+ All Categories
Home > Documents > for ThaiScience/Article/2/10015085.pdf · ˘8˘ % ˜c % ˜7 ˘˘ 8 ˜ j ˘3 7 j˘ ’ ˙ ˆ ˘ ˆ...

for ThaiScience/Article/2/10015085.pdf · ˘8˘ % ˜c % ˜7 ˘˘ 8 ˜ j ˘3 7 j˘ ’ ˙ ˆ ˘ ˆ...

Date post: 25-Aug-2020
Category:
Upload: others
View: 1 times
Download: 0 times
Share this document with a friend
8
Naresuan University Journal 2006; 14(2): 27-34 27 Efficacy and Toxicity of Amphotericin B-Chitosan Nanoparticles in Mice with Induced Systemic Candidiasis Nanteetip Limpeanchob a, * , Waree Tiyaboonchai b , Supaporn Lamlertthon c , Jarupa Viyoch b and Somkiet Jaipan a a Department of Pharmacy Practice, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Naresuan University, Phitsanulok 65000, Thailand. b Department of Pharmaceutical Technology, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Naresuan University, Phitsanulok 65000, Thailand. c Department of Microbiology and Parasitology, Faculty of Medical Sciences, Naresuan University, Phitsanulok 65000, Thailand. * Corresponding author. E-mail address: [email protected] (N. Limpeanchob) Received 10 February 2006; accepted 2 August 2006 Abstract Amphotericin B (AmB) is one of the most widely used agents for treating systemic fungal infections. Although AmB is available as a colloidal dispersion with sodium deoxycholate (Fungizone Ò ), its use is limited by renal toxicity. The goal of the present study was to evaluate the therapeutic activity and toxicity of a newly developed formulation, AmB chitosan nanoparticles (AmB-Chi nanoparticles), compared to Fungizone Ò . The in vitro antifungal activity was determined by measuring the growth inhibitory effect against Candida albicans and the in vivo antifungal activity was studied in mice with systemic candidiasis induced by C. albicans. The results demonstrate that both formulations showed no difference in their antifungal activity. The toxicity of both formulations was also investigated. In comparison with Fungizone Ò , AmB-Chi nanoparticles showed the same degree of toxicity but a slower progression of the acute toxicity and hence a reduced mortality rate. Amphotericin B chitosan particles showed less renal toxicity compared to the commercially available AmB formulation. The results suggest that AmB nanoparticles using chitosan as a carrier maintain their antifungal activity but are less toxic especially with respect to the renal toxicity compared to AmB-deoxycholate. Empty chitosan nanoparticles were also given to candidiasis compromised mice. They also showed a reduction of the mortality rate of the mice most probably due to binding of candida to the polymer resulting in a reduced activity and toxicity. The results of this study indicate that AmB-Chi nanoparticles have the potential to become a suitable drug delivery system for AmB, but more work is needed for reduction of the particle size of the carrier in order to increase its efficacy and decrease its side effects. Keywords: Amphotericin B, Chitosan, Nanoparticle, Fungal infection, Candida albicans Introduction Candida albicans is one of the fungal pathogens that can cause systemic infection with a high mortality rate in human immunodeficiency virus (HIV)-infected and acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients. However, the epidemiology of systemic candidal infection nowadays shows the trend for serious infections of non-immonosuppressed patients (Eggimann et al., 2003; Richardson, 2005). In general, both amphotericin B (AmB) and the azoles play an important role in the treatment of candidiasis (Rex et al., 2000; Perfect, 2004). A conventional AmB formulation is available as a micellar solution with sodium deoxycholate as surfactant (Fungizone Ò ). However, it is known that it has severe side effects and shows strong nephrotoxicity (Slain, 1999). Thus, there are several efforts to develop new AmB formulations with reduced nephrotoxicity. Three lipid-based liposome formulations of AmB (AmBisome Ò , Amphocil Ò , and Abelcet Ò ) have been successfully tested and are now on the market (Gulati et al., 1998). Unfortunately, these products are costly and require higher doses than Fungizone Ò . Later, a lipid nano-sphere (LNS) AmB formulation was developed which can be used for a low-dose therapy with reduced side effects (Fukui, Koike, Saheki, Sonoke, & Seki, 2003; Fukui, Koike, Saheki, Sonoke, Tomii et al., 2003). Nanoparticles seem to be a good drug delivery system for AmB for intraveneous application with a controlled release of the active ingredient. Therefore, we were interested in the preparation of AmB-loaded nanoparticles using chitosan as a biocompatible carrier. Water-soluble chitosan is the deacetylated form of chitin. It is extracted primarily from shells of crustaceans such as shrimps and
Transcript
Page 1: for ThaiScience/Article/2/10015085.pdf · ˘8˘ % ˜c % ˜7 ˘˘ 8 ˜ j ˘3 7 j˘ ’ ˙ ˆ ˘ ˆ ˘ ( ˘ ˆ ˇ ˆ ˙ ˆh ˜.’’’#$ %, ˆ ˆ ˘ ˘ ˘ ( *+ˇ-

� ���������������� � �������� ������ ������� ���� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �<

" ����������%�&��� ��� ������ ������$'��� �����(����� �����

���������� ��)��������� ����������������

���������8��������%�����C������� �%������

��7�������8���������

��

J������3� ��� ����7�������J����

��'����������������������������(���������������������������������������������������������+�������� �������

�'������������������������ ���������(���������������������������������������������������������+�������

�� ���������'����������2����/������������������������(����������2���������������������������������������+�������

�� ���������������������������� !�����������"�������#���������$���3�������/&

%�����1��(/������.���0��������.�)������.���

��������

�!"�����#��A���!A���������$�����!����� �� ���� ��������$������������ ���!#�$�������$�#����&

����������!A��������%��������#���� ��� �"������������ �!� ��B #��������1���4�����,�����������!��

% ���������B#� &�'���������$�����"���������� ��������������������������"���#��#��� ��� ���B#� ��$�������

�����"� � $��!������,��!A�#������� ����"���#���� ��!A�0�� ����"���#����,� #�!"��� � ���1���4����&'��� ��� ����� ���$������ �#��� ����� ����!�� �% �!�������� ����������� ��%��� � �$$�#�� �������������

� ������� �� � ���� ��� ����� ���$������ �#��� ����� ��� � � ��!#������ � ���!#� #�� ���� � �#�

% ����� ������&�'����������� �!��������������%����$��!������������� ���� $$����#������������$�������#��� &

'�����B#� ��$�%����$��!�������������������������� &��.��#�!"����������1���4�����,��!A�0������"���#���

����� �������!�� �������$���B#� �%������������"�����������$������#������B#� ��� ����#������ �#� �!������

����&� ��!"�����#��A�#�������"���#��������� � ����� ������ ��B#� �#�!"��� � ��� ����#�!!��#��� ������%��

�!A� $��!������&�'��� �������� �������� ������!A�����"���#���� ����� #������� ��� �� #������!������ ����

���$�������#��� �%��������������B#���"�#��� ��������"�#�����������������B#� �#�!"��� �����!A� ��B #������&

C!"� �#�����������"���#����������������������#�� ����#�!"��!�� �!#�&��'�� ����������� ����� �#���

�$�����!������ �������$�����!#��!����"��%�%� � ������%� ����$�#�� ���������"�� !������������������ �#�

�#��� ��� ���B#� &��'������������$�������� �� #����������!A�0������"���#�������������"�����������%�#�!�

������%��� ���� ����� �� ���!�$����!A,�%���!�������(������ � �$����� �#�����$�����"���#����4���$�����#�����

���� �������#����������$$#�# ��� � �#���������� ���$$�#��&

���� ����!"�����#��A,�0������,�����"���#��,�1�������$�#���,��������� ������

�����������

0���������������������������������������������������������� �������������������

��������������� �������������������������� ���������63#��������������)�����������

�������� �� �������*6<7#��������$�������������������������� ����� ����������������������

����� ���������������������������������������������������������������������4�����

�����$��.''59�����������.''&#$��6���������%�����������������+��*�+#���������2�������� ��

���������������������������������������������(������$��.'''9����������.''/#$�*�����������*�+

��������������������%����������������������������������������( ����������������������0���2���#$

�������������������������������������������������������������������������(���� ��7����� !!!#$

����������������������������������������������*�+���������������������������������(���� $�������

������%�����������������������������*�+��*�+��������*�������������*%������#������%��

����������� ��������������������������������G�����������$�� !!?#$�;��������� ����������������

��������� ������)����������������������0���2���$�8�������������������������8�7#�*�+

����������������������������������%���������������������������� ��������������������������

�0������H������7�������7��������7�����.''59�0������H������7�������7�����������������$��.''5#$

���������������������%��������������������� �� ���������*�+���������������������������������

����������������������������������������$��������������������������������������������������

*�+��������������������������������������%���������%����������$�C���������%�����������������

������ �������������������$�6������(���������������� ���������������������������������������������

Page 2: for ThaiScience/Article/2/10015085.pdf · ˘8˘ % ˜c % ˜7 ˘˘ 8 ˜ j ˘3 7 j˘ ’ ˙ ˆ ˘ ˆ ˘ ( ˘ ˆ ˇ ˆ ˙ ˆh ˜.’’’#$ %, ˆ ˆ ˘ ˘ ˘ ( *+ˇ-

��� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � ���������������� � ���������������������������� ������ � �������� ������ ������ � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � ��

���%�������������� ����������������������� �� ����������H������.'''#$�������%,��������������

���� ������������������������������������������ ������������������������������������������

� ����������������������������������������������(���� ����*�+�-��������������������������

�����������������*�+�������������0���2����#$

����� ������������

1��������

*�����������+����� ���������� �����7������;7*$�-������� �����������������

5'�'''��!&B������� �����#��������������������*)�����������+��������������$�0���2���

���� ����������������4��(���#�������%�����������+�������1 ����7)��%%�-���� ����+�(���

=����� �G�%�������������� $�1�����6-#���������������% ���������*�����8�%������ �-�����

+��������������$

������������������*�����������+������������

����*�+�-�����������������������������% ������� ���������� �����)������ ����

�����������$�����������������������������������% ��������������������������%�������������������

��������������������������� �����������(�����������$��+����� ������ ������������������*�+

�������� ������(�����<17=#���������� '���:��#���������������'$'"&���������(�����������

�)��������������� B��:�#����(��������'$"&&���������2��������$�������������������������

��������� ������������A''����$������'$ ��������)�����������������������'$.&�B��:�#����������

��������� ��� ���� �������������������������� �������� ���� &�������$�0��� ������������� ��

������ �������������������&B��:�#���������������$������������������%���2���*�+������������

��������� 2��$���������������� ������ ��� �������������� ������������������� ��� �� ����

��������������&B�:�$������������������������������2������ ������2������'$/��%��

��� �5'�-�����./������$����� � ������2�������������������� ������� ������������������/

�-$

������������ ������2���*�+��������������������������������������������2�����&'A�@�!�������

��� ��������� ����(����'$'.&$

)����������������������

���� �� ����� ������� � ���0���2���� ���*�+�-��� ����������� ��������������

����������% ������������������������%��������01���������*�--� '.5'$�G���������%�������

01������������ ( '�����:����������������% ����������������������������� ����A''�����7�%�����

��(������%���������������������������������������%��������5&�-�����/?��$

)��������������������� �������

7 ������������������������������������������������ �������%������������������������

�0������H��������������������$��.''5#$�+����� ��������5'�/'��#�������������������� ��,����������

����������������������� ���������������������������� &'���:��$�7 ���������������������

���� �������% � ���������� �������������01��������� �&( '�� �����:�����#$�0���2����

*�+�-����������������������������������������������������� ��,������������������

$'���:���/���������������������������������������������$�*�������������������������������

���������% ����������������������������������������������������/�������������� ����������������

����������������./��������������������������$�����������������%����������� /��� ����������

� ����������������������� ���������������% ������������������������������������������$��<������

����������������'����&����������������% ���������%��������9�'�O�������� �O�������� �����������

������%���)����� �����������������������#��.�O���������� ����������� ����������������

����������������������#��5�O���� ��������������%�������������������������������#��/�O��(������

����������������������������������������#����&�O������$��*������(����������������������

% �����4�������-��������������������;������� $

Page 3: for ThaiScience/Article/2/10015085.pdf · ˘8˘ % ˜c % ˜7 ˘˘ 8 ˜ j ˘3 7 j˘ ’ ˙ ˆ ˘ ˆ ˘ ( ˘ ˆ ˇ ˆ ˙ ˆh ˜.’’’#$ %, ˆ ˆ ˘ ˘ ˘ ( *+ˇ-

��������� ������ � �������� ������ ������ � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �9

*�������������(����

7�����������,���������������������������0���2�������*�+�-��������������� ��/����

?���:��#������������������������&�?������6-���������������5'�/'������������������$�4���

������������������������)���������������������������*�+�-������������������������

�,�����������������������������������$�<������������������������� ����� /��� �$�6���������

�������������������������������������������������� ���������%������������������+;�#���

����������������-�#����������������������%��������������%�������������������������� � /$

����� ��������D���(���� ������������%���������

<�������������%�����������+-#������������������������ �������%����0������H������7������

7�����������������$��.''5#$�������+-�����������������������������������������%�������

��������+7#�����������������+7��������������������&'B$�0���2�������*�+�-��������������

�������������� �A'���:�����������������+-������������������������� B���������������$����

��(������������������%���������5"��-�����.'���$�-����� ����������������% ����������������������

��������%����������� �����������������������% �����������������5'''���������&�����������

�������%����������������������������������������������������� ����&/ ��$ ''B�� �������

���������������������������$

7�������������� ���

������������������������������������������������������������������������������������

�� ���� ����������������*�=3*#$��7�������������������������������I�'$'&$

���� ��

)����������������������

��������������������������� ��������01������������*�+�-����������������������������

��������0���2���$���������������%���� ��������������16-#����0���2�������*�+�-��

����������������������(������ �'$ &A���:������'$ &'���:��������������� $��-�������������

������������������������������������� $

�������������������� ����������������������

7 ��������������������������������� �������������������������������������������

�-Q�����������������#$���������������������������������������������������������%�����������

������������������������������������������������������������������� �������������������������$

- ����������������������������������������������� ����%��� #$�*��������������������

01������������&( '�������:���������������������������� ''B��������� ���-Q�����������������

�7�������������$��.'' #��������������� ��������&'B��������� ��������(��������������������

�������%������������%��� #$�7��������� ������ ����������������������������������������������

���������������������������������������������������$���������������������� ������������������

��������������0���2�������*�+�-������������������������������������� ���������������

����������������������������������������������������-����������������������������������������

�����������������%���������������$�������������������*�+�-������������������������������������

0���2���$�+���������� �����������������0������ *#����������������������������0������ +#�

�������������������������������������������� $

Page 4: for ThaiScience/Article/2/10015085.pdf · ˘8˘ % ˜c % ˜7 ˘˘ 8 ˜ j ˘3 7 j˘ ’ ˙ ˆ ˘ ˆ ˘ ( ˘ ˆ ˇ ˆ ˙ ˆh ˜.’’’#$ %, ˆ ˆ ˘ ˘ ˘ ( *+ˇ-

3�� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � ���������������� � ���������������������������� ������ � �������� ������ ������ � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 3�

Table 1 Curing and mortality of fungal infected mice

Note.Each mice received treatment 4 h after fungal infection.

Figure 1 Antifungal activity in systemic candidiasis mice. Degree of sickness of each mouse was monitored after intravenous administration of single dose 4 h after fungal infection (A) or multiple doses (indicated by arrows) for 4 consecutive days (B) of Fungizone®, AmB-Chi nanoparticles or Chi nanoparticles. Degree of sickness scale 0 to 5 is normal to death and numbers in the between are different levels of sickness. Each point represents the mean+SEM of eight mice.

Numbers of sick/death�

Treatments�Day 7� Day 14� Day 21�

Cyclophosphamide 0 / 0 0 / 0 0 / 0

C. albicans 8 / 0 7 / 1 4 / 4

C. albicans+Fungizone® 0 / 0 0 / 0 0 / 0

C. albicans+AmB-Chi nanoparticles 1 / 0 0 / 0 0 / 0

C. albicans+Chi nanoparticles 8 / 0 8 / 0 7 / 1

C

C

C

C

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

1

2

3

4

5

Day after fungal infection

Deg

ree

of S

ickn

ess

A

C

C

C

C

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

1

2

3

4

5

Day after fungal infection

Deg

ree

of S

ickn

ess

C

C

C

C

C

C

C

C

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

1

2

3

4

5

Day after fungal infection

Deg

ree

of S

ickn

ess

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

1

2

3

4

5

Day after fungal infection

Deg

ree

of S

ickn

ess

A

C. albicans

C. albicans+Chi nanoparticle

C. albicans+ Fungizone®

C. albicans+AmB-Chi nanoparticle

Days after fungal infection

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

1

2

3

4

5

Deg

ree

of S

ickn

ess

B

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

1

2

3

4

5

Deg

ree

of S

ickn

ess

B

Days after fungal infection

C. albicans

C. albicans+ Fungizone

C. albicans+AmB-Chi nanoparticle

Page 5: for ThaiScience/Article/2/10015085.pdf · ˘8˘ % ˜c % ˜7 ˘˘ 8 ˜ j ˘3 7 j˘ ’ ˙ ˆ ˘ ˆ ˘ ( ˘ ˆ ˇ ˆ ˙ ˆh ˜.’’’#$ %, ˆ ˆ ˘ ˘ ˘ ( *+ˇ-

��������� ������ � �������� ������ ������ � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 3�

)��������(���� D�����������+-����%����

+����0���2���� ���*�+�-������������������� ����� ����)���� � ����������

�� ����� ���� ���������������������������0������.#$��&'B������ ���������������% �0���2���

����*�+�-���������������������������&$AA���:������"$!5���:��������������� $�-������

������������������������������������*�+�������������������������������������������+-

���%������������������#$

��������'�B#� ����DA0��$��!A�$��!�������&�?�!�� ����������$�1���4������� ��!A�0������"���#���

������ #�� �#�� � ��� �������7!�� #��#�����������$��!A&�;��� #��#�����������$��!A������"�����

���������M���!�� ��&�C�#��"������"������������!���G:C*��$��������B"��!����&

)�������(���� D���������(����

6����������������������� �����������*�+�-���������������������������� �����������

��������(���� ��������������������������������0���2���$�1�����,�����������*�+�-�������������

������������ ��/����?���:����(��%����������������������(���� ����������,�������������������������

���0���2������0������5#$������������������������������������ ���:��#����������������(���� 9

����������������������������/���:�����������%����A&�"'B���������$��������������������������

����������������������?���:���������.�������������$�������������� �������������������������

������������������ �-����������������������������/���:��$�����������������������������

��������������?���:���������� ��������������������$

*��������������������������������������� ���B�������������0���2�������*�+�-��

�������������0������5#�������������� ����������% �0���2��������������� �������������������

*�+�-������������������������� ���������������0������/#$

������(���� ����*�+������������

7��������������������������� � /������������������(���� �������������������������� 2��

����%������������������+;�#����-������������%���.#$��1�����,�������������������������0���2���

�������������� ������������������������������������$�*������������+;�������������������

�������������������������� �������������������������������������������������������������������

�������������������/���:��$����������������������������������������(���� ������0���2���

������������$�=����������� ��������+;�����-�� ������������������������*�+�-�����

-��������������������������������������������������������(���������������������������������$

7�����+;��������������%������������ ������������������������������ ��������������������

������������������(������ �"$.���:��$�6���������%����������������0���2�������*�+�-��

������������(�����������������������������������������������������������������������������

������������ ���������$

100.5

0

20

40

60

80

100

A

F

Log (Amphotericin B), mM

% H

emol

ysis

101.0 102.0101.5100.0 100.5

0

20

40

60

80

100

A

F

Log (Amphotericin B), mM

% H

emol

ysis

101.0 102.0101.5100.0

AmB-Chi nanoparticle

Fungizone®

Page 6: for ThaiScience/Article/2/10015085.pdf · ˘8˘ % ˜c % ˜7 ˘˘ 8 ˜ j ˘3 7 j˘ ’ ˙ ˆ ˘ ˆ ˘ ( ˘ ˆ ˇ ˆ ˙ ˆh ˜.’’’#$ %, ˆ ˆ ˘ ˘ ˘ ( *+ˇ-

3�� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � ���������������� � ���������������������������� ������ � �������� ������ ������ � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 3�

Page 7: for ThaiScience/Article/2/10015085.pdf · ˘8˘ % ˜c % ˜7 ˘˘ 8 ˜ j ˘3 7 j˘ ’ ˙ ˆ ˘ ˆ ˘ ( ˘ ˆ ˇ ˆ ˙ ˆh ˜.’’’#$ %, ˆ ˆ ˘ ˘ ˘ ( *+ˇ-

��������� ������ � �������� ������ ������ � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 33

��������

������������������������� ������������������������������������� ������(���� ����*�+�-��

����������������������������������������*�+�������������0���2���$������������������

����� ����� ����� ����������� ���%���� � ������������ �16-#��������01��������� ��� %���

�������������������������$������������������������ ������*�+������������������������������������

�������������������� ������������������������%�����������������������$

�������������������������������������� ������������������������������ ������

�����������% �-Q������������$��7��������%�����������(������������������� ����������� �&'B

���������������������������������������������������������������������������� ����������%���

%�������������� ��������������������$���������(�����������������������������������������������

*�+�-����������������������������*�+�������������0���2���#������������������������

������������� �����������������$�4�����������������������������������������������������������

������� �������������$�7��������� ��������������������������������� ���������������������������

������������������������� ������������� ��������,������/������������������������$�-����������

��������� ���������������������������������������������������������������������������

������C��������$��.''5#$�6��������������������%������������������� ����������%������������� �%��

��������������01�������������������������������������%���� ����������������������������������%����

����������$

=����� ���� ��������� ��� �����������*�+�-��� ���������������� ��� �������*�+

��(���� $�C�������������������������������(���� �������������0���2���$�=�������������������

0���2�������*�+�-����������������������������������(���� $��������(���� ����*�+�����%��

�������������%����������������������������������*�+��������,���������������+�����2������$�� !!.#$

C������������*�+���*�+�-����������������������������0���2��������������������

���������� ����������������������������������%�����������#$�C��������%���������������

�������� �������������% ����( ��������*�+�����������������������������% �*�+��������

�����������$��0�������������������������������*�+�������%����������������������� ��������

���������������������������������������������� ���������)������������������������������������

���( ��������������������0���2�������������������������� ����� �����(���� $�������� ���������������

%���������������������������%���������$������������������������%�������(�����������������������

���������������*�+�-���������������������+;�����-�����������������������������������$

0���2�������������� ���������������(���� ���������������������������������%������$

6���������� ��������������%����*�+�������������������������������������������� ����� ��

� �����������������&'B������ �������*�+�-�������������������������� �������������������

0���2���$�-�������������(������� ������������������������������������(���� �����������

���������+;�������������������%��������� ��������������$��6��������������� �����������������

����������������������������������������������������������������������������������$�� !!!#$

�����������������������������%����������������������������������������������������������$

C��%������������������������������%��������������� ���������������������%���� �����������������������

����������������������%��������������������������������������������% �������������������

�����������2�$�C���������������������������������������������������������������������,�����

������%����������������������%���������������%����������������% ����������������$��������������������

�����������������������������������%��������������������%����������������%���������������$

���� �����

*�+�-�����������������������%�������������������� �� ������������������������

� �����������������$�*��������������������(���� �������������������� �������������������������

*�+������������������������������������������������������(���� $��C����������������������������

�����������% �����������������������������2���������������%������������������� ����������

��(���� �����������������������������������$

Page 8: for ThaiScience/Article/2/10015085.pdf · ˘8˘ % ˜c % ˜7 ˘˘ 8 ˜ j ˘3 7 j˘ ’ ˙ ˆ ˘ ˆ ˘ ( ˘ ˆ ˇ ˆ ˙ ˆh ˜.’’’#$ %, ˆ ˆ ˘ ˘ ˘ ( *+ˇ-

3�� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � ���������������� � �������������������

������ ���������

�����������������������������������$�����4$�J���������������������������������������

����������������������$���������� ���������������% �������������������������-��������

G������4�����������+���������� ��+������#���������$

����������

+�����2��J$��-���������7$����G������6$�� !!.#$�4����������������������������������������������+��

������(���� ��������$�.�����������.��������0�������������4��.5 '�.5 &$

4��������$��G��%����J$������������<$��.''5#$�4���������� �����������������������������

��������� ������������������������������$����+�����)������ ��������������A?&�"'.$

0�������$��H�������$�������������$��7�������*$��7������7$���������Q$�������$��.''5#$�-��������

���8�7�*�+D�*�����������������������������������������+���������������������

�8�7#�� ����� ����������� ������%����� �����������$� )����������� ! ���� �

�������� ������#4(�� ' � .$

0�������$��H�������$��7�������*$��7������7$����7�����J$��.''5#$�*������������� �� ��������

������������+�����������������������8�7#$�)�����������! ������������� �����

#4,��5"�/&$

0�������$��H�������$��7�������*$��7������7$���������Q$����7�����J$��.''5#$�4���������������

������� � ��� ��(���� ���� ������������+� ������������ �� ���������������� �8�7#$

)�����������! ������������� ������#4���& �A'$

G�������1$��+�,����7$��7�����7$��0��������*$�J$����7�����1$�� !!?#$�<����������������������

������������+�����������$�! �����"��������� �������&,�� 5"� & $

��������� J$�$� �.''/#$�*�������� ���������D������������� ����$6����� ;%����������7<�

&��� &�..$

����H������1$��$�3$� �.'''#$�*� ��������������������������������������$'����������

= ����������������84�� �."$

�(��J$��$��C�������$�J$��7�%����J$�<$��0�������7$�G$�����������$�G$��<���������C$�4$�������$��.'''#$

�������������������������������������������������$�6���������<��������7����� ����*������$

0�������)������ ������������3��AA.�A"?$

����������1$�<$��.''&#$�-�������������������������� ���������������������$����! ����

�.�����������0������������,4�7����$� #���&�� $

����������7$�-$��H��%����$�3$����<�����$�� !!!#$������������������������������������������

��<�*�������� �� ����D�+���������%���� ��%�� �������%���������%���� ����������(���

��������<�*$�)�����������! ������������� ������&(���.5 �./5$

7���������Q$����7������4$��.'' #$��������������(�������������������������������������

+���������������(�����������������������������$����! �����.�����������

0������������8���./&�.& $

7�����<$� � !!!#$� 8�����%����� ������������+� ���� ���� ��������� ��� ������ ��������$

����������������&*��5'A�5.5$

C����J$��$��C����-$�C$��8�����$�-$����Q������$��$��.''5#$�+�����������1G�A5��������� ��:

��������%���������%����$� ! ���� �9��������"��������'�����������.�

,8��A'A�A &$


Recommended