Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Agatina Alessandrello Liotta

AOU Careggi- FirenzeSOD Malattie Aterotrombotiche CRR per lo Studio della Trombosi

Lupus anticoagulantLupus anticoagulant

Famiglia eterogenea di immunoglobuline di tipo IgG, IgM, IgA

In vitro provocano allungamento dei test fosfolipide dipendenti

Nel nostro organismo sono responsabili di trombosi arteriose e/o venose, di aborti ripetuti, morti fetali

NUOVA DEFINIZIONE DI SINDROME DA aPL NUOVA DEFINIZIONE DI SINDROME DA aPL Criteri di laboratorioCriteri di laboratorio

(Miyakis S et al, J Thromb Haemost 2006, 4:295(Miyakis S et al, J Thromb Haemost 2006, 4:295--306)306)

Presenza di LAC, determinato secondo le linee guida proposte da SSC

e/o

Medio/alto titolo di anticorpi anticardiolipina 2 glicoproteina I dipendenti (IgG e/o IgM), misurati con tecnica ELISA standardizzata

Conferma in 2 o pi occasioni ad almeno 12 settimane di distanza

Intrinsic Pathway Extrinsic PathwayVascular Injury

HMWK Surface HMWK

Tissue Factor

(TF)

FVIITF-FVII

FXaThrombinF VIIaF IXa

Ca++ PLTF-FVIIa

Ca++

F XII

F IXF IXa

F XF Xa

F XI PK

KallikreinF XIIa

F IX

F XIa

F X

F VIIIaCa++ PL

F VIIICa++ PL

Prothrombin Thrombin

F VaCa++ PL

F V

F Xa Ca++ PL

F XIII

F XIIIa

Ca++

Fibrin

Fibrinogen FibrinCross-linked

FibrinCentro Trombosi, Firenze

Antigeni degli aPLAntigeni degli aPL

Centro Trombosi, Firenze

Beta2 glicoproteina 1

Protrombina

Proteina C (attivata)

Proteina S

Trombomodulina

Annessina V

Attivatore tissutale del plasminogeno

Chininogeni a basso ed a alto peso molecolare

Fattore XII

Lipoproteine abassa densit ossidate (ox-LDL)

Beta2 glicoproteina 1

Protrombina

Proteina C (attivata)

Proteina S

Trombomodulina

Annessina V

Attivatore tissutale del plasminogeno

Chininogeni a basso ed a alto peso molecolare

Fattore XII

Lipoproteine a bassa densit ossidate (ox-LDL)

CRITERI PER LA DIAGNOSI

DI LUPUS ANTICOAGULANT

PROPOSTI DAI SSC (1995)

Prolungamento di 1 o pi test di screening PL dipendenti (aPTT, KCT, dRVVT, dPT o TTI)

Studi di mixing (1:1) per dimostrare la presenza di un inibitore ed escludere eventuali carenze di fattori

Test di conferma per dimostrare che linibitore diretto contro i PL

Esclusione di altre coagulopatie (es. inibitore del fattore VIII o presenza di eparina)

DIAGNOSTICA DEL LAC DIAGNOSTICA DEL LAC aPTTaPTT

Un aPTT di routine nei limiti della norma, non sufficiente per

escludere la presenza del LAC

I reagenti contengono fosfolipidi piuttosto

concentrati, quindi laPTT pu essere normale nei

pazienti con LAC medio/debole

Un aumento del fibrinogeno o fattore VIII (fase

acuta, gravidanza) pu accorciare laPTT e

mascherare la presenza di un LAC debole

Possono per essere utilizzati reagenti diluiti

0,5

1

1,5

2

2,5

3

A B C D

AP

TT

Rati

o

PTT LA Roche

(n=21)

Actin FSL Dade

(n=6)

Pathromtin SL Dade

(n=8)

Synthasil IL (n=5)

APTT LT Roche

(n=6)

APTT SP IL (n=9)

KPTT Stago (n=5)

Plasmas

APTT ResponsivenessTripodi et al, Clin Chem 2003

Semin Thromb Hemost 2012

aPTTaPTT REAGENT

Kershaw G

DIAGNOSTICA DEL LACDIAGNOSTICA DEL LACKaolinKaolin e e SilicaSilica ClottingClotting TimeTime (KCT, SCT)(KCT, SCT)

Non contengono PL

Sono molto sensibili

Molto influenzati dalla presenza di piastrine residue

Specificit ridotta dalla presenza di carenza di fattori

Il SCT una modificazione del KCT che ne consente limpiego su tutti gli strumenti

DIAGNOSTICA DEL LACDIAGNOSTICA DEL LACdRVVTdRVVT

Il veleno di vipera Russell attiva il fattore X in presenza di ioni Ca, FV,e PL.

Esistono molti reagenti commerciali che sono per molto diversi per sensibilit e specificit

Molti kit commerciali forniscono anche un reagente di conferma (fosfolipidi concentrati)

0,5

1

1,5

2

2,5

A B C D

dR

VV

T R

ati

o

Am. Diagnostica(n=23)

LAC Screen IL(n=27)

LA1 Dade (n=17)

Plasmas

dRVVT ResponsivenessTripodi et al, Clin Chem 2003

DIAGNOSTICA DEL LACDIAGNOSTICA DEL LACTissue Thromboplastin Inhbition Test ( Tissue Thromboplastin Inhbition Test ( TTI)TTI)

Il PT generalmente normale in soggetti con LAC (la tromboplastina contiene elevate concentrazioni di PL)

Se per il reagente diluito, la concentrazione dei PL pu diventare fattore limitante

Il TTI viene in genere eseguito con due o pi diluizioni di tromboplastina

Alcune tromboplastine ricombinanti sono particolarmente sensibili al LAC (Innovin, Dade Behring)

MODALITA DI ESPRESSIONE

DEI RISULTATI

- SECONDI

- RATIO R = SEC Tempo di coagulazione campione

SEC Tempo di coagulazione pool

plasmi normali

TEST DI SCREENING

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

I risultati sono considerati positivi

quando i tempi di coagulazione sono

pi lunghi o la Ratio maggiore del

valore Cut-off stabilito per il test e

calcolato al 99 percentile della

distribuzione normale ( SSC 2009)

TEST DI SCREENING

Possibili cause dellallungamento

del tempo del campione in esame

Carenza fattoriale o presenza di terapia farmacologica interferente

(eparina , warfarin)

Inibitore di tipo anticorpale:Lupus anticoagulante

Inibitore specifico

STEP I: TEMPO DEL CAMPIONE

Studi di mixing

2.4

2.0

1.6

1.2

0.8

P P+N

Cut-off

Ripetere il test sulla

miscela:

plasma del paziente e

plasma di un pool di

soggetti sani in rapporto

1:1

(La miscela comunemente non

incubata a 37C)

dR

VV

T (

rati

o)

INIBITORE

Carenza fattoriale

Carenza fattoriale Centro Trombosi Fi

TEST DI MIXING

MODALITA DI ESPRESSIONE DEI RISULTATI

RATIO SEC Tempo di coagulazione miscela (paziente/pool plasmi normali V/V)

R =

SEC Tempo di coagulazione pool plasmi normali

ICA % = (sec tempo di miscela-sec tempo pool normale) x 100sec tempo del paziente

ICA = (Indice di anticoagulante circolante)

TEST DI MIXING:

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

Risultati sono suggestivi per la presenza

di LAC quando ratio o ICA maggiori

del valore Cut-off stabilito per il Test e

calcolato al 99 percentile della

distribuzione normale

Cause dellallungamento del Cause dellallungamento del tempo della miscela in esametempo della miscela in esame

Inibitore di tipo anticorpaleInibitore di tipo anticorpale

Lupus anticoagulante

Inibitore specifico

Eparina?Eparina?

STEP II: TEMPO DELLA MISCELA

STEP III: TEST DI CONFERMA

Tempo di coagulazione in presenza di fosfolipidi in eccesso:

PNPTriplett, Am J Clin Pathol, 1983

Fosfolipidi in fase esagonaleRauch, Thromb Haemost, 1989

Triplett, Thromb Haemost, 1993

(Questo tipo di conformazione rende i PL pi disponibili a legare il LA : maggiore specificit)

valore assoluto - delta - ratio

Test di conferma

2.4

2.0

1.6

1.2

0.8

P P+fosfolipidi

Cut-offdR

VV

T (

rati

o)

Centro Trombosi Fi

TEST DI CONFERMATEST DI CONFERMAFALSI POSITIVIFALSI POSITIVI

LISATILISATI PIASTRINICIPIASTRINICI

Eparina Eparina

Inibitori del fattore VInibitori del fattore V

a basso titoloa basso titolo

(rilascio di fattore V dai granuli (rilascio di fattore V dai granuli piastrinici)piastrinici)

FOSFOLIPIDI ESAGONALIFOSFOLIPIDI ESAGONALI

Inibitori del fattore VIIIInibitori del fattore VIII

Centro Trombosi Fi

ANAMNESI POSITIVA PER SOSPETTA DIATESI EMORRAGICAANAMNESI POSITIVA PER SOSPETTA DIATESI EMORRAGICA

AntiAnti--fattore VIII, II, IX, X, XIfattore VIII, II, IX, X, XI

AntiAnti--fibrinogeno/fibrinafibrinogeno/fibrina

Anticoagulanti eparinoAnticoagulanti eparino--similisimili

AntiAnti--fattore Vfattore V

ANAMNESI POSITIVA PER EVENTI TROMBOTICIANAMNESI POSITIVA PER EVENTI TROMBOTICI

Lupus Anticoagulant Lupus Anticoagulant

AntiAnti--fattore XIIfattore XII

Centro Trombosi Fi

DIAGNOSI DIFFERENZIALE PER LA PRESENZA DI DIAGNOSI DIFFERENZIALE PER LA PRESENZA DI INIBITORI DELLA COAGULAZIONEINIBITORI DELLA COAGULAZIONE

DOSAGGIO DEI FATTORIDOSAGGIO DEI FATTORI

RIDUZIONERIDUZIONE MARCATAMARCATA DELDEL

SINGOLOSINGOLO FATTOREFATTORE

CHECHE NONNON SISI MODIFICAMODIFICA CONCON

LALA DILUIZIONEDILUIZIONE DELDEL CAMPIONECAMPIONE

INIBITORE SPECIFICOINIBITORE SPECIFICO

RIDUZIONERIDUZIONE APPARENTEAPPARENTE DIDI

PIUPIU FATTORIFATTORI

CHECHE SISI NORMALIZZANORMALIZZA CONCON

LALA DILUIZIONEDILUIZIONE DELDEL CAMPIONECAMPIONE

INIBITORE INIBITORE DIDI TIPO : TIPO : LUPUSLUPUS

J Thromb Haemost 2009

SCELTA DEI TEST

Lutilizzo di pi di due test fosfolipide dipendenti aumenta il rischio di risultati falsamente positivi

I due test devono basarsi su principi diversi I test raccomandati sono : dRVVT, SCT

aP

TT

SC

T

dR

VV

T

dR

VV

T/S

CT

dR

VV

T/a

PT

T

aP

TT

SC

T

dR

VV

T

dR

VV

T/S

CT

dR

VV

T/a

PT

T

SC

STANDARDIZZAZIONE STANDARDIZZAZIONE DELLA FASE PREANALITICADELLA FASE PREANALITICA

-- PRELIEVOPRELIEVO -- Tipo : venosoTipo : venoso-- Sede : vena cubitale della piega del gomitoSede : vena cubitale della piega del gomito-- Evitare laccio emostatico o ridurne la presenza, la

stasi ematica provoca:variazioni di pH ed aumenti della CO2 con perdita del fattore V; danno tissutale con conseguente liberazione di fattore tissutale e attivazione del fattore VII

-- TRATTAMENTO DELTRATTAMENTO DELCAMPIONE DI SANGUECAMPIONE DI SANGUE -- Centrifugazione a 2800 gCentrifugazione a 2800 g

per 15 minuti a temp. per 15 minuti a temp. ambienteambiente

-- Separazione del plasmaSeparazione del plasma-- 22 centrifugazione a centrifugazione a

12000 rpm per 312000 rpm per 3--5 minuti5 minuti* E importante ridurre le * E importante ridurre le

piastrine piastrine al di sotto di 1x10al di sotto di 1x10 99/L/L

-- CONSERVAZIONECONSERVAZIONE -- Congelamento rapido e Congelamento rapido e conservazione a conservazione a --8080 CC

CARATTERISTICHE DEL POOL di PLASMA CARATTERISTICHE DEL POOL di PLASMA NORMALE PER I TEST NORMALE PER I TEST DIDI MISCELAZIONEMISCELAZIONE

* * PRIVO PRIVO DIDI PIASTRINEPIASTRINE

* NORMALE CONTENUTO * NORMALE CONTENUTO DIDI TUTTI I FATTORI DELLA TUTTI I FATTORI DELLA COAGULAZIONECOAGULAZIONE

* NORMALE CONTENUTO * NORMALE CONTENUTO DIDI FIBRINOGENO FIBRINOGENO ( per escludere processi infiammatori o infettivi in atto)( per escludere processi infiammatori o infettivi in atto)

IL POOL IL POOL DIDI PLASMA NORMALE DEVE ESSERE PLASMA NORMALE DEVE ESSERE CONGELATO RAPIDAMENTE E CONSERVATO A CONGELATO RAPIDAMENTE E CONSERVATO A --7070 CC

Centro Trombosi Fi

SOSPETTO SOSPETTO DIDI EPARINA NEL EPARINA NEL CAMPIONECAMPIONE

PrimaPrima didi eseguireeseguire testtest didi miscelazionemiscelazione ee didiconferma,conferma, procedureprocedure lunghelunghe ee costosecostose

ESEGUIRE TEST TEMPO ESEGUIRE TEST TEMPO DIDI TROMBINATROMBINA

Effect of Lupus Anticoagulant and Anticoagulant

Therapies on commonly used clinical laboratories

assays

Ortel TL, 2012, mod

LAC nei Pazienti anticoagulati

Terapia eparinica: neutralizzare leparina con sostanze

antiepariniche(polibrene o eparinasi) oppure mediante luso

di una resina (ecteola) che mescolata al plasma, dopo

idonea incubazione, capace di adsorbire leparina

Anticoagulanti orali:

Esecuzione dei test previa miscela del plasma del paziente

con plasma normale (v/v);

Esecuzione del test di conferma a due diverse concentrazioni

di fosfolipidi, senza preventiva miscelazione con plasma

normale. Lentit della correzione rispetto ai valori di base del

test consente di effettuare la diagnosi (Tripodi A et al )

LAC e Sospensione terapia

anticoagulante

VKA: 1-2 settimane dalla sospensione della terapia

o quando INR < 1.5

LMWH: leffetto dipende dal tipo di eparina

utilizzata, dal momento in cui viene

eseguito il prelievo

attendere almeno 12 h

dallultima somministrazione

0

0.5

1.0

1.5

1.16

No

rmalized

Rati

o

2.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

SILICA CLOTTING TIMESILICA CLOTTING TIMEbefore surgery

5 days after surgery, 2-

3 hours of rivaroxaban

administration

PatientsAlessandrello Liotta A.

0

0.5

1.0

1.5

2.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

1.26

Rati

o

2.5

3.0

Patients

DILUTED RUSSELL VIPER VENOM TESTbefore surgery 5 days after surgery ,2-3 hours of rivaroxaban

administration

Alessandrello Liotta A.

DILUTED RUSSELL VENOM VIPER: DILUTED RUSSELL VENOM VIPER: mixing normal plasma (V/V) test five days after surgery

0

0.5

1.0

1.5

2.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 15 16 18

1.21Rati

o

2.5

Patients on RivaroxabanAlessandrello Liotta A.

DILUTED RUSSELL VIPER VENOM TEST: DILUTED RUSSELL VIPER VENOM TEST: Confirm Test five days after surgery

0

0.5

1.0

1.5

2.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 15 16 18

1.21Rati

o

2.5

Patients on RivaroxabanAlessandrello Liotta A.

STACLOT LA test by usinghexagonal phospholipids

After DRVVT confirmation test (byadding phospholipids) 6 patients werepositive at LA testing, in the other 10patients the DRVVT confirmation was stillprolonged. For this reason, we performedSTACLOT LA test by using hexagonalphospholipids and LA was not confirmed.

Test Integrati per la rilevazione del

LUPUS ANTICOAGULANT

Modalit di espressione dei risultati:

% Correzione =

[(Screening ratio-Confirmation ratio)/Screening

ratio] x 100

Ratio Normalizzata (TR)=

Screening Ratio/ Confirmation Ratio

To Mix or Not To Mix in Lupus Anticoagulant Testing ?

That is the Question

Armando Tripodi

Seminars Thrombosis and Hemostasis, 2012 ; 38: 385-389

Lupus Anticoagulant: I test integrati

Lupus Anticoagulant: I test integrati

Lesperienza del Centro Trombosi- Firenze

Test mix effettuati su campioni negativi: 127Allungamento del tempo di miscela: 0

Lallungamento del tempo di miscela stato rilevato su un solo caso positivo

N.M.

DRVVT S sec.47,2 R=1,51 SCT S sec 60,3 R=1,61

DRVVT C sec.29,7 R= 0,98 TR= 1,55 SCT-C sec 26,4 R= 0,86 TR= 1.88

DRVVT Mix sec. 47.2 R= 1,51 SCT-Mix sec 84,2 R = 2,21 TR =2,56

[DRVVT cut-off TR< 1.12] [SCT cut-off TR< 1.16]

Da fare

aPTT allungato.?

Test Integrati

LAC Presente LAC assente

Test di Miscelazione v/v

dRVVT S R= 1.49 (cut off R

Nuova definizione di Sindrome da Nuova definizione di Sindrome da aPLaPL(Miyakis S et al, J Thromb Haemost 2006, 4:295(Miyakis S et al, J Thromb Haemost 2006, 4:295--306)306)

CRITERI DI LABORATORIOCRITERI DI LABORATORIO

LupusLupus anticoagulantanticoagulant determinatodeterminato inin basebase aa quantoquanto stabilitostabilito nellenellelineelinee guidaguida proposteproposte daldal SSC,SSC, positivopositivo inin 22 oo pipi occasionioccasioni adadalmenoalmeno 1212 settimanesettimane didi distanzadistanza..

AnticorpiAnticorpi anticardiolipinaanticardiolipina--22 glicoproteinaglicoproteina II dipendentidipendentiqualificatiqualificati concon tecnicatecnica ELISAELISA standardizzata,standardizzata, didi classeclasse IgGIgG e/oe/oIgM,IgM, presentipresenti aa mediomedio oo altoalto titolotitolo inin 22 oo pipi occasionioccasioni aa distanzadistanzadidi almenoalmeno 1212 settimanesettimane..

Centro Trombosi Fi

Schouwers Thrombosis Research 2010

Lupus AnticoagulantAppropriatezza della richiesta

Alta: -Tromboembolismo venoso spontaneo

-Tromboembolismo arterioso inspiegabile in pz. et

REFERTOREFERTO

Risultati analitici accompagnati da un commentosulla loro compatibilit con la presenza o meno dilupus anticoagulant

Per i casi positivi alla prima determinazioneconsigliare di ripetere il test dopo almeno 12settimane