iii

SEMARANG

2012

RINGKASAN

Kelompok IIIC. 2012 . Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi. (Asisten : Lia

Kusuma S.)

Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi, Medium, Larutan

Pengenceran, Metode Penghitungan Cawan dan Pewarnaan Gram dilaksanakan

pada hari Rabu tanggal 23 Mei 2012, pada pukul 15.00 - 19.00 WIB dan pada hari

Kamis tanggal 24 Mei 2012, pada pukul 16.00 - 18.00 WIB bertempat di

Laboratorium Fisiologi dan Biokimia Ternak Fakutas Peternakan, Universitas

Diponegoro, Semarang.

Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi, Medium, Larutan

Pengenceran, Metode Penghitungan Cawan dan Pewarnaan Gram alat-alat yang

digunakan adalah oven, autoclave, cawan petri, pipet hisap, erlenmeyer, kertas

pembungkus, alumunium foil, timbangan, waterbath, gelas beker, gelas ukur,

pisau, kain saring, jarum dan loop inokulasi, api bunsen, tabung reaksi, kaca

obyek, tisu, nampan, mikroskop. Bahan yang dibutuhkan dalam praktikum ini

adalah kapas, alkohol, Nutrient Broth (bubuk), kentang, Dextrose, agar, aquades,

asam tartarat 10%, Methylene blue (kristal violet), gram A (kristal violet), gram B

(yodium/lugol), gram C (alkohol), gram D (safranin).

Berdasarkan praktikum mikrobiologi dapat disimpulkan bahwa

sterilisasi kering digunakan untuk mensterilkan alat sedangkan sterilisasi basah

untuk mensterilkan medium. Medium biakan terdiri dari cair dan padat. Medium

yang baik memilki nutrien yang cukup bagi mikroba, tidak ada zat penghambat

dan harus steril. Pewarnaan gram dapat membedakan bakteri yang bersifat gram

positif dan gram negatif. Pewarnaan gram yang dapat disimpulkan yaitu adanya

bakteri yang berbentuk bulat dan warna yang nampak adalah ungu. Hal ini berarti

bakteri gram positif. Sedangkan bakteri yang berwarna merah muda, termasuk

bakteri gram negatif. Pertumbuhan bakteri terdiri dari tujuh fase yaitu fase

adaptasi, fase pertumbuhan awal, fase pertumbuhan logaritma, fase pertumbuhan

lambat, fase pertumbuhan statis (stasioner), fase menuju kematian dan fase

kematian.

Kata Kunci : NA, APDA, sterilisasi, hitungan cawan dan pewarnaan gram

iv

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, yang telah melimpahkan

rahmat dan hidayah-Nya sehingga laporan praktikum Mikrobiologi ini dapat

selesai tepat waktu.

Laporan ini disusun berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan,

kemudian diaplikasikan dengan mata kuliah yang diajarkan ditunjang dengan

sumber yang penulis baca. Laporan ini diharapkan dapat berguna bagi kami

selaku praktikan dan segenap pihak yang membutuhkan.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Ir. Syaiful Anwar,

M.Si. selaku koordinator praktikum Mikrobiologi, Ganang Setyo Nugroho, selaku

koordinator Asisten praktikum Mikrobiologi, Lia Kusuma Setiasih. selaku asisten

pembimbing praktikum Mikrobiologi, serta semua pihak yang telah membantu

baik secara moril maupun materil dalam pelaksanaan dan pembuatan praktikum

ini.

Penulis mohon maaf jika terjadi kesalahan baik dari penulisan nama

ataupun pengetikan. Kritik dan saran penulis harapkan demi penyempurnaan

laporan ini.

Semarang , Juni 2012

Penulis

v

vi

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR .................................................................................... iv

DAFTAR ISI .................................................................................................... v

DAFTAR TABEL ............................................................................................ vii

DAFTAR ILUSTRASI .................................................................................... viii

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... ix

BAB I PENDAHULUAN ................................................................................ 1

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 3

2.1. Sterilisasi ........................................................................................... 3

2.1.1. Sterilisasi Kering .................................................................... 4

2.1.2. Sterilisasi Basah..................................................................... 4

2.2. Medium ............................................................................................. 5

2.2.1. Nutrien Agar........................................................................... 6

2.2.2. Potato Dextrose Agar.............................................................. 7

2.2.3. Acidified Potato Dextrose Agar.............................................. 7

2.3. Metode Hitungan Cawan................................................................... 8

2.4. Pewarnaan Gram. .............................................................................. 9

BAB III MATERI DAN METODE ................................................................. 10

3.1. Materi ................................................................................................ 10

3.2. Metode .............................................................................................. 11

3.2.1 Sterilisasi................................................................................... 11

3.2.1.1. Sterilisasi kering.............................................................. 11

3.2.1.1. Sterilisasi basah................................................................ 11

3.2.2. Pembuatan Medium.................................................................. 12

3.2.2.1 Nutrien Agar..................................................................... . 12

3.2.2.2. Potato Dextrose agar dan acidified potato dextrose agar.. 12

3.2.3. Penghitungan Mikroorganisme................................................. 13

3.2.3.1 Agar Cawan ....................................................................... 13

3.2.3.2 Pewarnaan Gram................................................................ 13

BAB IV HASIL PEMBAHASAN ................................................................... 15

vii

4.1. Sterilisasi ....................................................................................... 15

4.2. Medium.......................................................................................... 16

4.2.1. Nutrien Agar ........................................................................ 16

4.2.2. Potato Dextrose Agar .......................................................... 16

4.2.3. Acidefied Potato Dextrose Agar ......................................... 17

4.3. Metode Hitungan Cawan ............................................................... 17

4.4. Pewarnaan Gram ........................................................................... 18

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................... 21

5.1. Simpulan ....................................................................................... 21

5.2. Saran .............................................................................................. 21

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 22

viii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1.Metode Hitungan Cawan Sampel Sosil................................... ........... 18

Tabel 2.Pewarnaan Gram Staphylococcus dan E. coli............... ...................... 19

ix

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Gambar dan Fungsi Alat ....................................................... 23

Lampiran 2. Menjawab Pertanyaan Praktikum Mikrobiologi................... 26

Lampiran 3. Foto Kopi Laporan Hasil Praktikum .................................... 33

Lampiran 4. Foto Kopi Literatur ............................................................... 34

RINGKASAN

KELOMPOK IIIC. 2012. Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi (Asisten : Lia

Kusuma Setiasih).

Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi, Medium, Larutan

Pengncer, Metode perhitungan Cawan dan Pewarnaan Gram dilaksanakan pada

hari Rabu tanggal 23 Mei 2012 pukul 15.00-19.00 WIB dan hari kamis tanggal 24

Mei 2012 pukul 16.00-18.00 WIB di Laboratorium Fisiologi dan Biokimia Ternak

Fakultas Peternakan dan Pertanian Universitas Diponegoro, Semarang.

Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi, Medium, Larutan

Pengencer, Metode perhitungan Cawan dan Pewarnaan Gram alat-alat yang

digunakan adalah oven, autoklaf, cawan petri, pipet hisap, erlenmeyer, kertas

pembungkus, aluminium foil, timbangan, gelas beker, gelas ukur, pisau, kain

saring, jarum dan loop inokulasi, api bunsen, tabung dan rak reaksi, kaca obyek,

tisu nampan dan mikroskop. Bahan yang dibutuhkan dalam praktikum ini adalah

sosis ayam, kapas, alkohol, kentang, dextrosa, agar, aquades, asam tartarat 10%,

gram A (kristal violet), gram B (iodium atau lugol), gram C (alkohol) dan gram D

(safranin).

Sebelum dilaksanankan praktikum ini dilakukan sterilisasi kering

digunakan untuk alat-alat dan sterilisasi basah digunakan untuk bahan. Kemudian

membuat medium, dalam pembuatan medium dapat dilakukan dengan

menimbang masing-masing komponen bahan-bahan secara teliti, melarutkan

dalam air, mengatur pHnya. Sebelum dilaksanakan proses pewarnaan terlebih

dahulu dilakukan penghitungan cawan. Setelah diketahui terdapat suatu koloni

pada medium Acidified Potato Dextrose Agar dan Nutrient Agar maka dilakukan

perhitungan dengan metode hitungan cawan. Pada medium Acidified Potato

Dextrose Agar setelah dilakukan pengenceran 10-3

– 10-5

didapatkan Standart

Plate Count sebanyak 3.0 x 107

sedangkan pada medium NA setelah dilakukan

pengenceran 10-3

– 10-5

CFU/ml didapatkan Standart Plate Count sebesar 1.5 x

106 CFU/ml. Selanjutnya dilakukan pewarnaan gram. Hasil yang didapat untuk

pewarnaan sederhana pada Staphylococcus aureus adalah bentuknya berupa

Cocus (bulat), berwarna ungu yang disebut bakteri gram positif karena sel-selnya

tidak dapat melepaskan violet kristal sehingga menjadi ungu kebiruan. Sedangkan

untuk Escherichia coli bentuknya berupa Bacil (batang), warnanya merah muda

dan merupakan bakteri gram negatif, bakteri ini bisa dikatakan sebagai bakteri

gram negatif karena sel-selnya dapat melepaskan violet kristal dan mengikat

safranin sehingga warna yang muncul adalah merah muda.

Kata kunci : Sterilisasi, Pembuatan Medium, Pengenceran, Pencawanan, Metode

Hitung Cawan dan Pewarnaan Gram

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ................................................................................ i

LEMBAR PENGESAHAN ..................................................................... ii

KATA PENGANTAR ............................................................................. iii

DAFTAR ISI ............................................................................................ iv

DAFTAR TABEL ..................................................................................... v

DAFTAR ILUSTRASI ............................................................................. vi

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. vii

BAB I. PENDAHULUAN ........................................................................ 1

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA .............................................................. 2

2.1. Sterilisasi ............................................................................... 2

2.1.1. Sterilisasi kering ....................................................... 3

2.1.2. Sterilisasi basah ........................................................ 3

2.2. Medium dan Larutan Pengencer ........................................... 4

2.2.1. Medium Nutrient Agar (NA) ................................... 5

2.2.2. Medium Acidified Potato Dextrose Agar (APDA) .. 6

2.3. Metode penghitungan cawan ............................................... 6

2.3.1. Pengenceran ............................................................ 7

2.3.2. Metode tuang ............................................................ 8

2.4. Morfologi bakteri .................................................................. 8

2.4.1. Staphylococcus aureus ............................................. 8

2.4.2. Escherichia coli ........................................................ 9

2.5. Pewarnaan Gram .................................................................. 9

BAB III. METODOLOGI ........................................................................ 11

3.1. Materi ................................................................................... 11

3.2. Metode ................................................................................ 12

3.2.1. Sterilisasi .................................................................. 12

3.2.2. Medium dan Larutan Pengencer .............................. 13

3.2.3. Metode Hitungan Cawan ......................................... 14

3.2.3.1. Metode Pengenceran .................................. 14

3.2.3.2. Cara menghitung Koloni ............................ 15

3.2.4. Pewarnaan Gram ...................................................... 15

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................ 17

4.1. Sterilisasi ............................................................................. 17

4.2. Medium dan Larutan Pengencer .......................................... 18

4.2.1. Nutrient Agar (NA) .................................................. 18

4.2.2. Acidified Potato Dextrose Agar (APDA) ................. 18

4.3. Metode Hitungan Cawan .................................................... 19

4.4. Pewarnaan Gram ................................................................. 21

BAB V. KESIMPULAN ........................................................................... 25

5.1. Kesimpulan ........................................................................... 25

5.2. Saran ....................................................................................... 25

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 26

LAMPIRAN .............................................................................................. 27

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Metode Hitungan Cawan Sampel Sosis ............................................. 18

2. Pewarnaan Gram Staphylococcus aureus ........................................... 19

3. Pewarnaan Gram Escherichia coli .................................................... 21

1

BAB I

PENDAHULUAN

Mikrobiologi adalah salah satu cabang biologi yang menelaah mengenai

organisme hidup berukuran mikroskopis yang meliputi virus, bakteri, archaea,

protozoa, algae, dan fungi. Mikroorganisme ada yang menguntungkan ada juga yang

merugikan. Mikroorganisme yang bersifat menguntungkan dapat membantu

menyelesaikan masalah manusia dalam mengolah sumber daya alam sedang

mikroorganisme yang bersifat merugikan dapat merusak bahan-bahan organik,

membuat hilangnya kenikmatan makanan dan dapat menimbulkan penyakit.

Sosis adalah suatu makanan yang terbuat dari daging cincang, lemak hewan,

terna dan rempah, serta bahan-bahan lain. Sosis umumnya dibungkus dalam suatu

pembungkus yang secara tradisional menggunakan usus hewan, tapi sekarang sering

kali menggunakan bahan sintetis, serta diawetkan dengan suatu cara, misalnya

dengan pengasapan.

Tujuan praktikum ini adalah untuk mengetahui proses sterilisasi, mengetahui

proses pembuatan medium, mengetahui metode hitungan cawan dan penghitungan

mikroba serta pewarnaan Gram. Manfaat praktikum ini adalah dapat mengetahui dan

melakukan proses sterilisasi, dapat membuat medium untuk biakan mikroba, dapat

melakukan metode hitungan cawan, dan dapat melakukan cara pewarnaan Gram.

2

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Sterilisasi

Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan-bahan

dari segala macam bentuk kehidupan, termasuk mikroorganisme. Sterilisasi dicapai

dengan menggunakan pemanasan basah, pemanasan kering, filtrasi, penyinaran atau

bahan-bahan kimia (Irianto, 2006). Medium dan alat-alat yang digunakan dalam

inokulasi jika tidak steril tidak akan mungkin memperoleh biakan bakteri yang

diinginkan. Langkah pertama yang harus diambil sebelum mengadakan inokulasi

adalah mensterilkan medium serta alat-alat perlengkapannya (Dwidjoseputro, 2005).

Selain itu juga, dalam sterilisasi harus menguasai teknik inokulasi agar mendapat

hasil pengamatan yang baik (Purwoko, 2007). Sterilisasi secara umum dapat

dilakukan dengan berbagai cara, yaitu sterilisasi secara fisik yang meliputi pemanasan

sinar ultraviolet, sinar X dan sebagainya. Sterilisasi dengan pemanasan terdapat

empat cara yaitu dengan cara pemijaran, sterilisasi dengan udara panas, sterilisasi

dengan menggunakan uap air panas, sterilisasi dengan menggunakan uap panas yang

bertekanan. Sterilisasi selanjutnya yakni secara kimia. Sterilisasi ini menggunakan

disinfektan, larutan alkohol, dan larutan formalin (Dwidjoseputro, 2005).

3

2.1.1. Sterilisasi kering

Sterilisasi kering dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu menggunakan api

dan oven. Spora bakteri oleh sterilisasi kering baru dapat dimatikan pada suhu yang

lebih tinggi dan memerlukan waktu perlakuan yang lebih lama daripada waktu yang

diperlukan pada sterilisasi basah. Peralatan kaca, serbuk, minyak dan sebagainya

yang tahan terhadap pemanasan, dimasukkan ke dalam oven pada temperatur 160oC

selama 2 jam atau 170

oC selama 1 jam, hal ini bergantung kepada banyak sedikitnya

muatan yang dimasukkan ke dalam oven (Dwidjoseputro, 2005). Alat-alat yang

belum bersih dan belum kering tidak boleh dimasukkan dalam oven kering.

Pensterilan alat-alat dapat pula dilakukan dengan gas etilen oksida. Pensterilan harus

dikerjakan dengan hati-hati, karena ada bahaya letusan (Purwoko, 2007).

2.1.2. Sterilisasi basah

Sterilisasi basah biasanya menggunakan alat autoklaf yaitu serupa tangki

minyak yang dapat diisi dengan uap. Autoklaf biasanya digunakan untuk

menyeterilkan medium baik yang berasal dari agar maupun dari air susu. Apabila

medium besar disterilkan maka waktu yang diperlukan akan lebih panjang karena

panas memerlukan waktu untuk menembus bahan tersebut. Medium yang disterilkan

ditempatkan di dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC dengan tekanan 2

atm. Medium yang disterilkan sebaiknya ditempatkan dalam beberapa botol yang

agak kecil. Biasanya autoklaf sudah diatur sedemikian rupa, sehingga pada suhu

4

tersebut tekanan ada sebesar sebesar 1 atm atau 15 lb/in2

pada suhu

121oC (Dwidjoseputro, 2005). Menggunakan sterilisasi basah, sel-sel bakteri atau

fungi sudah dimatikan pada suhu 60oC dalam waktu 5–10 menit. Spora ragi fungi

mati diatas suhu 80oC dan spora bakteri mati diatas suhu 120

oC selama 15 menit.

Semakin tinggi kontaminasi maka semakin banyak jumlah spora yang termos resisten

(kebal/tidak mati) sehingga diperlukan pemanasan yang semakin lama (Irianto, 2006).

Medium yang mengandung vitamin, gelatin, atau sebangsa gula, setelah sterilisasi

dalam autoklaf, medium tersebut harus segera didinginkan sesudah dikeluarkan dari

autoklaf. Hal ini untuk menghindari terurainya zat–zat. Medium yang sudah steril

dapat disimpan dalam lemari es (Purwoko, 2007).

2.2 Medium dan Larutan Pengencer

Medium adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrisi yang dipakai

untuk menumbuhkan mikroorganisme. Selain itu medium dapat pula digunakan

sebagai isolasi, perbanyakan, penguji sifat-sifat fisiologis dan sebagai media

penghitung jumlah mikroba (Irianto, 2006). Mikroba dapat tumbuh dengan baik di

dalam medium diperlukan persyaratan tertentu yaitu medium harus mengandung

semua nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroba, medium harus mempunyai

tekanan osmose, tegangan muka dan pH yang sesuai, medium tidak mengandung zat-

zat penghambat dan medium harus steril (Schlegl, 2000). Medium agar merupakan

salah satu teknik yang sangat baik untuk memisahkan mikroba. Dasar makanan yang

paling baik bagi pemeliharaan dan pembiakan bakteri adalah medium yang

5

mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa-sisa makanan

atau ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia (Schlegel, 2000). Media biakan yang

digunakan untuk menumbuhkan bakteri terdapat dalam bentuk padat, setengah padat

dan cair. Medium cair dapat digunakan untuk berbagai tujuan termasuk

menumbuhkan atau membiakkan mikroba, fermentasi dan uji-uji lainnya. Media

padat digunakan untuk menumbuhkan mikroba pada permukaan sehingga

membentuk koloni yang dapat dilihat, dihitung dan diisolasi misalnya nutrient agar,

plate count agar dan potato dextrose agar. Media padat diperoleh dengan

menambahkan agar. Agar berasal dari ganggang merah. Agar digunakan sebagai

bahan pemadat karena tidak diuraikan mikroorganisme dan membeku pada suhu di

atas 45°C. Kandungan agar sebagai bahan pemadat dalam media

adalah 1,5-2% (Dwidjoseputro, 2005).

2.2.1. Medium Nutrient Agar (NA)

Nutrient Agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga

digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif,

yaitu mikroorganisme heterotrof. Nutrient Agar merupakan salah satu media yang

umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage,

produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji

bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni (Schlegel, 2000).

Nutrient Agar (NA) adalah suatu medium yang mengandung sumber nitrogen dalam

6

jumlah cukup yaitu 0,3% ekstrak sapi dan 0,5% pepton, tetapi tidak mengandung

sumber karbohidrat (Irianto, 2006).

2.2.2. Medium Acidified Potato Dextrose Agar (APDA)

Pembuatan medium yang dilakukan oleh manusia dapat berupa medium cair

dan medium padat. Dahulu orang menggunakan kentang yang dipotong-potong untuk

medium (Dwidjoseputro, 2005). Suatu penemuan yang lebih baik sekali ialah

medium dari kaldu yang dicampur dengan sedikit agar-agar. Setelah medium

disterilisasikan, kemudian dibiarkan mendingin, diperoleh medium padat yang

dapat ditanami mikroorganisme (Dwiloka, 2000). Medium harus mengandung semua

nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroorganisme. APDA dibuat untuk

menumbuhkan jamur. Hal itu karena jamur membutuhkan medium yang mengandung

karbohidrat, dan pada medium APDA ini terdapat kentang (sumber karbohidrat)

sebagai media yang cocok untuk menumbuhkan jamur. APDA (Acidified Potato

Dextrose Agar) yaitu digunakan untuk kultivasi dan identifikasi jamur sehingga

mempermudah dalam morfologinya (Irianto, 2006).

2.3 Metode Hitungan Cawan

Metode hitungan cawan merupakan metode yang digunakan untuk

menghitung jumlah mikroba dalam bahan pangan karena hanya sel yang hidup yang

dapat dihitung. Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk

7

menghitung jumlah mikroba karena hanya sel yang hidup yang dapat dihitung,

beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus dan dapat digunakan untuk isolasi

serta identifikasi mikroba (Irianto, 2006). Prinsip metode hitungan cawan adalah jika

sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba

tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung

dengan mata tanpa mikroskop. Kelemahan metode hitungan cawan diantaranya hasil

perhitungan tidak menunjukkan jumlah mikroba yang sesungguhnya, medium dan

kondisi yang berbeda memungkinkan hasil yang berbeda, mikroba yang ditumbuhkan

harus dapat tumbuh pada medium padat dan memerlukan persiapan dan masa

inkubasi beberapa hari (Schlegel, 2000). Syarat penghitungan koloni yaitu cawan

yang dihitung adalah cawan yang mengandung jumlah koloni 30 – 300, beberapa

koloni yang bergabung menjadi satu dapat dihitung satu koloni dan suatu deretan

koloni sebagai suatu garis tebal dapat dihitung sebagai satu koloni (Puwoko, 2007).

2.3.1 Pengenceran

Pengenceran adalah mencampur larutan pekat (konsentrasi tinggi) dengan

cara menambahkan pelarut agar diperoleh volume akhir yang lebih besar. Contohnya

suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies

diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Enceran ini kemudian diambil barang 1ml

untuk diencerkan lagi ke tabung yang telah berisi pelarut. Enceran yang kedua ini di

ambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut (Dwidjoseputro, 1994). Jumlah terbaik yang

8

digunakan untuk perhitungan mikroba anatara 30-300 koloni. Pengenceran biasanya

dilakukan secara desimal (Puwoko, 2007).

2.3.2 Metode tuang

Teknik pour plate adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan

mikroorganisme di dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang

masih cair dengan stok kultur bakteri. Teknik ini biasa digunakan pada uji TPC (Total

Plate Count). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat

tersebar merata pada media agar. Metode tuang adalah proses mencampurkan bakteri

yang sudah diencerkan, dan sampel tersebut kemudian disebarkan di dalam suatu

medium dari kaldu dan gelatin encer (Dwidjoseputro, 1994). Pengenceran yang telah

dilakukan untuk medium, selanjutnya adalah menuangkan hasil pengenceran pada

cawan petri. Waktu yang baik untuk melakuakan penuangan antara dimulai

pengenceran sampai menuangkan ke cawan petri tidak lebih lama dari 30

menit (Schlegel, 2000).

2.4. Morfologi Bakteri

2.4.1. Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus mempunyai bentuk coccus, berukuran besar, biasanya

Staphylococcus aureus terdapat pada rongga hidung manusia maupun pada beberapa

jenis hewan tertentu, juga terdapat pada kulit. Staphylococcus aureus merupakan

9

penyebab umum pada keracunan pangan (Schlegel, 2000). Staphylococcus aureus

mempunyai susunan yang menyerupai buah anggur, perkiraan diameternya 0,8 μ,

tumbuh pada media yang mempunyai temperatur 370C, tumbuh pada temperatur

optimal 35oC (Smith, 1960). Bentuk Staphylococcus bola sampai lonjong dengan

diameter 2 μm dan mudah tumbuh dalam medium yang sederhana (Pelczar, 2008).

2.4.2. Escherichia coli

Escherichia coli memiliki bentuk batang pendek dan habitat utamanya adalah

usus manusia dan hewan. Escherichia coli dipakai sebagai organisme indikator

karena Escherichia coli terdapat dalam jumlah yang banyak menunjukkan bahwa

pangan atau air telah mengalami pencemaran (Dwiloka, 2000). Morfologi

Escherichia coli antara lain berbentuk bacill pendek, mempunyai lebar antara 0,4

sampai 0,7 μ, panjang antara 1 sampai 4 μ. Pada medium agar cawan koloninya

mempunyai ukuran 2 sampai 3 mm dalam waktu 48 jam (Dwidjoseputro, 2005).

2.5. Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting

yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Cara pewarnaan ini paling sering

dilakukan dalam pekerjaan mikrobiologi. Pewarnaan gram merupakan salah satu

prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan dan atau mengidentifikasi

bakteri (Dwidjoseputro, 2005). Proses pewarnaan gram ini, olesan bakteri yang

10

terfiksasi dikenai larutan ungu kristal, larutan yodium, alkohol dan safranin. Bakteri

yang diwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua yaitu bakteri gram positif yang

mempertahankan zat pewarna ungu kristal dan karenanya tampak biru - ungu tua.

Kelompok yang lain yaitu bakteri gram negatif, yang kehilangan ungu kristal ketika

dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah

safranin atau tampak merah-merah muda (Pelczsar, 2006). Berdasarkan morfologinya

bentuk bakteri dapat dibagi atas tiga golongan yaitu basil, kokus dan spiril

(Dwidjoseputro, 2005). E. Coli merupakan bakteri negatif yang memiliki bentuk

batang, dan berwarna merah (Dwiloka, 2000). Sel Staphylococcus sp berbentuk

coccus atau bulat dengan ukuran 0,3 – 2,2 μm x 1,27 – 7,0 μm. Bakteri ini termasuk

bakteri yang mempunyai gram positif (Pelczar, 1986). Terdapat perbedaan stuktur

dinding sel pada bakteri gram positif dan bakteri gram negatif, bakteri gram negatif

mempunyai lapisan peptidoglikan tipis sehingga tidak dapat mengikat cat warna

utama dengan kuat (Dwiloka, 2000).

11

BAB III

METODOLOGI

Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi, Medium, Larutan

Pengenceran, Metode Penghitungan Cawan dan Pewarnaan Gram dilaksanakan pada

hari Rabu tanggal 23 Mei 2012, pada pukul 15.00 - 19.00 WIB dan pada hari Kamis

tanggal 24 Mei 2012, pada pukul 16.00 - 18.00 WIB bertempat di Laboratorium

Fisiologi dan Biokimia Ternak Fakutas Peternakan dan Pertanian, Universitas

Diponegoro, Semarang.

3.1. Materi

Alat yang digunakan pada praktikum adalah erlenmeyer berfungsi sebagai

tempat pembuatan medium, cawan petri berfungsi sebagai tempat pertumbuhan

bakteri, pipet volume berfungsi untuk mengambil larutan, oven yang berfungsi untuk

melakukan sterilisasi kering, autoklaf yang berfungsi untuk melakukan sterilisasi

basah, pipet volume berfungsi untuk mengambil larutan, bunsen yang digunakan

untuk melakukan sterilisasi, pisau digunakan untuk mengupas dan memotong

kentang, timbangan berfungsi untuk menimbang bahan, gelas ukur berfungsi sebagai

wadah larutan dalam jumlah yang sedikit, gelas beker sebagai wadah suatu larutan,

kertas saring digunakan untuk menyaring larutan, kaca objek digunakan untuk

membuat preparat, tabung reaksi dan raknya berfungsi sebagai wadah suatu sampel

larutan, dan mikroskop berfungsi untuk mengamati preparat. Sedangkan bahan yang

12

digunakan pada praktikum adalah kertas pembungkus, kapas, alkohol, aluminium

foil, kentang, sosis ayam, agar, aquades, dekstrosa, APDA, sampel (E. Coli dan

Staphylococcus) dan larutan gram A (ungu kristal 90%, etanol 95%, amonium oksalat

dan aquadest), gram B (kristal iodium, Kalium iodida dan aquadest), gram C (etanol

95%) serta gram D (larutan safranin 2,5% dalam etanol 95% dan aquadest).

3.2. Metode

3.2.1. Sterilisasi

3.2.1.1. Sterilisasi kering, metode yang dilakukan pada sterilisasi kering adalah

menyiapkan pipet, cawan petri, erlenmayer serta alat gelas lainnya sesuai dengan

kebutuhan. Membersihkan cawan petri dengan kapas yang telah dibasahi dengan

alkohol untuk membersihkan kotoran dan lemak yang menempel pada cawan

kemudian membungkus cawan petri dengan kertas pembungkus. Membersihkan pipet

hisap dan sumbat bagian pangkal pipet dengan kapas, kemudian bungkus pipet

dengan kertas pembungkus, jangan lupa memberi tanda pada bagian pangkal dan

ujung. Menutup mulut erlenmayer dengan menggunakan alumunium foil dengan

rapat. Memasukkan cawan petri ke dalam oven selama 1 jam pada suhu 170oC atau

selama 2 jam pada suhu 160oC, kemudian setelah selesai mengeluarkan cawan petri

dan pipet volume dari oven dan menunggu hingga dingin sebelum digunakan.

3.2.1.2. Sterilisasi basah, metode yang dilakukan pada sterilisasi basah adalah

memasukkan medium yang akan disterilkan ke dalam tabung reaksi, kemudian

13

menutup rapat dengan menggunakan kapas. Memasukkan tabung reaksi tersebut ke

dalam autoklaf, kemudian menutup autoklaf dengan rapat. Menyalakan autoklaf dan

menunggu hingga manometer serta termometer menunjukkan suhu 121o C dengan

tekanan 2 atm selama 15 menit. Membuka katup pengaman setelah selesai dan

biarkan hingga autoklaf tidak lagi bertekanan dan mengeluarkan mediumnya. Khusus

untuk medium agar, untuk menurunkan suhunya dan menjaga agar tidak membeku

maka memasukkan medium ke dalam inkubator bersuhu 55oC sebelum digunakan.

3.2.2. Medium dan Larutan pengencer

3.2.2.1. Nutrient Agar (NA), metode yang dilakukan pada pembuatan medium

Nutrient Agar (NA) adalah menyiapkan 2,3 gr Nutrient Agar (NA) dan 100 ml

aquadest kemudian memasukkan ke dalam gelas erlenmeyer campur kedua larutan

tersebut dan mengaduk dengan menggunakan pengaduk magnetik stirrer. Kemudian

melakukan sterilisasi menggunakan autoklaf.

3.2.2.2. Potato Dextrose Agar (PDA) dan Acidified Potato Dextrose Agar (APDA),

metode yang dilakukan pada pembuatan medium Potato Dextrose Agar (PDA) dan

Acidified Potato Dextrose Agar (APDA) adalah mengupas kentang dengan pisau

hingga bersih lalu membilas dengan air sampai bersih. Memotong dengan ukuran

1x1x1 cm. Menimbang kentang sebanyak 250 gr. Memasukkan kentang ke dalam

gelas beker dan menambahkan 500 ml aquades, kemudian menutup gelas beker

dengan aluminium foil. Memanaskan hingga mendidih, kemudian mendinginkan

14

rebusan kentang. Mengambil filtrat kentang dengan cara menyaringnya menggunakan

kain saring yang bersih. Membuat medium PDA dengan komposisi 100 ml filtrat

kentang, 2 gr dextrose dan 2 gr agar. Selanjutnya untuk membuat medium APDA

terlebih dahulu menyiapkan larutan asam tartarat 1 ml. Menyeterilkan medium PDA

dan melarutkan asam tartarat dalam autoclaf pada suhu 121oC, 2 atm, selama 10

menit. Setelah steril memasukkan medium PDA dan melarutkan asam tartarat 1 ml ke

dalam inkubator bersuhu 50oC. Setelah mencapai suhu 50

oC menambahkan dengan

pipet ukur steril larutan asam tartarat 1 ml ke dalam medium PDA secara aseptis.

Maka medium yang dihasilkan adalah medium APDA.

3.2.3. Metode Hitungan Cawan

3.2.3.1. Metode pengenceran, Metode yang digunakan yaitu menyiapkan dan

memberi label larutan pengencer dan cawan petri steril sesuai dengan pengenceran

yang ditetapkan, melakukan pengenceran sampai tingkat pengenceran yang

ditentukan (bahan yang busuk melakukan sampai tingkat pengenceran 10-5

).

Pengenceran dilakukan dengan menyiapkan lima tabung reaksi dan pipet volume dan

penghisap , mengisi tabung pertama dengan sampel, dan kelima tabung lain dengan

aquadest. Mengambil sampel dengan pipet volume diletakkan pada tabung pertama,

mengambil larutan pada tabung pertama diletakkan pada tabung kedua, dan

seterusnya sampai dengan tabung terakhir. Kemudian melakukan pencawanan pada

tiga tingkat pengenceran yang terakhir.

15

3.2.3.2. Metode tuang, Metode yang digunakan yaitu menuangkan ±10 ml medium

agar ke dalam cawan petri dan menggoyangkan membentuk angka 8 supaya semua

sampel merata, yang sebelumnya telah diberi larutan tape ketan yang telah diaduk

rata. Setelah medium membeku, menginkubasikan dengan posisi terbalik pada suhu

ruang selama 24 jam.

3.2.3.3. Cara menghitung koloni, Metode yang digunakan yaitu menyiapkan

medium agar yang telah ditumbuhi bakteri. Kemudian memulai menghitung bakteri

dengan menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada medium dengan tingkat

pengenceran yang berbeda. Mengitung koloni dapat menggunakan Quebecc Colony

Counter karena ketelitian lebih tinggi. Cara menghitung koloni yaitu beberapa koloni

yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana

jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni dan suatu deretan

atau rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni.

Mencatat hasil hitungan dan menghitung Standard Plate Count nya.

3.2.4. Pewarnaan Gram

Menggenangi objek dengan larutan gram A selama 1 menit. Kemudian

membilas objek dengan aquades. Menggenangi objek dengan larutan gram B selama

2 menit. Membuang sisa zat warna pada nampan, kemudian membilas objek dengan

aquades. Membilas objek dengan larutan gram C sampai warna biru tidak luntur lagi,

lalu membilas dengan aquades. Menggenangi objek dengan larutan safranin (gram D)

16

selama 30 detik. Membuang sisa zat warna pada nampan, kemudian membilas objek

dengan aquades. Membersihkan sisa aquades dengan tissue, lalu menggenangi

dengan minyak emersi. Kemudian mengamati dengan bantuan mikroskop dengan

perbesaran 100 kali.

17

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Sterilisasi

Berdasarkan hasil praktikum diperoleh hasil bahwa sterilisasi membutuhkan

kesabaran dan ketelitian. Alat–alat dan bahan yang akan digunakan dalam praktikum

harus benar – benar steril. Hal ini sesuai dengan pendapat Dwidjoseputro (2005) yang

menyatakan bahwa medium dan alat-alat yang akan dipergunakan dalam inokulasi

jika tidak steril, maka tidak akan mungkin memperoleh biakan bakteri yang

diinginkan. Sterilisasi kering dipergunakan untuk mensterilkan alat–alat praktikum

dengan menggunakan oven pada temperatur 170° C selama 1 jam. Hal ini sesuai

dengan pernyataan Dwidjoseputro (2005) yang menyatakan bahwa peralatan kaca,

serbuk, minyak dan sebagainya yang tahan terhadap pemanasan, dimasukkan ke

dalam oven pada temperatur 160oC

selama 2 jam

atau 170

oC selama 1 jam, hal ini

bergantung kepada banyak sedikitnya muatan yang dimasukkan ke dalam oven.

Sterilisasi basah menggunakan alat yang disebut dengan autoklaf yang dilengkapi

dengan manometer, termometer dan klep pengaman untuk mensetrilkan medium

sebagai media mikroba selama 15 menit tergantung banyaknya barang yang

disterilkan. Hal ini sesuai dengan pendapat Dwidjoseputro (2005) yang menyatakan

bahwa medium yang disterilkan ditempatakan di dalam autoklaf selama 15 menit, hal

ini tergantung kepada banyak sedikitnya barang yang disterilkan. Biasanya autoklaf

18

sudah diatur sedemikian rupa, sehingga pada suhu tersebut tekanan ada sebesar

sebesar 1 atm atau 15 lb/in2

pada suhu 121oC.

4.2. Medium dan Larutan Pengencer

4.2.1. Nutrient Agar (NA)

Medium yang digunakan untuk melakukan inokulasi pada bakteri E. coli dan

Staphylococcus yaitu medium yang dibuat dengan perbandingan aquades 100 ml dan

2,3 gram NA. NA yang digunakan dalam praktikum sudah dalam bentuk bahan jadi.

NA tersebut mengandung lipopepton dan agar. Penggunaan bahan tersebut untuk

memenuhi nutrisi yang dibutuhkan bakteri untuk berkembang biak. Pepton

mengandung protein yang sangat baik sebagai medium pembiakan mikroorganisme.

Hal ini sesuai dengan pendapat Irianto (2000) bahwa Nutrien Agar (NA) adalah suatu

medium yang mengandung sumber nitrogen dalam jumlah cukup yaitu 0,3% ekstrak

sapi dan 0,5% pepton, tetapi tidak mengandung sumber karbohidrat.

4.2.2. Acidified Potato Dextrose Agar (APDA)

Acidified Potato Dextrose Agar (APDA) yang dihasilkan dalam praktikum

mikrobiologi ini berbentuk padat sehingga mikroorganisme dapat tumbuh dan

berkembang, hal ini sesuai dengan pendapat Dwidjoseputro (2005) yang menyatakan

bahwa pembuatan medium yang dilakukan oleh manusia dapat berupa medium cair

dan medium padat, dulu orang menggunakan kentang yang dipotong-potong untuk

19

medium setelah medium itu disterilisasikan kemudian dibiarkan mendingin maka kita

peroleh medium padat yang dapat ditanami mikroorganisme. Penggunaan dekstrosa

pada medium ini karena jamur akan tumbuh pada médium yang mengandung

karbohidrat sebagai nutrisi yang mudah dicerna energi pertumbuhannya. Hal ini

sesuai dengan pendapat Irianto (2000) yang menyatakan bahwa mikroorganisme

dapat tumbuh dan berkembang dengan baik didalam medium, maka medium harus

mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroorganisme.

4.3. Metode Hitungan Cawan

Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan mengenai metode hitungan

cawan pada sampel sosis ayam diperoleh data sebagai berikut :

Tabel 1. Metode Hitungan Cawan Sampel Sosis Ayam

Medium Pengenceran SPC

(CFU/ml) 10-3

10-4

10-5

NA - 152 148 1,5 x 106

APDA - 364 296 3,0 X 107

Sumber : Data Primer Praktikum Mikrobiologi, 2012.

Berdasarkan data di atas didapatkan bahwa SPC Sosis Ayam dengan medium

NA sebesar 1,5 x 106

CFU/ml, sedangkan pada medium APDA sebesar 3,0 x 107

CFU/ml. Pengenceran pada sampel Sosis Ayam dilakukan sebanyak 5 kali. Namun

dalam penghitungan SPC sampel sosis ayam mengambil 3 pengenceran terakhir.

Semakin banyak dilakukan pengenceran maka semakin sedikit jumlah koloni yang

terhitung pada sampel sosis ayam. Hal ini sesuai dengan pendapat Purwoko (2007)

20

bahwa syarat penghitungan koloni yaitu cawan yang dihitung adalah cawan yang

mengandung jumlah koloni 30 – 300, beberapa koloni yang bergabung menjadi satu

dapat dihitung satu koloni dan suatu deretan koloni sebagai suatu garis tebal dapat

dihitung sebagai satu koloni. Dijelaskan lebih lanjut oleh Irianto (2000) bahwa

metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung

jumlah mikroba karena hanya sel yang hidup yang dapat dihitung, beberapa jenis

mikroba dapat dihitung sekaligus dan dapat digunakan untuk isolasi serta identifikasi

mikroba. Pada sampel sosis ayam dengan medium NA jumlah koloni yang

digunakan untuk menghitung SPC adalah 152 x 10-4

, hal ini dikarenakan

perbandingan antara jumlah koloni tertinggi dengan terendah hasilnya 9,73. Jika

pengenceran menghasilkan jumlah koloni antara 30-300 maka menggunakan

perbandingan antara hasil tertinggi dengan hasil terendah, bila hasilnya lebih kecil

atau sama dengan 2 penghitungan SPC dengan cara menghitung rata-rata dari jumlah

koloni sedangkan bila lebih dari 2 menggunakan jumlah koloni terendah. Hal ini

sesuai dengan pernyataan Irianto (2000) yang menyatakan bahwa jika cawan dari dua

tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah antara 30 dan 300, dan

perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut

lebih kecil atau sama dengan 2, tentukan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan

mempertimbangkan pengencerannya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan

terendah lebih besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil dari pengenceran terendah.

Pada medium APDA penghitungan SPC pada sampel sosis ayam jumlah koloni yang

digunakan untuk menghitung jumlah SPC adalah 296 x 10-5

, karena jumlah terbaik

21

perhitungan mikroba antara 30-300 koloni. Hal ini sesuai dengan pernyataan

Purwoko (2007) yang menyatakan bahwa jumlah terbaik yang digunakan untuk

perhitungan mikroba antara 30-300 koloni.

4.4. Pewarnaan Gram

4.4.1. Bakteri Staphylococcus aureus

Berdasarkan hasil pengamatan pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap

kultur cair Staphylococcus aureus dengan perbesaran 100x, diperoleh hasil sebagai

berikut :

Ilustrasi 1. Bakteri Gram Positif (Staphylococcus aureus)

Hasil Praktikum Pembanding

Keternagan :

Bakteri : Staphylococcus aureus

Bentuk : Bulat

Koloni : Menggumpal

Warna : Ungu

Gram : Positif

Keternagan :

Bakteri : Staphylococcus aureus

Bentuk : Bulat

Koloni : Memisah

Warna : Ungu

Gram : Positif

Sumber : Data Primer Praktikum Mikro Biologi, 2012

: Http://en.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus

22

Berdasarkan hasil praktikum pewarnaan gram pada Staphylococcus aureus

didapatkan warna ungu, berbentuk bulat, koloni menggumpal dan merupakan bakteri

gram positif. Hal ini sesuai dengan pendapat Dwidjoseputro (2005), yang menyatakan

bahwa bakteri berdasarkan morfologinya bentuk bakteri dapat dibagi atas tiga

golongan yaitu basil, kokus dan spiril. Disempurnakan oleh pendapat Pelczar (2006)

yang menyatakan sel Staphylococcus sp berbentuk coccus atau bulat dengan ukuran

0,3 – 2,2 μm x 1,27 – 7,0 μm.

23

4.4.2. Bakteri Escherichia coli

Berdasarkan hasil pengamatan pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap

kultur cair Escherichia Coli dengan perbesaran 100x, diperoleh sebagai berikut :

Gambar 2. Bakteri Gram Negatif (Escherichia Coli)

Hasil Praktikum Pembanding

Keternagan :

Bakteri : Escherichia Coli

Bentuk : Batang

Koloni : Menggerombol

Warna : Merah muda

Gram : Negatif

Keternagan :

Bakteri : Escherichia Coli

Bentuk : Batang

Koloni : Menggerombol

Warna : Merah muda

Gram : Negatif

Sumber : Data Primer Praktikum Mikro Biologi, 2012.

: www.google.com/Escherichia coli

Berdasarkan pengamatan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100x,

diketahui bahwa Escherichia coli didapatkan warna merah muda, berbentuk batang

dan merupakan bakteri gram negatif. Hal ini sesuai dengan pendapat Dwiloka (2000),

yang menyatakan bahwa bakteri E. Coli memiliki bentuk batang, dan berwarna

merah. Bakteri ini termasuk bakteri gram negatif, dan berwarna merah karena bakteri

ini mempunyai peptidoglikan tipis pada dinding selnya. Hal ini ditambahkan oleh

24

Dwiloka (2000), yang menyatakan bahwa terdapat perbedaan stuktur dinding sel

pada bakteri gram positif dan bakteri gram negatif, bakteri gram negatif mempunyai

lapisan peptidoglikan tipis sehingga tidak dapat mengikat cat warna utama dengan

kuat.

25

BAB V

KESIMPULAN

5.1. Kesimpulan

Berdasarkan praktikum mikrobiologi dapat disimpulkan bahwa

sterilisasi kering digunakan untuk mensterilkan alat sedangkan sterilisasi basah untuk

mensterilkan medium. Medium biakan terdiri dari cair dan padat. Medium yang baik

memilki nutrien yang cukup bagi mikroba, tidak ada zat penghambat dan harus steril.

Hasil perhitungan Pewarnaan gram dapat membedakan bakteri yang bersifat gram

positif dan gram negatif. Jumlah bakteri pada sosis ayam dengan medium NA sebesar

1,5 x 106

CFU/ml, sedangkan pada medium APDA sebesar 3,0 x 107

CFU/ml.

Pewarnaan gram yang dapat disimpulkan yaitu adanya bakteri yang berbentuk bulat

dan warna yang nampak adalah ungu. Hal ini berarti bakteri gram positif. Sedangkan

bakteri yang berwarna merah muda, termasuk bakteri gram negatif.

5.2. Saran

Saran untuk praktikum Mikrobiologi adalah agar praktikan lebih hati-hati dan

teliti ketika melakukan sterilisasi alat dan bahan serta dalam memindahkan bakteri ke

dalam medium biakan agar tidak terjadi kontaminasi dengan mikroorganisme lain

yang tidak dikehendaki.

26

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.

Dwijdoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.

Dwiloka, B. 2000. Pangan dan Gizi. Badan Penerbit Universitas Diponegoro,

Semarang.

Gaman, P. M., dan Sherrington, K. B. 1992. Ilmu Pangan: Pengantar Ilmu

Pangan, Nutrisi, dan Mikrobiologi Edisi Kedua. UGM Press, Yogyakarta.

Irianto, K. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme I. Yrama Widya,

Bandung

Pelczsar, M dan Chan, ECS. 2008. Dasar – Dasar Mikrobiologi 2. Universitas

Indonesia Press, Jakarta.

Purwoko, T. 2007. Fisiologi Mikroba. Bumi Aksara, Jakarta.

Schlegel, H. G. 2000. Mikrobiologi Umum Edisi keenam. Diterjemahkan oleh Tedjo

Baskoro. Universitas Gadjah Mada.Yogyakarta.

LAMPIRAN

27

Lampiran 1. Gambar Alat dan Fungsi

No. Nama Alat Gambar Fungsi

1. Erlenmeyer Untuk menampung

larutan,bahan atau

cairan.

2.

Magnetic

stirer

Untuk mengaduk

larutan supaya

menjadi homogen

3. Inkubator

Untuk menyesuaikan

suhu.

4. Pipet Tetes Untuk mengambil

larutan atau cairan n

dalam jumlah kecil.

Lampiran 1. (Lanjutan)

28

5. Gelas Ukur Untuk mengukur

cairan atau larutan.

6. Autoklaf

untuk mensterilisasi

(1210C, 15 lbs)

selama kurang lebih

15 menit

7. Beker Glass

Untuk

menempatkan

larutan

8. Mikroskop Sebagai alat bantu

untuk melihat benda

benda kecil

9. Cawan petri

Untuk tempat

medium

menumbuhan bakteri

Lampiran 1. (Lanjutan)

29

10. Pipet volume

Untuk mengambil

larutan dengan

volume tepat sesuai

dengan label.

11. Tabung reaksi Sebagai tempat

larutan.

12. Oven

Untuk membantu

mensterililasi alat-

alat sebelum

digunakan

13. Kaca objek Sebagai tempat

untuk meletakkan

sesuatu sebelum di

liat dengan

mikroskop.

Lampiran 2. Menjawab Pertanyaan

30

A. Medium dan Larutan Pengenceran

1. Jelaskan fungsi dari masing-masing komponen di bawah ini di dalam

medium:

a. Pepton c. Ekstrak sapi

b. Agar d. NaCl

Jawab :

a. Pepton: sebagai sumber utama nitrogen organik dan sumber nutrisi

b. Agar: untuk memadatkan medium PDA

c. Ekstrak sapi: sebagai salah satu komposisi nutri dalam medium NA

d. NaCl : merupakan suatu zat yang digunkan sebgai penghambat

pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang di

inginkan. Membunuh Streptococcus galactiae yang toleran terhadap

garam.

2. Jelaskan perbedaan masing-masing medium di bawah ini:

a. Nutrient Agar

b. Potato Dextrose Agar

c. Lactose Broth

d. Plate Count Agar

e. Briliant Green Lactose Bile Broth

Jawab :

31

a. Nutrient Agar : medium umum untuk uji air dan produk dari yang

juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang

tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof

Lampiran 2. (Lanjutan)

b. Potato Dextrose Agar : medium mikrobiologi umum yang dibuat dari

infus kentang dan dekstrosa atau gula jagung

c. Lactose Broth : medium yang digunakan untuk pendektesian

kehadiran bakteri coliform (Eschericia dan Enterobacter), sebagai pre-

enrichment untuk Salmonella dan studi fermentasi laktosa bakteri secara

umum

d. Plate Count Agar : media pertumbuhan umum yang digunakan untuk

menilai atau memantau pertumbuhan bakteri yang layak sampel

e. Briliant Green Lactose Bile Broth : medium yang digunakan untuk

mendeteksi bakteri coliform dalam air, makanan, dan produk susu

3. Sebut dan jelaskan klasifikasi medium!

Jawab :

A. Medium berdasarkan sifat fisik

a) Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah

dingin media menjadi padat.

32

b) Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4%

sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair.

c) Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah

NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).

Lampiran 2. (Lanjutan)

B. Medium berdasarkan komposisi

a) Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis

dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.

b) Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui

secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung

agar, dekstrosa dan ekstrak kentang.

c) Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang

tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari

bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar,

Pancreatic Extract.

C. Medium berdasarkan tujuan

a) Media untuk isolasi

Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba,

misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.

33

b) Media selektif/penghambat

Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu

sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan

merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Salt

Lampiran 2. (Lanjutan)

Broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae

yang toleran terhadap garam.

c) Media diperkaya (enrichment)

Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk

pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah,

serum, kuning telur. Misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar,

dll.

d) Media untuk peremajaan kultur

Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur.

e) Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.

Media ini digunakan untuk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme

suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan

untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.

34

f) Media untuk karakterisasi bakteri

Media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba.

Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.

Lampiran 2. (Lanjutan)

g) Media diferensial

Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya

berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya

TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria

berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di

sekeliling koloni.

B. Sterilisasi

1. Jelaskan perbedaan sterilisasi kering dan sterilisasi basah !

Jawab :

- Sterilisasi kering : suatu usaha untuk membebaskan alat – alat dari

segala macam mikroba. Sterilisasi kering dilakukan dengan berbagai

cara yaitu dengan pemijaran langsung serta dengan menggunakan

oven.

35

- Sterilisasi basah : suatu usaha untuk membebaskan bahan – bahan dari

segla macam mikroba. Biasanya sterilisasi basah menggunakan alat

yaitu autoklaf dan Arnold Steam Sterilzer.

Lampiran 2. (Lanjutan)

2. Jelaskan tujuan sterilisasi !

Jawab : untuk membebaskan alat – alat atau bahan – bahan dari segala

macam mikroba

C. Metode Hitungan Cawan

1. Bagaimana prosedur perhitungan total mikroba pada sempel susu bubuk

hingga pengenceran 10-5

. Hitung pula kebutuhan alat dan bahan!

Jawab :

Alat : tabung reaksi, cawan petri, pipet, penghisap, erlenmeyer, bunsen

Bahan : sampel yang akan di hitung (bakteri/jamur/mikroba), medium

Prosedur : menyiapkan dan memberi label pengencer dan cawan petri steril

sesuai dengan pengenceran dan pemupukan yang ditetapkan.

Melakukan pengenceran sampai tingkat pengenceran yang ditentukan

(melakukan sampai tingkat pengenceran 10-5

pada bahan yang

36

busuk). Melakukan pencawanan pada 4 tingkat pengenceran yang

terakhir dan memasukkan pada cawan petri.

Lampiran 2. (Lanjutan)

2. Laporkan ”Standard Plate Count” dari sampel di bawah ini:

Sampel Pengenceran

SPC 10

-2 10

-3 10

-4 10

-5

Kaldu

daging

280

262

45

28

3

1

-

-

Susu segar TBUD

TBUD

TBUD

TBUD

708

782

158

302

Sosis TBUD 294 35 5

Dendeng 55 15 1 0

Jawab :

Laporan ”Standard Plate Count”

Sampel Pengenceran

SPC 10

-2 10

-3 10

-4 10

-5

Kaldu daging 280

262

45

28

3

1

-

-

2,8 x 104

2,6 x 104

Susu segar TBUD

TBUD

TBUD

TBUD

708

782

158

302

1,6 x 107

3,0 x 107

Sosis TBUD 294 35 5 2,9 x 105

Dendeng 55 15 1 0 5,5 x 103

37

D. Pewarnaan Gram

1. Jelaskan perbedaan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif !

Jawab :

# Gram positif :

a) Tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu

kristal violet

Lampiran 2. (Lanjutan)

b) Pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin

c) Memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal

d) tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama

# Gram negatif :

a) Mengalami dekolorisasi oleh alcohol

b) Pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin

c) Memiliki 3 lapisan dinding sel

d) Tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek

38

Lampiran 2. (Lanjutan)

2. Sebutkan jenis dan bentuk koloni bakteri yang termasuk patogen !

Jawab :

# Bakteri penyebab penyakit pada manusia:

No. Nama bakteri Penyakit yang ditimbulkan

1. Salmonella typhosa Tifus

2. Shigella dysenteriae Disentri basiler

3. Vibrio comma Kolera

4. Haemophilus influenza Influensa

5. Diplococcus pneumoniae Pneumonia (radang paru-paru)

6. Mycobacterium tuberculosis TBC paru-paru

7. Clostridium tetani Tetanus

8. Neiseria meningitis Meningitis (radang selaput otak)

9. Neiseria gonorrhoeae Gonorrhaeae (kencing nanah)

10. Treponema pallidum Sifilis atau Lues atau raja singa

11. Mycobacterium leprae Lepra (kusta)

12. Treponema pertenue Puru atau patek

# Bakteri penyebab penyakit pada hewan:

No. Nama bakteri Penyakit yang ditimbulkan

1. Brucella abortus Brucellosis pada sapi

2. Streptococcus agalactia Mastitis pada sapi (radang payudara)

3. Bacillus anthracis Antraks

4. Actinomyces bovis Bengkak rahang pada sapi

5. Cytophaga columnaris Penyakit pada ikan

39

Lampiran 2. (Lanjutan)

# Bakteri penyebab penyakit pada tumbuhan:

No. Nama bakteri Penyakit yang ditimbulkan

1. Xanthomonas oryzae Menyerang pucuk batang padi

2. Xanthomonas campestris Menyerang tanaman kubis

3. Pseudomonas solanacaerum

Penyakit layu pada famili terung-

terungan

4. Erwinia amylovora Penyakit bonyok pada buah-buahan

Lampiran 3. Penghitungan SPC

40

Metode Hitungan Cawan Sampel Sosis Ayam

Medium Pengenceran SPC

CFU/ml 10

-3 10

-4 10

-5

NA - 152 148 1,5 X 106

APDA - 364 296 3,0 X 107

Jawab :

Menggunakan pengenceran terbesar

SPC NA = Jumlah koloni x 1 : faktor pengenceran

= 152 x 1 : 10-4

= 1,5 x 106

Menggunakan pengenceran terkecil

SPC APDA = Jumlah koloni x 1 : faktor pengenceran

= 296 x 1 : 10-5

= 2,96 x 10

7

= 3,0 x 10

7

41

Lampiran 4. Fotocopy Hasil Pengamatan

42

Lampiran 4. (Lanjutan)

43

Lampiran 4. (Lanjutan)

44

Lampiran 4. (Lanjutan)

45

Lampiran 5. Fotokopi Literatur

46

Lampiran 5. (lanjutan)

47

Lampiran 5. (lanjutan)

48

Lampiran 5. (lanjutan)

49

Lampiran 5. (lanjutan)

50

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Gambar dan Fungsi Alat .................................................................. 27

2. Menjawab Pertanyaan Praktikum Mikrobiologi .............................. 30

3. Penghitungan SPC ........................................................................... 46

4. Foto Kopi Laporan Hasil Pengamatan ............................................. 38

5. Foto Kopi Literatur .......................................................................... 22