Ser)
Phe AlaArg/Lys
ela
sta
si
ch
imo
trip
sin
a
trip
sin
a
Asp
AA idrofobici
Penicillina - meccanismi d’azione e di resistenza
penicilline G e V
amoxicillina
H20
meccanismo di resistenza basato
sulla degradazione del antibiotico
PAPAINA
CATEPSINA (digestione intracellulare
di proteine)
Cisteina o tiol proteasi (EC: 3.4.22.2)
(endo peptidasi)
acting on peptide bonds (peptidases)
cysteine endopeptidasespapain
Acilazione
Deacilazione
Carbossipeptidasi A (EC: 3.4.17.1)
(metallo proteasi, esopeptidasi )(enzima digestivo)
stacca il residuoC-terminale
aromatico oalifatico grande
Glu72
His196
His69
Zn
basico
carbossipeptidasi A
carbossipeptidasi B
acting on peptide bonds (peptidases)
metallocarboxypeptidases
carboxypeptidase A
Meccanismo d’azione della carbossipeptidasi
C
HN
C
C
O
O
O
Zn++
OC
C
O
O-
H 2 O
+
H2N
C
O
HO
-
Ser197
Glu270
Glu72
His69His196
Asn144
C
HN
C
C
O
O
O
Zn++
+
H2N
CO
HO
-
Ser197
Glu270
Glu72
His69His196
Asn144
HO
C
O
OH
-OC
Proteasi di HIV-1 EC: 3.4.23.16
Asp A25 Asp B25
RNA DNA DNA GENOMICO POLIPEPTIDI PROTEINE
virale virale virali virali
Proteasi
virale
trascrittasi
inversa virale
Integrasi
viraleEnzimi
cellulari
(aspartico proteasi virale, endopeptidasi) aspartic endopeptidases
acting on peptide bonds (peptidases)
HIV-1 retropepsin
Meccanismo d’azione
dell’aspartico proteasi
di HIV
H H\/O
H2O
HNN
OHO
-
O OO O H
OH
HNN
OO
-O O
O OH
HO
H
HNOH
-O O
O OH
N
O
H
O
(stato di transizione = gem diolo)
-NH- -NH-
P1 spesso è Phe
P1’ spesso è Pro
P2’ spesso è Glu
Meccanismi d’azione a confronto
serina proteasi cisteina proteasi
aspartico proteasi metallo proteasi
statina ammide ridotto
monoidrossietilenediidrossietilene
Isosteri del legame peptidico
Inibitori della HIV proteasi - esempi
Lopinavir (ABT-378)
Saquinavir (1995) Ritonavir (1996) Indinavir (1996) Nelfinavir (1997)
Amprenavir (1999) Fosamprenavir (2003) Tipranavir (2005)
La progettazione di inibitori di proteasi si basa sulle caratteristiche
1) del sito di legame ( P3-P2-P1-P1’-P2’-P3’ )
2) del meccanismo d’azione ( Asp— COOH / Asp—COO -)
3) dello stato di transizione ( gemdiolo )
TS analogo del TS
HN
HO
HN
HO
HNN
OOH
HN
HN
HO
idrossietilene
2) Criteri per la progettazione di inibitori come farmaci
- ADME (Assorbimento, Distribuzione, Metabolismo, Eliminazione)
- Lipinski’s rule of five (RO5) 1) non più di 5 proton donatori (OH e/o NH)2) non più di 10 proton accettori (N e/o O)3) MW nel intervallo 500 - 600 Da 4) Coefficiente di partizione (logPo/w) > 5
3) STRATEGIE per identificare nuovi inibitori:
- metodi basati sul substrato - utile quando non si conosce meccanismo e struttura
- High Troughput Screening - saggi rapidi e robotizzati su larga scala
- Metodi CADD (Computer Aided Drug Design) - progettazione basata sulla struttura
- Librerie molecolari - sintesi combinatoriale/parallela di molte varianti
1) Criteri per la progettazione di inibitori
- Sostituire il legame peptidico idrolizzato con un isostere non-idrolizzabile
- Modellare la struttura dell’isostere su quella dello stato di transizione
- Ridurre le dimensioni ( < 600 Da) } aumentare la biodisponibilità
- Ridurre la natura peptidica
octanol
water
[I]o
Po/w = [I]w
TIPI DI COENZIMA
+ S - P
ADP + Pi ATP
E2
• Un catalizzatore partecipa nella reazione ma non ne viene modificato
• È presente a concentrazioni anche molto inferiori a quelle del substrato
• Il cosubstrato invece deve avere una concentrazione almeno uguale a quella del substrato
• Viene ricostituito ad opera di un altro enzima
Coenzimastechiometrico
Coenzimacatalitico
-OH
CE1
E1 ADPCE1 + S PS
ATP
-OH
CE1
antiossidante lipidi animali e vegetali-tocoferoloE (tocoferolo)
pro-ormone " e produzione endogenaergo- e colecalciferoloD (calciferolo)
coagulazione lipidi animali e vegetalifillo- e menachinoneK(naftochinone)
visione, crescita lipidi animali e vegetalitrans-retinaleA (retinolo)
funzioneforma attivaVitamina
riduzione FeIII verdura, frutta acido ascorbicoC
unità monoC verdure, succhi, lenticchietetraidrofolatofolato
H, alchilici carne, pesce, pollame, lattic. cobalamminaB12
CO2 legumi, cereali, latte, lievitobiocitinabiotina
amminici carne, veg., uova, latticini piridossal fosfatoB6
aldeidi carne, veg., tiammina pirofosfatoB1
Acili carne, spinacilipoammideacido lipoico
acili tutti i cibi naturali coenzima A (CoA)B5 (acido pantotenico)
1 o 2 e- latte, uova, verd., fegatoFADH2, FMNH2B2 (riboflavina)
2e- (H-) carne, veg., uova, lattic. NADH, NADPHB3 (niacina)
gruppi trasportati/ fonti
modificatiVitamina coenzima
Vitamine idrosolubili trasportatori attivati
Fonti: http://njms.umdnj.edu/biochemistry/education/bioweb/EnzymeCofactors.htmhttp://web.indstate.edu/thcme/mwking/vitamins.html
Vitamine e Coenzimi – trasportatori attivati
Vitamine liposolubili altri ruoli
tiammina pirofosfato
piridossalfosfato
acido lipoico
biotina
CoCN
dimetilimidazolo
retinolo
cianocobalamina
acido folico
ascorbato
CH3
-
deidrocolesterolovitamina D3
luce UV
nella pelle:
nella piante:luce UV
ergosterolo vitamina D2
vitamina E vitamina K1
Il PLP è un coenzima molto versatile che partecipa a diverse reazioni
enzimatiche che spesso coinvolgono amino acidi:
• transaminazioni • - e -decarbossilazioni • -eliminazioni
• racemizzazioni • reazioni aldol
-chetoacido
NH2 C COO-
R´
H
+ R C
O
COO- C COO-O R C
NH2
COO-
H
+
amminoacido
R´
Transaminazione
-chetoacido amminoacido
La funzione del PLP è di
1) formare basi di Schiff (aldimine) stabili con gli -ammino gruppi degli AA
2) agire da trappola di elettroni per stabilizzare gli intermedi della reazione
Coenzimi – il piridossalfosfato
NH2
E (sito attivo)CHO
C H2PO4OH=
+
PLP
aminotrasferasi
Lys
=
E
Base di Schiff
N
C H
CH2PO4
C H3
OH
N
N
C H
CH3
OH
N
E
+
N
CH
CH2PO4
CH3
OH=
NH2
piridossammina fosfato
(PMP)
E-Lys-PLP
Intermedio aldimmina(resta legato all’enzima mediante
legami non-covalenti)
2
+
N
C H
C H2PO4
C H3
OH=
CH
N
R
COO -
+
H
N CH3
CR H
COO-
O
+
( -chetoacido, CA1)
H
+ AA1
- Lys
+ H2O - H+
H2O
CA1
AA1
H+
(l’amminoacido
sostituisce Lys
nel sito attivo )
(viceversa)
Meccanismo d’azione del piridossal fosfato
- H2O + H+
+ PMP
H2O H+
CA2
AA2
- AA2
+ LysCR’ H
COO-
O
CHR
COO -
acetaldeide
acetolattato
decarbossilazione condensazione
TPP è un coenzima spesso coinvolto in reazioni del metabolismo dei
carboidrati in cui vengono sintetizzati o scissi legami con atomi di
carbonio carbonilico (aldeidi o chetoni).
Coenzimi – la tiammina pirofosfato
