UNIVERSIDAD DE COLIMA
MAESTRÍA EN CIENCIAS: Área Biotecnología
INTERACCION DE PLANTAS DE CAFÉ FERTILIZADAS CONFÓSFOR0 E INOCULADAS CON HONGOS MICORRiZICO
ARBUSCULARES Y Phoma costarricencis Echandi
que para obtener el grado de
Maestro en Ciencias Área Biotecnología
Presenta
MIGUEL ANGEL ESCALONA AGUILAR
ASESORES.
DR. JAVIER FARIAS LARIOS
M.C. DORA TREJO AGUILAR
Tecoman, Col. Junio 2002
Tesis
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
OFICIO No. 117/2002.
C. MIGUEL ANGEL ESCALONA AGUILAREGRESADO DE LA m a e s t r i a EN CIENCIASAREA: BIOTECNOLOGIAP R E S E N T E .
Con fundamento en el dictamen emitido por EL jurado revisor del colegiado del area: deBiotecnologia de esta Facultad a MI cargo, de su trabajo de tesis de Maestría y en virtud de queEFECTUÓ las correcciones y acato LAS sugerencias que LE habian indicado losintegrantes delmismo, se le autoriza la impresión de la tesis “INTERACCION DE PLANTAS DE CAFÉFERTILIZADAS CON FOSFORO E INOCULADAS CON HONGOS MICORRIZICOSARBUSCULARES Y Phoma costarricencis Echandi”, misma que ha sido dirigida por losC.C. Dr. Javier Farias Larios y M.C. Dora Trejo Aguilar, Profesor-Investigador de la Facultadde Ciencias Biologicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima y Profesor-Investigadorde la Universidad Veracruzana, respectivamente.
Este documento reunió todas las caracteristicas apropiadas como requisito parcial paraobtener el grado de Maestro en Ciencias; Area: Biotecnologia y fue revisado en cuanto a formay contenido por, los C.C. Dra. Maria del Rocio Flores Bello Dr. Oscar Rebolledo Dominguez yel Dr. Sergio Aguilar Espinosa, Profesores-Investigadores de la Facultad de MedicinaVeterinaria y Zootecnia y de la Facultad de Ciencias Biologicas y Agropecuarias de laUniversidad de Colima, respectivamente.
Sin otro particular de momento, reciba un cordial saludo.
A T E N T A M E N T E“ESTUDIA * LUCHA * TRABAJA”
TECOMÁN, COL., A 05 DE MARZO DEL 2002.
RODOLFO VALENTINO MORENTÍN DELGADO
- Km4OAutopista Colima-Manzanillo, Tecomán, Colima, Mexico, Cp 28100Tels (3) 324 42 37, 324 46 42 l [email protected]
C.C.P. EXPEDIENTE ACADEMIC0 DEL ALUMNOC.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.C.C.P. ARCHIVO.RVMD/Lety**
Of. No. I 17/2002.
UNIVERSIDAD DE COLIMA
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Veracruzana, por su gran apoyo en pro del mejoramiento
académico de su personal.
Al C. M.V.Z. Jose Siliceo Romero que en su administración como Director
General del Area Biológico Agropecuaria, lucho porque muchos
profesores contaran con las facilidades para realizar estudios de posgrado.
A la Dirección General de Apoyo Académico, por todas las gestiones y ayuda
para realizar los estudios de posgrado sin sobresaltos y con soporte
financiero suficiente.
Al Programa de Mejoramiento al Profesorado (PROMEP), por la subvención
financiera para la realización del posgrado.
A la Universidad de Colima, en particular a la Facultad de Ciencias Biológicas y
Agropecuarias por la formación academica que recibi y por los atinados
consejos de sus profesores.
Al Dr. Javier Farias Larios, director de tesis, por todo lo que me enseño, su
apoyo permitió la finalización de este documento.
A la M.C. Dora Trejo Aguilar, asesora de tesis, compañeros de trabajo y por
mucho tiempo miembros del mismo equipo de investigación.
A 1os doctores Maria del Roció Flores Bello, Sergio Aguilar Espinosa y OscarRebolledo Dominguez revisores de tesis, gracias porque en sus
observaciones encontre muchas enseñanzas.
A mis amigos y compañeros de trabajo Ing. Luis Guillermo Hernández Montiel,
M.C. Marycruz Abato Zarate, M.C. Ramón Zulueta Rodriguez, Ing.Liliana Lara Capistrán e Ing. José Quinto Carreón, que sin su avuda esta
investigación no se hubiese concluido.
DEDICATORIAS.
A mi hermosa mujer Nadia, porque siempre esta a mi lado, con sus consejos y
amor es más facil salir adelante.
A mis increibles hijos Fabian y Miguelito, porque con sus sonrisas y caricias mellenan la vida y me recuerdan lo maravilloso que es el amor.
A mis tios Juan Carlos y Guadalupe del Socorro gracias por sus ejemplos de vida
y de lucha diaria y sobretodo por siempre creer en mi.
A mis amigos de toda la vida, Maria Celia Gómez Roldan, Gabriel May Mora,Ana Isabel Suárez Guerrero, Andrés Rivera Fernandez y Dario Polanco
Medina, porque siempre han estado ahí acompañandome y permitiendomecompartir parte de lo yo soy.
ÍNDICE
RESUMEN ............................................................................................................................. 1ABSTRACT ............................................................................................................................ 2I. INTRODUCCIÓN............................................................................................................................................................................... 3II. REVISIÓN DE LITERATURA ....................................................................................................................................... 72.1. Importancia del cultivo del cafe (Coffea arabica L.) ............................................................................... 72.2. Problematica del cultivo del cafe ............................................................... ...................................... 82.3. El requemo de las hojas del cafe (Phoma costarricencis Echandi) ........................................................... 8
2.4. La micorriza arbuscular y el cultivo del cafe (Coffe arabica L. ) ................................ 11
2.5. El fósforo en la planta.................................................................................. 13
2.6. La función de la micorriza en el ingreso del fósforo hacia la planta ..................... 16
2.7. Mecanismos de protección de los hongos micorrizicos .................................................. 21
2.8. Influencia de la nutrición en el control biológico ..............................................
2.9. Cambios en los componentes bioquimicos relacionados con la respuesta
de resistencia de la planta ..................................................................................... 26
2.10. Los hongos micorrizicos como agentes protectores de enfermedades ...............
2.11. La micorriza y su efecto en enfermedades foliares ..........................................
III. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................... 34
3.1. Desarrollo de plantulas de cafe (Coffea arabica L.) var. Typica conmicorriza yfertilizadas sin diferencias en el crecimiento .....................................
3.1.1. Preparación del semillero de cafe (Coffea arabica L.) var.
Typica ...............................................................................................
3.1.2. Hongos micorrizicos arbusculares utilizados en el experimento
3.1.3. Trasplante de las plantulas de cafe (Coffea arabica L.) e
inoculación de los HMA .................................................................. 34
3.1.4. Arreglo de los tratamientos y diseño experimental ....................................
3.1.5. Par+ámetros evaluados ................................................................................................3.1.5.1. Parametros d e crecimiento ..................................................................3 . 1.5.2. Producción de biomasa y area foliar ...................................
3.1.5.3. Evaluación de la severidad de Phoma costarricensis
2 5
3 0
3 2
3 4
3 4
3 4
3 5
3 63 63 6
Echandi ...........................................................................................................
3.1.5.4. Estimación de1 porciento de colonización ............................
3 6
3 7
3.2. Crecimiento vegetativo y severidad de Phoma costarricensis Echandien plantas de cafe inoculadas con HMA y/o fertilizadas con fósforocrecidas en vivero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......................... . . . . . .
3.2.1. Preparación del semillero d e cafe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......................... . . . . . .3.2.2. Hongos micorrizicos arbusculares utilizados en el experiment03.2.3. Trasplante de las plantulas de cafe e inoculación de HMA.....
3.2.4. Arreglo de los tratamientos y diseño experimental . . . . . . . . . . . . .........................
3.2.5. Parametros evaluados ..............................................................................................3.2.5.1. Parametros d e crecimiento . . . . . ‘ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3.2.5.2. Producción de biomasa y area foliar . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . .3.2.5.3. Evaluación de la severidad de la enfermedad . . . . . . ........................3.2.5.4. Estimación del porciento de colonización . . . . . . . . . . . ......................
3.3. Influencia de la inoculación controlada de Phoma costarricensis Echandien el crecimiento vegetativo y patron de regulación de intercambiogaseoso de plantas de cafe inoculadas con HMA o fertilizadascon fósforo . . . . . . . . . . . . . . . . ........................................................ . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.1. Producción de inóculo de Phoma costarricesis Echandi . . . . . ....................3.3.2. Verificación de sintomas y evaluation del número de conidios
para promover el daño de Phoma costarricensis Echandi.en plantulas de cafe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......................... . . . . . . . .
3.3.3. Crecimiento de plantas de cafe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.3.4. Inoculación con HMA y fertilización con fósforo en plantulas
3 73 83 83 8
3 9
3 93 93 94 04 0
404 0
4 1
de cafe . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .................. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .........................................
3.3.5. Inoculación de Phoma costarricensis Echandi. en plantulasde cafe inoculadas con HMA y fertilizadas con fósforo . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .
3.3.6. Parametros evaluados . . . . . . . ..................................................
3.3.6.1. Parametros de crecimiento y colonización de HMA.
3.3 .6.2 Evaluación de la severidad de la enfermedad . . . . . . . . . . . . . .
3.3.6.3. Patron de regulación de intercambio gaseoso de
plantas de cafe (Coffea arabica L.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
IV. RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .
4.1. Desarrollo de plantulas de cafe var. Typica con hongos micorrizicosy fertilizadas sin diferencias en su crecimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.1. Parametros de crecimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... . . . . . . . . . . . . . . . . ...........
4.1.2. Producción de biomasa, area foliar y porciento decolonización MA de plantulas de cafe crecidas eninvernadero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4 2
4 24 3
4 3
4 4
44
45
4545
48
4.1.3. Evaluación de la severidad de Phoma costarricensisEchandi en plantas de cafe inoculadas con HMA y/ofertilizadas crecidas en invernadero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 48
4.2. Crecimiento vegetativo y severidad de Phoma costarricensis Echandien plantas de cafe inoculadas con MMA y/o fertilizadas con fósforocrecidas en vivero . . . . . . . . . ......................................... . . . . . . . . . . . .................................. 50
4.2.1. Parametros de crecimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . 50
4.2.2. Producción de biomasa, area foliar y porciento decolonización de plantas de cafe crecidas en vivero . . . . . . . . . . . . . . . 5 2
4.2.3. Evaluación de la severidad de Phoma costarricensis Echandien plantas de cafe crecidas en vivero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.3. Influencia de la inoculación controlada de Phoma costarricensisEchandi en el crecimiento vegetativo y en el patron de regulación deintercambio gaseoso de plantas de cafe inoculadas con HMA ofertilizadas con fósforo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.3.1. Número de conidios suficiente para provocan lossintomas de Phoma costarricencies Echandi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.3.2. Parametros de crecimiento . . ..- -.. .- . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . 544.3.3. Producción de biomasa y porciento de colonización de
plantas de cafe crecidas en condiciones controladas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . 554.3.4. Índice de severidad de Phoma costarricensis Echandi en
plantas de cafe inoculadas con HMA o fertilizadas con P encondiciones controladas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
4.3.5. Actividad metabolica de plantas de cafe inoculadas con HMAo fertilizadas con P infectadas con Phoma costarricensisEchandi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
V. DISCUSIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . 63VI. CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 72VII. BIBLIOGRAFÍA CITADA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
INDICE DE CUADROS Y FIGURAS
TITULO PAGINA
Cuadro 1 Superficie, producción y rendimiento de cafe de los principales paisesproductores.
Cuadro 2 Algunas moléculas que promueven la resistencia, investigadas en lainteracción hongo-raiz en la micorriza arbuscular
Cuadro 3 Descripción de los tratamientos evaluados.
Cuadro 4 Escala para medir la severidad de Phoma costarricencis Echandi
Cuadro 5 Descripción de los tratamientos que evaluados
Cuadro 6 Tratamientos evaluados para el experimento de plantas inoculadas yfertilizadas.
Cuadro 7 Crecimiento de plantulas de cafe en suelo esterilizado con adicción de P ,inoculación de HMA y filtrado en condiciones de invemadero.
7
29
35
36
‘39
43
46Cuadro 8 Producción de biomasa y area foliar de plantulas de cafe, a los 200 día
despues del trasplante. 48Cuadro 9 Producción de biomasa y area foliar de plantulas de cafe, a los 240 dias
despues del trasplante 52Cuadro 10 Ntimero de conidios de Phoma costarricensis Echandi presentes en hojas
de plantulas de cafe a los 10 y 20 dias despues de la inoculación delmismo patógeno 54
Cuadro 11 Producción de biomasa de plántulas de cafe, a 1os 200 dias despues deltrasplante 56
Figura 1 Curva esquematica de la respuesta al P de plantas inoculadas y noinoculadas y respectivas areas de beneficio micorrizico (area achurada) yde beneficio del fósforo (area punteada), la faja de mutualismo esdelimitada por el cruzamiento de los puntos XI y X2 correspondientes a 12dosis de fósforo en el suelo
Figura 2 Adquisición de fósforo del suelo por la planta 15
Figura 3 Flujo de nutrimentos entre las células de la plantas y el hongo formadorde micorriza arbuscular, el cual es mediado por transportadoresespecificos 18
Figura 4 Modelo del intercambio fotosintatos-fósforo a travás de la interfasehongo-huésped, mediado por un translocador de Triosa-P 19
Figura 5 Diagrama que indica los posibles sitios de transporte de fósforo del hongoa la planta y dc glucosa al hongo en la membrana de una micorrizaarbuscular (tipo Arum). Transporte de fósforo 20
Modelo de componentes involucrados en la via de transmisión de señales 22Figura 6para aumentar la eficiencia de respuesta de defensa
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Figura 13
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Figura 18
Ejemplos de interección simbiótica. Izquierda; el complejo haustorial deErysyphe graminis dentro de una célula epidérmica foliar, derecha; elarbusculo de Glomus sp. dentro de una célula cortical de la raiz
Ruta de los fenilpropanoides en alfalfa
Altura, diámetro y número de hojas de pldntulas de cafe con adición deHMA y/o fósforo
Índice de severidad de Phoma costarricensis Echandi en plantulas de cafecrecidas en invemadero fertilizadas con P y/o inoculadas con HMA.
Altura, número de hojas, y diámetro de plantas fertilizadas con P y/oinoculadas con HMA, crecidas en vivero
Índice de severidad de Poma costarricensis Echandi e plantulas de cafecrecidas en vivero fertilizadas con P y/o inoculadas con HMA.
Altura y número de hojas de plantas de cafe fertilizadas con P y/o
inoculadas con HMA, crecidas en condiciones controladas
Índice de severidad de Phoma costarricensis Echandi en plantulas de cafefertilizadas con P o inoculadas con HMA, en tres fechas despues de lainoculación del patógeno
Transpiración, conductancia estomitica y asimilacion de CO2 en plantasde cafe inoculadas con HMA o fertilizadas con P, previo a la inoculaciónde Phoma costarricensis Echandi.
24
30
47
49
51
53
55
57
59Transpiración, conductancia estomática y asimilacion de CO2 en plantasde cafe inoculadas con HMA o fertilizadas con P, al momento de lainoculación de Phoma costarricensis Echandi 60Transpiración, conductancia estomática y asimilacion de CO2 en plantasde cafe inoculadas con HMA o fertilizadas con P, 20 dias después de lainoculación de Phoma costarricensis Echandi 61Transpiración de la hoja, conductancia estomática y asimilacion de CO2
de plantas de cafe inoculadas con HMA o fertilizadas con P 62
RESUMEN.
Se estudió la interacción entre plantas de cafe (Coffea arabica L.) inoculadas con hongos
micorrízicos arbusculares o fertilizadas con fósforo y Phoma costarricensis , se realizó un
primer experimento en invernadero en donde se logro desarrollar plantas de cafe. con
crecimiento similar después de haber sido inoculadas con un completo micorrizico nativo
(MTZ-1) y/o fertilizadas con 1 600 ppm de P Kg-1. Un segundo experimento se llevo a cabo en
condiciones de vivero con suelo estéril y sin esterilizar, observando que la respuesta a la
inoculación micorrízica se retrasó entre 40 y 60 días con respecto a los resultados en
invernadero, influido por las condiciones ambientales. En estos dos experimentos las plantas
inoculadasd presentaron una tendencia a disminuir la severidad de la enfermedad a lo largo
del tiempo. Con estos resultados y sin confirmar aún si la nutrición con fósforo contribuye a
disminuir la severidad de la enfermedad, se estableció un tercer experimento en donde plantas
de cafe previamente inoculadas con hongos micorrízicos arbusculares o fertilizadas con
fósforo, crecidas en condiciones controladas (temperatura de 20ºC, humedad relativa de 70%
y fotoperiodo de 3 horas de luz y 21 de oscuridad), se inocularon con 500 conidios de Phoma
costarricensis Echandi ml-1., midiendo el índice de severidad a los 10, 15 y 20 días después de
la inoculación del patógeno y el patron de regulación de intercambio gaseoso. Se demostró
que plantas inoculadas con hongos micorrízicos arbusculares con y sin filtrado presentaron los
niveles más bajos de la enfermedad (menor al 35%), mientras que las plantas fertilizadas con
fósforo tuvieron un 44.8% y las plantas testigo un 60%, asimismo las plantas inoculadas
presentaron los valores más altos en transpiración, conductancia estomática y asimilación de
CO2 Estos resultados sugieren que plantas inoculadas con hongos micorrízicos arbusculares
mejoran la eficiencia respiratoria de la planta, que junto con un buen crecimiento podrían
explicar la tolerancia al patógeno.
Palabras clave: Hongos micorrízicos arbusculares, café, Phoma costarricensis, fósforo,
actividad respiratoria.
1
ABSTRACT
Interaction between arbuscular mycorrhizal fungi and Phoma costarricensis was studied in
relation to phosphorus fertilization and AMF inoculation. The first experiment under
greenhouse conditions was conduced with inoculated plants with inoculum AMF native MTZ-
1 and/or 1600 ppm Kg-1 of phosphorus adition, with the objetive of had plants without growth
differences. Was found that’s possible obtain this condition. Second experiment was carried
out in nursery conditions with sterilized an non-sterilized soil. In were the response to AMF
inoculation delay for 40-60 days with respect to greenhouse experiment, to due at the
enrionmental conditions. In this two experiments plants with AMF inoculation had the more
low severity index in the time. With this results and without had confirmed if the phosphorus
nutrition to reduced the severity disease, the third experiment was established in were coffe
plants previously AMF inoculated or phosphorus fertilized, grown in controled conditions
(20°C of temperature, 70% of relative humidity and photoperiod of 3 h light and 21 h dark),
was inoculated added 500 conidia ml-1 of Phoma costarricensis Echandi, the severity index
was estimated 10, 15 and 20 days following of pathogen inoculation, and the gas exchange
pattern was measured. It was observed that AMF plants with or without filtrate had the lowest
disease levels (lower that 35%), whilst plant fertilized with phosphorus had 44.8% and the
control plants had 60%. The AMF plants showed the most high levels in transpiration,
stomata1 conductance and CO2 asimilation. This results suggest that AM inoculation
improvement of respiratory efficience, together with a good growth, were are the basis of
pathogen tolerance.
2
I. INTRODUCCIÓN
El requemo del cafe (Phoma costarricensis Echandi), fue reportado por primera vez en la
India en el año de 1955, ocasionando graves perdidas de plántulas (10-30% y ocasionalmente
50-75%) (George, 1959; Rajendran et al., 1983). Esta enfermedad ataca desde el estado de
plántula hasta cafetales adultos (Regalado, 1982), desarrollandose principalmente en hojas de
café (Coffea arabica L.) lo que provoca una fuerte defolación, llegando afectar plantaciones
establecidas de 10 a 20 meses de edad, y con una disminución en su productividad del 25 al
45% (Chalarca y Muñoz, 1974; Gianasi, 1995).
Actualmente esta enfermedad está presente en la mayoria de los paises cafetaleros del mundo,
siendo tipica de cultivos localizados en altitudes superiores a los 1 600 m, aunque puede estar
presente desde los 600 m (Zambolin et al., 1996; Calderón, 1992), con regimenes de lluvia
prolongados, baja luminosidad y temperatura minima inferior a 20” C (Fernández 196 1. Gil,
y Leguizamon, 2000). En Mexico se localiza arriba de los 900 m en las diferentes zonas
cafetaleras (Regalado, 1982).
La infección ocurre cuando las esporas, transportadas por el viento, germinan sobre los tejidos
del hospedante y su tubo germinativo penetra por estomas y/o heridas formando un apresorio
(Gil y Leguizamon, 2000). Rajendran et al., (1983) indican que también los insectos como es
el caso de Idiarthron subquadratum Sauss & Pict (Orthoptera: Tettigoniidae) favorecen el
desarrollo de la enfermedad.
Phoma costarricensis Echandi se incrementa por el establecimiento de cafetales en suelos de
baja fertilidad natural o con propiedades físicas inadecuadas, la utilización de variedades y
Líneas con elevado potencial productivo, competencia con malezas, pobre sistema radical,
anegamiento por mal drenaje, presencia de plagas y enfermedades de las rakes, bajo pH del
suelo y fertilizaciones desequilibradas o deficiencias nutritivas (Valencia, 1979; Almeida,
1987), lo que influye de manera directa en las reservas de carbohidratos en la planta que son
fundamentales para su crecimiento, producción y mantenimiento de vigor (Janardhan et al.,
1971).
3
De lo anterior, se desprende que una inadecuada nutrition es factor determinante en el
desarrollo de la enfermedad. Quintero y Buritica (1976) en un estudio del efecto de la
deficiencia de elementos nutricionales sobre Phoma sp. encontraron que: 1) La expresion de
los primeros sintomas se produjo dos dias después de la inoculación; 2) Las plantas
desarrolladas en los soluciones: completa, sin K, sin P, sin B, sin Ca y sin N, fueron las más
afectadas inicialmente y el diámetro de las lesiones oscilo entre 1.6 y 2.7 mm; con el tiempo
se produjo coalescencia de lesiones y finalmente la muerte de las plántulas; 3) El material de
las soluciones sin Fe y sin Mg present6 un 90% de afección, y el desarrollo de los sintomas
fue más lento; 4) solo en los tratamientos correspondientes a la solución completa y en los
carentes de K, Ca o N, hubo formación de picnidios.
No obstante los datos anteriores, generalmente la forma más empleada para el manejo de la
enfermedad, ha sido el uso de productos quimicos, Sin embargo, en este caso es preciso
realizar aplicaciones a intervalos cortos de tiempo (entre 15 y 30 días) de lo contrario puede
haber problemas serios de defolación, (Rodriguez et al., 1958; Fernández, 1968; Sanchez,
1975; Gurdian y Helfenberger, 1976; Mansk et al., 1976; Kannan et al; 1985; Nirmala y
Hanumantha, 1989; Astua y Vargas, 1991. Chavez (1991) indica que la reducción en el
porcentaje de la infección, en ocasiones se debe principalmente a una disminución en el area
foliar causada por el patógeno y no tanto a la eficiencia de los productos empleados.
Ante esta situación los agricultores han mostrado interés en el papel de los hongos
micorrizicos arbusculares (HMA) como biofertilizantes y bioprotectores (Azcon-Aguilar y
Barea 1997). La inoculación micorrizica puede ser efectiva contra patógenos del suelo, los
cuales en ocasiones son dificiles de controlar por medios físicos o quimicos (Azcon-Aguilar y
Barea 1996; 1997, Rousseau et al., 1996; Cordier et al. 1997). En contraste, la formación de la
simbiosis muchas veces presenta una alta susceptibilidad a enfermedades foliares
(Lindermann 1994; Dugassa et al. 1996). Dehne (1982,) postula que existe una influencia
sistématica de los HMA al mejorar la nutrición, crecimiento y respuesta fisiológica de la planta,
con el incremento en la concentración de asimilados, tales plantas pueden servir como fuente
4
de nutrimentos para organismos parasiticos de la planta, de esta manera podria aseverarse que
una planta bien nutrida seria más susceptible al ataque de patógenos foliares.
Sin embargo, existen reportes que indican, que a pesar de que puede haber un incremento en la
producción de conidios de hongos patogenos foliares en plantas inoculadas con HMA, puede
existir un efecto compensatorio que se refleja en una mejor producción de grano en plantas de
cebada (Gemns et al., 2001). Este efecto compensatorio se atribuye a una transferencia directa
de los carbohidratos que son producidos en mayor cantidad en las plantas colonizadas hacia
los granos y a una redistribución de los azucares a sitios de reserva, por ejemplo en los tallos.
Por ello se ha sugerido que para asegurar que los efectos están basados en una compensación y
no en la promoción de crecimiento de la micorriza, sea preciso trabajar con sistemas planta-
HMA, en donde no haya diferencias en el crecimiento entre plantas colonizadas y no
inoculadas después de una fertilización adecuada (Gernns et al., 2001)
De esta manera y considerando que el desarrollo de Phoma costarricensis es favorecido por
un inadecuado suministro de fósforo y que los hongos micorrizicos arbusculares pueden evitar
el impacto de algunas enfermedades foliares con base en un efecto compensatorio, se
desarrolló la presente investigación, con la interrogante de evaluar la interacción entre
plántulas de cafe (Coffea arabica L.) fertilizadas con fósforo y/o inoculadas con un complejo
nativo de hongos micorrizicos arbusculares (MTZ-1) y Phoma costarricensis Echandi en
condiciones controladas y en vivero.
5
HIPÓTESIS
Los hongos micorrizicos arbusculares al funcionar como estructuras que proporcionan a la
planta, además de nutrimentos, una mayor tolerancia al daño de patógenos, permiten que
plantas de cafe inoculadas con HMA, muestren una menor severidad de la enfermedad
causada por Phoma costarricensis Echandi, que cuando las plantas son solo fertilizadas con
fósforo.
OBJETIVO GENERAL.
Evaluar la interacción en plántulas de cafe (Coffea arabica L.) fertilizadas con fósforo y/o
inoculadas con un complejo nativo de HMA (MTZ-1) y Phoma costarricensis Echandi en
condiciones controladas y en vivero.
OBJETIVOS ESPECIFICOS.
Contar con plantas de cafe (Coffea arabica L.) sin diferencias en el crecimiento, inoculadas
con hongos micorrizicos arbusculares y/o fertilizadas con fósforo.
Evaluar el crecimiento vegetativo y la severidad de Phoma costarricensis Echandi en plantas
de cafe (Coffeaea arabica L.) inoculadas con hongos micorrizicos arbusculares y/o fertilizadas
con fósforo en condiciones de vivero.
Determinar la influencia de Phoma costarricensis Echandi en el crecimiento vegetativo y en el
patron de regulación de intercambio gaseoso en plantas de cafe (Coffea arabica L.) inoculadas
con hongos micorrizicos arbusculares o fertilizadas con fósforo.
6
II. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1, Importancia del cultivo del cafe (Coffea arabica L.)
En nuestro país, el cafe es uno de los cultivos con mayor tradición, a pesar de no ser nativo, se
estima que su manejo se ha realizado desde hace aproximadamente dos siglos con grandes
resultados (ASERCA, 1995).
Actualmente Mexico ocupa el cuarto lugar en el ámbito mundial, con una superficie
cosechada de 756 758 ha (Cuadro 1), solamente detrás de Brasil, Costa de Marfil e Indonesia
los cuales son los principales productores. Sin embargo esta posición no se refleja en la
producción que se obtiene, ya que con una superficie similar, Colombia obtiene un mayor
rendimiento casi del doble (FAO, 2000).
Cuadro 1.Superficie, producción y rendimiento de cafe de los principales paises productores.
País
MundialBrasil
Costa de MarfilIndonesiaMÉxico
ColombiaCamerún
Fuente: FAO (2000).
Supetficie Producción de café Rendimiento decosechada verde café verde(hectárea) (toneladas) (ton.ha-1)11,505,503 7,092,263 0.622,344,260 1,834,420 0.782,050,000 365,000 0.18
900,000 432,000 0.48756,758 353,999 0.47750,000 630,000 0.84300,000 70,000 0.23
La producción de cafe en Mexico se desarrolla basicamente en 12 estados de la República,
calculándose que abarca unos 281 municipios, 4 326 comunidades y un número de
productores cercano a los 276 655. Siendo en Chiapas, Veracruz, Oaxaca y Guerrero, donde se
genera el 86% del total de la producción nacional (ASERCA, 1995).
En Veracruz el cafe ocupa el Segundo lugar tanto entre los cultivos perennes, como dentro del
patron productivo nacional, al ser dentro de la balanza agropecuaria, el cultivo más relevante
para el comercio agricola internacional del país en general y del Estado en particular. En el
7
año 2000, se dedicaron 153 mil hectareas a este cultivo, que produjeron 5 14.5 mil toneladas, y
un rendimiento promedio en campo de 3.4 ton. ha-1 de cafe cereza
En la cafeticultura se hayan ocupados alrededor de 67.6 mil productores, ubicados en 842
comunidades de 82 municipios, y se generan poco mas de 300 mil empleos permanentes y 30
millones de jornales al aiio (ASERCA, 1995).
2.2. Problematica del cultivo del cafe
La problematica del cafe resulta de la combinación de factores externos e internos; en elambito internacional los bajos precios bajos precios internacionales están asociados, entreotras cosas: Al incremento de la producción a escala mundial sobretodo por paises que notenían tradición cafetalera y que ahora se encuentran entre los mayores productores del mundocomo Vietnam y b) A la producción de cafe por Brasil con nuevas tecnologias y en areas yaltitudes que lo hacen menos susceptible a las heladas y sequia. Lo que provoca unaintranquilidad en el mercado y una marcada descapitalización del sector productivo (Carvalhoet al., 2000).
En el ambito interno la problematica está asociada entre otras cosas a los altos. costos de
producción, bajos indices productivos y bajos niveles tecnológicos, a la poca diversificación
de los sistemas productivos y a la limitada diversificación del rubro cafe, sobretodo hacia
aquellos tipos de cafe con los que se tienen mas ventajas comparativas. Asimismo hay un
limitado o inexistente manejo de las cuencas hidrograficas en las zonas cafetaleras, problemas
del financiamiento, poca capacitación de los trabajadores y baja eficiencia laboral (ASERCA,
1995).
2.3. El requemo de las hojas del cafe (Phoma costarricensis Echandi)
Esta enfermedad ocurre principalmente en hojas de Coffea arabica L. produciendo fuerte
defoliación. Este trastorno que se encuentra en zonas cafetaleras altas, con baja temperatura y
alta humedad relativa; causa defoliación prematura y limitación de crecimiento. Las heridas
causadas en el campo, probablemente por insectos son factores favorables para desarrollar la
enfermedad (Rajendran et al; 1983; Figueroa, 1985).
8
Actualmente la enfermedad está presente en la mayoria de los países cafetaleros del mundo,siendo tipica de cultivos localizados en altitudes superiores a los 1 600 m, aunque puede estarpresente desde los 600 m (Zambolin et al., 1996; Calderón, 1992), con regimenes de lluviaprolongados, baja luminosidad y temperatura minima baja (inferior a 20°C) (Fernandéz,1961; Gil y Leguizamon, 2000). En Mexico se localiza arriba de los 900 m en las diferenteszonas cafetaleras (Regalado, 1982).
Los sintomas aparecen en campo en plantas de 8-11 meses en agosto-octnbre. Los tallos
encogidos tienen arrugas longitudinales. Las puntas de las hojas se vuelven amarillas o más a
menudo de un color bronce cobrizo. Las plantas afectadas son a menudo altas y delgadas con
internudos largos pero los chupones nuevos pueden crecer normalmente. Si se encogen en o
por debajo del nudo primario la formación de rakes adventicias gruesas encima del area
encogida ocurre usualmente (George, 1959). A medida que las lesiones avanzan, sobreviene
una marchitez y luego la muerte de las partes terminales de las ramas Las hojas son invadidas
por manchas pardas, seguidas de un amarillento y después se desprenden causando defoliación
completa del cafeto (Centro Nacional de Investigaciones de Cafe, 1954).
Se ha demostrado que el agente causal del requemo es Phoma costarricensis Echandi. Las
observaciones microscopicas realizadas en 10 aislamientos a partir de crecimientos obtenidos
en los medios malta agar y avena agar, permitieron evidenciar la formación de picnidios
oscuros, ostiolados de forma ovalada, con dimensiones de 25-280 x 25-277 micras en su
interior presentaron abundantes conidias o picnidiosporas de l-5 x l-6 micras sin septas o con
una septa. El micelio es hialino y ramificado. Estas caracteristicas coinciden con las
mencionadas por DeGruyter y Noordeloos (1992) para P. costarricensis Echandi. En los
estudios histopatólogicos se observó e n algunas ocasiones que el hongo no necesita de las
aperturas estomatales para su penetración El patógeno avanza por los espacios intercelulares
de la epidermis hasta el mesofilo. Allí las células se presentan plasmolizadas y los cloroplastos
aglutinados. Los tejidos de empalizada y esponjoso son colonizados por las hifas, las cuales se
entrelazan posteriormente en la epidermis para formar el picnidio (DeGruyter y Noordeloos,
1992; Vidal, 1977).
9
Phoma costrricensis Echandi ha sido favorecido por la implantación de cafetales en suelosde baja fertilidad natural o con propiedades físicas inadecuadas, la utilizationde variedades ylíneas con elevado potencial productivo, fertilizaciones desequilibradas o deficiencias
nutritivas, competencia con malezas, pobre sistema radical, anegamiento por mal drenaje,presencia de plagas y enfermedades de las raíces, bajo pH del suelo (Valencia, 1979; Almeida,1987), todo esto influye de manera directa en las reservas de carbohidratos en la planta queson fundamentales para su crecimiento, producción y mantenimiento de vigor (Janardhan etal., 1971).
Quintero y Buritica (1976) en un estudio sobre el efecto de la deficiencia de elementosnutricionales sobre Phoma sp. encontraron que: 1) La expresión de los primeros sintomas seprodujo dos dias después de la inoculación; 2) Las plantas desarrolladas en las soluciones:Completa, sin K, sin P, sin B, sin Ca y sin N, fueron las m á s afectadas inicialmente y eldiametro de las lesiones oscilo entre 1.6 y 2.7 mm; con el tiempo se produjo coalescencia delesiones y finalmente la muerte de las plántulas; 3) El material de las soluciones sin Fe y sin
Mg present6 un 90% de afección y el desarrollo de los sintomas fue más lento; 4) solo en lostratamientos correspondientes a la solución completa y en los carentes de K, Ca o N, huboformation de picnidios.
La forma más empleada para el manejo de la enfermedad, ha sido el uso de productosquimicos, empleandose entre otros al Arseniato de plomo (Rodriguez et al., 1958), Difolatan,Clorotalonil, Benomyl, Hidroxido de cobre (Fernández, 1968; Sanchez, 1975; Gurdian yHelfenberger, 1976), Zincofol + Difolatan (Mansk et al., 1976), Captafol (Kannan et al., 1985,Nirmala y Hanumantha, 1989) y Cyproconazol (Astua y Vargas, 1991; Chavez, 1991). Yaunque todos estos productos han sido reportados como adecuados para el control de laenfermedad, es preciso realizar aplicaciones a intervalos cortos de tiempo (entre 15 y 30 dias)de lo contrario puede haber problemas serios de defolación, (Chavez, 1991) indica que lareducción en el porcentaje de infección, en ocasiones se debe principalmente a unadisminución en el area foliar causada por el patógeno 65 dias después de una aplicación, porlo que se recomienda realizar aplicaciones seguidas y a intervalos no mayores a los 30 dias.
10
2.4. La micorriza arbuscular y el cultivo de1 cafe (Coffea arabica L. )
Existe una elevada dependencia micorrizica del cafe en suelos de baja fertilidad y muy
compactos, ejerciendo efectos benéficos en la nutrición, crecimiento y en la producción de
granos de este cultivo, a pesar de esto, el uso de los HMA no es comun entre los viveristas
(Saggin-Junior et al., 1995; Rivera et al., 1997).
En contraste la aplicación de dosis crecientes de fósforo inorgánico disminuye la colonización
micorrizica, y las plantas inoculadas presentan un mejor crecimiento y desarrollo que aquellas
que son fertilizadas. Con el uso de los hongos micorrizicos puede sustituirse la adición de
fertilizante durante la fase de vivero, lo cual resulta en un beneficio para la economía de los
viveristas, además de que la planta al salir a campo cuenta con un sistema biológico que le
permite una mejor adaptación en el nuevo habitat (Trejo, 1997).
Con base en algunos datos recopilados se menciona que el cafe tiene cierta dependencia con
algunas especies de hongos micorrizicos entre los cuales se encuentran los géneros
Acaulospora y Glomus.
Jiménez (1989) encontró que en viveros de cafe donde se inocularon varias especies de
hongos, se registro un mayor crecimiento de plantas, como es en el caso de ensayos realizados
con Gigaspora margarita en lo que se han obtenido crecimientos superiores a un 200% con
relación a las plantas no inoculadas.
Se ha visto que la colonización se incrementa en aproximadamente tres veces cuando se le
adicionaron 200 ppm de P2O5, pero conforme se incrementaron los niveles de fósforo se
presenta un ligero descenso hasta las 800 ppm llegando hasta un 10%.
El contenido de fósforo en la parte aérea presenta una respuesta positiva muy acentuada a 200
ppm de fósforo, pero tiende a disminuir hasta llegar a la dosis de 1,600 ppm, para luego
incrementarse nuevamente a dosis mayores. Existe una correlación lineal inversamente
proporcional entre el porcentaje de colonización y la absorción de fósforo, es decir, a medida
11
que se disminuye el nivel de fósforo el porcentaje de colonización se incrementa (Fig. 1)
(Saggin-Junior y Siqueira, 1995).
Figura 1. Curva esquemdtica de la respuesta al P de plantas inoculadas y no inoculadas y respectivas Leas debeneficio micorrizico (área achurada) y de beneficio del fósforo (Area punteada), la faja de mutualismoes delimitada por el cruzamiento de los puntos Xl y X2 correspondientes a dosis de fósforo en el suelo(Saggin-Junior y Siqueira, 1995).
Los autores proponen un modelo del funcionamiento de la simbiosis G. margarita-Coffeaarabica en función a la disponibilidad de fósforo de la siguiente manera: Cuando el suelotiene 10 ppm la simbiosis es parasitica, cuando los niveles se encuentran entre 100-300 ppm,existe una zona de transición entre el mutualismo y el parasitismo y los beneficios de lainoculación se observaron cuando los porcentajes de colonización fueron mayores de 30 a35%, y esto solamente ocurre cuando el nivel de fósforo es menor a 150 ppm. Las plantasinoculadas exigiran diez veces menor cantidad de fósforo que las plantas no inoculadas, lo querepresenta una economía al viverista.
Las plantas crecidas en suelo fnmigado presentan un crecimiento lineal como respuesta a laaplicación de fósforo, mientras que las plantas inoculadas, en suelo no fnmigado mostraronuna respuesta cuadratica, al incremento del fósforo en el suelo (Saggin-Junior et al., 1994). Endonde han observado respuestas de crecimiento a diferentes cantidades de fósforo y hongosmicorrizicos en diversos periodos. Las plantas inoculadas con Glomus etunicatum,procedentes de dos zonas cafetaleras presentaron una respuesta más rápida que las inoculadascon las otras cepas. Al final del experimcnto (170 dias) las plantas inoculadas incluyendoaquellas crecidas en suelo no fumigado se desarrollaron mejor que las no inoculadas.Sin embargo la promoción del crecimiento estuvo relacionada con los niveles de fósforo. Los
efectos en el crecimiento fueron maximizados a niveles intermedios de fósforo. Los altos
12
contenidos de fósforo, mostraron efectos depresivos a la colonización micorrizica, variando
considerablemente entre las diferentes especies y viéndose reducida por los altos niveles de
fósforo.
Fernandez et al., (1992) no encontraron efectos benéficios entre la combinación de hongos
micorrizicos y becterias solubilizadoras de fósforo y combinando G. manihotis más suelo con
vermicomposta en una proporción de 5:10 con ausencia de fósforo se comporta
adecuadamente, concluyendo que la colonización produce beneficios sobre el crecimiento de
las plantas de cafe, observando también que sustratos con altas cantidades de fósforo
redujeron el efecto de la micorriza con relación al sustrato que contiene cantidades menores de
este nutrimento.
2.5. El fósforo en la planta
El fósforo, a pesar de ser uno de los componentes claves en moléculas tales como ácidos
nucleicos, fosfolipidos y ATP, es uno de los macronutrimentos cuya disponibilidad en el suelo
es baja, pero que se le considera como un elemento esencial debido a la variedad y
complejidad de los procesos metabólicos en que participa (Rocha et al., 1994). Por ello las
plantas han tenido que desarrollar numerosos mecanismos morfológicos, fisiológicos,
bioquimicos y adaptaciones moleculares para su adquisición (Schachtman et al., 1998;
Raghothama, 1999; Kramer y Green, 2000).
Entre estos mecanismos se encuentran:
La Respuesta morfológica: Con un incremento en la relación raiz:tallo, cambios en la
morfologia y arquitectura de las rakes; Incremento en la proliferación de los pelos radicales,
elogación de los pelos radicales, acumulación de pigmentos antocianinas, formación de
protcoides radicales, incremento en la asociación con hongos micorrizicos.
Respuesta fisiológica: Con una mejoria en el ingreso de fósforo, reduccción del eflujo de
fósforo inorgánico (Pi), Incremento en la eficiencia en el uso de Pi, movilización de Pi de la
vacuola al citoplasma, incremento en la translocación de fósforo dentro de la planta, retención
13
de más Pi en las raíces, secreción de ácidos organicos, secreción de fosfatasas y RNasas,
alteración en las rutas metabolicas de la respiración, del carbono, fotosintesis, fijación del
nitrógeno y enzimas aromaticas.
Respuesta Bioquimica: Con la activación de enzimas, mejoramiento en la producción de
fosfatasas, RNasas y ácidos organicos en la fosforilación de proteinas, activación de la ruta del
glicolitico.
Respuesta molecular: Activando genes (RNasas, fosfatasas, trasportadores de fosfatos, Ca-
ATPasa, proteinas de almacenamiento vegetativo, β-Glucosidasa, PEPCasa, genes nuevos
como TPSII Mt4).
Así los intrincados mecanismos que involucran el mantenimiento en la homeostasis de Pi,
reflejan la complejidad de la adquisición y translocación de este elemento en la planta
(Raghothama, 1999).
El fósforo se encuentra de diferentes maneras en el suelo, como son ácidos organicos y en
forma mineral (Fig. 2) es importante enfatizar que del 20 al 80% en el suelo se encuentra de
manera organica, siendo el ácido fitico (inositol hexafosfato) el mayor de los componentes, los
restantes se encuentran en la fracción inorganica que contiene 170 formas minerales de
fósforo (Richardson, 1994, Omar, 1998).
La raiz de la planta tiene una función muy importante en la absorción de este elemento, al
ejercer una acción directa en la capacidad de ingreso del Pi, ya que influye en el pH, potencial
redox, mineralización y en la adición de una amplia variedad de compuestos organicos
(incluyendo mucílago y surfactantes), lo que determina la dinámica de las comunidades
microbianas del suelo (McCully, 1999).
En general se asegura que la nutrición de Pi es controlada por dos factores importantes, la
disponibilidad del nutrimiento y la capacidad de las plantas para adquirirlo (Raghothama,
1999).
14
Figura 2. Adquisición de fósforo del suelo por la planta (Tomado de Schachtman et al., 1998).
El fósforo orgánico (PO) en el suelo puede ser utilizado por las plantas después de la
mineralización y la subsiguiente liberación de Pi, la division hidrolitica del Po por fosfatasas
extracelulares de origen microbiano o radical es uno de los mecanismos de tal mineralización
Las fosfatasas han sido detectadas en la superficie de las rakes, en la rizosfera del suelo y en
el suelo sin la influencia de las rakes y en algunos casos su actividad ha sido positivamente
correlacionada con la disminución de PO (Eivazi y Tabatabai, 1977; Joner et al., 1995).
Así las fosfatasas medidas en el suelo reflejan la actividad de las enzimas encontradas en los
coloides y en las sustancias húmicas asociadas con plantas vivas y muertas y con celulas de
microorganismos, de esta manera las fosfatasas pueden ser un buen indicador del potencial de
mineralización del fósforo orgánico y de la actividad biologica del suelo (Kramer y Green,
2000).
Las mediciones fisiológicas de la entrada del fósforo en las células indican la presencia de un
número importante de sistemas trasportadores, los cuales operan optimamente en diferentes
15
rangos de concentración de fosfatos y que es mediado por un sistema de componentes
multiples (Liu et al., 1998), el cual es controlado por una cascada intrincada que involucra
proteinas reguladoras tanto positivas como negativas, e incluyen genes que coditican para a)
proteinas estructurales, (tales como fosfatasas ácidas y alcalinas y transportadores de Pi de alta
afinidad); b) reguladores positivos y c) reguladores negativos (Raghothama, 1999).
El ingreso de fósforo se mantiene como un problema importante para las plantas, ya que en
muchos casos la concentración de este mineral es baja en la solución de suelo, pero los
requerimientos de la planta son altos. No obstante lo anterior y de que existe la percepción
general de que este mecanismo ocurre directamente del suelo hacia las células de las raíces
Parece ser que más del 80% de las plantas presentan una asociacion simbiotica con los hongos
micorrizicos (Volpin et al., 1995; Davi et al., 1998).
En esta simbiosis las hifas del hongo actúan en forma muy importante en la adquisición de
fósforo poco disponible en el suelo por parte de la planta (Arines et al., 1994; Gianinazzi-
Perason, 1996; Schachtman et al., 1998; Bago et al., 1999; Subramanian y Charest, 1999;
Vierheilig et al., 2000). La interacción entre el hongo formador de micorriza arbuscular y la
planta comienza cuando la hifa de una espora entra en contacto con las rakes del huésped
(Gianinazzi-Pearson, 1996).
2.6. La función de la micorriza en el ingreso del fósforo hacia la planta
Los rangos de concentración del fósforo que las raíces pueden encontrar en el suelo son
extremadamente amplios, pues los niveles de fosfatos pueden ser ocasionalmente tan altos
como 10 µM, aunque más bien son tan bajos como 1 µM, Además de que este elemento es
muy poco móvil en el suelo y la absorción por parte de las raíces es en zonas localizadas.
Consecuentemente las plantas han desarrollado diversas estrategias de acceso al fósforo en
ambientes con bajos niveles de contenido de este elemento, una de las más ampliamente
utilizadas para tal fin es la formación de la asociacion simbiotica con hongos micorrizicos
arbusculares (HMA) (Daniels-Hylton y Ahmad, 1994; Liu et al., 1998).
16
En esta relation simbiótica mutualistica cada organismo mantiene sus caracteristicas
intrinsecas, pero cuando están unidos constituyen un supraorganismo con caracteristicas
únicas, y el mantenimiento de esta asociacion requiere de un alto grado de integracion, de
modo tal que la dominación de uno puede disrumpir este delicado balance (Anderson, 1988;
Bago, 1999).
De hecho muchas veces este puede verse afectado por una muy baja o muy elevada cantidad
de fósforo en el suelo (Douds et al., 1998), así como por el manejo, que el hombre hace del
suelo, por ejemplo la esterilizacion de sustratos elimina esta asociacion provocando una
consecuente deficiencia de fósforo, al no existir quien pueda facilitarlo (Aggangan et al.,
1996).
El proceso de colonización y el establecimiento de una asociacion activa involucra u n
sinúmero de interacciones morfofisiológicas y bioquimicas entre las hifas del hongo y lascélulas de las raíces
celulas de las raices de la planta, las cuales incluyen el contacto entre la hifa del hongo y la
superficie de la raiz, la diferenciación para formar apresorios, penetración y crecimiento de la
hifa dentro de la raíz y una subsecuente diferfenciación de estructuras especializadas (los
arbúsculos) dentro de la célula cortical, que incluye modificaciones dramaticas en las células
del huésped, como es la invaginación del plasmalema de la célulaplanta, fragmentación
de la vacuola y un incremento en el número de organelos tales como el Aparato de Golgi,
(Harrison y Dixon, 1993; Bonfante y Perotto, 1995; Niemira et al., 1996).
En donde los exudados, principalmente flavonoides y otros compuestos fenólicos de las raicesen crecimiento, promueven el reconocimiento del huésped y el crecimiento de las hifas
(Gianinazzi-Pearson et al., 1989; Christensen y Jakobsen, 1993; Giovannetti et al., 1996;
Pereira y Siqueira, 1997; Pinior et al., 1999), así se ha establecido que los flavonoides pueden
estar restringidos a fases iniciales de la infección micorrizica arbuscular (Gryndler y Hrselová,
1998; Fries et al., 1996).
En la actualidad se reporta que el establecimiento de la simbiosis esta acompañado por
cambios cuantitativos y cualitativos en muchos de los metabolitos secundarios de las raíces,
17
los cuales son reflejados por el perfil de transcripción de enzimas codificadas para la
biosintesis de fenilpropanoides, flavonoides y fitoalexinas (Harrison et al., 1993).
La contribución más importante que se reconoce en las plantas colonizadas es, en su nutrición
y crecimiento, ya que las hifas del hongo permiten incrementar la superficie de absorción de
las raices (Mendoza y Borie, 1998; Subramanian y Charest, 1999) de elementos como el
fósforo y otros nutrimentos de limitada difusión (Munyanziza et al., 1997).
Así las raices colonizadas son capaces de explorar en el suelo de una forma más eficiente que
las de las que no han sido micorrizadas, donde el micelio extraradical de los HMA absorbe y
transporta elementos de baja difusión como son el fósforo, nitrógeno y otros elementos a
considerables distancias de la raiz (Fig. 3) (Bothe et al., 1994; Bago y Azcon-Aguilar, 1997;
Clark et al., 1999; Pamiske, 2000).
Figura 3. Flujo de nutimentos entre las células de la plantas y el hongo formador de micorriza arbuscular, el cuales mediado por transportadores especificos (Tornado de Pamiske, 2000)
Azcon-Aguilar y Barea (1997) indican que se ha estimado que el largo promedio de la hifa
extema creciendo en un suelo, asociadas con raices colonizadas es de 1 m, pero hay reportes
de que llega a ser de hasta 10-14 m.
En esta asociacion las membranas de ambos simbiontes están intimamente asociadas y se
considera que desempeñan una acción crucial en regular el intercambio de nutrimentos, y
dentro de estas la ATP-asa y una Triosa como translocador son las moléculas más importantes
I8
para controlar el transporte iónico y molecular a nivel celular entre la planta y el hongo (Fig.
4) (Schwab et al., 1991; Bago et al., 1997).
Figura 4. Modelo del intercambio fotosintatos.fósforo a través de la interfase hongo-huésped, mediano por untranslocador de Triosa-P (Tornado de Schwab et al., 199 1).
La funcionalidad de esta simbiosis es mediada por efectos directos e indirectos de los factores
bióticos y abióticos que existen alrededor de la rizosfera, por ello es importante reconocer la
complejidad del sistema micorrizico (Jhonson et al., 1998). En donde los HMA obtienen
carbohidratos sintetizados y liberados por las raices del huésped y estos mejoran la nutrición
mineral de la planta, mediante un ingreso más eficiente a través de una red amplia de micelio
extemo, donde son liberados y activamente tomados por las raices de la planta (Bago et al.,
1996; Bago et al., 1998).
Así los hongos MA obtienen la mayoría, si no es que todo su carbono de la planta h&sped, y
donde la simbiosis micorrizica incrementa la producción de biomasa y la fotosintesis y de
manera directa el flujo de una fracción significativa de los fotoasimilados de la planta
huésped. Aunque varian las estimaciones se considera que hay un incremento entre e14 y 20%
de estos en los sistemas radicales colonizados (Bago et al., 2000; Khaliq y Sander, 2000),
dependiendo de la especie o cultivar del huésped, de las condiciones ambientales y la
compatibilidad funcional entre el hongo y la planta (Ravnskov y Jakobsen, 1995).
19
Cuando la exploración de las raices es restringida, cerca del 80% del fósforo de la planta
puede ser suministrado por las hifas externas de los HMA, que llegan a cubrir distancias
mayores a los 10 cm de la superficie de las rakes, ademas de este incremento en la
disponibilidad espacial de P, la adquisición efectiva de este elemento por la hifa externa esta
relacionado con: a) la formación de polifosfatos en la hifa y su mantenimiento en
concentraciones bajas de fósforo (Pi), b) las hifas de menor diametro conducen en un volumen
relativamente grande de suelo m á s P por unidad de superficie, comparado con el area de la
superficie de las raices y c) la producción de fosfatasas ácidas extracelulares, las cuales
catalizan la liberación de fósforo del complejo orgánico del suelo, ademas de que las hifas
extemas de los HMA pueden contribuir a mejorar la utilización de ciertas fuentes de P
orgánico por las plantas colonizadas (Fig. 5) (Marschner y Dell, 1994).
Figura 5. Diagrama que indica los posibles sitios de transporte de fósforo del hongo a la planta y de glucosa alhongo en la membrana de una micorriza arbuscular (tipo Arum). Transporte de fósforo; 1) Entrada defósforo a través de la membrana de la hifa extema; 2) Flujo de fósforo a travts de la membrana delarbúsculo; 3) entrada del fósforo a través de la membrana peri-arbuscular. Transporte de Carbono: 2) y4) posibles sitios de entrada de glucosa para el hongo. (Tornado de Harrison, 1999).
Cuando hay niveles altos de P en el suelo, el efecto de la mejoria en el incremento en el
crecimiento promovidos por los HMA decrece y puede llegar a reprimirse por completo
(Tawaraya et al., 1994; Asmah, 1995; Saggin-Junior y Siqueira, 1995), como se ha visto en
cítricos, en donde altos niveles de fósforo en plantas micorrizadas pueden reducir hasta en un
19% su tasa relativa de crecimiento (Rocha et al., 1994; Fonseca et al., 1994; Graham y
Eissenstat, 1998)
20
De manera general se han propuesto 4 mecanismos para explicar la inhibición o limitación del
desarrollo de la micorriza por altos niveles de fósforo; 1) Cambios fisiológicos o anatómicos
pueden ocurrir en las raices limitando la extension intraradical del hongo; 2) Recientes
evidencias, utilizando la producción de esporas como medida de distribución de carbono del
: huésped al hongo, sugieren un flujo bajo de carbono a través de la raiz colonizada en
condición de altos niveles de fósforo, que bajo condiciones de poco fósforo; 3) Por cambios
cualitativos o cuantitativos en los exudados de las raices, los cuales pueden afectar de alguna
manera, la formación de apresorios y el crecimiento del micelio extraradical y de esta manera
afectar el desarrollo de la penetración secundaria, finalmente; 4) El P puede directamente
inhibir el crecimiento del hongo en el suelo. Estos mecanismos pueden resultar en una
reducción en la exploración del suelo, y un menor contacto con las raices y consecuentemente
una baja colonización (Tawaraya et al., 1993; Nagahashi et al., 1996; Pinior et al., 1999).
2.7. Mecanismos de proteccidn de los hongos micorrízicos
A pesar del gran número de hongos y bacterias involucrados en la descomposición del
material vegetal muerto, patógenos potenciales han adquirido la capacidad de colonizar las
plantas vivas. En los casos en que ocurran infecciones, los agentes patógenos no invaden con
la misma intensidad todas las variedades de una misma especie, provocando daños diversos
entre ellas (Bent, 1996; Kapulnik et al., 1996).
Si bien la resistencia a la infección contra patógenos es ampliamente distribuida entre las
plantas, es bastante dificil probar la naturaleza de los mecanismos de defensa que confieren
algunas de estas formas de resistencia, ya que pueden mantenerse desde una resistencia
mecánica pasiva hasta la activación de diversos genes para crear una barrera quimica (Wyss et
al., 1992; Jackson y Taylor, 1996).
De esta manera, parece obvio que las plantas tienen la capacidad de reconocer a un patógeno
potencial y de transmitir esta información dentro de las células y en la vecindad de las mismas
para aumentar la eficiencia de las respuestas de defensa (Vereecke et al., 1997).
21
Los estudios basados en células de perejil y un elicitor de naturaleza proteica derivado del
hongo Phytophthora megasperma han servido como un modelo de via de transmisión de
señales intracelulares, la más rápida respuesta detectada en las células de esta planta, son los
cambios en los flujos de protones, cloruros, potasio y calcio a través de la membrana
plasmática y la formación de peróxido de hidrógeno (estallido oxidativo), la cual ocurre dos y
cinco minutos (Fig. 6) (Bent, 1996; Fernández et al., 1998).
Figura 6. Modelo de componentes involucrados en la via de transmisión de señales para aumentar la eficienciade respuesta de defensa (Fuente: Numbenger et al., 1994).
En muchos casos la resistencia de la planta esta asociada con respuestas de defensa multiples,
las cuales pueden incluir: 1) Una respuesta hipersensible (HR1), la cual es caracterizada por
una defensa quimica rápida y localizada y la muerte de las células vegetales alrededor del sitio
de infección; (Volpin et al., 1995) 2) la acumulación de metabolitos secundarios, tales como
fitoalexinas antimicrobianas; 3) Barreras estructurales de respuesta, tales como la lignina y
proteinas de la pared celular ricas en hidroxiprolina; y 4) La producción de algunas enzimas
nuevas con actividad antifungica (Kapulnik et al., 1996).
La micorriza es un tejido en el cual existe una armonia metabolica entre dos organismos, un
hongo y la raiz de una planta, siendo una interección dinámica en donde sus componentes
1 Por sus siglas en inglés Hipersensitive Response (HR)
22
están en un flujo continuo y manteniendo cada individuo sus caracteristicas intrinsecas, y de
esta manera la nueva colonización de hifas en las células huésped se extienden hacia la
rizosfera (Anderson, 1988; Siqueira et al., 1998; Bago, 1999).
En el establecimiento de la simbiosis tanto las estructuras asociadas con esta, como la reacción
de la planta a la colonización son en ocasiones reminiscencias de los primeros estadios de las
interacciones compatibles tanto biotróficas como hemibiotrofkas de la relación patogeno-raiz,
donde el patogeno invade exitosamente grandes areas del huésped e inicialmente activa los
mecanismos de defensa del huésped (Lieberei y Feldman, 1989; Harrison y Dixon, 1993),
muchos de estos mecanismos consisten en la fortificación de la pared celular, acumulación de
proteinas relacionadas con la patogénesis (Benhamou et al., 1996), incluyendo las enzimas
quitinasas y β-1,3-glucanasa y la acumulación de compuestos antimicrobianos como las
fitoalexinas (ácido p-Cumarico, m-Cumarico, p-pada-Cumarico metil ester [p-CAME], ácido
cafeico, ácido ferúlico, ácido sinapico) (Daayf et al., 1997; Scharff et al., 1997).
Autores como Pozo et al., (1996) reportan para el caso del jitomate (Lycopericon
esculentum), que existe una inducción diferencial de las isoformas de quitinasas (enzimas que
catalizan la hidrdlisis de quitina) en las rakes después de la simbiosis o el ingreso del
patógeno, permitiendo pensar que la actividad de estas isoformas de quitinasas inducidas en la
micorriza arbuscular pueden ayudar a las plantas a responder a la invasion de hongos
fitopatógenos directamente por actividad hidrolitica o por la liberación de elicitores que
pueden activar los mecanismos de defensa.
Por todo ello la investigación en el control biológico de patógenos de los vegetales ha recibido
mucha atención en años recientes como un medio para incrementar la producción y evitar ungran número de problemas relacionados con el control quimico (por ejemplo, contaminaciónambiental, incremento en la resistencia de los patógenos, etc.) además de desarrollar prácticascompatibles con una agricultura sostenible (Krishna y Bagyaraj, 1983; Calvet et al., 1993;Thomas y Willis, 1998).
23
En la actualidad se asume que la simbiosis micorrizica per-mite un incremento en la resistenciade las plantas a patógenos de la raiz, especialmente cuando las plantas son inoculadas antes deque afecte el patogeno (Dassi et al., 1998; Dassi et al., 1999).
Howard en 1943 citado por Dugassa et al., (1996) señala que la presencia de una efectiva
simbiosis micorrizica es un prerrequisito esencial para la sanidad de la planta, y aunque la
penetración a la raiz por parte del andófito es similar a formación de los haustorios
(estructuras de alimentación) formados por los hongos patógenos, su función es muy diferente
una célula epidtrmica foliar, derecha; el arbúsculo de Glomus sp. dentro de una célula cortical de la
La literatura reciente sugiere que la contribución de los hongos micorrizicos arbusculares en el
control biológico puede ser:
Mejorando la nutriciónde la planta y la biomasa radical, compitiendo con el patógeno por
recursos y espacio, con cambios morfológicos de la planta y formación de barreras,
modificación de los componentes bioquimicos relacionados con la respuesta de resistencia de
la planta, interrumpiendo el estrés fisico, deteriorando a las poblaciones antagónicas de la
micorrizosfera, activando mecanismos de defensa vegetal y promoviendo alteraciones
cualitativas y cuantitativas en la expresión de proteinas (Cervinkova, 1989; St-Amaud et al.,
24
(Fig. 7)(Jackson., 1996; Parniske,2000)
Figura 7. Ejemplos de interacción simbiotica. Izquierda; el complejo haustorial de Erysphe graminis dentro de
raíz (Tomado de Parnsike,2000).
:
1995; Trota et al., 1996; Fernando y Linderman, 1994; Norman et al., 1996; Pozo et al., 1996;
Scharff et al., 1997; Dassi et al., 1998; Cordier et al., 1998).
2.8. Influencia de la nutrición en el control biológico
El biocontrol puede involucrar la supresion del patogeno por una privación en sus nutrimentos
(Handelsman et al., 1996), otra explicación que puede aclarar el efecto protector de la
micorriza, es su facultad de mejorar la nutrición mineral de las plantas huésped y más
precisamente la entrada de fósforo (Davis y Menge, 1980).
Sin embargo existen reportes que señalan que la nutrición adecuada de fósforo esta asociada
con un incremento en la severidad de la enfermedad, o que no tiene un efecto bioprotector (St-
Amaud et al., 1994; Cordier et al., 1996; St-Amaud et al., 1997). Graham y Egel (1988)
indican, inclusive, que en el caso de Phytophthoraparasitica en citricos se redujo hasta en un
50% el grado de colonización micorrizica, cuando las plantas fueron fertilizadas con fósforo.
En este sentido Newsham et al., (1995) señalan que aunque en ocasiones no se eleva la
concentración de fósforo en la planta, se ha observado una protección en enfermedades como
Fusarium oxysporum en tallo y raíz, aparentemente por la supresión del patogeno durante el
crecimiento de la raiz colonizada.
En contraste, Caron et al., (1986) encontraron que elevadas concentraciones de fósforo en la
planta no son las responsables del bajo desarrollo de la enfermedad y las bajas poblaciones del
patogeno. Confirmando con ello que la necrosis de las rakes y las poblaciones de F.
oxysporum f.sp.. radicis-Zycopersici disminuyen cuando existe algún nivel de colonización
micorrizica. Resultados similares se han reportado para el caso de Pythium ultimun en
Tagetespatula inoculada con Glomus intraradices (St-Amaud et al., 1994).
Así se establece que aunque no haya un incremento en el contenido del fósforo, si es posible
lograr una protección hacia el agente patogeno tanto en la parte aérea como en la radical,
aparentemente por la supresion del patogeno en la raiz (Newsham et al., 1995).
25
Fernando y Linderman (1994) reportan que la inoculación con G. intraradices puede proveer
algún grado de reducción del daño del patogeno, independientemente del nivel nutrimental y
de otros factores del crecimiento.
Por su parte, autores como Trota et al., (1996) señalan que la concentración de fósforo en las
hojas esta fuertemente determinada por la colonización con Glomus mosseae y por la
infección de Phytophthora nicotianae var. parasitica, independientemente de la nutrición de
fósforo. La más alta concentración de fósforo fue encontrada en plantas inoculadas y la menor
en plantas con P. nicotianae var. parasitica y sin micorriza, sin que afectará el nivel de
fósforo en el medio nutritivo.
En contraste Sreenivasa (1994) evaluando la actividad del control biológico de Glomus
macrocarpum y de Trichoderma harzianum contra Sclerotium rolfsii (Corticium folfsii) un
patogeno del chile (Capsicum annuum) con varios niveles de fósforo, encontró que la
combinación de G. macrocarpum y T. harzianum fue más efectiva para suprimir a S. rolfsii.
concluyendo que la actividad biologica de estos se incremento con el nivel de fósforo, pero no
existieron diferencias significativas entre el 75 y 100% de fósforo recomendado.
Con base a lo referido anteriormente es dificil sugerir que la nutrición con fósforo no este
directamente involucrada en los mecanismos de protección de la micorriza en la planta, por
ello se sugieren dos posibilidades para explicar este proceso: 1) Una competencia directa o
indirecta cerca de la rakes y la fase extraradical de los HMA en el sustrato y 2) La induccidn
de mecanismos de resistencia por parte de la planta (Dehne, 1982; St-Arnaud et al., 1994).
2.9. Cambios en los componentes bioquimicos relacionados con la respuesta de resistencia de
la planta
Cuando SC forma la micorriza, la fisiologia del huésped cambia significativamente en
respuesta a la presencia del simbionte en la raiz. Los hongos micorrizicos pueden inducir en la
planta huésped la producción, o alterar los niveles, de sus constituyentes quimicos incluyendo
26
I
1fitohormonas, isoflavonoides, etc. que influyen en el crecimiento y función de la planta. Un
cambio significativo en plantas inoculadas es la alteración en los exudados de la raices hacia1
la rizosfera del suelo que provoca la selección de un nuevo equilibrio microbiano en la1
micorrizosfera (Harrison y Dixon, 1993; Scharff et al., 1997).
Otros cambios, ocurren en los tejidos de la raices que involucran la producción de compuestos
fenólicos que inhiben al patógeno, numerosos estudios sugieren que estos son de bajo peso
molecular, tales como el ácido benzoico y los fenilpropanoides (Nicholson y Hammerschmidt,
1994).
Con los hongos micorrizicos, los cambios en los constituyentes del huésped se rcflejan en un
incremento en los niveles substancias isoflavonoides como las fitoalexinas, aminoacidos
específicos como la arginina (Peipp et al., 1997).
También se pueden inducir cambios en el ámbito morfológico en los tejidos de la raíz, que
bloquean el ingreso del patógeno o modifican su desarrollo en los tejidos del huésped
(Hartwig, 1993; Mark y Cassells, 1996; Morandi, 1996), reduciendo de manera importante no
únicamente las partes inoculadas, sino también las partes no colonizadas del sistema radical
inoculado (Cordier et al., 1998).
Dumas-Gaudot et al., (1996) y Dassi et al., (1998) señalan que algunos compuestos y enzimas
involucrados en la defensa de la planta pueden ser fitoalexinas, callosa, glicoproteinas ricas en
hidroxiprolina, fenoles, quitinasas β− 1,3-glucanasa, y proteinas relacionadas con la
patogénesis Por lo que dichos productos se han propuesto como potenciales compuestos
antifungicos en el control de enfermedades de los vegetales (Salzer et al., 2000).
Con respecto a la simbiosis MA, los estudios en Poro colonizado con Glomus mosseae, han
mostrado que la actividad de las quitinasas se incrementa durante los estadios iniciales de la
interacción y luego se suprime en los estadios avanzados (Salzer et al., 2000), esto
probablemente se deba a que estas enzimas hidrolizan parcialmente la pared celular de
27
algunos hongos fitopatógenos y consecuentemente inhiben su infección inicial (Davi et al.,
1998).
Grandmaison et al., (1993), realizaron la carcaterización fitoquímica de compuestos fenolicos
y su localización en la ultraestructura de raices de cebolla inoculadas con dos hongos
micorrizicos (Glomus intraradices y G. versiforme). Siendo los ácidos ferúlico y P-Cumarico,
así como la N-feruloyltiramina los principales compuestos, encontrandose en la pared celular
de las raices de plantas inoculadas, sugiriendo que existe un mecanismo para la condensación
oxidativa de los fenoles.
Algunos bioensayos realizados por los autores sugieren que la N-feruloyltiramina induce la
ramificación de las hifas y reduce el desarrollo total del hongo, proponiendo que la progresiva
formación de compuestos fenolicos en raices colonizadas esta directamente involucrada en el
control del establecimiento y desarrollo del endófito, así como de la gradual reducción de su
plasticidad y elasticidad de la matriz simbiótica.
De esta manera, se asevera, que la acumulación de estos productos son formados por la planta
en los sitios de penetración del hongo (Benhamou et al., 1994).
Morandi (1996) menciona que una de las mejores formas para conocer sí los compuestos
fenolicos son los responsables de mejorar la resistencia o tolerancia de las plantas a patógenos
es comparar su acumulación en plantas con y sin micorrizas, aunque señala que
desaforhmadamente son pocos los trabajos al respecto. Cita a Dehne y Schonbeck quienes en
1979 estudiaron la influencia de Glomus mosseae en la resistencia hacia Fusarium oxysporum,
favorecida por la acumulación de fenoles, encontrando que la infección simultánea con la
endomicorriza y el patógeno incremento los niveles de fenoles y la actividad de β-glucosidasa,
disminuyendo así la severidad de la enfermedad.
También observaron un incremento en la lignificación del endodermo y del estele en las
plantas inoculadas, señalado que estos resultados son un buen argumento que favorecen la
hipótesis de que la resistencia a F. oxysporum es debida a la micorriza, ya que ella permite la
28
acumulación de compuestos fenólicos en las rakes, estas observaciones sugieren que agentes
bióticos y abióticos sensibilizan a la planta para responder más rapidamente al ataque
microbiano extemo, causando acumulación de productos de genes de defensa que pueden
requerir menos energia (Benhamou et al., 1994).
Gianinazzi-Pearson et al., (1996) presentan una sintesis de los posibles mecanismos quimicos
involucrados en la resistencia de las plantas (Cuadro 2), indicando que los HMA pueden
activar parte de las rutas metabolica asociadas con los procesos de defensa pero no de manera
coordinada, existiendo una activación espacio-temporal limitada y aún poco conocida.
Cuadro 2. Algunas moléculas que promueven la resistencia, investigadas en la interacción hongo-raízen la micorriza arbuscular (Tornado de Gianinazzi-Pearson et al., 1996).
I1
Molecula ModificaciónI Fitoalexinas Incremento transitorio o tardio en algunos isoflavonoides, Fenil alanina amonio-liasa(PAL*), Calcona cintasa (CHS*), Calcona isomerasa (CHI*), son transcritas durante lacolonización de la raíz. Localización de PAL y CHS son transcritas en las células quecontienen los arbúsculos. No se incrementa la isoflavona reductasa.
Calosa
Peroxidasa
β 1,3 glucanasa en la pared del huésped es la base de la base del arbúsculo
Se incrementa su actividad en total y en la pared celular en los primeros estadios de lacolonización de la raiz.No se localiza en celulas que contienen arbúsculos
Quitinasa Se incrementa inicialmente en actividad y transcripción, generalmente seguida por lasupresión de estados posteriores de la colonización.Nuevas isoformas
β 1,3 GlucanasaI
PR-1 Proteinas+
No se detectan cambios cuantitativos en proteinas y decremento en la transcripción en losestados posteriores.
Incremento discreto en la transcripciónLocalizadas alrededor de los arbúsculos vivos.
* Por sus siglas en inglb, + Proteinas relacionadas con la patogénesis1II En este sentido, la alfalfa (Medicago sativa) se ha empleado como modelo, ya que es unI1I huésped donde var ios patógenos y la acumulación de medicarpina una fitoalexina
isoflavonoide puede estar involucrada en la resistencia a ellos (Fig. 8).
29
Figura 8. Ruta de los fenilpropanoides en alfalfa (Tornado de Kapunik et al., 1996).
Las células en suspension de alfalfa responden a elicitores por la inducción de un pico de la
actividad de quitinasa y glucanasa, y los productos de la ruta de los fenilpropanoides se
acumulan; algunos de estos productos tienen actividad microbiana y algunos aparentemente
funcionan como moléculas de reconocimiento en las interacciones simbióticas (Volpin et al.,
1994; Kapulnik et al., 1996).
2.10. Los hongos micorrizicos como agentes protectores de enfermedades
Fitter y Garbaye (1994) señalan que existen relaciones de la micorriza con otros organismos
del suelo, y que estas pueden ser inhibitorias o estimulatorias, competitivas o mutualistica y
pueden observarse en todo el ciclo de vida del endófito, influyendo tambitn en la interacción
de las plantas con otros organismos del suelo, tanto en el caso de patogenos, como son los
nematodos y hongos, como con organismos mutualisticos, siendo particularmente notable en
el caso de bacterias fijadoras de notrógeno.
Iqbal et al., (1990), trabajaron en papa, la influencia de los hongos micorrizicos contra la
presencia de Rhizoctonia solani, encontrando en la variedad "Cardinal" que un incremento en
la colonización micorrizica, mejora el crecimiento y suprime la infección del patógeno.
30
Liu-Ro (1995) estudió los efectos de los hongos micorrizicos Glomus mosseae, G. versiforme
y Sclerocystis sinuosa contra Verticillium dahliae en las especies Gossypium hisutum y G.
barbadense, observando que ambas especies de algodon fueron colonizadas por las especies
de micorrizas, formando vesiculas y arbúsculos en las células corticales de la raiz después de
la inoculación. Cuando existió un infección por V. dahliae la colonización ocurrió más en la
punta de la raiz y 2 cm arriba.
Este mismo autor encontro, también, que cuando la micorriza y el patogeno se aplican
simultaneamente ambos reducen su porcentaje de infección, observando que la inoculación del
endófito reduce el número de microesclerotios germinados en la micorrizosfera, además de
que el número de esporas de las micorrizas es afectado en presencia del patogeno. Sin
Iembargo el porciento de arbúsculos en la raíces mostró una correlación negativa con los
grados de la enfermedad, lo que no ocurrió con el número de vesiculas.1
I Esto sugiere que existe cierta competencia y reacciones de antagonismo entre los hongosI micorrizicos y V. dehaliae. La micorriza redujo la incidencia y el índice de la enfermedad en
algodón durante todo su crecimiento, reflejándose en el número de flores, cápsulas, con una
consecuente mejora en la producción. Aunque todas las especies de micorriza fueron efectivas
se observó que G. versiforme fue la más efectiva y S. sinuosa fue la inferior.I
Catska (1994) señala que un micromiceto fitotóxico es el causante de la “enfermedad del
replante en manzana”, y que fue suprimida cuando las plántulas fueron inoculadas con Glomus
fasciculatum y G. macrocarpum, reflejándose en un mejor crecimiento dependiendo del tipo
de suelo. Así después de 12 meses de trasplantada la planta, la producción de biomasa se
incremento por la inoculación de G. fasciculatum, a la par el número de colonias formas por
unidad de suelo del micromiceto fitotóxico y de una bacteria diazotrofa (Azospirillum) se
vieron afectadas en la rizosfera, decreciendo en el caso del patogeno e incrementandose en el
caso de la bacteria, sugiriendo que la proporción en el número de colonias formadas por
unidad de suelo de la bacteria y del micromiceto fitotóxico, pueden ser empleadas como un
indicador del grado de la enfermedad del replante. El autor plantea que ciertos hongos
micorrizicos pueden reemplazar el tratamiento quimico del suelo para evitar la enfermedad.
31
2.11. La micorriza y su efecto en enfermedades foliares
Muchos estudios indican que las enfermedades causadas por bacterias decrecen al inocular
con hongos micorrizicos, pero las enfermedades por virus o algunos patogenos foliares son a
menudo incrementadas por los hongos micorrizicos, ya que reducen la respuesta de la planta
al estrés abiótico, como puede ser la sequia o la deficiencia de nutrimentos, que predisponen a
las plantas a infecciones bióticas de patogenos oportunistas (Dugassa et al., 1996).
Los factores que inducen una alta susceptibilidad en plantas colonizadas a patogenos del tallo,
aún no están bien definidos, a excepción de que los incrementos en el ingreso del fósforo
hacia la planta, posiblemente aumenten la infección de hongos biotroficos como por ejemplo
Puccinia lagenphorae en Senecio vulgaris.
Shaul et al., (1999) indican que el retardo en la senescencia es una posible razón para que las
plantas sean más susceptibles a patogenos foliares biotroficos, ya que estos dependen
fuertemente del suministro de asimilados de las hojas del huésped.
Así la simbiosis de los hongos micorrízicos arbusculares con la planta, altera los componentes
de la membrana celular tales como los esteroles libres en las rakes infectadas. Dicha
modificación en la parte area de la planta miconizada puede influir también en el desarrollo
de patogenos foliares biotroficos los cuales absorben nutrimentos del huésped via haustorios.
Por otra parte los microorganismos asociados con las raíces han sido ampliamente examinadospor su papel en suprimir de manera natural o inducida ciertas enfermedades del suelo, algunosde los cuales pueden extender esta efectividad al resto de la planta tras activar estosmecanismos de defensa, que pueden reducir la sintomatologia de algunas enfermedadesfoliares, ha este proceso se le ha referido como Resistencia Sistemica Inducida (RSI) oResistencia Sisttmica Adquirida (RSA) (Wei et al., 199 1; Kloepper et al., 1999; Shaul, 1999).La RSI difiere de los mecanismos de antagonismo, primero porque su acción esta basada en
mecanismos de defensa vegetal que son activados por agentes inductores; segundo, la RSI una
vez expresada, activa mecanismos de defensa potencial multiples, que incluye incrementos en
32
la actividad de quitinasas, β-1,3-glucanasa, peroxidasas y otras proteinas relacionadas con la
patogenesis, acumulación de sustancias antimicrobianas de bajo peso molecular, tales como la
lignina, callosa y proteinas ricas en hidroxiprolina y tercero, un importante aspecto de la RSI
es el amplio espectro de patógenos que pueden ser controlados con un simple agente inductor
(Spanu y Bonfante-Fasolo, 1988, Wei et al., 1996).
En este sentido Cordier et al., (1998) han reportado que la formación de la micorriza
arbuscular induce no únicamente una resistencia localizada, sino que puede inducir una
resistencia sisttmica en las rakes de tomate infectadas por P. parasittca. La cual es
caracterizada por una gran reducción en el daño de las rakes y en el desarrollo del hongo,
involucrando la acumulación de moléculas relacionadas con la defensa en asociación con la
alicitación de reacciones de la pared en las rakes del huésped.
Algo muy importante que se ha demostrado es el hecho de la disminución en el daño de tejido,
radical no inoculado del sistema micorrizado, lo que confirma que la liberación de moléculas
inducidas por la simbiosis micorrizica en las rakes pueden defender todo el sistema (Cordier
et al., 1998). Así mismo se ha planteado la posibilidad de un efecto compensatorio en plantas
inoculadas con HMA, encontrando que a pesar de que haya infección del patógeno en las
hojas, no exista una gran producción de las estructuras reproductivas y que los HMA
permiten que la planta tenga una buena producción de granos (Gemns et al., 2001).
33
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Desarrollo de plántulas de cafe (Coff ea arabica L.) var. Typica con micorriza yfertilizadas sin diferencias en el crecimiento.3.1.1. Preparación del semillero de cafe (Coffea arabica L.) var. Typica.
Se trabajo con semillas de cafe (Coffea arabica L.) var. Typica, provenientes de plantas de 7
años de edad, que se encuentran ubicadas en el Camps Experimental de Teocelo,
perteneciente al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias
(INIFAP), las cuales se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 10% por 15 min. y se
pusieron a germinar en una estufa a 30ºC, hasta la emergencia de la radicula. Posteriormente
se trasplantaron a macetas de plástico con capacidad de 400 g, las cuales contenian arena
esterilizada dos veces en autoclave a 120°C por 1 h. (Norman et al., 1996, St-Arnaud et al.,
1997, Arie et al., 1998, Duncan y Howard, 2000; Zhu et al., 2000) manteniendolas 35 o 40
dias en invernadero hasta que llegaron a su fase previa de la emergencia de las hojas
cotiledonales (Pereira et al., 1996).
3.1.2. Hongos micorrizicos arbusculares utilizados en el experimento.
La fuente del inoculante fue el consorcio micorrizico nativo MTZ-1, proporcionado por el
Laboratorio de Microbilogía de la Facultad de Ciencias Agricolas, campus Xalapa de la
Universidad Veracruzana y que está integrado por las especies: Gigaspora sp, Glomus
mossseae, Glomus geosporum y Glomus intraradices, con un 85% de infectividad al
momento de la inoculación en rakes de maiz crecidas en arena.
3.1.3. Trasplante de las plantulas de cafe (Coffea arabica L.) e inoculación de los HMA.
Plántulas de 60 dias de emergidas que ya tenían totalmente abiertas las hojas cotiledonales
(conocidas por los viveristas como fase de “mariposa”) fueron trasplantadas a macetas de
plástico con una capacidad de 1.0 Kg., que contenian sustrato a base de suelo:pulpa de cafe
(100% descompuesta) en una proporción 4:6, previamente esterilizado en autoclave por dos
veces a 120” C por 1 h. (Norman et al., 1996; St-Arnaud et al., 1997; Arie et al., 1998;
34
Duncan y Howard, 2000; Zhu et al., 2000), agregando 10 g del inoculante de HMA por
maceta, el cual se deposit6 a 4 cm de profundidad y se procedió a colocar las plantulas, para
despues presionar el suelo alrededor de la raíz y aplicar un riego ligero (Diaz y Honrubia,
1994). Con la finalidad de reestablecer la microbiota perdida al momento de la esterelización,
después del trasplante las plantulas fueron regadas con 10 ml de un tiltrado hecho con 100 g
I de sustrato sin esterilizar diluidos en 1 L de agua, empleando papel filtro Whatman No.I1 l(Arines et al., 1994; Monzón y Azcón, 1996; Pereira et al. , 1996).
Para las plantulas que recibieron los tratamientos de fertilización, se empleó como fuente de 1
fósforo al Superfosfato de Calcio Triple, completando 1 600 ppm Kg. -1, considerando que la
cantidad de fósforo original del sustrato era de 140 ppm. El fertilizante se aplicó previó al
trasplante, incubandolo en las macetas por 20 dias (Pereira et al., 1996; Saggin-Junior et al.,
1995).
3.1.4. Arreglo de los tratamientos y diseño experimental
Con base en la combinación del uso de la fertilización con fósforo, inoculación de hongos MA !
y uso de tiltrado se obtuvieron 8 tratamientos (Cuadro 3)
ICuadro 3. Descripción de los tratamientos evaluados./
Factor Tratamientos! Fertilización H M A Filtrado
(P) ( M ) (F)Si No Si PFSi N o No P
1 Si Si Si PMFI Si Si No P M
! No Si Si M FNo No Si F
! No Si No MNo No No T (testigo)
!El experimento fire con arreglo trifactorial y una distribución completamente aleatorizada con
un total de 8 tratamientos y 5 repeticiones, con 4 plantas como parcela experimental, teniendo
un total de 160 unidades experimentales, las cuales se manejaron en condiciones de
invernadero con humedad relativa entre 70 y 90% y temperatura entre 22 y 26ºC. Los datos
1I
35
obtenidos fueron analizados empleando el programa M-STAT ( Michigan State University, E.
Lansing, MI. USA).
3.1.5. Parámetros evaluados3.1.5.1. Parámetros de crecimiento
Después de establecido el experimento, se midió cada 15 dias a las plantas: altura en cm, de
la base hasta el meristemo apical; diametro del tallo, a 2 cm de altura de la base del tallo y
número de hojas, sin considerar las cotiledonales (Siqueira y Saggin-Junior, 1998).
3.1.5.2. Producción de biomasa y area foliar
El peso fresco y seco de las plantas se determinó al final del experimento empleando una
balanza digital Sartorius BL 3 100, el peso seco del material vegetativo se obtuvo mantenido
los tejidos en una estufa a 70” C, hasta alcanzar peso constante, con los resultados se calculo
la relación parte aérea/raíz (Tawaraya et al., 1993; Ravnskov et al., 1995; Pereira et al., 1996;
Mendoza y Borie, 1998; Zhu et al., 2000). El area foliar total se obtuvó con un medidor
portátil CI-202, modelo SE4 1 OG de la empresa CID.
3.1.5.3. Evaluación de la severidad de Phoma costarricensis Echandi
Para conocer la ocurrencia de Phoma costarricenis Echandi en invernadero se registró cada
15 dias después del trasplante la severidad de la enfermedad utilizando la metodologia
propuesta por Dugassa et al., (1996), y una escala propuesta por Trejo (1997), donde se
sugieren cinco clases (Cuadro 4)
Cuadro 4. Escala para medir la severidad de Phoma costarricencis Echandi
Escala descripción0 Sin infección1 5 % del área foliar enferma2 20% del área foliar enferma3 40% del área foliar enferma4 60% del área foliar enferma5 + del 60% del área foliar enferma
36
Con los valores de la escala, se calculó el Índice de Severidad (IS) de la enfermedad utilizando
la formula:
d o n d e :
Índice de Severidad (IS %) = ( ∑ (nxb)/(NxB) x 100
n = Número de plantas de la misma clase
b = Clase
N = Número total de plantas medidas
B = Número total de clases
3. I .5.4. Estimación del porciento de colonización
Para evaluar el porcentaje de colonización MA en las raíces inoculadas se utilizó la técnica de
Phillips y Hayman (1970), realizando observaciones al microscopio óptico de 100 segmentos
para cada tratamiento con sus respectivas repeticiones. En la estimación del porciento de
colonización se revisó cada uno de los segmentos, realizando tres pasajes equidistantes sobre
cada fragmento y cada vez que una parte de la raíz fue atravesada por el campo óptico y que
contuviera hifas, vesículas o arbúsculos, se le dio el valor de 1, para cada estructura y en base
al número de observaciones. Para posteriormente estimar el porciento de colonización
micorrizica, este parámetro se midió al final del experimento, cuando las plantas completaron
260 dias después de la inoculación.
Con los resultados se realizó un análisis de varianza y cuando existieron diferencias entre los
tratamientos, se separaron las medias utilizando la prueba de Tukey con un nivel de
significancia del 5%.
3.2. Crecimiento vegetativo y severidad de Phoma costarricensis Echandi en plantas de cafeinoculadas con HMA y/o fertilizadas con fósforp crecidas en vivero
El experimento se realizó en el Campo Experimental de Teocelo, perteneciente al Instituto
Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecurias (INIFAP), siguiendo las
pricticas de manejo que se práctican normalmente en dicho centro de investigaciones.
37
3.2.1. Preparación del semillero de cafe
Se trabajó con semillas de cafe (Coffea arabica L.) var. Typica, con una preparación del
semillero, similar a la del primer experimento (inciso 3.1.1. pag. 32).
3.2.2. Hongos micorrizicos arbusculares utilizados en el experimento
Se empleó el consorcio micorrizico nativo MTZ-1, el cual fue proporcionado por el
Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Agricolas, campus Xalapa de la
Universidad Veracruzana y que está constituido por las especies: Gigaspora sp, Glomus
mossseae, Glomus geosporum y Glomus intraradices, con un 85 de infectividad al momento
de la inoculación.
3.2.3. Trasplante de las plantulas de cafe e inoculación de HMA
Plántulas de 60 dias de emergidas que ya tenián totalmente abiertas las hojas cotiledonales
(conocidas por los viveristas como fase de “mariposa”) fueron trasplantadas a bolsas de
polietileno negro con una capacidad de 3.5 Kg. que contenian sustrato a base de suelo2:pulpa
de cafe (100% descompuesta) en una proporción 4:6, previamente esterihzado con Dazomet
(Basamid) a una dosis de 125 gm.m-2 (el cual se revolvió y ventiló por 15 dias) (Fraedrich y
Dwinell. 1997; O'Neill y Mitchell, 1999), agregando 10 g del inoculante de HMA por bolsa,
el cual se deposit6 a 4 cm de profundidad y se procedió a colocar laslas plantulas, para después
presionar el suelo alrededor de la raiz y aplicar un riego ligero (Diaz y Hom-ubia, 1994).
Para las plantulas de los tratamientos con fertilización, se empleó como fuente de fósforo al
Superfosfato de Calcio Triple, a razón de 1 600 ppm Kg.-1, considerando que la cantidad de
fósforo original del sustrato era de 28 ppm. El fertilizante se aplicó previó al trasplante,
incubandolo en las macetas por 20 dias (Pereira et al., 1996; Saggin-Junior et al., 1995.)
2 El suelo fue tornado del campo experimental, siendo distinto al empleado en el caso de la pag. 33.
38
3.2.4. Arreglo de los tratamientos y diseño experimental
En el Cuadro 5 se anotan los distintos tratamientos obtenidos al combinar la presencia de
hongos micorrízicos, la fertilización y esterilización del sustrato.
Cuadro 5. Descripcidn de los tratamientos que evaluados
Fertilización HMA Sustrato esttril( P ) (M) (SE, SSE*)Si Si SiSi Si NoSi No SiSi No No
No Si SiNo Si NoNo No SiNo No No
*SE: Sustrato esttril; SSE: Sustrato sin esterilizar
Tratamiento
SEPMSSEPMSEPSSEPSEMSSEMSESSE
El diseño fue en arreglotrifactorial con una distribución en bloques al azar con un total de 8
tratamientos y 5 repeticiones, con 4 plantas como parcela útil, teniendo un total de 160
unidades experimentales, los datos fueron analizados empleando el programa M-STAT
(Michigan State University, E. Lansing, MI. U.S.A).
Parámetros evaluadosParámetros de crecimiento
3.2.5.3.2.5.1
A las plantas se les midió para cada uno de los tratamientos: Altura total de la planta;
diámetro de tallo con un vernier digital a 2 cm de altura de la base y número de hojas, sin
considerar las cotiledonales, todos estos parámetros se registraron desde el trasplante hasta los
260 dias posteriores, con una periodicidad de 15 dias (Siqueira y Saggin-Junior, 1998)
3.2.5.2. Producción de biomasa y area foliar
El peso fresco y seco de las plantas se determinó al final del experimento (260 dias después
del trasplante) empleando una balanza digital Sartorius BL 3 100, y para el caso del peso seco,
el procedimiento fue similar al señalado en el inciso 3.1.5.2. (Pág. 34).
39
El area foliar se determinó con un medidor portátil CI-202, modelo SE410G de la empresa
C I D .
3.2.5.3. Evaluación de la severidad de la enfermedad
La severidad de Phoma costarricensis Echandi fue medida de manera similar a la forma
indicada en el inciso 3.1.5.4. (Pág. 35) empleando la formula de Dugassa et al. (1996) y la
escala propuesta por Trejo (1997).
3.2.5.4. Estimación del porciento de colonización
Para evaluar los niveles de colonización MA se utilizó la técnica establecida por Phillips y
Hayman (1970).
Con los resultados obtenidos se realizó un análisis de varianza y cuando se estableció
diferencias significativas entre los tratamientos, las medias se separaron utilizando la prueba
de Tukey con un nivel de significancia al 5%.
3.3. Influencia de la inoculación controlada de Phoma costarricensis Echandi en elcrecimiento vegetativo y patron de regulación de intercambio gaseoso de plantas de cafeinoculadas con HMA o fertilizadas con fósforo.
Previó a la evaluación de la influencia del patógeno en plantas inoculadas con HMA o
fertilizadas con fósforo, se procedió al aislamiento y evaluación del número de conidios
necesarios para manifestar la sintomatologia de la enfermedad.
3.3.1. Producción de inóculo de Phoma costarricesis Echandi.
Phoma costarricensis Echandi fue aislado de material infectado proveniente de viveros
comerciales dedicados a la producción de plantas de cafe (Heiny, 1990) realizando el
aislamiento en cajas Petri que contenian medio agar-jugo V8, a partir de un picnidio. Una vez
realizada la siembra, las cajas se mantnvieron a 20°C en plena oscuridad (Gómez y
40
Bustamante, 1976), a los 8 dias se realizó una revision al microscopio óptico ( YS2T)
para observar que no hubiera contaminación y que existieran estructuras reproductivas del
hongo (Perez y Salazar, 1978).
3.3.2. Verificación de sintomas y evaluación del número de conidios para promover el daño dePhoma costarricensis Echandi. en plantulas de cafe.
Una vez que se contaba con el aislamiento y que el hongo habia crecido en el medio nutritivo,
1 se realizó una prueba para verificar su sintomatologia y la concentración en que se
manifestaban los daños en plantulas de cafe, evaluando:
I - Suspension de conidios con 3 diferentes concentraciones [500, 100, 1 .6 x 105 conidios
por ml.] (Denoyes y Baudry, 1995; Smith et al., 1997; Arie et al., 1998.) y
/ - Empleo de secciones circulares de medio nutritivo de 0.3 cm de diametro, que contieneI
conidios patogeno y que se colocan de manera directa en el haz de la hoja (Wade et
al., 1995; Heiny, 1994; Salzer et al., 2000).
L
Para ello, se utilizaron plantulas de 60 dias de emergidas (estado de “mariposa”) las cuales seIL1 produjeron según la metodologia señalada en el inciso 3.1.1 (Pág. 32) y 3.1.3 (Pág. 32).
IUna vez que las plantulas (5 repeticiones para cada prueba) se habian trasplantado a las
I macetas, estas fueron inoculadas en hojas, que previamente fueron lesionadas conIII carborundum, con conidios de P. costarricensis Echandi producidos durante las últimas 24 h,
los cuales fueron lavados con agua destilada y filtrados a través de una gasa doble (Bostock et
al., 1999; Quintero y Buritica, 1976).
Después de inoculación del patogeno, las plantulas se mantuvieron en una cámara húmeda contemperatura controlada a 20°C y 70% de humedad relativa y un fotoperiodo de 3 h de luz y 21h de oscuridad (Gómez y Bustamante, 1976; Quintero et al., 1976), adicionalmente a lasmacetas se les colocó una bolsa de plástico para evitar contaminación de un tratamiento a otro
Iy también para mantener un ambiente de elevada humedad relativa (Shaul et al., 1999).Cuando se tuvo la certeza de que se contaba con Phoma costarricensis Echandi y que se
Iconocia el número de conidios que mejor expresaba los daños de la enfermedad se procedió al
41
establecimiento del experimento para medir el crecimiento vegetativo y el patron deregulación de intercambio gaseoso de plantulas de cafe (Coffea arabica L.) inoculadas conhongos micorrizicos arbusculares y fertilizadas con fósforo.
3.3.3. Crecimiento de plantas de café
El manejo de las plantulas en semillero y los cuidados requeridos se hicieron de manera
similar a lo indicado en el punto 3.1. 1. de esta metodologia (Prig. 32).
3.3.4. Inoculación con HMA y fertilización con fósforo en plantulas de cafe
La cantidad de inóculo de la micorriza arbuscular y concentración de fósforo empleada fue
igual que la empleada para el inciso 3.1.2 (Pág. 32).
3.3.5. Inoculación de Phoma costarricensis Echandi. en plantulas de cafe inoculadas conHMA y fertilizadas con fósforo.
Contando ya con plantas fertilizadas e inoculadas con HMA, se procedió a establecer elexperimento en donde plantas sin diferencias en su crecimiento fueron inoculadas con elpatógeno.
La inoculación de Phoma costarricensis Echandi se realizó a los 168 dias después de lainoculación de los HMA y la fertilización, ya que se observó una respuesta positiva atribuida ala fertilización y/o la inoculación con HMA (Cordier et al., 1996). La dosis empleada parapromover la infección del patogeno fue de 500 picnidios/ml y posterior a una lesion físicarealizada con carborundum en un area de un centimetro cuadrado en dos hojas cotiledonales,dos hojas intermedias y dos hojas jóvenes.
Después de que las plantulas fueron infectadas se mantuvieron en una cámara con temperatura
controlada a 20°C y 70% de humedad relativa y un fotoperiodo de 3 h de luz y 21 h de
oscuridad, para así asegurar la proliferación y permanencia de la enfermedad (Gómez y
Bustamante, 1976; Quintero y Buritica, 1976), adicionalmente las macetas se colocaron en
una caja de estructura de madera de. 60 x 60 x 70 cm, cubierta con plástico transparente calibre
800, para crear un ambiente de alta humedad relativa (Shaul et al., 1999).
42
En el Cuadro 6 se muestran los tratamientos resultantes para evaluar la severidad de la
enfermedad foliar en plantas fertilizadas e inoculadas, estos tratamientos son producto de los
mejores resultados en el experimento del inciso 3.1. (Pig. 32), por ello es que no existe una
ortogonalidad en la distribución de los mismos.
Cuadro 6. Tratamientos evaluados para el experiment0 de plantas inoculadas v fertilizadas.Micorriza Fertilización Filtrado
( M ) (P) ( F )N o Si N oSi N o N OSi N o S i
N o N o N o
Tratamientos
PMM FTestigo
El diseño experimental empleado fue completamente aleatorizado con 4 tratamientos y 12
repeticiones, teniendo un total de 48 unidades experimentales, los datos fueron analizados
empleando el programa M-STAT (Michigan State University, E. Lansing, MI. U.S.A).
3.3.6. Parámetros evaluados
3.3.6.1. Parámetros de crecimiento y colonización de HMA.
La altura de la planta y número de hojas sin considerar a las cotiledonales fueron evaluados
cada 7 días, al final del experiment0 (200 dias después del trasplante) se midió peso seco y
peso fresco de follaje y raiz y el porciento de colonización de HMA según la metodologia
expuesta para el experimento del inciso 3.1. )Pág. 32).
Con los resultados obtenidos se realizó un análisis de varianza y cuando hubo diferencias entre
los tratamientos, las medias se separaron utilizando la prueba de Tukey con un nivel de
significancia al 5%.
3.3.6.2. Evaluación de la severidad de la enfermedad
Para este experimento, la metodologia consistió en marcar una superficie de 1 cm2, en dos
hojas apicales las cuales se identificaron con los número 1 y 2; dos hojas intermedias,
reconocidas como 3 y 4; dos hojas cotiledonales que se identificaron como 5 y 6. En cada hoja
43
se evaluó el porcentaje de infección del area delimitada a los 10, 15 y 20 dias después de la
inoculación de Phoma costarricensis Echandi y con estos resultados el indice de severidad de
la enfermedad conforme la metodologia indicada en el inciso 3.1.5.4. (Pag.35).
3.3.6.3. Patron de regulación de intercambio gaseoso de plantas de cafe (Coffea arabica L.)
La asimilación de CO2, transpiración en las hojas de las plantas y conductancia estomatica se
evaluó en 3 fechas: a) previó a la inoculación del patógeno, b) al momento de la inoculación
de Phoma costarricensis Echandi, y c) 20 dias después, con un analizador de gas CO2/H2O
modelo TPS- 1.
44
IV. RESULTADOS
4.1. Desarrollo de plantulas de cafe var. Typica con hongos micorrizicos y fertilizadas sindiferencias en su crecimiento.
4.1.1. Parámetros de crecimiento
El análisis de varianza permitió establecer diferencia significativa (P < 0.05) para las
variables: altura, diametro y número de hojas en el caso de las plantas de los tratamientos PF,
P, MFP, MP, MF y M, siendo diferentes a aquellas que correspondieron al testigo (T) y a las
que se les agregó solo filtrado (F).
El crecimiento vegetativo de las plantulas de cafe sometidas a estos tratamientos mostraron
una tendencia similar para las variables medidas, evidenciando un crecimiento lineal. A los
120 dias después del trasplante (ddt) ya habia diferencia significativa entre las plantas de los
tratamientos T y F con respecto a los demás para el número de hojas. En el caso del diametro
y altura, la diferencia estadisticas se observaron hasta los 160 dias (Cuadro 7).
Estos resultados demuestran que las plantulas de cafe en sus primeras etapas de crecimiento,
requieren de un buen suministro de fósforo, ya que de lo contrario su crecimiento será
limitado y por consecuencia podrán ser más susceptibles al daño de patógenos o factores
adversos. Así las plantas que crecieron en suelo fumigado respondieron m á s rapidamente al
fósforo, que aquellas que fueron inoculadas, evidenciando la alta exigencia del cafe a este
nutrimento (Fig. 9).
Por otra parte result6 interesante observar, que las plantas que crecieron en el sustrato estéril
más filtrado (F), tuvieron un comportamiento similar a las que de suelo estéril (Testigo). En
/ cambio las plantas inoculadas con hongos micorrizicos más el filtrado (MF), crecieron más
que las M, mostrando un efecto favorable del filtrado para los HMA durante la simbiosis.
I 45
46
I I I I I
Figura 9. Altura, diámetro ynúmero de hojas de plantulasde café con adición de HMAy/o fósforo.
47
4.1.2. Producción de biomasa, area foliar y porciento de colonización MA de plántulas decafe crecidas en invernadero
La producción de biomasa expresada como peso seco desarrollado por las plantas de los 8
tratamientos, fue evaluada a los 200 ddt, se determinó que tanto el peso seco de la parte aérea
y total, como el area foliar, presentaron diferencias significativas (P < 0.05) con respecto a las
plantas del T (testigo) y F (filtrado). Mientras que para el peso seco de la raiz y relación
tallo:raiz, no existió diferencia significativa (P < 0.05) (Cuadro 8).
Cuadro 8. Producción de biomasa y área foliar de plántulas de café, a los 200 dias después deltrasplante.
Tratamientos Peso Peso Peso Relación A r e a Colonización
seco f o l l a j e Seco raíz seco t o t a l tallo:raíz foliar M A
( g ) ( g ) ( g ) ( c m 2 ) ( % )
PF 1 .OOa* 0.73ab 1.72a 1.36a 231.7a 8.16d**
P 1.05a 0.93a 1.97a 1.14abc 226.79a O.OOf
MFP 1.05a 0.77ab 1.83a 1.38a 190.90a 10.76cd
M P 1.05a 0.83a 1.88a 1.37a 229.99a 14.50c
M F 0.90a 0.77ab 1.67a 1.21ab 176.76a 42.96a
F 0.13b 0.25c 0.38b 0.50c 10.03b 2.60c
M 0.88a 0.63abc 1.50a 1.42a 149.24a 23.60b
T 0.23b 0.38bc 0.60a 0.62bc 9.92b 1 .OOef
* Valores con la misma letra son estadisticamente equivalentes (P < 0.05), ** Los datos se transformaron pararealizar el análisis de varianza con la formula raiz (x+1).
Los efectos de la fertilización con fósforo fueron reflejados en la mayor producción de
biomasa y area foliar, evidenciando la alta exigencia del cafe a este nutrimento. Las plantas
inoculadas con hongos MA más filtrado (MF) presentaron una mayor producción de biomasa
con respecto a las solo inoculadas (M).
Los mayores valores de colonización micorrizica fueron registrados en las plantas de los
tratamientos MF (inoculadas con HMA más filtrado) y las M con un 42.96 y 23.60%
respectivamente, con diferencia estadisticamente significativa en relación con los demás
ratamientos.
48
4.1.3. Evaluación de la severidad de Phoma costarricensis Echandi en plantas de caféinoculadas con HMA y/o fertilizadas crecidas en invemadero.Se evaluó la ocurrencia natural de Phoma costarricensi Echandi, bajo condiciones de
invemadero, observando que las plantas de los tratamientos F y Testigo fueron las que más se
enfermaron, con valores del 100% de severidad a los 140 y 165 ddt (Fig. 10).
Dias después del trasplante
Figura 10. Índice de severidad de Phoma costarricensis Echandi en plántulas de café crecidas eninvemadero fertilizadas con P y/o inoculadas con HMA.
De manera general se estableció que a los 90 ddt en todas las plantas, a excepción de las
inoculadas con HMA, existe una disminución en la severidad de la enfermedad, para luego
volver a incrementarse a los 140 dias y nuevamente bajar a los 165 ddt, evidenciando que la
planta presenta periodos de recuperación, caso particular fue el de las plantas inoculadas con
HMA (M) las cuales en un principio presentaron 20% de severidad de la enfermedad pero
conforme transcurrió el tiempo la tendencia fue a disminuir, para que en la última evaluación
(165 ddt) fueran las que menor índice de severidad de la enfermedad mostraron.
49
4.2. Crecimiento vegetativo y severidad de Phoma costarricensis Echandi en plantas de caféinoculadas con MMA y/o fertilizadas con fósforo crecidas en vivero.
4.2.1. Parámetros de crecimiento
Se encontro que el crecimiento fue muy lento durante los primeros 160 dias después de
trasplante (ddt), evidenciandose en una altura, diametro y número de hojas similar para las
plantas de todos los tratamientos, fue hasta 1os 200 ddt que hubo un incremento para cada una
de las variables medidas, pero aún sin existir diferencia significativa, a excepción del número
de hojas donde se manifesto un efecto significativo (P> 0.05), las plantas crecidas en suelo
esteril (SE) presentaron el menor número.
En la última evaluación (240 ddt), existió diferencia signifkativa, donde todas las plantas
crecier on de manera similar a excepción de las de SE. Lo anterior indica que las plantas
pueden crecer igual al ser fertilizadas con P y/o inoculadas con HMA.
Se encontro tmabién, que cuando las plantas son trasplantadas en un sustrato esteril (SE) sin
fertilización inorganica y/o sin la incorporación de un inoculante como los HMA, estas no
crecen de manera satisfactoria.
A diferencia de los estudios en invemadero (sección 4.1.1. Fig. 9. Pág. 45) en que la respuesta
de las plantas comenzó a los 80 ddt, para el presente experimento esta se dio hasta los 200 ddt,
pudiéndose atribuir a la fluctuación diuma de temperatura y humedad que ocurrieron en el
vivero.
Otro aspecto interesante de resaltar fue el relacionado con la esterelización del sustrato, ya que
no existieron diferencias en el crecimiento entre plantas crecidas en sustrato estéril y sin
esterilizar, salvo el caso ya referido de las plantas que crecieron únicamente en sustrato esteril
(SE) (Fig. 11).
50
I I I
Dias después del trasplante
Figura 11. Altura. ndmero deh o j a s , y diámetro d e plantasfertilizadas con P y/o inoculadascon HMA, crecidas en vivero.
51
4.2.2. Producción de biomasa, area foliar y porciento de colonización de plantas de cafécrecidas en vivero.
Los efectos de la inoculación de HMA (consorcio nativo MTZ1) y de la fertilización con
fósforo en la producción de biomasa, area foliar y porciento de colonización micorrizica se
muestran en el Cuadro 9. existió a los 240 dias despues del trasplante diferencia significativa
(P< 0.05) para todas las variables evaluadas a excepción del area foliar. Las plantas de SE
fueron las que mostraron menor producción de biomasa. Estos resultados establecen que no
hay diferencias en la producción de biomasa entre plantas que son crecidas en un sustrato
estéril y no esterilizado.
Cuadro 9. Producción de biomasa y area foliar de plántulas de cafe, a los 240 dias después deltrasplante.
Tratamientos Peso Peso Peso Relación A r e a f o l i a r Colonización
seco follaje seco raiz seco total tallo:raiz M A
(g) (g) (g) (cm2) (%)
SEMP 5.75a* 1.14a 6.89a 4.79a 1151.24a 13.82c
SSEMP 3.46a 0.86a 4.32a 4.11a 639.45ab 10.22cd
SEP 3.88a 0.83a 4.71a 4.66a 772.60ab 3.60de
SSEP 4.79a 0.93a 5.72a 5.14a 821.99ab 6.00de
SEM 3.91a 0.8a 4.72a 4.87a 848.38ab 27.00ab
SSEM 4.88a 1.13a 6.01a 4.46a 696.35ab 32.02a
SE 0.66b 0.34b 1 .OOb 1.91b 127.58b 2.00e
SSE 4.20a 0.86a 5.06a 4.88a 692.49ab 22.00b
* Valores con la misma letra son estadisticamente equivalentes (P < 0.05).
La colonización micorrizica fue estadisticamente diferente en SSEM, SEM y SSE comparada
con la de los otros tratamientos, evidenciando que existe una colonización MA natural en las
plantas crecidas en el sustrato sin esterilizar (SSE) por un lado, y por otra parte es probable
que haya habido un efecto positivo al momento de agregar el inoculante nativo MTZ- 1, ya que
las plantas que crecieron en sustrato sin esterilizar y fueron inoculadas con HMA fueron las
que mayor colonización tuvieron.
52
4.2.3. Evaluación de la severidad de Phoma costarricensis Echandi en plantas de cafe crecidasen vivero.
En la Fig. 12 se muestra la respuesta de las plantas de cafe a la severidad de Phoma
costarricensis Echandi, expresada como índice de severidad. Se encontr6 que en condiciones
de vivero la enfermedad tiende a presentar dos momentos de mayor incidencia a los 80 y 160
dias después del trasplante.
Después de los 200 ddt, las incidencia de la enfermedad disminuye de manera general, para
las plantas de todos los tratamientos, a excepción de las que crecieron en suelo estéril (SE) que
fueron las que mayor severidad de la enfermedad evidenciaron, durante todo el experimento.
Figura 12. de severidad de Phoma costarricensis Echandi en plántulas de café crecidasen vivero fertilizadas con P y/o inoculadas con HMA.en vivero fertilizadas con P y/o inoculadas con HMA.
Las plantas a las que se les agregó el inoculante nativo MTZ-1 solo presentaron el pico de alta
severidad de la enfermedad a los 80 ddt, y a partir de ese momento la enfermedad tendió a
disminuir conforme transcurria el tiempo, siendo las plantas que menor índice de severidaddisminuir conforme transcurria el tiempo, siendo las plantas que menor índice de severidad
Dias después del trasplante
presentaron a 240 ddt, mostrando un efecto positivo de la incorporación del inoculante.
53
4.3. Influencia de la inoculación controlada de Phoma costarricensis Echandi en elcrecimiento vegetativo y en el patron de regulación de intercambio gaseoso de plantas de caféinoculadas con HMA o fertilizadas con fósforo.
4.3.1. Número de conidios suficiente para provocar los sintomas de Phoma costarricenciesEchandi.
Se encontro que la aplicación de 500 conidios de Phoma costarricensis Echandi aplicados de
manera directa a las hojas, después de haberlas lesionado con carborundum, fue la
concentracion que mejor permitió manifestar la sintomatologia de la enfermedad en plantulasde cafe en condiciones controladas, a los 10 y 20 dias después de la inoculación del patogeno(Cuadro 10).
Cuadro 10. Número de conidios de Phoma costarricensis Echandi presentes en hojas de plantulas decafe a los 10 y 20 dias después de la inoculación del mismo patógenoNúmero de conidios de Phoma Dias después de la inoculación del patógeno
costarricensis aplicado 10 20
Sección circular o.oc 3.2c
Concentrado (1.6 x105 3.0b
1000 2.4b
500 6.8a* Valores con la misma letra son estadisticamente equivalentes (P < 0.05).
3.4c
5.20b
17.2a
Con estos resultados se procedió a evaluar la interacción existente en plantulas de caféfertilizadas con fósforo y/o inoculadas con un complejo nativo (MTZ-1) y Phomacostarricensis Echandi en condiciones controladas.
4.3.2. Par&metros de crecimiento
El análisis de varianza estableció diferencia signifkativa (P < 0.05) para la altura a los 160 y200 ddt, siendo las plantas del Testigo y P las que menor altura mostraron, con respecto a lasde los tratamientos M y MF.
Para el número de hojas también existió diferencia significativa (P< 0.05) solo que las planta
del Testigo mostraron la menor cantidad de hojas (Fig. 13). Estos resultados muestran que la
plantas de los tratamientos P, M y MF llegaron con un número de hojas similar a 1a
inoculación del patogeno.
54
.
.
?
Dias después del trasplante
Figura 13. Altura y número de hojas de plantas de café fertilizadas con P y/o inoculadas con HMA,crecidas en condiciones controladas.
4.3.3. Producción de biomasa y porciento de colonización de plantas de café crecidas encondiciones controladas
La producción de biomasa expresada como peso seco desarrollado por las plantas de los 4
tratamientos del experiment0 fue medida a los 200 dias después del trasplante (Cuadro 11). Se
encontró que para el peso seco del follaje hubo diferencias significativas (P <0.05) en las
plantas de los tratamientos P, M y MF con respecto a las T, siendo las de menor producción.
55
Para el peso seco de la raiz las plantas del tratamiento M tuvieron una menor producción, en
comparación a las de los demás tratamientos, sobresaliendo las plantas del tratamiento P y del
Testigo.
Cuando se analizó el peso seco total, las plantas del tratamiento MF fueron las que mayor
producción registraron, con diferencia significativa (P< 0.05) con respecto a los otros tres
tratamientos. 1
Cuadro 11. Producción de biomasa de plántulas de cafe, a los 200 dias después del trasplante.
* Valoresel análisis de varianza con la formula raiz (x+ 1).
Tratamientos Peso Peso Peso Relación Colonización
P
seco follaje seco raiz seco total tallo:raíz M A(g) (g) (g) (%)
0.33a* 0.16a 0.49b 2.15ab 2b**
M 0.37a 0.11b 0.47b 0.39a 29”
MF 0.54a 0.15a 0.69a 3.58a 31a
T e s t i g o 0 . 2 4 b 0 . 1 6 a 0 . 4 1 b 1 . 5 8 b o c
con la misma letra son estadisticamente iguales (P < 0.05). ** Los datos se transformaron para Irealizar
En el caso de la relación tallo:raiz no hubo diferencia significativa (P<0.05) entre
tratamientos, es de resaltar que las plantas de los tratamientos M y MF fueron las de mayor
proporción. El porciento de colonozación micorrízica fue similar en las plantas de los
tratamientos M y MF.
4.3.4. fndice de severidad de Phoma costarricensis Echandi en plantas de cafe inoculadas conHMA o fertilizadas con P en condiciones controladas.
Se evaluó el índice de severidad (IS) de Phoma costarricensis Echandi en plantas de cafe que
tenían 200 dias de haber sido inoculadas con HMA o fertilizadas con P y que crecían en
condiciones controladas, se observó que las plantas que menos se enfermaron fueron las de los
tratamientos M y MF, seguidas por las fertilizadas con P (Fig. 14).
A los 10 dias después de la inpculación (ddi) del patógeno, el índice de severidad fue similar
en todos los casos, pero a los 15 y 20 ddi del patógeno las plantas a las que se le habia
56
incorporado el inoculante HMA (M y MF) presentaron valores de IS inferiores al 35%,
mientras que las plantas fertilizadas con P tuvieron un IS del 44.8%.
Figura 14. Índice de severidad de Phoma costarricensis Echandi en plántulas de cafe fertilizadasTiempo en dias
con P o inoculadas con HMA, en tres fechas después de la inoculación del patógeno.
4.3.5. Actividad metabólica de plantas de cafe. inoculadas con HMA o fertilizadas con Pinfectadas con Phoma costarricensis Echandi.
Se midió la transpiración de la hoja, conductancia estomatica y tasa de
incorporación/asimilación de CO2, como indicadores de la actividad metabolica de las plantas
en estudio.
En el primer registro, previo a la inoculación del patógeno (que muestra la circunstancia en
que se encontraban las plantas sin ningún factor adverso), se observa que las plantas M y MF
presentan una mayor transpiración y conductancia estomatica de las hojas con respects a las
plantas del tratamiento Testigo y P. Lo que evidencia que estas plantas mantienen sus estomas
más tiempo abiertos, teniendo una mayor probabilidad de captar CO2.
En lo que se refiere a la asimilación de CO2 (recuerdese que valores positivos en la Fig. 14
indican captación de CO2, y valores negativos significa asimilación), las plantas MF son las
57
que mejor se comportan ya que son más eficientes, por lo que se consider-o que eran las que
mayor actividad fotosintetica tenían en ese momento (Fig. 15).
Al momento de la inoculación del patogeno, las plantas del tratamiento M (durante todo el
tiempo de la medicion) evidenciaron mayor tasa de transpiración y conductancia estomatica,
que las de los otros tratamientos (MF, P y Testigo). Las plantas del tratamiento P inician con
valores similares a las plantas de los tratamientos M y MF, pero posteriormente desciende
rapidamente, cerrando sus estomas, para que a las 12:30 h los vuelvan abrir.
Aunque similar en su comportamiento de asimilacion de CO2, los cuatro tratamientos, las
plantas del tratamiento M son las que mayores valores presentaron (Fig. 15).
A los 20 dias después de la inoculación del patogeno no hubo diferencia en la transpiración y
en la conductancia estomatica de las plantas de los cuatro tratamientos, ya que se mantuvieron
con los estomas casi cerrados durante el tiempo que duró el registro.
Cuando se midió la asimilacion de CO2, se observo que las plantas del tratamiento MF fueron
las que mayor actividad tuvieron, mostrando una eficacia fotosintetica mayor, sin que afectará
la baja conductancia estomatica que en este momento tenián (Fig. 16).
58
estomática y asimilación de CO2 en plantasde café inoculadas con HMA o fertilizadascon P, previo a la inoculación de Phomacostarricensis Echandi.
Figura 15. Transpiracion, conductancia
59
Figura 16. Transpiración, conductanciaestomática y asimilación de CO2 en plantasde café inoculadas con HMA o fertilizadascon P, al momento de la inoculación dePhoma costarricensis Echandi.
60
estomática y asimilación de CO2 en piantasde café inoculadas con HMA o fertilizadascon P, 20 dias después de la inoculación dePhoma costarricensis Echandi.
61
Figura 17. Transpiración, conductancia
En la Fig.17 se muestra la respuesta durante las 3 fechas de la evaluación, se observa que las
plantas de todos los tratamientos inician con valores elevados en su actividad respiratoria,
conductancia estomatica y transpiración desde el momento previo a la inoculación del
patógeno (-3 dias en la Fig.), hasta valores muy bajos 20 dias después de que las hojas se
infectaron con el patogeno. Probablemente porque el area foliar capaz de realizar esta acción
disminuyó por las lesiones provocadas por Phoma costarricensis Echandi, no obstante este
comportamiento resaltan las plantas de los tratamientos M y MF que fueron las que mejor
respondieron al estrés provocado por las lesiones del hongo durante todo el tiempo.
Figura 18. Transpiración de la hoja,conductancia estomática y asimilaciónde CO2 de plantas de café inoculadascon HMA o fertilizadas con P.
62
V. d i s c u s i ó n
El uso de plantas con crecimiento similar fue esencial en esta investigación para determinar
los efectos y las interacciones de la inoculación de HMA, inoculación del patógeno y la
ferytilización con P. Los resultados del primer experiment0 mostraron que plantas fertilizadas o
inoculadas con HMA pudieron tener un crecimiento semejante y que no hubo variación en la
producción de biomasa.
En este sentido el primer objetivo que era de contar con plantas con crecimiento similar se
cumplió y se pueden resaltar algunos aspectos que son relevantes como producto del primer
experimento.
Los resultados que las plantas de cafe crecidas en invernadero, manifiestan la efectividad de la
colonización micorrizica a partir de los 120 dias después de la inoculación del endófito (Fig.
9). Saggin-Junior et al., (1992) indican que a los 4 meses de edad las plantas de cafe ya están
colonizadas. Esta colonización efectiva se manifiesta en los resultados obtenidos en la
producción de biomasa con respecto al testigo, con una producción más alta y una mayor
relación tallo:raiz que las plantas testigo y las crecidas en suelo estéril. En este sentido Ortas
(1996) señala que la proporción tallo:raíz es normalmente más alta en plantas infectadas con
HMA, ya que estos microorganismos, incrementan la tasa de crecimiento vegetal e influyen
en la distribucidn de los nutrimentos a los tallos, los cuales aumentan la utilización de los
fotosintatos en la parte aérea.
Los registros de colonización micorrizica proporcionados en el cuadro 8 muestran que las
plantas de los tratamientos M y MF fueron las que presentaron los mayores porcentajes. Estos
valores son similares a los encontradospor Rivera et al., (1997) quienes para el caso de
plantas de cafe repot-tan datos de infección entre el 21 y 54%, por lo que se puede considerar
que los valores de infección del endófito en este caso, fueron normales.
En lo referente al suministro de fósforo se encontró que la dosis empleada fue adecuada y que
la respuesta de la planta se expresó en su crecimiento, de tal manera y a pesar de que no hubo
diferencia significativa con las plantas M, las plantas del tratamiento P presentaron los
63
mayores valores en altura, diametro y número de hojas. St-Amaud et al. (1994) resaltan que la
concentración de fósforo en la solución nutritiva tiene un efecto significativo en la biomasa
vegetal y esto se refleja en la disponibilidad de nutrimentos en la planta. Para el caso concreto
del cafe, Quintero y Buritica (1976) repot-tan la importancia que este elemento tiene en el
adecuado desarrollo de la planta durante su estancia en vivero.
Aunque en este experimento el objetivo principal era contar con plantas c o n crecimiento
similar, se decidió medir la ocurrencia natural de la enfermedad. En la Fig. 10 se muestra el
comportamiento de la enfermedad observando que no existen diferencias en el IS de la
enfermedad entre plantas inoculadas con HMA y/o fertilizadas con P. Estos resultados no
coinciden con los reportados por Trota et al. (1996) quienes sugieren que los efectos benéficos
de la nutrición de P fueron únicamente aparentes en la forma de estimular el crecimiento de la
planta, y el P presenta pocos efectos en el desarrollo de la enfermedad con respecto a otros
factores quimicos.
Así mismo, Caron et al., (1986) indican que un incremento en la nutrición del fósforo en las
plantas no altera las poblaciones del patógeno o el desarrollo de la enfermedad. Su estudio
demuestra que alatas concentraciones de P en la planta no son las responsables del bajo
desarrollo de la enfermedad y las bajas poblaciones del patógeno.
Si bien estos reportes son opuestos a los resultados obtenidos en este experimento, en el
sentido que la fertilización elevada de fósforo no influye en la disminución de la enfermedad,
se puede pensar que en el caso de cafe hay una respuesta particular, ya que el fósforo, en este
caso, influyó en la disminucion de la enfermedad. Quintero y Butirica (1976) en un estudio del
efecto de la deficiencia de elementos nutricionales sobre Phoma sp. encontraron que las
plantas desarrolladas en los soluciones: completa sin K, sin P, sin B, sin Ca y sin n, fueron
las más afectadas inicialmente y el diametro de las lesiones osciló entre 1.6 y 2.7 mm; con el
tiempo se produjo coalescencia de lesiones y finalmente la muerte de las plántulas.
Una vez que se demostró que las plantas podían crecer sin diferencias en su desarrollo, se
resolvió estudiar la interacción de la inoculación de HMA, inoculación del patógeno y la
fertilizacipon con P, pero ahora en condiciones de vivero, para ello, y como se explicó en la
64
metodologia, se tranajó en el vivero del INIFAP, en su campo experimental de Teocelo, en el
estado de Veracruz, donde llegan a producirse de manera comercial cerca de 60 000 mil
plantas en un ciclo.
Una variable que se modificó en este experimento fue la de estudiar el crecimiento vegetativo
y el índice de severidad por Phoma costarricensis Echandi en un sustrato sin esterilizar y en
condiciones ambientales no controladas. En primera instancia, se observó que no existe
diferencia significativa entre plantas inoculadas con HMA y/o fertilizadas crecidas en sustrato
estperil y sin esterilizar, salvo el tratamiento SE donde las plantas mostraron la menor altura,
número de hojas y diámetro tanto a los 200 ddt como a los 240 ddt.
Palacios-Mayorga et al., (1987), reportan que la esterilización induce disminución en el
desarrollo de cebolla, debido entre otras cosas al efecto que se produce al destruir los
microorganismos del suelo Rivera et al., (1997) encontraron que la esterilización del suelo no
solo fue innecesaria, sino que en algunos casos ocasiona un efecto negativo, posiblemente
asociado con la desaparicion de las interacciones positivas y mutualistas entre otros
microorganismos y la micorriza.
Se encontró que la colonización MA fue baja en las plantas que inoculadas y fertilizadas (
SEMP: 13.82% y SSEMP: 10.22%) en comparación con las que fueron solo inoculadas con
HMA (Cuadro 9), lo que se puede atribuir al efecto del fertilizante y no a la colonización de
los HMA, Saggin-Junior et al., (1995) encontraron que la inoculación ejerce poco efecto en el
crecimiento de las plantas de cafe durante su formación, en un sustrato con adecuado nivel de
P, pero favorece el desarrollo de plantas, después del trasplante en suelo fumigado y con bajo
nivel de P. Las plantas no colonizadas durante la formación en vivero en un sustrato con
! suficiente P, crecieron bien en esta fase, pero mostraron ser inferiores a las colonizadas
i cuando fueron trasplantadas a un suelo fumigado y con baja disponibilidad de este nutrimento.
/ Por otra parte, el hecho de que se haya registrado colonización micorrizica en planats a las!
cuales no se le habia aplicado originalmente inoculante MTZ-1 y que solo contenian fósforo,
j hace pensar en una colonización natural. Hakam et al. (1987) señalan que esto puede ocurrir
/ por un movimiento de agua de lluvia o suelo infestado movido por actividades que se realicen
65
en el vivero, explicando que normalmente los valores de colonizacih son bajos por una
infección tardia de las plantas.
Los resultados en los parámetros de crecimiento de las plantas del tratamiento SSE, llaman la
atención y sugieren en primera instancia quc no seria nccesaria la incorporación de algún
inoculante o dosis de fertilización.
En este sentido se pueden sugerir las siguientes explicaciones:
1. Que en el sustrato sin esterilizar existían poblaciones nativas de HMA y que fueron capaces
de promover una colonizacih inicial. Rivera et al (1997) indican que en algunos
experimentos con el uso de concentrado nativo, se originaron efectos positivos en la mayoría
de los casos, aunque no siempre superiores a la inoculación con cepas específicas.
2. A la existencia de microorganismos en la rizosfera de las plantas colonizadas con HMA y
crecidas en sustrato sin esterilizar, facilitando el desarrollo de las plantas de café. St-Amaud et
al., (1995) mencionan que cambios cuantitativos y cualitativos tienden a ser reportados en las
poblaciones de microorganismo no patogénicos en la rizosfera de plantas inoculadas con
HMA crecidas en condiciones de suelos sin esterilizar, por ejemplos grandes poblaciones de
bacterias, y actinomicetos fueron observados en la rizosfera de plantas de tomate
micorrizadas.
Calvet et al., (1993) al evauluar la inoculación de Pseudomonas putida en suelo no estéril
observaron que la colonizacih de HMA se incremento en platas de trebol, y ambos actuaron
sinérgeticamente para favorecer el crecimiento vegetal.
Estos resultados permiten establecer las ventajas de la colonizacih micorrizica en el
desarrollo de plantas de café en vivero, Siqueira et al (1995) encontraron que la inoculación
con HMA de plantas de café influyen positivamente en su crecimiento en vivero y en la
sobrevivencia y tolerancia al estrés al momento del trasplante. El condicih de estar en
simbiosis las plantas, citan los autores, puede ejercer una gran influencia en su
66
comportamiento, especialmente cuando estas son trasplantadas a suelos con pocos o
totalmente ausentes de propágulos de HMA.
Así aunque plantas fertilizadas con fósforo y/o inoculadas con HMA hayan tenido un
crecimiento semejante, se puede pensar en las ventajas que tendria el contar con plantas de
cafe micorrizadas. Siqueira et al. (1993), sugieren que los efectos benéficos de la
colonización en vivero de las plantas de cafe fueron también observados al momento de
trasplantarlas a campo. Después de 6 meses de crecimiento en campo, las plantas no
inoculadas con HMA presentaron una sobrevivencia muy inferior a los demás tratamientos.
Las plantas con manejo convencional (con fertilización y manejo de agroquimicos)
presentaron una tasa de sobrevivencia similar a las que fueron inoculadas en vivero. Esto
sugiere, resaltan los autores, que la micorrización no parece ser esencial para la sobrevivencia
de las plantas, si esta es reemplazada con una elevada fertilización quimica en el sustrato, pero
en todo caso habria que considerar las implicaciones economicas y ambientales.
Cuando se estudió la infección natural del patógeno en las condiciones del vivero se encontró
una tendencia similar a la observada en invernadero (primer experimento), es decir existen dos
picos marcados de la enfermedad, para este experimento ocurrió a los 80 y a los 160 ddt. Se
registró diferencia solo en el caso de las plantas del tratamiento SEM, que mostraron una
tendencia lineal negativa en el IS de la enfermedad (Fig. 1 1), evidenciando que aunque hubo
un crecimiento vegetativo semejante entre plantas fertilizadas con P e inoculadas con HMA y
crecidas en un sustrato estéril y sin esterilizar, la respuesta a la enfermedad es distinta.
Shaul et, al., (1999) estudiando el efecto del patógeno Botrytis cinerea en plantas de tabaco,
indican que las caracteristicas de crecimiento, producción de biomasa y concentración de
micronutrimentos no difirió significativamente entre plantas micorrizadas y las no inoculadas,
indicando que los efectos observados no fueron causados (directamente) por los cambios en
los patrones de crecimiento de plantas colonizadas con HMA; más bien, esto pudo ser causado
por la ocurrencia de mecanismos regulatorios más especificos asociados con la colonización
micorrizica.
67
En el estudio de algunas interacciones planta-patógeno se ha postulado que, durante la
formación de las lesiones necroticas, una señal es producida y transducida por una ruta de
transducción para iniciar la respuesta defensiva al ataque del patogeno. Este proceso esta
estrechamente relacionado con la expresión de proteinas relacionadas con la patogénesis
(proteinas PR) y puede ser localizada o sistemáticamente expresada (Shaul et al., 1999).
Con base a los resultados obtenidos de los dos experimentos anteriores y sin tener aún claro si
en cafe la fertilización a base de P disminuia la severidad de Phoma costarricensis Echandi, y
pensando en que la inoculación con HMA podría además influir de otra manera, quizás
mediante algún mecanismo sistemico. Se decidió entonces, evaluar la influencia del patogeno
en el patron de regulación de intercambio gaseoso en plantas de cafe inoculadas con hongos
micorrizicos arbusculares o fertilizadas con fósforo (experimento tres).
En cuanto al crecimiento vegetativo se demostro que la altura y relación tallo: raiz, las plantas
de los cuatro tratamientos fueron similares estadisticamente (P< 0.05) en los parametros. Para
el caso de número de hojas, peso seco de la raíz y peso seco total, las plantas del tratamiento
MF presentaron los mayores valores. Sin embargo en términos generales se considero que
existió un crecimiento semejante entre las plantas inoculadas con HMA y fertilizadas con P y
que ya podían ser inoculadas con el patogeno para estudiar su interacción.
Para el caso del IS de la enfermedad resultó interesante determinr que las plantas de los
tratamientos M y MF mostraron los valores más bajos (Fig. 13), con este hecho, se confirmó
que no es un factor nutrimental el responsable de la disminución en el daño del patogeno.
Kloepper et al., (1999) reportan que la disminución de enfermedades foliares puede darse al
activar un agente inductor, el cual acelera de manera sistématica los mecanismos de defensa
físicos o quimicos de la planta huésped. Principalmente para reducir los sintomas de los
patógenos, los cuales infectan un tejido semejante al lugar donde se indujo, el proceso es
conocido como Resistencia Sistemica Inducida (ISR) o resistencia sistématica adquirida. En
este sentido Cordier et al. (1996; 1998) establecen que tanto la inducción de efectos de
protection sistématicos y localizados inducidos por los HMA involucran la acumulación de
68
moléculas relacionadas con la defensa vegetal en asociación con reacciones de elicitación de
la pared en las rakes del huésped.
La resistencia sistemica se refiere a la tolerancia que ocurre en sitios del hospedante distintos
del punto de interacción inicial, con una patogeno potencial. En muchas especies, la infección
local de una variedad de patógenos per-mite una inducción de resistencia general frente a la
enfermedad en las partes no infectadas de la planta. Esta resistencia es efectiva contra un
amplio rango de patogenos y puede perdurar durante semanas o meses (Fernández et al.,
1998).
La capacidad de los HMA para inducir una respuesta sistemica ha sido reportada, indicando
que no es un factor nutrimental, sino que pueden ser mecanismos de acción a larga distancia, y
aunque no han sido bien determinados, los mediadores de tales mecanismos pueden ser
fitohormonas por las siguientes razones: i) los niveles de auxinas, giberelinas, citocininas y
ácido absicico son alterados durante la simbiosis micorrizica, ii) la colonización micorrizica
puede elevar los niveles internos de citocininas del tejido infectado y mejorar los flujos de esta
fitohormona a otros órganos de la planta y iii) la alteración del balance de fitohormonas puede
estar regulado por la expresión de genes relacionados con la defensa vegetal (Shaul et al.,
Gernns et al. (2001) estudiaron la influencia de la inoculación micorrizica en la disminución
de la severidad de Erysiphe graminis, patogeno foliar de la cebada, concluyen que los cambios
en el balance hormonal pudieron actuan en forma importante en la disminución de la
senescencia en plantas colonizadas, donde un incremento en la concentración de citocininas,
puede ser importante para mejorar la fotosintesis. En ese sentido la fotosintesis esta ligada a
la conductancia estomatal y la tasa de asimilación de CO2.
Para esta investigación las plantas de los tratamientos M y MF fueron las que llegaron en una
mejor circunstancia con respecto a la asimilación de CO2 y conductancia estomatica previo a
la inoculación del patogeno.
69
1999).
Koch et al. (1997) refieren que la inoculación de HMA en plantas eleva notablemente la tasa
de fotosintesis comparada con las plantas no inoculadas, y puede atribuirse el incremento en el
crecimiento de las plantas micorrizadas a un aumento de la actividad fotosintetica.
Concluyendo que la elevada tasa de asimilacion de CO2 por la micorriza no esta relacionada
con la disponibilidad de fósforo, sino más bien por un cambio en los niveles endógenos de
hormonas vegetales, especialmente citocininas, siendo responsables de los cambios en los
movimientos estomatales y por lo tanto del aparato fotosintetico, lo cual resulta en un
incremento en los niveles de asimilacion de CO2.
La disminucion en la conductancia estomatal y en la asimilacion de CO2 se hizo evidente a
partir de la inoculación del patógeno (Fig. 17) y estaria directamente relacionada con la
presencia del patógeno en la hoja y su disminucion en el area fotosinteticamente activa, ya que
las células son penetradas por las estructuras del hongo y son muertas por la secrección de
enzimas y perdida de clorofila (Shtiemberg, 1992).
Sin embargo, este descenso en la actividad respiratoria , las plantas de los tratamientos M y
MF tuvieron siempre el mejor comportamiento al estrés provocado por el patógeno en la
planta , con respecto a plantas de los tratamientos testigo y P. Ruiz-Lozano y Azcón (2000)
señalan que la tolerancia para el caso de sales, esta basada en un incremento en el intercambio
de gases (aumento en la tasa fotosintetica, transpiración y conductancia estomatica y
eficiencia en el uso del agua) más que a la entrada de nutrimentos.
Un caso particular fueron las plantas del tratamiento MF, las cuales presentaron los
porcentajes más bajos en el IS, y mantuvieron casi siempre una tasa de asimilacion de CO2
activa. En este sentido St-Arnaud et al., (1994) refieren que la inhibición de Pythium ultimum
es debida a la diferencia en la microflora introducida a través de un filtrado en los tratamientos
con y sin HMA, más que a un efecto directo de los HMA en la planta huésped.
Por lo que al parecer la diferencia en la respuesta entre las plantas inoculadas con HMA con y
sin filtrado esta dada por la presencia de otros microorganismos en la rizosfera de plantas de
cafe . Budi et al., (1999) citan la existencia de una rizobacteria del genero Paenibacillus sp. en
70
un extracto de inoculante de HMA y que puede actuar como agente de control biológico en
contra de hongos que causan enfermedades, mejorando tambitn la formación de la micorriza
arbuscular, abriendo así la posibilidad de usar la inoculación dual entre hongo y bacteria.
Con base a estos resultados se plante la necesidad de continuar con investigaciones que
permitAn discemir que compuestos están regulando la respuesta positiva de la inoculación de
HMA en plantas de cafe e la tolerancia al patógeno, toda vez que existen muy pocos reportes
para el caso de enfermedades foliares y menos aún sobre los mecanismos que explican esta
respuesta./II
71
VI. CONCLUSIONES
- La inoculación con hongos micorrizicos arbusculares o la aplicación de fósforo a a
una dosis de 1600 ppm Kg -1, permiten generar plantas de cafe con un crecimiento
vegetativo similar.
- La respuesta a la inoculación micorrizica de plantas de cafe difiere cuando estas crecen
en invernadero que en vivero.
- La ocurrencia natural de Phoma constarricensis Echandi en plantas de cafe inoculadas
con HMA crecidas en invernadero y vivero, disminuye a lo largo del tiempo.
- La dosis de fósforo empleada no influye en la disminución de la severidad de Phoma
costarricensis Echandi en plantas de cafe.
- En condiciones controladas plantas de cafe inoculadas con HMA con o sin filtrado
presentaron un menor Índice de severidad de Phoma costawicensis Echandi, y una
mayor conductancia estomatica, transpiración y asimilación de CO2.
- Existe una respuesta distinta de las plantas inoculadas a las fertilizadas con fósforo, en
cuanto a la tolerancia del patógeno, influida por una mayor capacidad en su patron de
intercambio gaseoso y no por una mejor nutrición.
72
VII. BIBLIOGRAFIA CITADA
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UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGÍCAS Y AGROPECUARIAS
POSGRADO EN BIORTECNOLOGÍA
DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSACOORDINADOR DEL POSGRADO DE LA F.C.B.A.PRESENTE.-
Por este conducto los abajo firmantes profesores-investigadores de la F.C.B.A. dela Univ. De Colima, hacemos de su conocimiento que después de haber revisadoel borrador de tesis titulado "interacción de Plantasde Café Fertilizadas conFósforo e lnoculadas con Hongos Micorrizicos Arbusculares y Pomacostarricencis Echandi”, que presenta el C.Miguel Angel Escalona Aguilar,alumno del posgrado de esta Facultad, consideramos que reúne los elementossuficientes de contenido y forma de un documento de Maestria. Por ello,expresamos nuestra aprobación para que se imprima y se sigan los tramitesacadémicos que correspondan.
Sin otro particular, le saludamos cordialmente
ATENTAMENTETecoman, Colima, a 15 de Febrero de
Dra. María del Rocio Flores Bello Dr.Oscar Rebolledo Dominguez
C.C.D. Ing. Rodolfo V. Morentin Delgado.- Director de la F.C.B.A.c.c.p. Interesadoc.c.p. Archivo Personalc.c.p. Expediente correspondiente
Dr. Sergio Aguilar Espinosa
UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
POSGRADO EN BIOTECNOLOGÍA
ING. RODOLFO V. MORENTÍN DELGADODIRECTOR DE LA F.C.B.A.PRESENTE
En atención a que el C. Miguel Angel Escalona Aguilar, alumno egresado de laMaestría en Ciencias, area Biotecnologia, con número de cuenta 97-4317, harealizado todas las correcciones al manuscrito de tesis que presentó al cuerpoacadémico de revisores, constituido por: Dra. Maria del Rocio Flores Bello, Dr.Oscar Rebolledo Dominguez y Dr. Sergio Aguilar Espinosa profesores-investigadores de la Universidad de Colima, me dirijo respetuosamente parasolicitarle la autorización de impresión de la tesis titulada: "Interacción dePlantas de Café Fertilizadas con Fósforo e Inoculadas con HongosMicorrizicos Arbusculares y Phoma costarricencis Echandi”.
Esta tesis ha sido dirigida por el Dr. Javier Farias Larios y la M.C. Dora TrejoAguilar.
Sin otro asunto más que tratar, me es grato reiterarle mi disposición en todas lasactividades que me encomiende.
Reciba mi agradecimiento, saludo y consideración distinguida.
Atentamente”
Estudia*Lucha*Trabaja
Tecomán, Colima a 15 de Febrero de 2002
Dr.Sergio Aguilar EspinosaCoordinador
c.c.p. Expediente Académico del Alumnoc.c.p. Interesadoc.c.p. Archivo
