การศึกษาฤทธิ์ปกป้องเซลล์...

นพนธตนฉบบ วกรมวทยพ2557;56(1):1-19

1วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทย

ปท 56 ฉบบท 1 มกราคม - มนาคม 2557

การศกษาฤทธปกปองเซลลประสาทของสารสกด

มะกอกน�าตอการตายของเซลลจากไฮโดรเจน

เปอรออกไซดและกลตาเมตในเซลลประสาท

เพาะเลยง mouse neuroblastoma

สดด รตนจรสโรจน วารณ จรวฒนาพงศ ณฉตรา จนทรสวานชย ยวด เมตตาเมธา

และศกดวชย ออนทอง

สถาบนวจยสมนไพร กรมวทยาศาสตรการแพทย ถนนตวานนท นนทบร 11000

Accepted for publication, 25 November 2013

บทคดยอ พชสมนไพรมะกอกน�ำประกอบดวยสำรกลมโพลฟนอล มคณสมบตในกำรตำนออกซเดชน (oxidation) และ อำจจะใชในกำรบรรเทำภำวะเครยดจำกออกซเดชนทท�ำใหเกดกระบวนกำรเสอมของเซลลประสำทได กำรศกษำนเพอทดสอบฤทธปกปองเซลลประสำทของสำรสกดดวยเอทำนอลจำกเปลอกตน (EHB) และเนอไม (EHW) ของมะกอกน�ำตอควำมเปนพษ จำกไฮโดรเจนเปอรออกไซดและกลตำเมตในเซลลประสำทเพำะเลยง mouse neuroblastoma N1E-115 พบวำ กำรสมผสรวม (co-exposure) ระหวำงสำรสกด EHB หรอ EHW และ glutamate เปนเวลำ 24 ชวโมง อำจมผลปกปองกำรตำยของเซลล เพำะเลยง N1E-115 จำกกลตำเมต ขณะทสำรสกดทง 2 ชนดไมแสดงผลปกปองกำรตำยของเซลลจำกไฮโดรเจนเปอรออกไซด กำรศกษำนยงแสดงกลไกกำรออกฤทธปกปองเซลลประสำทของสำรสกดมะกอกน�ำวำไมนำจะเกยวของกบวถ Mitogen- activated protein kinase (MAPK) และวถ Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) ดงนน กลไกทแนนอนในกำรออกฤทธ ปกปองเซลลประสำทของสำรสกดมะกอกน�ำยงไมเปนทแนชด จงควรศกษำวจยเพอขยำยผลตอไป

Neuroprotective Effects of Makok-nam Sadudee Rattanajarasroj et al.

2วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 56 ฉบบท 1 มกราคม - มนาคม 2557

ภาพท 1 มะกอกน�ำ (Elaeocarpus hygrophylus Kurz.)

บทน�า

มะกอกน�ำ หรอสำรภน�ำ (Elaeocarpus hygrophylus Kurz.) เปนพชในวงศ Elaeocarpaceae มกขน

รมน�ำ เปนไมตนขนำดใหญ ทรงพมกลมคอนขำงทบ เปลอกล�ำตนสน�ำตำลแดง ใบเปนใบเดยว กำนใบมสแดง ดอกออก

เปนชอตรงซอกใบ ผลเลกร รสเปรยวฝำด เปนผลไมพนบำนของไทย สำมำรถน�ำมำใชเปนอำหำร(1) (ภำพท 1) สำรทพบ

ในพชสกลน คอ สำรกลมฟลำโวนอยด (Flavonoids) ซงเปนสำรประกอบ polyphenolic มฤทธทำงเภสชวทยำหลำย

อยำง ประโยชนทส�ำคญของสำรประกอบกลมน คอ กำรเปนสำรตำนออกซเดชน (antioxidant)(2-3) จำกกำรทบทวน

วรรณกรรมทเกยวของในกำรศกษำในหลอดทดลอง (in vitro) โดยใชเซลลเพำะเลยง พบวำ สำรประกอบบำงชนด

ทแยกไดจำกพชในสกล Elaeocarpus เชน cucurbitacin F มควำมเปนพษตอเซลลมะเรงเพำะเลยง ไดแก human

oral epidermoid carcinoma KB cells และ mouse leukemia P-388 cells โดยมคำ median effective dose

(ED50) คอขนำดหรอควำมเขมขนสำรทท�ำใหเกดควำมเปนพษตอเซลลเพำะเลยงจ�ำนวนรอยละ 50 เปน 0.074 และ

0.04 ไมโครกรม/มลลลตร ตำมล�ำดบ(4) และมรำยงำนทพบวำ สำรประกอบ cucurbitacin D และ cucurbitacin F

ทแยกไดจำกพชในสกลนท�ำใหเกดควำมเปนพษตอเซลลมะเรงเพำะเลยงของคน ไดแก human lung cancer,

human colon cancer, human oral epidermoid carcinoma, hormone-dependent human prostate

cancer, human telomerase reverse transcriptase-retinal pigment epithelial cells และ human umblilical

vein endothelial cells โดยสำรประกอบทง 2 ชนด มคำ ED50 นอยกวำ 0.5 ไมโครกรม/มลลลตร(5) นอกจำกน

มรำยงำนวำ สำรประกอบบำงชนดทเปนอนพนธของ ellagic acid ทแยกไดจำกพชในสกล Elaeocarpus สำมำรถ

ยบยงกำรเจรญเตบโตของเชอ Babesia gibsoni ซงเปนพำรำสตทพบในสนข(6) และยงพบวำสำรสกดดวยเมทำนอล

จำกใบของพชในสกลนมฤทธตำนเชอมำลำเรย(7)

ภำวะเครยดจำกกำรเกดออกซเดชน (oxidative stress) หมำยถงภำวะทมควำมไมสมดลระหวำงอนมลอสระ

(free radicals) หรอ reactive oxygen species (ROS) กบสำร antioxidants ซงสงผลใหเกดกำรท�ำลำยชวโมเลกล

ภำยในรำงกำย เชน ดเอนเอ โปรตน และไขมน (oxidative damage) ภำวะ oxidative stress มควำมเกยวของโดยตรง

กบกำรเกดโรคเกยวกบควำมเสอมของประสำท (Neurodegenerative disease) โดยปรมำณของ free radical หรอ

ROS มำก ท�ำใหสำร antioxidant มปรมำณไมเพยงพอจงท�ำใหเซลลประสำทถกท�ำลำยหรอบำดเจบ เกดกำรตำยของ

เซลลประสำท และกอใหเกดโรคตำง ๆ (8) เชน โรคอลไซเมอร (Alzheimer’s disease), โรคพำรกนสน (Parkinson’s

disease), Huntington’s disease, Amylotrophic lateral sclerosis และ Neuroinflammatory disorder

เปนตน ปจจบนประชำชนไดรบควำมทกขทรมำนจำก neurodegenerative disease ตำง ๆ ทง Alzheimer’s disease

และ Parkinson’s disease เพมมำกขนโดยเฉพำะในประเทศทก�ำลงพฒนำ(9-10) โรคเรอรงเหลำนสงผลท�ำใหกำรท�ำงำน

ฤทธปกปองเซลลประสาทของสารสกดมะกอกน�า สดดรตนจรสโรจนและคณะ



ของสมองดอยลงจำกเดมจนมผลกระทบตอกำรท�ำงำน และกำรใชชวตประจ�ำวนท�ำใหคณภำพชวตของประชำกร

สงอำยลดลง

ไฮโดรเจนเปอรออกไซด (hydrogen peroxide) เปนตวตงตน (precursor) ของอนมลออกซเจน

(oxygen radical) ทอยภำยในเซลล hydrogen peroxide กอใหเกดภำวะ oxidative stress และเกด oxidative

damage ตำมมำ สงผลใหเกดปฏกรยำ lipid peroxidation ของไขมนอมตวจงเกดกำรตำยของเซลล(11) สวนกลตำเมต

(glutamate) เปนกรดอะมโนทเกยวของกบกำรกระตน (excitatory amino acid) หรอสำรสอประสำททเกยวของ

กบกำรกระตน (excitatory neurotransmitter) ทส�ำคญในระบบประสำทสวนกลำง โดยมบทบำทส�ำคญใน

neurotransmission, neuronal development และ synaptic plasticity ผำนกำรกระตนตวรบของ glutamate

(glutamate receptor)(12-13) กำรกระตน glutamate receptor มำกเกนไปโดยเฉพำะ N-methyl-D-aspartic acid

(NMDA) receptor เปนสำเหตใหเกดกำรตำยของเซลล(14) กลไกของกลตำเมตในกำรท�ำใหเกดพษตอเซลลประสำทนน

ยงไมทรำบแนชด จำกรำยงำนกำรวจยพบวำ glutamate อำจกอใหเกดพษตอเซลลประสำทไดโดยกำรกระตนเอนไซม

ทเกยวของกบแคลเซยม(15) กำรกระตน nitric oxide synthase(16) และกำรสรำง ROS จำกไมโตคอนเดรย(17)

ซงปจจยเหลำนสงผลใหเกดกำรตำยของเซลลประสำท

Mitogen-activated protein kinases (MAPK) เปนกลมของเอนไซมทท�ำหนำทเปนเครอขำยควบคม

กำรท�ำงำนของเซลลในหนำทหลกตำงๆ ไดแก กำรเจรญเตบโตของเซลล (cell growth) กำรเพมจ�ำนวนเซลล

(cell proliferation) กำรเปลยนสภำพของเซลล (differentiation) และกำรตำยของเซลล (cell death)(18-19)

เอนไซมกลมนท�ำงำนโดยปรบควำมสำมำรถในกำรท�ำงำนของโปรตนเปำหมำยทจ�ำเพำะภำยในเซลล โดยกำรเตมหม

ฟอสเฟตเขำไปยงโปรตนเปำหมำย ณ ต�ำแหนงกรดอะมโน Serine หรอ Threonine ทจ�ำเพำะ(20) MAPK จง

จดเปนกลมเอนไซมทเรยกวำ Serine/Threonine kinase กำรสงสญญำณในวถ MAPK ไดแก MAPK และ PI3K

signaling pathway มควำมจ�ำเปนตอกำรมชวตอยรอดของเซลล

เนองจำกมหลกฐำนสนบสนนวำ สำร antioxidant อำจจะปองกนกำรเกดพยำธสภำพจำกกำรเสอมของเซลล

ประสำทอนเปนผลมำจำก free radical ได และสำรสกดทไดจำกพชสมนไพรมะกอกน�ำ ซงเปนแหลงของสำรประกอบ

ทมฤทธเปน antioxidant(2) อำจสำมำรถปองกนหรอลดกำรเกดพยำธสภำพนได ท�ำใหลดกำรตำยของเซลลประสำท

รวมทงอำจมศกยภำพทจะน�ำมำวจยและพฒนำตอไปเพอใชปองกนหรอชะลอกระบวนกำรเสอมของเซลลประสำทอนเกด

จำกภำวะ oxidative stress ซงยงไมมขอมลหรอหลกฐำนทำงวทยำศำสตรสนบสนน ดงนน กำรวจยจงไดศกษำฤทธ

ปกปองเซลลประสำทของสำรสกดมะกอกน�ำ โดยกำรประเมนผลของสำรสกดมะกอกน�ำตอเซลลประสำทเพำะเลยงปกต

และเซลลประสำทเพำะเลยงทท�ำใหเกดกำรบำดเจบหรอตำยจำก hydrogen peroxide และ glutamate ในเซลล

ประสำทเพำะเลยง mouse neuroblastoma cells นอกจำกนผวจยยงไดศกษำกลไกกำรออกฤทธของสำรสกดมะกอกน�ำ

โดยกำรเตมสำรยบยงเฉพำะตอกำรสงสญญำณในวถ MAPK และวถ PI3K ใน mouse neuroblastoma cells ดวย

วสดและวธการ

1. ตวอยางวตถดบสมนไพร

เกบรวบรวมตวอยำงมะกอกน�ำส�ำหรบจดท�ำตวอยำงพช และตรวจระบชนดพรอมทงสวนของล�ำตนเพอน�ำ

มำใชเปนวตถดบในกำรศกษำวจยจำกพนทจงหวดปทมธำน ผลกำรตรวจระบชนดตำมหลกอนกรมวธำนพช โดยอำศย

เอกสำรวชำกำรทเกยวของ(21-22) พบวำ มะกอกน�ำมชอพฤกษศำสตรวำ Elaeocarpus hygrophilus Kurz.

วงศ Elaeocarpaceae (ไดจดท�ำตวอยำงพรรณไมแหงอำงอง (voucher specimen) คอ N. Chansuvanich,

W. Jirawattanapong and S. Ontong 3369 และเกบรกษำไวทพพธภณฑพชกรมวทยำศำสตรกำรแพทย (DMSC)

โดยมหมำยเลขพรรณไมของพพธภณฑพชกรมวทยำศำสตรกำรแพทย คอ DMSC 5173)



2. วธการทดลอง

2.1 การเตรยมสมนไพร

น�ำสวนทใช คอ ล�ำตน มำแยกเนอไมและเปลอกตนออกจำกกน แยกหนเปนชนเลก ๆ อบใหแหง

ทอณหภม 50 องศำเซลเซยส บดเปนผงหยำบและเกบไวในภำชนะปดสนท

2.2 การเตรยมสารสกด

น�ำผงสมนไพรแหงของแตละสวนทใชตงตนปรมำณ 100 กรม มำเตรยมเปนสำรสกดโดยกำรหมกใน

เอทำนอล 95% จ�ำนวน 3 ครง นำนครงละ 3 วน กรอง และน�ำไประเหยแหงภำยใตสญญำกำศดวยเครอง rotary

evaporator (Rotary vaccum evaporator, Büchi, Japan) ไดสำรสกดสวนเนอไม (EHW) และสวนเปลอกตน

(EHB) โดยมปรมำณสำรทสกดได (% yield, wt/wt) เปน 2.16 % และ 4.27 % ตำมล�ำดบ น�ำสำรสกดทไดมำละลำย

ดวยเอทำนอลบรสทธแลวเจอจำงดวยน�ำใหไดควำมเขมขนทตองกำร ในกำรศกษำนไดมกำรควบคมคณภำพทำงเคม

ของสำรสกดโดยใชเทคนคทำงโครมำโตกรำฟดวยวธ TLC fingerprint

2.3 การเตรยมเซลลเพาะเลยง

เซลลประสำทเพำะเลยงทใชในกำรศกษำ คอ mouse neuroblastoma cells, N1E-115 (American

Type Culture Collection (ATCC), USA, Cat.No. CRL-2263) passage number 23-30 น�ำเซลลแขวนลอย

(cell suspension) ใสในขวดเลยงเซลลขนำด 25 ตำรำงเซนตเมตร น�ำเซลลไปเลยงในตบมเลยงเซลลชนดควบคม

กำซคำรบอนไดออกไซด อณหภม 37 องศำเซลเซยส ภำยใตสภำวะ CO2 5% ดวยอำหำรเลยงเซลล (DMEM-high

glucose; Sigma-Aldrich, USA, Cat.No. D1152) ทม sodium bicarbonate 3.7 มลลกรม/มลลลตร, fetal

bovine serum 10% (FBS; Hyclone, USA) และยำปฏชวนะ penicillin G sodium (100 ยนต/มลลลตร) และ

streptomycin (100 ไมโครกรม/มลลลตร) นำน 5 - 7 วน หลงจำกนนยอยเซลลดวย trypsin-EDTA 0.25%

ใหได cell suspension แลวน�ำไปปนโดยใชเครองปนชนดควบคมอณหภม (Sorval RT7, USA) ดวยควำมเรว 1,200

รอบตอนำท อณหภม 20 องศำเซลเซยส เปนเวลำ 5 นำท แลวน�ำ cell pellet มำเตม DMEM ทม FBS 10% และท�ำ

เปน cell suspension นบจ�ำนวนเซลลทมชวตดวย hemocytometer โดยวธ trypan blue exclusion และน�ำเซลล

ไปเพำะเลยงตอเนอง (passage) โดยกำรแบงใสขวดเพำะเลยงเซลลใหมขนำด 75 ตำรำงเซนตเมตร เพอเพมจ�ำนวน

เซลล เปลยนอำหำรเลยงเซลลทก 2 - 3 วน และท�ำกำรเพำะเลยงขยำยดงทกลำว สปดำหละ 1 ครง หรอเมอเซลลเพม

จ�ำนวนประมำณ 80 - 90% ของพนทขวด

2.4. การเตรยมเซลลส�าหรบการทดสอบการเสอมของเซลลประสาท

ใชแบบจ�ำลองทท�ำใหเซลลประสำทบำดเจบหรอตำยจ�ำนวน 2 แบบ คอ กำรบำดเจบหรอกำรตำยของ

เซลลทเกดจำกควำมเปนพษของ hydrogen peroxide หรอ glutamate

2.4.1 การเตรยมเซลลเพาะเลยงส�าหรบการทดสอบการเสอมของเซลลประสาทจาก hydrogen

peroxide: เลยงเซลล N1E-115 ใน 48 well plate โดยควำมหนำแนนของเซลลเรมตน 3 × 104 เซลล/ตำรำง

เซนตเมตร ภำยใตสภำวะ CO2 5% เปนเวลำ 48 ชวโมง หลงจำกนนเปลยนอำหำรเลยงเซลลเปนแบบไมมซรม ซง

ประกอบดวย DMEM-high glucose (Sigma-Aldrich, USA, Cat.No. D1152) ทม sodium bicarbonate

3.7 มลลกรม/มลลลตร ยำปฏชวนะ และ N2 supplement ไดแก sodium selenite (Na2SeO3) 30 นำโนโมลำร,

human transferrin 30 ไมโครกรม/มลลลตร, bovine insulin 10 ไมโครกรม/มลลลตร, progesterone 20 นำโน

โมลำร และ putrescin 100 ไมโครโมลำร น�ำเซลลเพำะเลยงนไปใชในกำรทดลองหลงจำกอำยได 48 ชวโมง

2.4.2 การเตรยมเซลลเพาะเลยงส�าหรบการทดสอบการเสอมของเซลลประสาทจาก glutamate:

เลยงเซลล N1E-115 ใน 48 well plate ทเคลอบดวยสำร poly-D-lysine 100 ไมโครกรม/มลลลตร โดยควำม

หนำแนนของเซลลเรมตน 4 × 104 เซลล/ตำรำงเซนตเมตร ภำยใตสภำวะ CO2 5% เปนเวลำ 24 ชวโมง หลงจำกนน




เปลยนอำหำรเลยงเซลลเปน DMEM-high glucose (Sigma-Aldrich, USA, Cat.No. D1152) ทม sodium

bicarbonate 3.7 มลลกรม/มลลลตร, FBS 0.5% และยำปฏชวนะ แลวเตม dimethyl sulfoxide (DMSO) 1.5%

ในอำหำรเลยงเซลล เพำะเลยงเซลลตอไปอกจนครบ 96 ชวโมง จงน�ำเซลลไปใชในกำรทดลองได (เซลลเพำะเลยง

N1E-115 สำมำรถเปลยนสภำพ (differentiation) ไดภำยใตสภำวะทมซรมต�ำและม DMSO(23-24))

2.5 วธการทดสอบ

2.5.1 การทดสอบการเสอมของเซลลประสาทจาก hydrogen peroxide

1) การหาความเขมขนของ hydrogen peroxide ทเหมาะสมตอการทดสอบเซลลประสาท

เพาะเลยง

เจอจำงสำรละลำย hydrogen peroxide 30% (เทยบเทำกบ 9.794 โมลำร) ดวย Phosphate

Buffered Saline (DPBS; Sigma-Aldrich, USA) ทม MgCl2 0.100 กรม/ลตร (DPBS ประกอบดวย KCl 0.200

กรม/ลตร, NaCl 8.000 กรม/ลตร, KH2PO4 0.200 กรม/ลตร และ Na2HPO4 (anhydrous) 1.150 กรม/ลตร)

เพอใหไดควำมเขมขนตำง ๆ ทตองกำร น�ำเซลลเพำะเลยง N1E-115 (3 × 104 เซลล/ตำรำงเซนตเมตร) อำย 48

ชวโมง มำเตมสำรละลำย hydrogen peroxide ทควำมเขมขน 25, 50, 100, 200, 300, 400 และ 500 ไมโครโมลำร

ลงในเซลลเพำะเลยงแตละหลมแลวเลยงตอเปนเวลำ 24 ชวโมง สวนเซลลกลมควบคมใหเตม PBS ในปรมำตรเทำกน

หลงจำกนนประเมน cell viability โดยตรวจวดดวยวธ MTT reduction

2) การทดสอบผลของสารสกด EHB และ EHW ของมะกอกน�าตอเซลลประสาท

เพาะเลยงปกต

ละลำยสำรสกด EHB และ EHW ของมะกอกน�ำในเอทำนอลบรสทธ และเจอจำงดวย

sterile distilled water เพอใหไดควำมเขมขนตำง ๆ ทตองกำร (ควำมเขมขนสดทำยของเอทำนอลไมเกน 0.1%) น�ำเซลล

เพำะเลยง N1E-115 (3 × 104 เซลล/ตำรำงเซนตเมตร) อำย 48 ชวโมง มำเตม EHB หรอ EHW ทควำมเขมขน

0.5, 1, 5, 25 และ 50 ไมโครกรม/มลลลตร ลงในเซลลเพำะเลยงแตละหลมแลวเลยงตอเปนเวลำ 24 ชวโมง และเตม

เอทำนอล 2.5% ในปรมำตรเทำกน (ควำมเขมขนสดทำยของเอทำนอลไมเกน 0.1%) ในเซลลกลมควบคม หลงจำกนน

ประเมน cell viability โดยตรวจวดดวยวธ MTT reduction

3) การทดสอบผลของสารสกด EHB และ EHW ของมะกอกน�าตอการบาดเจบและ

การตายของเซลลประสาททเกดจาก hydrogen peroxide

น�ำเซลลเพำะเลยง N1E-115 (3 × 104 เซลล/ตำรำงเซนตเมตร) อำย 48 ชวโมง มำเตมสำรสกด

EHB หรอ EHW ทควำมเขมขน 0.5, 1, 5, 25 และ 50 ไมโครกรม/มลลลตร พรอมกบเตม hydrogen peroxide

200 ไมโครโมลำร ในเซลลเพำะเลยงแตละหลมและเลยงตอเปนเวลำ 24 ชวโมง อกกลมกำรทดสอบใหเตมสำรสกดท

ควำมเขมขนดงกลำว เปนเวลำ 24 ชวโมง กอนเตม hydrogen peroxide 200 ไมโครโมลำร แลวน�ำเซลลไปเลยงตอ

เปนเวลำ 24 ชวโมง และเตม PBS ในปรมำตรเทำกนในเซลลกลมควบคม หลงจำกนนประเมน cell viability โดย

ตรวจวดดวยวธ MTT reduction

2.5.2 การทดสอบการเสอมของเซลลประสาทจาก glutamate

1) การหาความเขมขนของ glutamate ทเหมาะสมตอการทดสอบเซลลประสาทเพาะเลยง

ละลำย glutamate และ glycine ใน sterile PBS (DPBS ทปรำศจำก MgCl2) แลวเจอจำง

ดวย PBS เพอใหไดควำมเขมขนตำง ๆ ทตองกำร น�ำเซลลเพำะเลยง N1E-115 (4 × 104 เซลล/ตำรำงเซนตเมตร) อำย

96 ชวโมง แตละหลมมำเตม glutamate ทควำมเขมขน 1, 10, 25, 50, 75 และ 100 มลลโมลำร พรอมกบเตม glycine

ทควำมเขมขน 2 มลลโมลำร แลวเลยงตอเปนเวลำ 24 ชวโมง และเตม PBS ในปรมำตรเทำกนในเซลลกลมควบคม




2) การทดสอบผลของสารสกด EHB และ EHW ของมะกอกน�าตอเซลลประสาทเพาะ

เลยงปกต

น�ำเซลลเพำะเลยง N1E-115 (4 × 104 เซลล/ตำรำงเซนตเมตร) อำย 96 ชวโมง แตละหลมมำ

เตมสำรสกด EHB หรอ EHW ทควำมเขมขน 0.5, 1, 5, 25 และ 50 ไมโครกรม/มลลลตร แลวเลยงตอเปนเวลำ 24

ชวโมง และเตมเอทำนอล 2.5% ในปรมำตรเทำกน (ควำมเขมขนสดทำยของเอทำนอลไมเกน 0.1%) ในเซลลกลมควบคม


3) การทดสอบผลของสารสกด EHB และ EHW ของมะกอกน�าตอการบาดเจบและ

การตายของเซลลประสาททเกดจาก glutamate

น�ำเซลลเพำะเลยง N1E-115 (4 × 104 cell/cm2) อำย 96 ชวโมง แตละหลมมำเตมสำรสกด

EHB หรอ EHW ทควำมเขมขน 0.5, 1, 5, 25 และ 50 ไมโครกรม/มลลลตร พรอมกบเตม glutamate 50 มลลโมลำร

และ glycine 2 มลลโมลำร แลวเลยงตอเปนเวลำ 24 ชวโมง อกกลมกำรทดสอบใหเตมสำรสกดทควำมเขมขนดงกลำว

เปนเวลำ 24 ชวโมง กอนเตม glutamate และ glycine แลวน�ำเซลลไปเลยงตอเปนเวลำ 24 ชวโมง และเตม PBS

ในปรมำตรเทำกนในเซลลกลมควบคม หลงจำกนนประเมน cell viability โดยตรวจวดดวยวธ MTT reduction

4) การทดสอบผลของสารยบยงเฉพาะ MEK inhibitor (PD 98059) หรอ PI3K

inhibitor (LY 294002) ตอฤทธปกปองเซลลประสาทของสารสกด EHB และ EHW ของมะกอกน�า

ตอการบาดเจบและการตายของเซลลประสาททเกดจาก glutamate

ละลำย PD 98059 และ LY 294002 ใน DMSO ใหไดควำมเขมขน 50 มลลโมลำร เกบเปน

stock solutions ทอณหภม -20 องศำเซลเซยส และเจอจำงดวย DMSO เพอใหไดควำมเขมขนทตองกำร น�ำเซลล

เพำะเลยง N1E-115 (4 × 104 cell/cm2) อำย 96 ชวโมง มำแบงเปน 7 กลม ดงน

กลมท 1 เปนกลมควบคม เตม DMSO 2.5% (ควำมเขมขนสดทำยเปน 0.1%) เปนเวลำ 2

ชวโมง เปลยนอำหำรเลยงเซลลแลวเตม DMSO 2.5% ในปรมำตรเทำเดม

กลมท 2 และ 3 เตมสำร PD 98059 30 ไมโครโมลำร และ LY 294002 40 ไมโครโมลำร

ตำมล�ำดบ เปนเวลำ 2 ชวโมง เปลยนอำหำรเลยงเซลลแลวเตมสำร PD 98059 และ LY 294002 ทควำมเขมขน

เทำเดม ตำมล�ำดบ

กลมท 4 เตม DMSO 2.5% (ควำมเขมขนสดทำยเปน 0.1%) เปนเวลำ 2 ชวโมง เปลยน

อำหำรเลยงเซลลแลวเตม glutamate 50 มลลโมลำร และ glycine 2 มลลโมลำร

กลมท 5 เตม DMSO 2.5 % (ควำมเขมขนสดทำยเปน 0.1%) เปนเวลำ 2 ชวโมง เปลยนอำหำร

เลยงเซลลแลวเตมสำรสกด EHB หรอ EHW ทควำมเขมขนท 50 ไมโครกรม/มลลลตร พรอมกบเตม glutamate

50 มลลโมลำร และ glycine 2 มลลโมลำร

กลมท 6 เตมสำร PD 98059 30 ไมโครโมลำร เปนเวลำ 2 ชวโมง เปลยนอำหำรเลยงเซลลแลว

เตมสำรสกด EHB หรอ EHW ทควำมเขมขนท 50 ไมโครกรม/มลลลตร พรอมกบเตม glutamate 50 มลลโมลำร

และ glycine 2 มลลโมลำร รวมกบเตมสำร PD 98059 30 ไมโครโมลำร

กลมท 7 เตมสำร LY 294002 40 ไมโครโมลำร เปนเวลำ 2 ชวโมง เปลยนอำหำรเลยงเซลล

แลวเตมสำรสกด EHB หรอ EHW ทควำมเขมขนท 50 ไมโครกรม/มลลลตร พรอมกบเตม glutamate 50 มลลโมลำร

และ glycine 2 มลลโมลำร รวมกบเตมสำร LY 294002 40 ไมโครโมลำร

หลงจำกนนน�ำเซลลไปเลยงตอเปนเวลำ 24 ชวโมง แลวประเมน cell viability โดยตรวจวดดวยวธ

MTT reduction




3. การประเมนคณภาพและความอยรอดของเซลล

3.1 การประเมน cell morphology

ตดตำมกำรเปลยนแปลงรปรำง (morphology) ของเซลลเพำะเลยง โดยสองดวยกลองจลทรรศนชนด

หวกลบ (inverted microscope, Axiovert 200, Zeiss, Germany)

3.2 การวดจ�านวนเซลลทมชวตโดยวธ MTT reduction

ตรวจวดเซลล MTT reduction ดวยวธ colorimetric โดยดดแปลงจำกวธของ Mosmann (1983)(25)

ดงน เตมสำรละลำย MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenltetrazolium bromide) 10 ไมโครลตร

(5 มลลกรม/มลลลตรใน PBS) ลงในเซลลของแตละหลม (ควำมเขมขนสดทำย 100 ไมโครกรม/มลลลตร) แลวน�ำ

เซลลเพำะเลยงไปบมในตอบเพำะเชอ อณหภม 37 องศำเซลเซยส เปนเวลำ 1 ชวโมง หลงจำกนนดดอำหำรเลยงเซลลทง

และเตม DMSO 200 ไมโครลตร ลงในแตละหลม ดดสำรละลำยของแตละหลมใสใน 96 well plate แลวน�ำไปวดคำ

กำรดดกลนแสงดวย Multi-detection microplate reader (SynergyTM HT, Biotex, USA) ทควำมยำวคลน

570/620 นำโนเมตร คำ MTT reduction แสดงในรปของรอยละเปรยบเทยบกบกลมควบคมซงค�ำนวณจำก

(คำกำรดดกลนแสงของกลมทไดรบสำรหรอสมนไพร × 100)/คำกำรดดกลนแสงของกลมควบคม

4. การวเคราะหขอมลทางสถต

ขอมลทกคำน�ำเสนอในรปคำเฉลย (mean) + คำควำมคลำดเคลอนมำตรฐำน (standard error, SEM)

โดยคำเฉลยของแตละขอมลมำจำก 6 ตวอยำง (n = 6) ทเปนอสระตอกน และแตละตวอยำงท�ำสำมซ�ำ กำรเปรยบเทยบ

ควำมแตกตำงของคำเฉลยมำกกวำ 2 กลม ใช Analysis of variance (ANOVA) และเปรยบเทยบขอมลทแตกตำงกน

กรณควำมแปรปรวนของทง 2 กลมไมแตกตำงกนใช Scheffe multiple comparisons และกรณควำมแปรปรวนของ

ทง 2 กลมแตกตำงกนใช Tamhane’s T2 multiple comparisons คำ p ทนอยกวำ 0.05 หรอทระดบควำมเชอมน

95% ถอวำมควำมแตกตำงอยำงมนยส�ำคญทำงสถต

ผล

ในกำรศกษำนไดประเมนควำมอยรอดของเซลล (cell viability) โดยกำรตรวจวด MTT reduction

ซงเปนดชนชวดของ mitochondrial viability/ activity โดยเอนไซม mitochondrial dehydrogenase ในเซลล

ทมชวต และ mitochondria ทยงท�ำงำนอยนสำมำรถเปลยนสำร MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,

5-diphenyltetrazolium bromide (สำรสเหลอง) ไปเปน formazan (สำรสมวง) ทไมละลำยน�ำ หลงจำกนน ละลำย

formazan ดวย DMSO กอนน�ำไปวดคำกำรดดกลนแสง โดยคำทเพมขนนบงบอกถงกำรเพม total metabolic

activity คอ กำรเพมจ�ำนวนของเซลลมชวตหรอกำรเพม MTT reduction

1. การทดสอบการเสอมของเซลลประสาทจาก hydrogen peroxide

1.1 การหาความเขมขนของ hydrogen peroxide ทเหมาะสมตอการทดสอบเซลลประสาท

เพาะเลยง

เซลลประสำท N1E-115 สมผสกบ hydrogen peroxide ทควำมเขมขน 25 - 500 ไมโครโมลำร

เปนเวลำ 24 ชวโมง แลวประเมน cell viability โดยวดดวยวธ MTT reduction พบวำ hydrogen peroxide ท

ควำมเขมขน 25, 50, 100, 200, 300, 400 และ 500 ไมโครโมลำร มคำ MTT reduction ของเซลลประสำทเปน 93.39,

91.38, 61.85, 47.28, 31.81, 21.32 และ16.19% ตำมล�ำดบ แสดงใหเหนวำ hydrogen peroxide ลด cell viability



ภาพท 2 ผลของ Hydrogen peroxide ตอ cell viability ของเซลลประสำทเพำะเลยง mouse Neuroblastoma,

N1E-115 เซลลประสำทเพำะเลยง N1E-115 อำย 48 ชวโมงสมผสกบ Hydrogen peroxide ทควำมเขมขน

25-500 ไมโครโมลำร เปนเวลำ 24 ชวโมง หลงจำกนนประเมน cell viability ดวยวธ MTT reduction ขอมล

ทกคำแสดงในรปของคำเฉลย ± คำควำมคลำดเคลอนมำตรฐำน โดยคำเฉลยของแตละขอมลมำจำก 6 ตวอยำง

(n = 6) ทเปนอสระตอกน และแตละตวอยำงท�ำสำมซ�ำ จำกกรำฟคำ IC50 = 236.38 ไมโครโมลำร และ

IC60 = 176.18 ไมโครโมลำร

120

100

80

60

40

20

0 0 100 200 300 400 500 600

Hydrogen peroxide concentrations (uM)

MTT

reduction (% of C

ontrol)

เปนสดสวนโดยตรงกบควำมเขมขนของ hydrogen peroxide โดยมคำ IC50 (Inhibition concentration at 50%)

ซงคอ คำควำมเขมขนทสำมำรถยบยง cell viability ไดรอยละ 50 เทำกบ 236.38 ไมโครโมลำร (ภำพท 2) และจำก

กำรสงเกตภำยใตกลองจลทรรศน พบวำ เซลลประสำทมรปรำงผดปกต โดยมลกษณะบวม/หดตว/ฝอเปนซำกเศษเซลล

ทตำยแลวอยปะปนกบเซลลทยงมชวตอย และควำมยำวของ neurite สนลงและไมมควำมตอเนอง เมอเทยบกบกลม

ควบคม ควำมผดปกตดงกลำวเกดขนพรอมกนกบกำรลดลงของ cell viability เนองจำกเซลลประสำทสมผสกบ

hydrogen peroxide ทควำมเขมขน 200 ไมโครโมลำร เปนเวลำ 24 ชวโมงท�ำใหเซลลตำยประมำณรอยละ 50 - 60

(IC50 = 236.38 และ IC60 = 176.18) ดงนน ผวจยจงเลอกใชควำมเขมขนดงกลำวในกำรท�ำใหเกดกำรบำดเจบและ

กำรตำยของเซลลประสำทในกำรทดลองตอไป

1.2 ผลของสารสกดมะกอกน�าตอเซลลประสาทเพาะเลยงปกต

เซลลประสำท N1E-115 สมผสกบสำรสกด EHB ทควำมเขมขน 0.5, 1, 5, 25 และ 50 ไมโครกรม/

มลลลตร เปนเวลำ 24 ชวโมง พบวำ MTT reduction ของเซลลประสำทเปน 108.70, 102.36, 102.53, 99.32 และ

88.50% ตำมล�ำดบ เมอเทยบกบกลมควบคม (100%) เมอเซลลประสำทสมผสกบสำรสกด EHW ทควำมเขมขน

เดยวกนนเปนเวลำ 24 ชวโมง พบวำ MTT reduction ของเซลลประสำทเปน 106.19, 100.48, 102.35, 103.32

และ 104.91% ตำมล�ำดบ เมอเทยบกบกลมควบคม (100%) แสดงใหเหนวำ สำรสกดมะกอกน�ำทง 2 สำรสกดท

ควำมเขมขนดงกลำวไมมผลตอ cell viability ของเซลลประสำทเพำะเลยงปกต

1.3 ผลของสารสกดมะกอกน�าตอการปกปองการบาดเจบและการตายของเซลลประสาททเกดจาก

hydrogen peroxide

เมอใหเซลลประสำท N1E-115 สมผสกบสำรสกด EHB หรอ EHW ทควำมเขมขน 0.5, 1, 5, 25

และ 50 ไมโครกรม/มลลลตร พรอมกบ hydrogen peroxide ทควำมเขมขน 200 ไมโครโมลำร เปนเวลำ 24 ชวโมง หรอ




120

100

80

60

40

20

0

0 20 40 60 80 100 120

Glutamate concentrations (mM)

MTT

reduction (% of C

ontrol)

ภาพท 3 ผลของ Glutamate ตอ cell viability ของเซลลประสำทเพำะเลยง mouse neuroblastoma เซลล

ประสำทเพำะเลยง N1E-115 อำย 96 ชวโมงสมผสกบ Glutamate ทควำมเขมขน 1 - 100 มลลโมลำรเปนเวลำ

24 ชวโมง หลงจำกนนประเมน cell viability ดวยวธ MTT reduction ขอมลทกคำแสดงในรปของคำเฉลย ±

คำควำมคลำดเคลอนมำตรฐำน โดยคำเฉลยของแตละขอมลมำจำก 6 ตวอยำง (n = 6) ทเปนอสระตอกน และแตละ

ตวอยำงท�ำสำมซ�ำ จำกกรำฟ คำ IC50 = 68.81 มลลโมลำร และ IC60 = 48.07 มลลโมลำร

ใหเซลลประสำท N1E-115 สมผสกบสำรสกด EHB หรอ EHW ทควำมเขมขนเดยวกนนเปนเวลำ 24 ชวโมง กอนกำรให

hydrogen peroxide ทควำมเขมขน 200 ไมโครโมลำร เปนเวลำ 24 ชวโมง พบผลเชนเดยวกน คอ ไมมกำรเปลยนแปลง

MTT reduction เมอเทยบกบกลมควบคม แสดงใหเหนวำ สำรสกด EHB และ EHW ของมะกอกน�ำไมสำมำรถ

ลดกำรบำดเจบหรอกำรตำยทเกดจำก hydrogen peroxide ได

2. การทดสอบการเสอมของเซลลประสาทจาก glutamate

2.1 การหาความเขมขนของ glutamate ทเหมาะสมตอการทดสอบเซลลประสาทเพาะเลยง

จำกกำรน�ำเซลลประสำท N1E-115 ทท�ำใหเปลยนสภำพแลวดวย DMSO มำสมผสกบ glutamate

ทควำมเขมขน 1 - 100 มลลโมลำร เปนเวลำ 24 ชวโมง และประเมน cell viability โดยวดดวยวธ MTT reduction

พบวำ glutamate ทควำมเขมขน 1, 10, 25, 50, 75 และ 100 มลลโมลำร มคำ MTT reduction ของเซลลประสำท

เปน 88.94, 78.83, 66.27, 54.39, 44.56 และ 40.24% ตำมล�ำดบ แสดงใหเหนวำ glutamate ลด cell viability

เปนสดสวนโดยตรงกบควำมเขมขนของ glutamate โดยมคำ IC50 เทำกบ 68.81 มลลโมลำร และ IC60 เทำกบ 48.07

มลลโมลำร (ภำพท 3) และจำกกำรสงเกตภำยใตกลองจลทรรศน พบวำ ควำมหนำแนนของเซลลประสำทลดลง เซลล

ประสำทมรปรำงผดปกต และควำมยำวของ neurite สนลงและไมมควำมตอเนอง และม cell viability ลดลงเมอ

เทยบกบกลมควบคม ดงนน กำรทดลองตอไปจงเลอกใชกำรสมผสกบ glutamate ทควำมเขมขน 50 มลลโมลำร

เปนเวลำ 24 ชวโมง เพอท�ำใหเกดพษตอเซลลประสำทเพำะเลยง



ภาพท 4 ผลกำรสมผสของเซลลประสำทเพำะเลยง N1E-115 กบสำรสกด EHB ตอกำรบำดเจบและกำรตำยของเซลลประสำททเกดจำกพษของ glutamate เซลลประสำทเพำะเลยง N1E-115 อำย 96 ชวโมงสมผสกบสำรสกด EHB ทควำมเขมขน 0.5 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร พรอมกบ glutamate ทควำมเขมขน 50 มลลโมลำร เปนเวลำ 24 ชวโมง หลงจำกนนประเมน cell viability ดวยวธ MTT reduction ขอมลทกคำแสดงในรปของคำเฉลย ± คำควำมคลำดเคลอนมำตรฐำน โดยคำเฉลยของแตละขอมลมำจำก 6 ตวอยำง (n = 6) ทเปนอสระตอกน และแตละตวอยำงท�ำสำมซ�ำ # แตกตำงอยำงมนยส�ำคญทำงสถต (p<0.05) เมอเทยบกบกลมควบคม * แตกตำงอยำงมนยส�ำคญทำงสถต (p<0.05) เมอเทยบกบกลมทสมผสกบ glutamate

120

100

80

60

40

20

0 Control 0 0.5 1 5 25 50

สำรสกด EHB (µg/ml)

Glutamate 50 mM

MTT

reduction (% of C

ontrol)

#

* * * *

2.2 ผลของสารสกดมะกอกน�าตอเซลลประสาทเพาะเลยงปกต

เมอใหเซลลประสำท N1E-115 ทท�ำใหเปลยนสภำพแลวดวย DMSO มำสมผสกบสำรสกด EHB

ทควำมเขมขน 0.5, 1, 5, 25 และ 50 ไมโครกรม/มลลลตร เปนเวลำ 24 ชวโมง พบวำ cell viability ของเซลลประสำท

เปน 106.52, 103.26, 106.22, 104.92 และ 102.54% ตำมล�ำดบ เมอเทยบกบกลมควบคม (100%) ในขณะท

เมอสมผสกบสำรสกด EHW ทควำมเขมขนเดยวกนนเปนเวลำ 24 ชวโมง พบวำ cell viability ของเซลลประสำท

เปน 104.93, 98.07, 103.12, 107.10 และ 105.99% ตำมล�ำดบ เมอเทยบกบกลมควบคม (100%) แสดงใหเหนวำ

สำรสกดมะกอกน�ำทง 2 สำรสกดทควำมเขมขนดงกลำวไมมผลตอ cell viability ของเซลลประสำทเพำะเลยงปกต

2.3 ผลของสารสกดมะกอกน�าตอการปกปองการบาดเจบและการตายของเซลลประสาททเกดจาก

glutamate

เมอใหเซลลประสำท N1E-115 ทท�ำใหเปลยนสภำพแลวดวย DMSO มำสมผสกบสำรสกด EHB

ทควำมเขมขน 0.5 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร พรอมกบ glutamate ทควำมเขมขน 50 มลลโมลำร เปนเวลำ 24 ชวโมง

ผลกำรทดลองพบวำ MTT reduction ของเซลลเพำะเลยงหลงกำรสมผสกบ glutamate เปน 57.98% เมอเทยบกบ

กลมควบคม และเมอใหเซลลประสำทเพำะเลยงสมผสกบสำรสกด EHB ทควำมเขมขน 0.5 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร

พรอมกบ glutamate ทควำมเขมขน 50 มลลโมลำร พบวำ สำรสกด EHB ทควำมเขมขน 1, 5, 25 และ 50 ไมโครกรม/

มลลลตร สำมำรถเพม cell viability อยำงมนยส�ำคญทำงสถต (p<0.05) โดยเพมขน 19.98, 18.34, 19.76 และ 24.19%

ตำมล�ำดบ เมอเทยบกบกลมทไดรบ glutamate อยำงเดยว (ภำพท 4) แสดงใหเหนวำ สำรสกด EHB ของมะกอกน�ำ

ทควำมเขมขน 1 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร แสดงฤทธปกปองเซลลประสำท โดยสำมำรถลดกำรบำดเจบหรอ

กำรตำยทเกดจำก glutamate ได




* * **

*

#

120

100

80

60

40

20

0 Control 0 0.5 1 5 25 50

สำรสกด EHW (µg/ml)

Glutamate 50 mM

MTT

reduction (% of C

ontrol)

ภาพท 5 ผลกำรสมผสของเซลลประสำทเพำะเลยง N1E-115 กบสำรสกด EHW ตอกำรบำดเจบและกำรตำยของ

เซลลประสำททเกดจำกพษของ glutamate เซลลประสำทเพำะเลยง N1E-115 อำย 96 ชวโมงสมผสกบสำรสกด

EHW ทควำมเขมขน 0.5 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร พรอมกบ glutamate ทควำมเขมขน 50 มลลโมลำร เปนเวลำ

24 ชวโมง หลงจำกนนประเมน cell viability ดวยวธ MTT reduction ขอมลทกคำแสดงในรปของคำเฉลย ±

คำควำมคลำดเคลอนมำตรฐำน โดยคำเฉลยของแตละขอมลมำจำก 6 ตวอยำง (n = 6) ทเปนอสระตอกน และแตละ

ตวอยำงท�ำสำมซ�ำ

# แตกตำงอยำงมนยส�ำคญทำงสถต (p<0.05) เมอเทยบกบกลมควบคม

* แตกตำงอยำงมนยส�ำคญทำงสถต (p<0.05) เมอเทยบกบกลมทสมผสกบ glutamate

สวนกำรสมผสของเซลลประสำท N1E-115 ทท�ำใหเปลยนสภำพแลวดวย DMSO กบสำรสกด EHW

ทควำมเขมขน 0.5 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร พรอมกบ glutamate ทควำมเขมขน 50 มลลโมลำร เปนเวลำ 24 ชวโมง

พบวำ MTT reduction ของเซลลเพำะเลยงหลงกำรสมผส glutamate เปน 55.43% และเมอใหเซลลประสำทเพำะ

เลยงสมผสกบสำรสกด EHW ทควำมเขมขน 0.5 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร พรอมกบ glutamate ทควำมเขมขน 50

มลลโมลำร พบวำ สำรสกด EHW ทควำมเขมขน 0.5, 1, 5, 25 และ 50 ไมโครกรม/มลลลตร สำมำรถเพม cell viability

อยำงมนยส�ำคญทำงสถต (p<0.05) โดยเพมขน 22.03, 25.02, 28.85, 36.48 และ 41.85% ตำมล�ำดบ เมอเทยบกบ

กลมทไดรบ glutamate อยำงเดยว ซงกำรออกฤทธของสำรสกดนเปนสดสวนโดยตรงกบควำมเขมขนของสำรสกด

(dose-dependent) คอ กำรออกฤทธของสำรสกดเพมขนเมอเพมควำมเขมขนของสำรสกด (ภำพท 5) แสดงให

เหนวำ สำรสกด EHW ของมะกอกน�ำทควำมเขมขน 0.5 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร แสดงฤทธปกปองเซลลประสำท

โดยสำมำรถลดกำรบำดเจบหรอกำรตำยทเกดจำก glutamate ได

เมอเปรยบเทยบควำมแรงในกำรออกฤทธปกปองเซลลประสำทของสำรสกดมะกอกน�ำทง 2 ชนดทควำมเขมขน

เดยวกน พบวำ สำรสกด EHW ของมะกอกน�ำแสดงฤทธปกปองเซลลประสำทไดดกวำ และเปนกำรออกฤทธโดยขนกบ

ควำมเขมขนของสำรสกด ในทำงตรงกนขำม กำรสมผสของเซลลประสำทเพำะเลยงกบสำรสกด EHB หรอ EHW

ของมะกอกน�ำทควำมเขมขน 0.5 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร กอนกำรสมผสกบ glutamate ทควำมเขมขน 50

มลลโมลำร เปนเวลำ 24 ชวโมง ไมมผลตอกำรลดกำรบำดเจบหรอกำรตำยทเกดจำกพษของ glutamate



จำกผลกำรทดลองในเบองตน พบวำ สำรสกด EHB (1 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร) และสำรสกด EHW

(0.5 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร) แสดงฤทธปกปองเซลลประสำทในแบบจ�ำลองกำรเสอมของเซลลประสำทจำก

glutamate โดยกำรออกฤทธปกปองเซลลประสำทของสำรสกดนเปนแบบ dose-dependent ดงนน ผวจยจงเลอก

สำรสกด EHB และสำรสกด EHW ทควำมเขมขน 50 ไมโครกรม/มลลลตร ส�ำหรบใชในกำรทดลองตอไป

2.4 ผลของ MEK inhibitor (PD 98059) หรอ PI3K inhibitor (LY 294002) ตอฤทธปกปอง

เซลลประสาทของสารสกด EHB และ EHW ของมะกอกน�าตอการบาดเจบและการตายของเซลลประสาททเกด

จาก glutamate

ในกำรทดสอบวำกลไกกำรออกฤทธปกปองเซลลประสำทของสำรสกด EHB และ EHW เกยวของกบ

กระบวนกำรสงสญญำณผำนวถ Mitogen-activated protein kinases (MAPK) หรอวถ phosphatidylinositol

3-kinase (PI3K) signaling pathway หรอไม โดยเตมหรอไมเตมสำรยบยงเฉพำะ ไดแก MEK inhibitor

(PD 98059) หรอ PI3K inhibitor (LY 294002) เปนเวลำ 2 ชวโมงกอนกำรสมผสรวมและหลงจำกนนเตมสำร

ยบยงเฉพำะพรอมกบกำรสมผสรวมระหวำงสำรสกด EHB หรอ EHW และ glutamate ในเซลลเพำะเลยง เปนเวลำ

24 ชวโมง พบผลดงน

#

* * *

120

100

80

60

40

20

0 Control PD LY - - PD LY

EHB EHB EHBGlutamate

MTT

reduction (% of C

ontrol)

ภาพท 6 ผลของ MEK inhibitor (PD 98059) และ PI3K inhibitor (LY 294002) ตอฤทธปกปองเซลลประสำทของสำรสกด EHB จำกกำรบำดเจบและกำรตำยของเซลลประสำททเกดจำกพษของ glutamate เซลลประสำท เพำะเลยง N1E-115 อำย 96 ชวโมง สมผสกบสำรยบยงเฉพำะ PD 98059 (PD) ทควำมเขมขน 30 ไมโครโมลำร หรอ LY 294002 (LY) ทควำมเขมขน 40 ไมโครโมลำร หรอสมผสกบ glutamate ทควำมเขมขน 50 มลลโมลำร หรอสมผสรวมระหวำงสำรสกด EHB ทควำมเขมขน 50 ไมโครกรม/มลลลตร และ glutamate 50 มลลโมลำร หรอสมผสกบสำรยบยงเฉพำะ PD หรอ LY กอนสมผสรวมระหวำงสำรสกด EHB ทควำมเขมขน 50 ไมโครกรม/มลลลตร และ glutamate 50 มลลโมลำร เปนเวลำ 24 ชวโมง หลงจำกนนประเมน cell viability ดวยวธ MTT reduction ขอมลทกคำแสดงในรปของคำเฉลย ± คำควำมคลำดเคลอนมำตรฐำน โดยคำเฉลยของแตละขอมลมำจำก 6 ตวอยำง (n = 6) ทเปนอสระตอกน และแตละตวอยำงท�ำสำมซ�ำ # แตกตำงอยำงมนยส�ำคญทำงสถต (p<0.05) เมอเทยบกบกลมควบคม * แตกตำงอยำงมนยส�ำคญทำงสถต (p<0.05) เมอเทยบกบกลมทสมผสกบ glutamate




ภาพท 7 ผลของ MEK inhibitor (PD 98059) และ PI3K inhibitor (LY 294002) ตอฤทธปกปองเซลลประสำท

ของสำรสกด EHW จำกกำรบำดเจบและกำรตำยของเซลลประสำททเกดจำกพษของ glutamate เซลลประสำท

เพำะเลยง N1E-115 อำย 96 ชวโมง สมผสกบสำรยบยงเฉพำะ PD 98059 (PD) ทควำมเขมขน 30 ไมโครโมลำร

หรอ LY 294002 (LY) ทควำมเขมขน 40 ไมโครโมลำร หรอสมผสกบ glutamate ทควำมเขมขน 50 มลลโมลำร

หรอสมผสรวมระหวำงสำรสกด EHW ทควำมเขมขน 50 ไมโครกรม/มลลลตร และ glutamate 50 มลลโมลำร หรอ

สมผสกบสำรยบยงเฉพำะ PD หรอ LY กอนสมผสรวมระหวำงสำรสกด EHW ทควำมเขมขน 50 ไมโครกรม/มลลลตร

และ glutamate 50 มลลโมลำร เปนเวลำ 24 ชวโมง หลงจำกนนประเมน cell viability ดวยวธ MTT reduction

ขอมลทกคำแสดงในรปของคำเฉลย ± คำควำมคลำดเคลอนมำตรฐำน โดยคำเฉลยของแตละขอมลมำจำก 6 ตวอยำง

(n = 6) ทเปนอสระตอกน และแตละตวอยำงท�ำสำมซ�ำ

# แตกตำงอยำงมนยส�ำคญทำงสถต (p<0.05) เมอเทยบกบกลมควบคม

* แตกตำงอยำงมนยส�ำคญทำงสถต (p<0.05) เมอเทยบกบกลมทสมผสกบ glutamate

120

100

80

60

40

20

0 Control PD LY - - PD LY

EHW EHW EHWGlutamate

MTT

reduction (% of C

ontrol)

* **

#

กำรใหเซลลประสำท N1E-115 ทท�ำใหเปลยนสภำพดวย DMSO มำสมผสกบ PD 98059 หรอ

LY 294002 พบวำ PD 98059 30 ไมโครโมลำร และ LY 294002 40 ไมโครโมลำรไมมผลตอ MTT reduction

เมอเทยบกบกลมควบคม ขณะท MTT reduction ของเซลลเพำะเลยงหลงกำรสมผสกบ glutamate 50 มลลโมลำร

เปน 54.54% เมอเทยบกบกลมควบคม กำรสมผสรวมของสำรสกด EHB 50 ไมโครกรม/มลลลตร กบ glutamate

50 มลลโมลำร พบวำ สำรสกด EHB ทควำมเขมขน 50 ไมโครกรม/มลลลตร สำมำรถเพม cell viability อยำงม

นยส�ำคญทำงสถต (p<0.05) โดยเพมขน 25.60% เมอเทยบกบกลมทไดรบ glutamate อยำงเดยว เมอให PD 98059

หรอ LY 294002 กอนกำรสมผสรวม หลงจำกนนให PD 98059 หรอ LY 294002 พรอมกบกำรสมผสรวมของสำรสกด

EHB กบ glutamate พบวำ สำรสกด EHB ทควำมเขมขนดงกลำวสำมำรถเพม cell viability อยำงมนยส�ำคญ

ทำงสถต (p<0.05) โดยเพมขน 29.52% หรอ 22.88% ตำมล�ำดบ เมอเทยบกบกลมทไดรบ glutamate อยำงเดยว

(ภำพท 6) แสดงใหเหนวำ PD 98059 30 มลลโมลำร และ LY 294002 40 มลลโมลำร ไมมผลตอ cell viability

และไมมผลตอฤทธปกปองเซลลประสำทของสำรสกด EHB

กำรใหเซลลประสำท N1E-115 ทท�ำใหเปลยนสภำพดวย DMSO มำสมผสกบ PD 98059 หรอ LY 294002

พบวำ PD 98059 30 ไมโครโมลำร และ LY 294002 40 ไมโครโมลำรไมมผลตอ MTT reduction เมอเทยบกบกลม

ควบคม ขณะท MTT reduction ของเซลลเพำะเลยงหลงกำรสมผสกบ glutamate 50 มลลโมลำร เปน 55.05%

เมอเทยบกบกลมควบคม กำรสมผสรวมของสำรสกด EHW 50 ไมโครกรม/มลลลตร กบ glutamate 50 มลลโมลำร



พบวำ สำรสกด EHW ทควำมเขมขน 50 ไมโครกรม/มลลลตร สำมำรถเพม cell viability อยำงมนยส�ำคญทำงสถต

(p<0.05)โดยเพมขน 34.79% เมอเทยบกบกลมทไดรบ glutamate อยำงเดยว เมอให PD 98059 หรอ LY 294002

กอนกำรสมผสรวมหลงจำกนนให PD 98059 หรอ LY 294002 พรอมกบกำรสมผสรวมของสำรสกด EHW กบ

glutamate พบวำสำรสกด EHW ทควำมเขมขนดงกลำวสำมำรถเพม cell viability อยำงมนยส�ำคญทำงสถต

(p<0.05) โดยเพมขน 34.80% หรอ 43.48% ตำมล�ำดบ เมอเทยบกบกลมทไดรบ glutamate อยำงเดยว (ภำพท 7)

แสดงใหเหนวำ PD 98059 30 มลลโมลำร และ LY 294002 40 มลลโมลำร ไมมผลตอ cell viability และไมม

ผลตอฤทธปกปองเซลลประสำทของสำรสกด EHW

วจารณ

กำรศกษำน ผวจยไดทดสอบผลของสำรสกดมะกอกน�ำตอกำรบำดเจบหรอกำรตำยของเซลลประสำท

เพำะเลยง mouse neuroblastoma N1E-115 โดยใชแบบจ�ำลองระดบเซลลของกำรเสอมของเซลลประสำท 2 แบบ

คอกำรบำดเจบหรอกำรตำยของเซลลทเกดจำก hydrogen peroxide และ glutamate ซงกำรเสอมของเซลลประสำท

ทงสองแบบนเปนผลเนองมำจำก oxidative stress

ภำวะ Oxidative stress ท�ำใหเกดกำรท�ำลำยเซลลและมควำมเกยวของกบควำมผดปกตตำง ๆ ทำงระบบ

ประสำท เชน Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease และ stroke เปนตน ซงควำมผดปกตนเกดขนผำน

free radicals หรอ ROS ไดแก hydrogen peroxide, superoxide และ hydroxyl radicals ปรมำณของ ROS

ทมำกเกนไปนอำจจะท�ำใหเกดกำรท�ำลำยดเอนเอ โปรตน และไขมน ซง hydrogen peroxide เปน ROS หลกทใชกน

อยำงกวำงขวำงส�ำหรบเปนตวเหนยวน�ำใหเกด oxidative stress ในหลอดทดลอง

ในกำรศกษำนพบวำ hydrogen peroxide แสดงควำมเปนพษตอเซลลประสำทเพำะเลยง N1E-115 เปน

สดสวนโดยตรงกบควำมเขมขนซงสอดคลองกบรำยงำนทมผวจยมำแลว(26-27) เนองจำกกำรสมผสกบสำรสกด EHB หรอ

EHW 0.5 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร เปนเวลำ 24 ชวโมงไมมผลตอ cell viability ของเซลลประสำทเพำะเลยงปกต

จงเลอกควำมเขมขนทไมเปนพษตอเซลลประสำทเพำะเลยงมำใชในกำรทดลอง และเมอใหสำรสกด EHB หรอ EHW

พรอมกบหรอกอนให hydrogen peroxide ไมสำมำรถลดกำรบำดเจบหรอกำรตำยทเกดจำก hydrogen peroxide ได

แสดงใหเหนวำ สำรสกดมะกอกน�ำไมแสดงฤทธปกปองเซลลประสำทจำก oxidative stress ทเปนผลมำจำกพษของ

hydrogen peroxide

สวนกำรใช glutamate เปนแบบจ�ำลองกำรเสอมของเซลลประสำทและกำรเตม glycine พรอมกบ

กำรเตม glutamate ในทกกำรทดลองนนเพอกระตนให glutamate จบกบตวรบ (NMDA receptor) ไดดขน(28-29)

ซงกำรกระตนตวรบทมำกเกนไปนเปนสำเหตใหเกดกำรตำยของเซลล(14) ในกำรศกษำนพบวำ glutamate มควำมเปน

พษตอเซลลประสำท N1E-115 เปนสดสวนโดยตรงกบควำมเขมขนซงควำมเปนพษตอเซลลประสำทของ glutamate

นสอดคลองกบรำยงำนวจยอน ๆ(30-32) และกำรศกษำน glutamate มคำ IC50 ทควำมเขมขน 50 มลลโมลำร โดยเรม

แสดงควำมเปนพษทควำมเขมขน 25 มลลโมลำร อยำงไรกตำม มกำรศกษำวจยทแสดงใหเหนวำ glutamate เรมแสดง

ควำมเปนพษทควำมเขมขนระหวำง 0.1 และ 10 มลลโมลำร ในเซลลประสำทเพำะเลยง N1E-115(30), hNT (human

Ntera/D1)(33) และเซลลประสำทเพำะเลยง hippocampal dentate gyrus ทแยกจำกสมองของหนขำว(34) และ

ทควำมเขมขนระหวำง 1 - 100 มลลโมลำร ในเซลลประสำทเพำะเลยง cortical ทแยกจำกสมองของหนขำว(35)

ควำมแตกตำงนอำจเปนผลมำจำกควำมหนำแนนทแตกตำงกนของเซลลประสำทเพำะเลยง ระยะเวลำทเซลลประสำท

สมผสกบ glutamate และยงขนกบชนดของเซลลประสำทเพำะเลยงทใชในกำรทดลอง ดวยเหตนจงมผลท�ำใหเซลล

ประสำทมควำมไวตอกำรเกดพษจำก glutamate แตกตำงกน




จำกกำรศกษำนไดประเมน cell viability จำกกำรตรวจวด MTT reduction พบวำ กำรสมผสกบสำรสกด

EHB หรอ EHW ของมะกอกน�ำ เปนเวลำ 24 ชวโมง ไมมผลตอ cell viability ของเซลลประสำทเพำะเลยงปกต

ทเกด differentiation แลว จงเลอกใชควำมเขมขนทพบนในกำรทดลอง โดยเมอเซลลประสำท N1E-115 สมผสกบ

สำรสกด EHB 1 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร หรอ EHW 0.5 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร พรอมกบ glutamate

เปนเวลำ 24 ชวโมง สำมำรถลดกำรบำดเจบหรอกำรตำยทเกดจำก glutamate ได โดยเพม MTT reduction ซงเปน

ดชนชวดของ mitochondrial viability/activity แสดงใหเหนวำ สำรสกด EHB และ EHW ของมะกอกน�ำแสดงฤทธ

ปกปองเซลลประสำทจำกพษของ glutamate ซงยงไมเคยมกำรรำยงำนมำกอน

จำกกำรสมผสรวมระหวำงสำรสกดมะกอกน�ำพรอมกบ glutamate เปนผลใหเกดกำรปกปองกำรตำยของ

เซลลประสำทเพำะเลยงทเกดจำกพษของ glutamate ในขณะทกำรสมผสกบสำรสกดมะกอกน�ำกอน glutamate

ไมมผลตอกำรปกปองกำรตำยของเซลลประสำทเพำะเลยงทเกดจำกพษของ glutamate ได อำจเปนไปไดวำฤทธ

ปกปองเซลลประสำทของสำรสกดมะกอกน�ำเกดจำกกำรออกฤทธโดยตรงในกำรลดควำมเปนพษของ glutamate ขณะ

กำรสมผสรวมท�ำใหลดกำรตำยของเซลลประสำท แตอำจจะไมมผลตอเซลลประสำทเมอสำรสกดมะกอกน�ำเขำสเซลล

แลวกอนกำรเตม glutamate ลงในกำรเพำะเลยงตำมหลง

ในกำรศกษำนผวจยไดพสจนวำ ฤทธปกปองเซลลประสำทของสำรสกด EHB และ EHW ในแบบจ�ำลอง

กำรเสอมของเซลลประสำทจำก glutamate มกลไกกำรออกฤทธผำนกระบวนกำรสงสญญำณในวถ MAPK และวถ PI3K

หรอไม โดยเตมสำรยบยงเฉพำะ คอ MEK inhibitor (PD 98059) และ PI3K inhibitor (LY294002) ซงเปนตวยบยง

กำรสงสญญำณในวถดงกลำว ตำมล�ำดบ ผลพบวำ สำรสกด EHB และ EHW ทควำมเขมขน 50 ไมโครกรม/มลลลตร มฤทธ

ปกปองเซลลประสำทเพำะเลยงจำกพษของ glutamate ซงผลทไดนสนบสนนกบผลกำรทดลองครงกอนในกำรศกษำน

ทพบวำ สำรสกดมะกอกน�ำปกปองกำรบำดเจบและกำรตำยของเซลลประสำททเกดจำก glutamate กลมเซลลประสำท

เพำะเลยงทสมผสกบสำรยบยงเฉพำะ PD 98059 หรอ LY 294002 กอน แลวตำมดวยกำรสมผสรวมระหวำงสำรสกด

EHB และ glutamate พรอมกบเตมสำรยบยงเฉพำะดงกลำวมคำ cell viability ไมแตกตำงจำกกลมเซลลประสำท

เพำะเลยงทใหเฉพำะกำรสมผสรวมระหวำงสำรสกด EHB และ glutamate พบผลเชนเดยวกนกบเซลลประสำท

เพำะเลยงอกกลมทสมผสกบสำรยบยงเฉพำะ PD 98059 หรอ LY 294002 กอน แลวตำมดวยกำรสมผสรวมระหวำง

สำรสกด EHW และ glutamate พรอมกบเตมสำรยบยงเฉพำะดงกลำวมคำ cell viability ไมแตกตำงจำกกลม

เซลลประสำทเพำะเลยงทใหเฉพำะกำรสมผสรวมระหวำงสำรสกด EHW และ glutamate และ cell viability ของ

ทง 2 กลมนมคำสงกวำ cell viability ของกลมเซลลประสำทเพำะเลยงทสมผสกบ glutamate อยำงเดยว แสดงวำ

กำรเตมหรอไมเตมสำรยบยงเฉพำะ MEK inhibitor (PD 98059) หรอ PI3K inhibitor (LY 294002) กอน

แลวตำมดวยกำรสมผสรวมระหวำงสำรสกด EHB หรอ EHW และ glutamate ไมมผลตอฤทธปกปองเซลลประสำท

ของสำรสกด EHB หรอ EHW กำรศกษำนชใหเหนวำ กำรยบยงทวถ MAPK ดวย MEK inhibitor หรอวถ PI3K

ดวย PI3K inhibitor ไมมผลตอกำรแสดงฤทธปกปองเซลลประสำทของสำรสกด EHB และ EHW ดงนน กลไก

กำรออกฤทธปกปองเซลลประสำทในแบบจ�ำลองกำรเสอมของเซลลประสำทจำก glutamate ไมนำจะเกยวของกบ

วถ MAPK และวถ PI3K

จำกรำยงำนกำรเกดพษจำก glutamate พบวำ กำรกระตน glutamate receptor มำกเกนไป และอยำง

ตอเนองโดยเฉพำะท NMDA receptor ท�ำใหควำมเขมขนของแคลเซยมภำยในเซลล (intracellular Ca2+ ([Ca2+]i))

เพมมำกขน มผลท�ำใหเกดกำรเสอมสลำยและกำรตำยของเซลลประสำทจำกพษของ glutamate ผำน excitotoxic

pathway ทเรยกวำ glutamate neurotoxicity หรอ excitotoxicity(36) ซงจะไปกระตนเอนไซมหลำยชนดทมควำม

เกยวของกบกำรตำยของเซลลประสำทโดยท�ำใหเกด protein breakdown มกำรสรำง free radical หรอกำรสะสม

ROS ทเกดจำกไมโตคอนเดรย และเกด lipid peroxidation(37) เปนเหตใหเซลลประสำทสญเสยหนำทและตำยในทสด



นอกจำกน ควำมเปนพษของ glutamate ยงเกดขนผำน oxidative pathway โดยมกำรสรำง malondialdehyde

ระหวำงกำรเกด lipid peroxidation ผลท�ำใหเกด oxidative damage และเซลลประสำทตำย(35) จำกผลกำรทดลอง

สำรสกด EHB และ EHW สำมำรถปกปองกำรตำยของเซลลประสำทเพำะเลยงจำก glutamate แตไมแสดงผลปกปอง

กำรตำยของเซลลประสำทเพำะเลยงจำก hydrogen peroxide อำจเปนไปไดวำ กลไกกำรออกฤทธปกปองเซลลประสำท

ของสำรสกดมะกอกน�ำไมนำจะเกยวของกบคณสมบตตำนออกซเดชนของสำรสกดมะกอกน�ำ แตอำจจะเกยวของกบ

กำรยบยงกำรกระตนท glutamate receptor เปนผลใหลดกำรตำยของเซลลประสำทจำกกำรเกดพษของ glutamate

อยำงไรกตำม กลไกกำรออกฤทธปกปองเซลลประสำทของสำรสกดมะกอกน�ำโดยละเอยดยงไมเปนทเขำใจ ดงนน

ควรศกษำวจยเพมเตมเพอขยำยควำมตอไป

สรป

กำรศกษำฤทธปกปองเซลลประสำทของสำรสกดมะกอกน�ำในเซลลประสำทเพำะเลยง mouse

neuroblastoma N1E-115 โดยใชแบบจ�ำลองกำรเสอมของเซลลประสำททท�ำใหเกดกำรบำดเจบหรอกำรตำยของเซลล

จำก hydrogen peroxide หรอ glutamate พบวำ ทง hydrogen peroxide และ glutamate มควำมเปนพษตอเซลล

ประสำท N1E-115 โดยลด cell viability ของเซลลประสำทเพำะเลยงเปนสดสวนโดยตรงกบควำมเขมขน

ในแบบจ�ำลองกำรเสอมของเซลลประสำทจำก hydrogen peroxide พบวำ สำรสกด EHB หรอ EHW

เมอใหพรอมกบหรอกอนให hydrogen peroxide ไมสำมำรถปกปองกำรบำดเจบหรอกำรตำยของเซลลประสำทเพำะ

เลยงจำกควำมเปนพษของ hydrogen peroxide ได สวนในแบบจ�ำลองกำรเสอมของเซลลประสำทจำก glutamate

พบวำ เมอเซลลประสำท N1E-115 สมผสกบสำรสกด EHB หรอ EHW พรอมกบ glutamate เปนเวลำ 24 ชวโมง

พบวำ สำรสกด EHB (1 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร) และ EHW (0.5 - 50 ไมโครกรม/มลลลตร) สำมำรถปกปอง

กำรบำดเจบหรอกำรตำยของเซลลประสำทเพำะเลยงจำกควำมเปนพษของ glutamate ได และกำรเตมสำรยบยงเฉพำะท

MAPK หรอ PI3K signaling pathway ไมมผลตอกำรแสดงฤทธปกปองเซลลประสำทของสำรสกด EHB และ EHW

จำกพษของ glutamate แสดงวำฤทธดงกลำวไมนำเกยวของกบทงคณสมบตตำนออกซเดชนของสำรสกดมะกอกน�ำ

และกำรสงสญญำณผำนวถ Mitogen-activated protein kinase (MAPK) และวถ Phosphatidylinositol

3-kinase (PI3K)

เอกสารอางอง

1. สนทร สงหบตรำ, บรรณำธกำร. สรรพคณสมนไพร 200 ชนด. กรงเทพฯ: โอ.เอส.พรนตง เฮำส; 2536. 2. Ruangchakpet A, Sajjaanantakul T. Effect of spanish plum (Elaeocarpus hygrophilus Kurz.) maturity

on total phenolics, flavonoids and antioxidant activity. Agricultural Sci J 2007; 5(Suppl.): 127-30. 3. Piao MJ, Kang KA, Zhang R, Ko DO, Wang ZH, Lee KH, et al. Antioxidant properties of 1, 2, 3, 4,

6-penta-O-galloyl-b-D-glucose from Elaeocarpus sylvestris var. Ellipticus. Food Chem 2009; 115: 412-8.

4. Fang X, Phoebe CH Jr, Pezzuto JM, Fong HHS, Farnsworth NR, Yellin B, et al. Plant anticancer agents, XXXIV. Cucurbitacins from Elaeocarpus dolichostylus. J Nat Prod 1984; 47(6): 988-93.

5. Ito A, Chai H-B, Lee D, Kardono LB, Riswan S, Farnsworth NR, et al. Ellagic acid derivatives and cytotoxic cucurbitacins from Elaeocarpus mastersii. Phytochemistry 2002; 61(2): 171-4.

6. Elkhateeb A, Subeki, Takahashi K, Matsuura H, Yamasaki M, Yamato O, et al. Anti-babesial ellagic acid rhamnosides from the bark of Elaeocarpus parvifolius. Phytochemistry 2005; 66(21): 2577-80.




7. Nguyen-Pouplin J, Tran H, Tran H, Phan TA, Dolecek C, Farrar J, et al. Antimalarial and cytotoxic activities of ethnopharmacologically selected medicinal plants from South Vietnam. J Ethnopharmacol 2007; 109(3): 417-27.

8. Sayre LM, Perry G, Smith MA. Oxidative stress and neurotoxicity. Chem Res Toxicol 2008; 21: 172-88. 9. Khandhar SM, Marks WJ. Epidemiology of Parkinson’s disease. Dis Mon 2007; 53(4): 200-5. 10. Sanders S, Morano C. Alzheimer’s disease and related dementias. J Gerontol Soc Work 2008; 50

(Suppl. 1): 191-214. 11. Teepker M, Anthes N, Fischer S, Krieg JC, Vedder H. Effects of oxidative challenge and calcium on

ATP-levels in neuronal cells. Neurotoxicology 2007; 28: 19-26. 12. Conn PJ. Physiological roles and therapeutic potential of metabotropic glutamate receptors. Ann N

Y Acad Sci 2003; 1003: 12-21. 13. Bleich S, Romer K, Wiltfang J, Kornhuber J. Glutamate and the glutamate receptor system: a target

for drug action. Int J Geriatr Psychiatry 2003; 18 (Suppl. 1): S33–40. 14. Choi DW, Rothman SM. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.

Annu Rev Neurosci 1990; 13: 171-82. 15. Ankarcrona M, Dypbukt JM, Orrenius S, Nicotera P. Calcineurin and mitochondrial function in

glutamate-induced neuronal cell death. FEBS Lett 1996; 394(3): 321-4. 16. Dawson VL, Kizushi VM, Huang PL, Snyder SH, Dawson TM. Resistance to neurotoxicity in cortical

cultures from neuronal nitric oxide synthase-deficient mice. J Neurosci 1996; 16(8): 2479-87. 17. Urushitani M, Nakamizo T, Inoue R, Sawada H, Kihara T, Honda K, et al. N-methyl-D-aspartate

receptor-mediated mitochondrial Ca(2+)overload in acute excitotoxic motor neuron death: a mecha-nism distinct from chronic neurotoxicity after Ca(2+) influx. J Neurosci Res 2001; 63(5): 377-87.

18. Junttila MR, Li SP, Westermarck J. Phosphatase-mediated crosstalk between MAPK signaling pathways in the regulation of cell survival. FASEB J 2008; 22(4): 954-65.

19. Gerits N, Kostenko S, Shiryaev A, Johannessen M, Moens U. Relations between the mitogen-activated protein kinase and the cAMP-dependent protein kinase pathways: comradeship and hostility. Cell Signal 2008; 20(9): 1592-607.

20. Pearson G, Robinson F, Gibson TB, Xu BE, Karandikar M, Berman K, et al. Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions. Endocr Rev 2001; 22(2): 153-83.

21. Backer CA, Bakhuizen van den Brink Jr RC. Flora of Java. Vol. 1. Groningen, The Netherlands: N.V.P. Noordhoff; 1968. p. 648.

22. Phengklai C. Elaeocarpaceae. In: Flora of Thailand. Vol. 2 Part 4. Bangkok: The Tistr Press Co. Ltd.; 1981. p. 405-38.

23. Amano T, Richelson E, Nirenberg M. Neurotransmitter synthesis by neuroblastoma clones. Proc Natl Acad Sci USA 1972; 69: 258-63.

24. Kimhi Y, Palfrey C, Spector I, Barak Y, Littauer UZ. Maturation of neuroblastoma cells in the presence of dimethylsulfoxide. Proc Natl Acad Sci USA 1976; 73(2): 462-6.

25. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983; 65(1-2): 55-63.

26. Kong PJ, Kim YM, Lee HJ, Kim SS, Yoo ES, Chun WJ. Neuroprotective effects of methanol extracts of Jeju native plants on hydrogen peroxide-induced cytotoxicity in SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Korean J Physiol Pharmacol 2007; 11: 171-4.



27. Zhang J, Melton LD, Adaim A, Skinner MA. Cytoprotective effects of polyphenolics on H2O2-induced cell death in SH-SY5Y cells in relation to their antioxidant activities. Eur Food Res Technol 2008; 228: 123-31.

28. Johnson JW, Ascher P. Glycine potentiates the NMDA response in cultured mouse brain neurons. Nature 1987; 325: 529-31.

29. Danysz W, Parsons CG. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacol Rev 1998; 50(4): 597-664.

30. Schelman WR, Andres RD, Sipe KJ, Kang E, Weyhenmeyer JA. Glutamate mediates cell death and increases the Bax to Bcl-2 ratio in a differentiated neuronal cell line. Brain Res Mol Brain Res 2004; 128(2): 160-9.

31. Zhang YM, Bhavnani BR. Glutamate-induced apoptosis in primary cortical neurons is inhibited by equine estrogens via down-regulation of caspase-3 and prevention of mitochondrial cytochrome c release. BMC Neurosci 2005; 6:13-35.

32. Kogo J, Takeba Y, Kumai T, Kitaoka Y, Matsumoto N, Ueno S, et al. Involvement of TNF-α in glutamate-induced apoptosis in a differentiated neuronal cell line. Brain Res 2006; 1122: 201-8.

33. Perovic S., Pialoglou P, Schroder HC, Pergande G, Muller WE. Flupirtine increases the levels of glutathione and Bc1-2 in hNT (human Ntera/D1) neurons: mode of action of the drug-mediated anti-apoptotic effect. Eur J Pharmacol 1996; 317: 157-64.

34. Figiel I, Kaczmarek L. Cellular and molecular correlates of glutamate-evoked neuronal programmed cell death in the in vitro cultures of rat hippocampal dentate gyrus. Neurochem Int 1997; 31(2): 229-40.

35. Murphy TH, Miyamoto M, Sastre A, Schnaar RL, Coyle JT. Glutamate toxicity in a neuronal cell line involves inhibition of cystine transport leading to oxidative stress. Neuron 1989; 2(6): 1547-58.

36. Nicholls DG, Ward MW. Mitochondrial membrane potential and neuronal glutamate excitotoxicity: mortality and millivolts. Trends Neurosci 2000; 23(4): 166-74.

37. Mark LP, Prost RW, Ulmer JL, Smith MM, Daniels DL, Strottmann JM, et al. Pictorial review of glutamate excitotoxicity: fundamental concepts for neuroimaging. AJNR Am J Neuroradiol 2001; 22(10): 1813-24.




The Study of Neuroprotective Effects of Makok-nam (Elaeocarpus sp.)

Extracts on Hydrogen Peroxide and glutamate-induced neurotoxicity in

mouse neuroblastoma cells

Sadudee Rattanajarasroj Warunee Jirawattanapong Nuchattra Chansuvanich

Yuwadee Mettametha and Sakwichai Ontong

Medicinal Plant Research Institute Department of Medical Sciences Tiwanond Road, Nonthaburi 11000

Thailand.

ABSTRACT Makok-nam contains polyphenols which are marked antioxidant and may suggest its potential to alleviate oxidative stress-induced neurodegenerative process. The present study was to investigate the neuroprotective activities of ethanol extracts of Makok-nam bark (EHB) and Makok-nam wood (EHW) on hydrogen peroxide and glutamate-induced neurotoxicity in mouse neuroblastoma N1E-115 cell line cultures. It was found that co-exposure of cultured neurons to glutamate with EHB or EHW for 24 hours may be protective against cell injury from glutamate in N1E-115 cultures, while both extracts did not show this beneficial effect in hydrogen peroxide-induced cell death. Moreover, we also proved that the underlying neuroprotective mechanisms of Makok-nam extracts may not involve in the mitogen-activated protein kinase (MAPK) or phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway, and yet, certain neuroprotection mechanisms of these extracts are still unclear and warrant further investigation.

Key words : มะกอกน�า, Elaeocarpus sp., hydrogen peroxide-induced cell death, glutamate-induced cell death, mouse neuroblastoma cells, N1E-115 cells

Date post:	28-Jun-2020
Category:	Documents
Upload:	others
View:	2 times
Download:	0 times

การศึกษาฤทธิ์ปกป้องเซลล์...

Documents