MARCIN SAMIEC MARIA SKRZYSZOWSKA - izoo.krakow.pl · zmiany biochemiczne i molekularne, wskazują,...

ROCZNIKI NAUKOWE ZOOTECHNIKI

Monografie i Rozprawy

MARCIN SAMIEC

MARIA SKRZYSZOWSKA

Zastosowanie metod przyżyciowej analizy

fluorycytochemicznej do wykrywania

symptomów śmierci apoptotycznej

w komórkach-dawcach jąder oraz

w zarodkach świni uzyskiwanych technikami

klonowania somatycznego

The use of the methods of intra vitam

fluorocytochemical analysis for detection of apoptotic

cell death in porcine nuclear donor cells and embryos

generated by somatic cell cloning techniques

INSTYTUT ZOOTECHNIKI PAŃSTWOWY INSTYTUT BADAWCZY

KRAKÓW 2015

M. Samiec i M. Skrzyszowska

2

Recenzenci monografii:

dr hab. Daniel Lipiński, prof. nadzw. UP; Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu,

Wydział Rolnictwa i Bioinżynierii, Katedra Biochemii i Biotechnologii,

Zakład Diagnostyki Molekularnej

dr hab. Wiesława Młodawska; Uniwersytet Rolniczy w Krakowie,

Wydział Hodowli i Biologii Zwierząt, Instytut Nauk Weterynaryjnych,

Zakład Weterynarii, Rozrodu i Dobrostanu Zwierząt

Prezentowana praca uzyskała wsparcie finansowe z Narodowego Centrum Badań

i Rozwoju (umowa nr INNOMED/I/17/NCBR/2014) ze środków Programu

Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka w ramach Europejskiego Funduszu

Rozwoju Regionalnego.

Opracowanie redakcyjne

mgr Magdalena Bielska

mgr Bogusława Krawiec

Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni

3

ROCZNIKI NAUKOWE

ZOOTECHNIKI

Monografie i Rozprawy

INSTYTUT ZOOTECHNIKI

PAŃSTWOWY INSTYTUT BADAWCZY

2015 KRAKÓW Nr 53


4

REDAKCJA

Redaktor naczelny – dr hab. Dorota Kowalska, prof. IZ PIB

Sekretarz redakcji – mgr Magdalena Bielska

Projekt okładki – Beata Barszczewska-Wojda

Adres redakcji ― Instytut Zootechniki Państwowy Instytut Badawczy,

ul. Sarego 2, 31-047 Kraków

© Copyright by Instytut Zootechniki PIB

Druk: Instytut Zootechniki Państwowy Instytut Badawczy, Zespół Wydawnictw

i Poligrafii, 32-083 Balice k. Krakowa. Nakład 100 egz.

PL ISNN 0137-1655

ISBN 978-83-7607-226-5


5

1. WSTĘP

1.1. Dwa „oblicza” śmierci komórek: aktywna śmierć fizjologiczna

(apoptoza) i pasywna śmierć patologiczna (nekroza)

1.1.1. Scenariusz śmierci apoptotycznej i nekrotycznej a różnice

w komórkowym obrazie morfologicznym i ultrastrukturalnym, podłożu bio-

chemicznym i biofizycznym oraz mechanizmach molekularnych i genetycznych

Uruchomienie molekularnego scenariusza apoptozy w komórkach ho-

dowanych in vitro zarodków klonalnych ssaków jest kluczowym elementem

mechanizmu regulującego przedimplantacyjną fazę embriogenezy oraz śmiertel-

ność zarodków w stadium blastocysty.

W komórkach, które wkroczyły na drogę apoptozy, dochodzi do akty-

wacji szeregu procesów indukujących charakterystyczne zmiany ultrastruktural-

ne, morfologiczne i biofizyczne wykrywane metodami z zakresu mikroskopii

fluorescencyjnej, cytobiochemii bądź cytometrii przepływowej. Jedną z pierw-

szych tego typu zmian jest osmotyczne kurczenie się komórek na skutek postę-

pującego odwodnienia (dehydratacji) cytozolu. Proces ten prowadzi do konden-

sacji cytoplazmy, a także zmiany wielkości i kształtu komórek wskutek zmniej-

szenia ich objętości oraz stopniowego uwypuklania się/pofałdowania po-

wierzchni plazmolemmy. Podczas apoptozy większość organelli (z wyjątkiem

jądra komórkowego) i błona plazmatyczna komórek zachowują strukturalną

integralność przez dłuższy okres. W obrębie jądra komórkowego zachodzi

kondensacja i brzeżne ułożenie chromatyny, tj. jej marginalizacja pod otoczką

jądrową. Transformacje te poprzedzają postępującą fragmentację jądra.

W późniejszym etapie śmierci apoptotycznej, w wyniku dalszego zagęszczenia

chromatyny i nukleoplazmy oraz całkowitej biodegradacji jądra komórkowego

i cytoplazmy, tworzą się tzw. ciałka apoptotyczne, czyli obłonione fragmenty

komórek zawierające morfologicznie niezmienione organelle komórkowe,

szczątkowe struktury jądra i resztkowe składniki cytoplazmy. W warunkach in

vivo, ciałka apoptotyczne są najczęściej wchłaniane przez sąsiadujące komórki

bądź są eliminowane przez makrofagi. Z kolei, w warunkach pozaustrojowych,

w przypadku zaawansowanych zmian późnoapoptotycznych w znacznej części

populacji komórkowej i braku komórek fagocytujących w mikrośrodowisku

hodowlanym, zmiany degradacyjne związane z utratą integralności błony ko-

mórkowej mogą być przejawem zachodzenia „wtórnej nekrozy”. Oprócz wi-


6

docznych zmian morfologicznych, w komórkach apoptotycznych zachodzi

szereg zmian biochemicznych: fragmentacja DNA z udziałem endonukleaz do

odcinków oligonukleosomalnych, wzrasta wewnątrzkomórkowe stężenie jonów

wapnia, następują procesy degradacji specyficznych białek jądrowych, obniżenie

wewnątrzkomórkowego pH i spadek potencjału błon mitochondrialnych, a także

pojawiają się zmiany biofizyczne, spowodowane translokacją cząsteczek fosfa-

tydyloseryny w błonie plazmatycznej (Denecker i in., 2001; McCarthy i Evan,

1998; Gross i in., 1999; Kroemer 1997).

W przeciwieństwie do apoptozy, w procesie nekrozy (martwicy) docho-

dzi do zwiększania się rozmiarów komórek, obrzęku organelli komórkowych,

głównie mitochondriów i siateczki śródplazmatycznej. Obserwuje się późną

degradację DNA i pyknotyczne jądra. Organelle komórkowe ulegają degenera-

cji, tworzą się wakuole, polisomy odłączają się od siateczki śródplazmatycznej.

W dalszym etapie procesu martwicy obserwuje się destrukcję chromatyny, zanik

jąder komórkowych, a ostatecznie całkowitą strukturalną dezintegrację komórek

(Denecker i in., 2001; Kitanaka i Kuchino, 1999).

Kryteria śmierci apoptotycznej i nekrotycznej (martwiczej), obejmujące

zmiany biochemiczne i molekularne, wskazują, iż oba rodzaje śmierci pozostają

we wzajemnej zależności. Jednym z czynników odgrywających istotną rolę

w procesie śmierci jest wewnątrzkomórkowy poziom ATP. W wyniku uszko-

dzenia DNA, aktywowana jest polimeraza poli(ADP-rybozy) [PARP], a poli-

ADP-rybozylacja białek jądrowych prowadzi do zmniejszenia wewnątrzkomór-

kowej puli NAD/NADH i obniżenia poziomu ATP w komórce (Kim i in., 1999;

Scovassi i Poirier, 1999). W utrzymaniu właściwego poziomu energetycznego

komórek ważną rolę odgrywają mitochondria. W czasie śmierci komórkowej

błonowy potencjał mitochondrialny, odpowiedzialny za syntezę ATP, ulega

obniżeniu. Pozbawienie komórek energii może być bezpośrednią przyczyną ich

śmierci, zatem poziom wewnątrzkomórkowych zasobów energetycznych decy-

duje o zachodzeniu apoptozy lub nekrozy. Podjęcie decyzji o destrukcji

i eliminacji komórek wymaga aktywacji wielu komórkowych procesów, m.in.

związanych z ekspresją genów, syntezą pro- i antyapoptotycznych białek, czy

aktywacją wielu procesów enzymatycznych. Apoptoza i nekroza mogą być

inicjowane przez te same receptory komórkowe. Apoptoza, w zależności od

rodzaju czynnika indukującego, może przebiegać z udziałem różnych ewolucyj-

nie konserwatywnych mechanizmów molekularnych, odpowiedzialnych za

przenoszenie sygnału zapoczątkowującego ten proces. Większość procesów

proteolitycznych podczas apoptozy przebiega w obecności rodziny cysteinoza-

leżnych proteaz katalizujących hydrolizę białek za resztą kwasu asparaginowego

zwanych kaspazami (ang. caspases; cysteine-dependent aspartate specific pro-

teases). Poza kaspazami, w kolejnych etapach procesu apoptozy uczestniczą

białka Bcl-2, które są produktami ekspresji protoonkogenów bcl-2, wykrytych

w białaczkach i chłoniakach wywodzących się z limfocytów B (ang. B-cell

leukemia/lymphoma) oraz białka p53, które są produktami ekspresji genów

z grupy supresorów transformacji nowotworowej (Fadeel i in., 1999a; Gross


7

i in., 1999; Kroemer, 1997). Na decyzję o rodzaju zachodzącej śmierci komór-

kowej – apoptozie lub nekrozie – może wpływać poziom ekspresji białek Bcl-2,

aktywacja kaspaz czy proteaz serynowych.

1.2. Charakterystyka trzech etapów w scenariuszu śmierci apopto-

tycznej komórek

1.2.1. Etap pierwszy – faza inicjacji apoptozy

W przebiegu procesu genetycznie zaprogramowanej śmierci apopto-

tycznej komórek dochodzi do kaskady zdarzeń, które obejmują trzy fazy: 1.

inicjacji, czyli wzbudzenia, 2. wykonawczą (efektorową) oraz 3. destrukcyjną,

czyli zniszczenia (Kroemer, 1997). Najlepiej poznanym mechanizmem wzbu-

dzenia apoptozy pozostaje indukcja spowodowana wiązaniem ligandów przez

odpowiednie receptory śmierci. Uważa się, że aktywację kaspaz inicjujących

poprzedzają zmiany morfologiczne w obrębie komórek somatycznych (Blan-

kenberg i in., 2000). Dotyczą one m.in. formowania charakterystycznych pęche-

rzykopodobnych uwypukleń błony komórkowej (ang. blebbing). Niektórzy

badacze uważają, że zjawisko pęcherzykowatości błon występuje w niektórych

typach komórek równolegle z kondensacją chromatyny (Katsen i in., 1998).

W czasie aktywacji kaspaz, komórki realizujące program śmierci sygnalizują

o tym sąsiadującym komórkom przez eksponowanie fosfatydyloseryny (PS) na

swojej powierzchni (Verhoven i in., 1995). Ten glicerofosfolipid wraz z innymi

lipidami − fosfatydyloetanoloaminą, fosfatydylocholiną i sfingomieliną są

naturalnymi składnikami błony komórkowej. Skład lipidowy obu monowarstw

błony cytoplazmatycznej żywych komórek jest bardzo różny. Zjawisko to nosi

nazwę asymetrii składu lipidowego błony lub anizotropii w rozmieszczeniu

fosfoglicerydów w obrębie obu monomolekularnych warstw lipidowych plazmo-

lemmy. W błonie komórkowej obojętne glicerofosfolipidy zawierające w swojej

strukturze chemicznej cholinę, do których należą fosfatydylocholina (PC) oraz

sfingomielina (SM) znajdują się w zewnętrznej warstwie monomolekularnej,

podczas gdy prawie wszystkie cząsteczki anionowych fosfolipidów glicerolo-

wych zawierające terminalną grupę aminową, takie jak fosfatydyloetanoloamina

(PE) i fosfatydyloseryna (PS) znajdują się w monowarstwie wewnętrznej. Po-

nieważ kwasy tłuszczowe fosfatydylocholiny i sfingomieliny są w ogólności

bardziej nasycone niż kwasy tłuszczowe wchodzące w skład fosfatydyloetanolo-

aminy i fosfatydyloseryny, więc asymetrii rozmieszczania głów polarnych

fosfolipidów towarzyszy asymetria dystrybucji kwasów tłuszczowych, która

powoduje, że wewnętrzna monowarstwa lipidowa błony plazmatycznej jest

nieco bardziej płynna. Z uwagi na fakt, iż ujemnie naładowana fosfatydylosery-

na jest zlokalizowana po wewnętrznej stronie plazmolemmy, powoduje to wy-

stępowanie dodatkowej różnicy ładunku pomiędzy obiema monowarstwami

fosfolipidowymi. Utrzymująca się przez cały czas życia komórek asymetria


8

składu błony cytoplazmatycznej, pomimo występowania ruchliwości translacyj-

nej cząsteczek lipidów typu dyfuzji transwersalnej z jednej monowarstwy do

drugiej (ruchy flip-flop), świadczy o występowaniu w błonach wysoce specy-

ficznych układów enzymatycznych, które są odpowiedzialne za istnienie zjawi-

ska anizotropii rozmieszczenia fosfolipidów (Bratton i in., 1997, 1999). Ruchli-

wości transwersalnej amfipatycznych składników lipidowych między monomo-

lekularnymi warstwami błony plazmatycznej musi towarzyszyć zmiana konfor-

macji poszczególnych cząsteczek fosfoglicerydów, która dotyczy wzajemnej

orientacji przestrzennej ich części polarnych („głów”) i niepolarnych („ogo-

nów”). Uważa się, że duży transbłonowy gradient stężenia różnych składników

lipidowych powinien powodować dyfuzję transwersalną i eliminację asymetrii.

Udowodniono występowanie trzech klas transporterów fosfolipidów glicerolo-

wych: 1. flipaz, w tym translokazy aminofosfolipidowej, transportujących ak-

tywnie lipidy z monowarstwy zewnętrznej do wewnętrznej; 2. flopaz aktywnie

transportujących lipidy w kierunku odwrotnym, do których należą białka opor-

ności wielolekowej, oraz 3. transportujących biernie w obie strony błony cyto-

plazmatycznej skramblaz, do których należy m. in. skramblaza aktywowana

przez kationy wapnia (Frasch i in., 2004; Fadeel i in., 1999b). W komórkach

żywych rozmieszczenie aminofosfolipidów (PS i fosfatydyloetanoloaminy)

ogranicza się zatem do warstwy wewnętrznej błony. Asymetryczna lokalizacja

aminofosfolipidów jest utrzymywana dzięki aktywności ATP-zależnej translo-

kazy zwanej flipazą, która „wpompowuje” je do wewnętrznej warstwy błony,

a inne lipidy − do zewnętrznej. Aktywacja kaspaz doprowadza do zakłócenia

tego stanu, przyczyniając się do zablokowania funkcji translokazy i do aktywacji

enzymu skramblazy/flopazy, którego aktywność „wyrównuje” rozmieszczenie

lipidów wewnętrznej i zewnętrznej warstwy błony, powodując szybkie pojawie-

nie się PS na powierzchni błony komórek apoptotycznych (Blankenberg i in.,

2000; Martin i in., 1995a; Zwaal i Schroit, 1997).

Rola asymetrii plazmolemmy nie jest do końca jasna. Przeważa pogląd,

że różnorodność lipidów i ich anizotropia, tj. niejednakowy sposób ułożenia

w warstwie dimolekularnej błony plazmatycznej mają zasadniczy wpływ na

prawidłowe funkcjonowanie komórek. Wskazuje się tu na specyficzne oddzia-

ływanie niektórych enzymów z subklasą lipidów, szczególnie fosfatydyloseryną,

ulokowaną w konkretnym miejscu błony. Na przykład aktywność białkowej

kinazy C zależy w dużym stopniu od stężenia PS. Również białka wiążące

nukleotydy guaninowe (tj. białka G), a także amfitropowe i antykoagulacyjne

białka błonowe wiążące jony Ca2+

i fosfolipidy, czyli aneksyny, stanowiące całą

rodzinę enzymów pełniących wiele funkcji w komórce, są enzymami zależnymi

od PS. W przypadku autodestrukcyjnej śmierci fizjologicznej komórek następuje

zwiększona ekspozycja fosfatydyloseryny do monowarstwy zewnętrznej, co jest

sygnałem do wolnej od procesu zapalnego eliminacji komórki apoptotycznej

przez makrofagi (Ferraro-Peyret i in., 2002; Martin i in., 1995a, b). Uważa się,

że postępująca oksydacja translokazy aminofosfolipidowej, spowodowana przez

wewnątrzkomórkową akumulację reaktywnych form tlenu, jest odpowiedzialna


9

za utratę asymetrii lipidów w plazmolemmie komórek będących w fazie inicjato-

rowej i wykonawczej apoptozy (Arroyo i in., 2002; Tyurina i in., 2004a, b).

Wyniki badań przeprowadzonych przez Deneckera i in. (2001) wskazują, że

przemieszczanie PS stanowi jedno z wcześniejszych wydarzeń w szlaku apopto-

tycznym, zachodzącym przed spadkiem potencjału transbłonowego mitochon-

driów oraz uwalnianiem cytochromu c z przestrzeni międzybłonowej tych

struktur. Przemieszczenie PS na powierzchnię komórek można łatwo monitoro-

wać poprzez wiązanie tego fosfolipidu za pomocą aneksyny V związanej

z fluoresceiną (Martin i in., 1995a; Fadok i in., 1992a, b). Aktywacja kaspaz

inicjujących doprowadza do pierwszych proteolitycznych cięć niektórych skład-

ników cytoszkieletu (m.in. aktyna, fodryna) (Martin i in., 1995b; Vanags i in.,

1996).

1.2.2. Etap drugi – faza wykonawcza apoptozy i jej kontrolny punkt

nieodwracalności

Stymulacja aktywności kaspaz wykonawczych i przemieszczanie PS

w błonie komórek jest sygnałem rozpoczęcia fazy efektorowej, która wydaje się

być wspólnym etapem wiodącym do śmierci komórek wzbudzanych przez

poszczególne ścieżki apoptotyczne (Medema i in., 1997a; Huppertz i in., 1999).

W tej fazie dochodzi do ostatecznego włączenia programu śmierci, precyzyjnie

kontrolowanego przez produkty genów, które mogą aktywować czy blokować

bądź opóźniać apoptozę przez hamowanie kaspaz wykonawczych. Centralnym

punktem skupiającym różne sygnały apoptotyczne, charakterystyczne dla fazy

inicjatorowej są zatem proteazy cysteinowe z podrodziny kaspaz wykonawczych

(Bedner i in., 2000). Aktywacja kaspaz wykonawczych przez kaspazy inicjujące,

czy inne białka (np. proteaza serynowa GrB) stanowi etap, „punkt kontrol-

ny/restrykcyjny”, od którego nie ma już odwrotu w apoptozie (ang. point of no

return) i podlega precyzyjnej regulacji przez białka rodziny Bcl-2 (ang. B-cell

leukemia/lymphoma-2) oraz IAP (ang. inhibitory apoptosis proteins) (Renvoize

i in., 1997). Czas ich aktywacji wynosi od kilku minut do kilku godzin i zależy

od typu oraz stanu funkcjonalnego komórek. Zaktywowane kaspazy wykonaw-

cze (np. kaspaza-3) bezpośrednio albo w kaskadzie kaspaz dokonują proteolizy

wielu białek krytycznych dla życia komórek, wśród których znajdują się m.in.

białka cytoszkieletu, otoczki jądrowej, białka odpowiedzialne za organizację

przestrzenną DNA i jego naprawę, enzymy zaangażowane w relaksację α-

heliksu DNA oraz w anafazowy rozdział chromosomów podczas mitozy. Obok

najlepiej poznanych proteaz – kaspaz, zaangażowanych w realizację programu

fazy efektorowej samobójczej śmierci komórek, wymienia się inne proteazy,

zarówno cysteinowe (izoformy kalpain, katepsyny B i L), asparaginianowe

(katepsyna D), jak i serynowe (granzym B, proteaza AP24) (Fadeel i in., 2000;

Squier i in., 1994; Wright i in., 1997; Yamashima, 2000). Kalpainy, które pod

względem biochemicznym stanowią zależne od jonów wapnia, obojętne endo-

peptydazy wewnątrzkomórkowe, zawierające w swoim centrum katalitycznym


10

cysteinę i histydynę, występują w dwóch izoformach, tj. m i μ, oznakowanych

również odpowiednio jako II i I. Wspomniane izoformy różnią odmienne wy-

magania w stosunku do ich aktywatora – jonów Ca2+

– milimolowe, w przypad-

ku m-kalpainy, i mikromolowe – dla μ-kalpainy, które opisuje się również,

odpowiednio, jako m- i μ-CANPs/CLs (ang. calcium-activated neutral prote-

ases/calpains) (Tagliarino i in., 2003). Kalpainy występują w cytozolu oraz

różnych organellach komórkowych i aktywowane są m.in. przez fosfolipidy oraz

białka jądrowe – histony. Znanym inhibitorem komórkowym kalpain jest kalpa-

statyna (Sanges i in., 2006). Kalpainy rozszczepiają wiązania peptydowe we-

wnątrz łańcucha białkowego i nie wykazują specyficzności substratowej wobec

aminokwasów. Ponadto, cząsteczki kalpain dokonują proteolitycznego cięcia

wielu białek w komórkach ulegających apoptozie zwykle w innych miejscach

łańcucha aniżeli kaspazy. W wyniku działania kalpain powstają duże fragmenty

polipeptydowe, które ulegają dalszej proteolizie katalizowanej przez inne enzy-

my komórkowe np. kaspazy (Friedrich i in., 2001; Wang, 2000; Squier i Cohen,

1997).

Stwierdzono, że wzrost aktywności kalpain wyprzedza zmiany morfolo-

giczne typowe dla komórek apoptotycznych oraz fragmentację DNA. Wyniki

badań przeprowadzonych przez Squiera i in. (1994) oraz Squiera i Cohena

(1997) udokumentowały, że w wielu typach komórek włączających program

śmierci samobójczej wywołany różnymi czynnikami dochodzi do rozchwiania

homeostazy jonów Ca2+

(izokalcemii), co prowadzi do aktywacji izoform kalpa-

iny. Substratami kalpain w komórkach apoptotycznych są białka cytoszkieleto-

we, m.in białka wiążące aktynę (fodryna/spektryna, talina, filamina, α-aktynina),

białka związane z mikrotubulami (MAP-2), oraz białka wiążące się z kalmoduli-

ną, kinazy białkowe takie jak np. kinaza białkowa C (PKC), zależna od jonów

Ca2+

i kalmoduliny kinaza białkowa typu II i IV (CaM-PK-II/IV), kinaza łańcu-

cha lekkiego miozyny, a także enzym PARP, proapoptotyczne białko Bax

z rodziny Bcl-2, fosfolipaza C, czynniki transkrypcyjne (c-Fos, c-Jun), białka

receptorowe (np. receptory epidermalnego czynnika wzrostu), błonowe transpor-

tery jonowe (Ca2+

-ATPaza), kanały wapniowe, cytokiny (interleukina 1α) i kilka

enzymów istotnych w sygnalizacji komórkowej (Mandic i in., 2002; McGinnis

i in., 1998). Na podkreślenie zasługuje obserwacja, że katalityczne rozszczepie-

nie wielu białek następuje w innych miejscach niż w przypadku kaspazy-3.

Pojawiły się przypuszczenia, że być może aktywność proteolityczna kalpainy

i kaspazy-3 jest uporządkowana hierarchicznie. Zaobserwowano, że kalpaina

aktywuje (poprzez rozszczepienie proteolityczne) kaspazę-3, -7 i -9 (Fadeel i in.,

2000; Neumar i in., 2003). Odnotowano także aktywację kalpainy przez kaspa-

zę-3 (Wood i Newcomb, 1999; Sharma i Rohrer, 2004). Niewykluczone rów-

nież, że kaspaza-3 (ale również -1 i -7) może być odpowiedzialna za proteolizę

kalpastatyny, powodując tym samym aktywację kalpainy (Graves i in., 2001;

Kato i in., 2000a; Pörn-Ares i in., 1998; Wang i in., 1998). Ponadto, w czasie

apoptozy translokacja kalpain do jąder komórkowych prowadzi do interakcji

z białkiem p53, aktywującym proapoptotyczny gen kodujący białko Bax


11

z rodziny genów bcl-2 (Choi i in., 2001). We wczesnych etapach fazy wyko-

nawczej apoptozy, przed punktem nieodwracalności, należy podkreślić rolę

m.in. białek rodziny Bcl-2, których aktywność warunkuje przepuszczalność błon

mitochondrialnych, wypływ czynników proapoptotycznych oraz stymuluje bądź

hamuje aktywność kaspaz (Adams i Cory, 1998; Green i Reed, 1998). Białka tej

rodziny, głównie inhibitory apoptozy, np. białko Bcl-2, kontrolują uwalnianie

jonów Ca2+

z komórkowych zapasów siateczki śródplazmatycznej czy mito-

chondriów (Lam i in., 1994). Kationy wapnia odgrywają ważną rolę w transmisji

sygnału apoptotycznego w komórkach (Squier i in., 1994; Squier i Cohen,

1997). Ostatnio doniesiono, że aktywowane przez te jony cząsteczki kalpain są

zaangażowane w proteolizę cytozolowego, proapoptotycznego białka Bax w N-

końcu jego cząsteczki w komórkach, w których czynna autodestrukcja była

indukowana poprzez działanie etopozydu bądź staurosporyny (Cao i in., 2003;

Gao i Dou, 2000). Skrócone białko Bax o masie molekularnej 18 kDa, opisy-

wane jako Bax/p18, po translokacji do mitochondriów inicjuje uwalnianie cyto-

chromu c, promującego tworzenie apoptosomu – wielopodjednostkowego kom-

pleksu białkowego niezbędnego do aktywacji proteolitycznej inicjatorowej

prokaspazy-9 i przekroczenia przez komórki kontrolnego punktu nieodwracalno-

ści procesu apoptozy (Cain i in., 2000; Zou i in., 1999). Jony Ca2+

są również

nieodzowne do aktywacji niektórych enzymów dokonujących przeorganizowa-

nia kompleksu chromatynowego i jego dostępności na atak nukleolityczny,

a także wpływają, bezpośrednio lub pośrednio, na indukcję ekspresji (inicjację

aktywności transkrypcyjnej) genów związanych z realizacją programu śmierci

(Nicotera i Rossi, 1994). Wright i in. (1997) zidentyfikowali apoptotyczną

proteazę serynową o masie cząsteczkowej 24 kDa (AP24; ang. 24kDa apoptotic

protease), której aktywność jest uwarunkowana wzrostem stężenia kationów

wapniowych w cytozolu i nukleoplazmie oraz wpływa na fragmentację DNA

jądrowego. Wydaje się, że aktywacja kaspazy-3 jest czynnikiem niewystarczają-

cym do rozpoczęcia apoptotycznej fragmentacji DNA w komórkach, w których

zablokowano aktywność proteazy AP24 (Wright i in., 1998; Altairac i in., 2003).

Kolejną proteazę zależną od jonów Ca2+

, oznakowaną symbolem NS (ang.

nuclear scaffold) ze względu na lokalizację w szkielecie jądrowym (lub asocja-

cję z nukleoszkieletem), wykryto w komórkach apoptotycznych jako enzym

odpowiedzialny za proteolizę lamin (Zhivotovsky i in., 1997). Inhibitory tego

enzymu hamują degradację laminów, obkurczanie komórek, a także fragmenta-

cję DNA.

Wśród ścieżek sygnalizacyjnych apoptozy wymienia się tzw. szlak

pseudoreceptorowy, opisywany najczęściej w krwinkach białych szeregu limfo-

cytarnego (limfocyty T cytotoksyczne oraz komórki NK). Komórki te syntetyzu-

ją i wydzielają białko perforynę oraz alkaliczne białko glikoproteinowe o funkcji

enzymatycznej (proteazę serynową), określane mianem granzymu B (GrB). To

ostatnie białko określane jest również jako fragmentyna-2. Zarówno perforyna,

jak i granzym B są kierowane do komórek uśmiercanych (Frazer i Evan, 1996;

Greenberg, 1996; Thornberry i in., 1997). Perforyna tworzy w błonach plazma-


12

tycznych takich wczesnoapoptotycznych komórek mikrokanały, przez które

wnika proteaza serynowa GrB, indukująca śmierć dwiema drogami (Scharif-

Askari i in., 2001). W tzw. drodze „cytozolowej” GrB, podobnie jak kaspazy,

dokonuje cięć substratów między resztą kwasu asparaginowego a kolejnym

aminokwasem, aktywując w pierwszej kolejności kaspazę-3. Ta z kolei usuwa

prodomenę kaspazy-7, czyniąc ją aktywną w uruchomieniu enzymatycznej

kaskady kaspaz, której działanie prowadzi do autodestrukcji komórki (Yang

i in., 1998). Natomiast, mniej wyjaśniona droga „jądrowa”, z udziałem GrB,

prawdopodobnie angażuje białka regulujące cykl komórkowy (Estébanez-

Perpiñá i in., 2000). Granzym B może również usuwać inhibitor endonukleazy

DFF45/ICAD (ang. DNA fragmentation factor 45 kDa/inhibitor of caspase-

activated deoxyribonuclease), a także dokonywać proteolitycznego cięcia białka

Bid (Estébanez-Perpiñá i in., 2000; Medema i in., 1997b). Ostatnio udowodnio-

no, że GrB i kaspaza-3 rozszczepiają w tym samym miejscu endonukleazę

DFF40/CAD (ang. DNA fragmentation factor 40 kDa/caspase-activated deoxy-

ribonuclease), powodując uwalnianie polipeptydu o masie molekularnej 28 kDa,

co wydaje się istotne dla fragmentacji DNA w komórkach apoptotycznych, nie

wykorzystujących kaspaz w szlaku przekaźnictwa sygnału śmierci (Scharif-

Askari i in., 2001). Formowanie przez białka z grupy perforyn mikrokanałów

lub mikroporów w błonach cytoplazmatycznych komórek znajdujących się

prawdopodobnie we wczesnych fazach śmierci apoptotycznej (stadium wzbu-

dzenia oraz stadium efektorowe prawdopodobnie przed przekroczeniem kontrol-

nego punktu nieodwracalności apoptozy) można wykrywać przy zastosowaniu

przyżyciowych metod fluorycytochemicznych z użyciem małocząsteczkowego

barwnika specyficznie wiążącego się z DNA – YO-PRO-1 (Daly i in., 1997;

Estaquier i in., 1995, 1996; Idziorek i in., 1995; Samiec i Skrzyszowska, 2012a,

2013; Samiec i in., 2013a).

Podczas fazy wykonawczej zaprogramowanej genetycznie śmierci sa-

mobójczej dochodzi do wybiórczego gromadzenia się włókien spolimeryzowa-

nej aktyny fibrylarnej, tj. aktyny F, w centralnej części komórek apoptotycz-

nych, zaś monomerycznych cząsteczek aktyny globularnej, tj. aktyny G – obwo-

dowo, w miejscu formowania pęcherzykowatych uwypukleń błony komórkowej

(ang. blebbing) (Asumendi i in., 2000). Taka polaryzacja w rozmieszczeniu

cząsteczek aktyny F i G wiąże się z przeorganizowaniem sieci mikrofilamentów

aktynowych i wydaje się niezbędna do późniejszego tworzenia ciałek apopto-

tycznych w komórkach. W tym samym czasie dochodzi do zaburzeń ultrastruk-

turalnych w mikrotubulach i ich rozpadu w następstwie rozszczepienia cząste-

czek tubuliny α i tubuliny β. Zmianom tym towarzyszy zapoczątkowanie proteo-

lizy włókien aktynowych cytoszkieletu. Na obecnym etapie badań sugeruje się,

że utrzymywanie integralności części mikrofilamentów aktynowych i mikrotu-

buli, a także ich częściowa, wybiórcza proteoliza przygotowuje komórki apopto-

tyczne do ich ostatecznego zniszczenia.

Należy zwrócić uwagę, że również enzymy lizosomalne uczestniczą

w przebiegu wczesnych etapów fazy wykonawczej apoptozy, przed przekrocze-


13

niem przez ten proces restrykcyjnego punktu nieodwracalności. W opinii Stoka

i in. (2001), proteazy uwalniane z lizosomów w niewielkim stopniu wpływają na

aktywację kaspaz wykonawczych, natomiast ich funkcję wiąże się z proteolizą

białka proapoptotycznego Bid, która jest dokonywana w pozycji Arg65

, a zatem

w innym miejscu niż tnie inicjatorowa kaspaza-8 (Asp59

). Proteoliza białka Bid

prowadzi do jego konwersji w formę łatwiej przemieszczającą się do mitochon-

driów, w których przyczynia się ona do wypływu cytochromu c (Csordás i in.,

2002; Mandic i in., 2002).

1.2.2.1. Udział mitochondriów w scenariuszu śmierci apoptotycznej –

główne czynniki i kluczowe mechanizmy warunkujące przebieg fazy wykonaw-

czej apoptozy w wewnątrzmitochondrialnym i cytoplazmatycznym przedziale

komórkowym

Niezwykle istotnym powodem, dla którego mitochondriom przypisuje

się najważniejszą rolę w fazie wykonawczej procesu apoptozy, jest występowa-

nie w błonie zewnętrznej oraz w przestrzeni międzybłonowej tych organelli

wielu krytycznych aktywatorów i efektorów apoptotycznej śmierci komórek.

W błonie zewnętrznej mitochondriów znajdują się białka rodziny Bcl-2 (Noura-

ini i in., 2000; Dejean i in., 2005). W przestrzeni międzybłonowej zlokalizowane

są: 1. proapoptotyczne białko AIF (ang. apoptosis inducing factor) o masie

molekularnej 57 kDa, należące do grupy flawoprotein; 2. cytochrom c, określany

również mianem drugiego czynnika aktywującego kaskadę proteaz apoptotycz-

nych (Apaf-2; ang. apoptosis protease activating factor-2); 3. białko

Smac/DIABLO określane także jako drugorzędowy/wtórny aktywator kaspaz

pochodzenia mitochondrialnego lub białko o niskiej wartości punktu izoelek-

trycznego, inaktywujące białkowe czynniki inhibitorowe procesu apoptozy

poprzez ich bezpośrednie wiązanie [ang. second mitochondrial activator of

caspases/direct IAP (inhibitor of apoptosis protein)-binding protein with low

pI], a także 4. prokaspazy-2, -3 i -9, czyli zymogeny kaspaz należących do

inicjatorów fazy wykonawczej (-2, -9) oraz efektorów fazy wykonawczej apop-

tozy (-3) (Sanges i Marigo, 2006; Sanges i in., 2006; Ruiz-Vela i in., 2005).

W zależnym od mitochondriów szlaku transdukcji sygnału apoptotycz-

nego, rolę enzymu inicjującego kaskadę reakcji proteolitycznych pełni głównie

kaspaza-9, a cały ten wielostopniowy proces jest regulowany przez rodzinę

białek Bcl-2. W komórkach o niskiej aktywności inicjatorowej kaspazy-8,

enzym ten nie aktywuje bezpośrednio efektorowej prokaspazy-3, ale oddziałuje

z proapoptotycznym białkiem Bid, dokonując jego proteolitycznego cięcia do

formy skróconego polipeptydu o masie cząsteczkowej 15 kDa (Bid/p15), okre-

ślanego także mianem tBid (ang. truncated Bid). Polipeptyd tBid, reagując

z innym proapoptotycznym białkiem Bax, rozpoczyna kaskadę reakcji

z udziałem mitochondriów, których efektem są zmiany w przepuszczalności

błon tych organelli, intensywny wyciek cytochromu c oraz aktywacja kaspaz

(Csordás i in., 2002; Anto i in., 2002). Aktywacja prokaspaz z udziałem mito-

chondriów rozpoczyna się od wycieku cytochromu c z przestrzeni międzybło-


14

nowej do cytozolu. Uwolnione cząsteczki cytochromu c, wspólnie z dATP/ATP,

przyłączają się do pierwszego czynnika aktywującego apoptotyczne proteazy

(Apaf-1; ang. apoptosis protease activating factor-1). W tym ostatnim procesie,

cytochrom c i ATP pełnią rolę kofaktorów i stymulują oligomeryzację Apaf-1.

Zmiany konformacyjne czynnika Apaf-1 znacznie ułatwiają jego połączenie

z prokaspazą-9. Utworzony kompleks: cytochrom c-dATP/ATP-Apaf-1-

prokaspaza-9 znany jest jako apoptosom. Następstwem powyższych zmian jest

uwolnienie aktywnej kaspazy-9, która proteolitycznie aktywuje efektorowe

kaspazy-3, -6 i -7. Uwalnianie cytochromu c, jak i powstawanie apoptosomu, są

kontrolowane przez białka rodziny Bcl-2, transportowane do zewnętrznej błony

mitochondrialnej (Shimizu i in., 1999; Harris i Thompson, 2000). Obecność

w mitochondriach takich białek proapoptotycznych należących do rodziny Bcl-2

jak: Bik, Bak, Bax, Bid, Bad, Bim ułatwia zatem wyciek cytochromu c i innych

czynników apoptogennych do cytozolu poprzez wzrost przepuszczalności błony

zewnętrznej, a tym samym przyśpiesza autodestrukcyjną (samobójczą) śmierć

komórek (Nutt i in., 2002 a,b). Z kolei, nadekspresja w komórkach białek Bcl-2

o aktywności antyapoptotycznej zapobiega uwalnianiu cytochromu c oraz hamu-

je proces tworzenia apoptosomu i aktywacji kaspaz efektorowych (Murphy i in.,

2000).

Wyciek cytochromu c, prokaspaz-2, -3 i -9 oraz białek AIF i Smac/DIABLO

prawdopodobnie odbywa się za pośrednictwem kanałów oraz porów obecnych,

bądź powstających w błonie mitochondrialnej podczas apoptozy (Desagher

i Martinou, 2000; Du i in., 2000; Reed, 1997; Verhagen i in., 2000). W komór-

kach apoptotycznych mogą to być kanały utworzone w zewnętrznej błonie tylko

przez białka rodziny Bcl-2 albo kanały chimerowe powstałe po przyłączeniu

białka proapoptotycznego Bax lub Bak do kanałów jonowych zależnych od

napięcia oraz natężenia pola elektrostatycznego lub od potencjału elektroche-

micznego (Zheng i in., 2004; Zalk i in., 2005). Obecne w mitochondriach białka

Bcl-2 mogą też prowadzić do destabilizacji błony i powstania tzw. „dziur lipi-

dowych”. Istnieją również przypuszczenia, że czynniki indukujące apoptozę

bezpośrednio oddziałują z porami mitochondrialnymi (PM), powodując ich

otwarcie, a w kolejnych etapach depolaryzację mitochondriów, pęcznienie

matriks oraz rozerwanie zewnętrznej błony mitochondrialnej (De Giorgi i in.,

2002). Pory mitochondrialne, zwane także „megakanałami”, zbudowane są

z trzech różnych składników: napięciowo-zależnego kanału jonowego w ze-

wnętrznej błonie mitochondrialnej, translokazy nukleotydów adeninowych

w błonie wewnętrznej oraz z mitochondrialnego receptora benzodiazepiny

(Dahlem i in., 2006; Wang i in., 2005; Shimizu i in., 2000). Proces otwierania

porów regulowany jest zarówno przez potencjał błony mitochondrialnej (ΔΨm),

jak i pH macierzy mitochondrialnej. Prawdopodobieństwo otwarcia PM wzrasta

wraz ze spadkiem ΔΨm oraz maleje poniżej pH 7 (Desagher i Martinou, 2000;

Castedo i in., 1996; Lam i in., 1994; Zamzami i in., 1995, 1996). Uwolnione

zatem, przez otwarte megakanały, z przestrzeni międzybłonowej mitochondriów

do cytozolu czynniki apoptogenne, takie jak: cytochrom c oraz białka


15

Smac/DIABLO i AIF uczestniczą, bezpośrednio lub pośrednio, w procesach

aktywacji kaspaz inicjatorowych i wykonawczych we wczesnych etapach samo-

bójczej śmierci komórek. Wtórny mitochondrialny aktywator kaspaz

Smac/DIABLO jest odpowiedzialny za inaktywację inhibitorów wielu kaspaz

inicjujących (-8, -10) i wykonawczych procesu apoptozy (-3, -6, -7) poprzez ich

bezpośrednie wiązanie. Z kolei, czynnik indukujący apoptozę AIF wykazuje

znaczną homologię do oksydoreduktaz oraz zdolność aktywacji prokaspazy-3.

Obecnie wiadomo, że po uwolnieniu czynnika AIF z mitochondriów do cytopla-

zmy ulega on translokacji do jąder komórek apoptotycznych, gdzie staje się

sygnałem do uruchomienia kaspazo-niezależnej ścieżki kondensacji chromatyny

i fragmentacji DNA na odcinki o długości ≥50 kpz (Susin i in., 1999). Mecha-

nizm stymulacji kondensacji chromatyny z udziałem flawoproteiny AIF jest

wciąż niewyjaśniony.

Uważa się, że po przekroczeniu punktu nieodwracalności w fazie efekto-

rowej śmierci apoptotycznej komórek, poza obniżeniem potencjału transbłono-

wego mitochondriów, otwarciem megakanałów mitochondrialnych, oraz zakłó-

ceniem mitochondrialno-cytozolowej homeostazy stężeniowej jonów Ca2+

(izokalcemii), dochodzi również do fragmentacji mitochondrialnego DNA, która

zwykle poprzedza fragmentację DNA jądrowego. Ponadto, wykonawcza kaspa-

za-3, stymulowana proteolitycznie przez uwolnioną z apoptosomu aktywną

formę inicjatorowej kaspazy-9, dokonuje aktywacji i rozszczepienia heterodime-

rycznego czynnika fragmentacji DNA jądrowego DFF/CAD (ang. DNA frag-

mentation factor/caspase-activated deoxyribonuclease) (Liu i in., 1997, 1998,

1999). Czynne kaspazy efektorowe (-3, -6, -7) aktywują także różne enzymy

modyfikujące białka i DNA wewnątrz jądra komórkowego (Huppertz i in., 1999;

Robertson i in., 2000; Song i in., 1996), a także białko Acinus (ang. apoptosis

chromatin condensation inducer in the nucleus), którego funkcja związana jest

z indukcją kondensacji chromatyny (Sahara i in., 1999).

1.2.2.2. Udział jądra komórkowego w scenariuszu śmierci apoptotycz-

nej – główne czynniki i kluczowe mechanizmy determinujące przebieg fazy

wykonawczej apoptozy w wewnątrzjądrowym przedziale komórkowym

Do najważniejszych apoptotycznych zmian w jądrze komórkowym nale-

żą: kondensacja chromatyny, fragmentacja jądra oraz fragmentacja DNA. Spo-

śród uszkodzeń DNA indukowanych podczas apoptozy najwcześniej notowane

są pojedyncze pęknięcia. Produktami tych reakcji są duże fragmenty DNA od

300 kpz do 1 Mpz, fragmenty średniej długości (20-300 kpz) oraz fragmenty

internukleosomalne (około 200 pz). Z kolei, produktami podwójnych pęknięć

DNA są fragmenty od 50-300 kpz oraz fragmenty internukleosomalne (180-200

pz lub ich wielokrotności) (Robertson i in., 2000; Zhivotovsky i in., 1994).

Wiadomo, że proces nukleolitycznego trawienia DNA genomowego podczas

apoptozy obejmuje dwie fazy: 1. doprowadzającą do powstania fragmentów

genomu o odcinkach liczących 200-300 i 20-50 kpz (Earnshaw, 1995), określa-

nych jako wielkocząsteczkowy DNA lub DNA o wysokiej masie molekularnej


16

(HMW DNA; ang. high molecular weight DNA) oraz 2. doprowadzającą do

utworzenia odcinków odpowiadających długości nukleosomowego DNA (rzędu

około 180-200 pz) lub jego wielokrotności (Earnshaw, 1995), oznakowanych

jako drobnocząsteczkowy DNA lub DNA o niskiej masie molekularnej (LMW

DNA; ang. low molecular weight DNA) (Robertson i in., 2000; Walker i in.,

1994).

W procesie apoptotycznej degradacji DNA uczestniczą różnego typu

endonukleazy. Enzymy te występują w różnych strukturach subkomórkowych.

Pod wpływem sygnałów apoptotycznych endonukleazy zmieniają swoją lokali-

zację i wszystkie przemieszczają się do jądra. W wielu przypadkach endonukle-

azy aktywowane są przez kaspazy efektorowe. Ze względu na pełnione funkcje

oraz wrażliwość na jony, enzymy podzielono na trzy grupy: endonukleazy

zależne zarówno od jonów Ca2+

, jak i jonów Mg2+

(Ca2+

/Mg2+

-endonukleazy),

endonukleazy zależne tylko od jonów Mg2+

(Mg2+

-endonukleazy) oraz endonu-

kleazy kationoniezależne (nukleazy kwaśne) (Earnshaw, 1995; Robertson i in.,

2000; Zhivotovsky i in., 1994). Do pierwszej grupy enzymów należy DNaza I.

Wykryto ją w retikulum endoplazmatycznym, aparacie Golgiego i małych

pęcherzykach wydzielniczych. Endonukleaza ta uczestniczy głównie w powsta-

niu pojedynczych pęknięć DNA po uprzedniej aktywacji przez kaspazy oraz

proteazy serynowe. Do Mg2+

-endonukleaz należy DNaza aktywowana przez

kaspazy (CAD; ang. caspase-activated deoxyribonuclease), która określana jest

również mianem czynnika fragmentacji DNA o masie cząsteczkowej 40 kDa

(DFF40; ang. DNA fragmentation factor 40 kDa) (Liu i in., 1997). Deoksyrybo-

nukleaza DFF40/CAD odpowiedzialna jest za podwójne pęknięcia DNA

w regionach bogatych w pary zasad adenina-tymina (A/T) (Enari i in., 1998;

Halenbeck i in., 1998; Liu i in., 1998). Enzym ten katalizuje reakcje cięć DNA

między nukleosomami, tworząc fragmenty LMW. Jego aktywność nukleazową

stymuluje obecność histonu H1, niehistonowych białek o wysokiej ruchliwości

elektroforetycznej (HMG-1 i HMG-2; ang. high mobility group-1/2 proteins)

oraz topoizomerazy II (Liu i in., 1999; Widlak i in., 2000). Z badań Sakahira

i in. (1999) wynika, że enzymatyczny czynnik DFF40/CAD jest odpowiedzialny

za degradację DNA zarówno do odcinków LMW, jak i do dużych fragmentów

genomu. Atak nukleolityczny dotyczy DNA zakotwiczonego w szkielecie ją-

drowym, w miejscach wzbogaconych w se-kwencje adenina-tymina (AT),

preferowanych przez tę endonukleazę. Nacięcie przez enzym w pierwszej kolej-

ności takich miejsc może rozwijać kompleks chromatynowy, w którym odsło-

nięte zostaną regiony łącznikowe między nukleosomami do dalszego trawienia

nukleolitycznego, formując odcinki odpowiadające długością DNA nukleoso-

mów lub ich wielokrotności (Nagata, 2000). W komórkach nieulegających

apoptozie endonukleaza DFF40/CAD występuje jako nieaktywny heterodimer

w kompleksie z inhibitorem o masie molekularnej 45 kDa (DFF45/ICAD; ang.

DNA fragmentation factor 45 kDa/inhibitor of CAD). Natomiast w komórkach

późnoapoptotycznych kaspaza-3 (oraz w mniejszym stopniu kaspaza-7) uwalnia

przez proteolityczne cięcie czynnik inhibitorowy DFF45/ICAD, umożliwiając


17

formowanie aktywnych homooligomerów przez nukleazę DFF40/CAD (Halen-

beck i in., 1998; Sakahira i in., 1998). Produkty działania aktywnej formy

DFF40/CAD można uwidocznić w żelu agarozowym lub poliakryloamidowym

w formie charakterystycznej „drabinki”, uznawanej za marker molekularny

apoptozy wielu komórek. Przedstawicielem enzymów należących do trzeciej

grupy endonukleaz niezależnych od jonów metali jest lizosomalna DNaza II (L-

DNaza II). W procesie apoptozy L-DNaza II przenoszona jest z cytozolu do

jądra komórkowego. Deoksyrybonukleaza ta indukuje kondensację chromatyny

jądrowej oraz jej degradację do fragmentów wielkości nukleosomów (Altairac

i in., 2003; Brossas i in., 2004; Torriglia i in., 2000). W degradacji DNA mogą

uczestniczyć również inne białka. W mitochondriach występuje endonukleaza

G. Podczas apoptozy enzym ten, niezależnie od aktywności kaspaz, powoduje

degradację DNA mitochondrialnego (mtDNA) na fragmenty mononukleosomal-

ne (Li i in., 2001). Za kondensację chromatyny oraz internukleosomalną frag-

mentację DNA odpowiedzialne są także endonukleaza γ i katepsyna B (Earns-

haw, 1995; Nagata, 2000; Robertson i in., 2000). Obydwa białka podczas pro-

gramowanej śmierci komórek uwalniane są z lizosomów. Znaczący udział

zarówno w procesie degradacji DNA, jak i w kondensacji chromatyny ma rów-

nież wspomniany już wcześniej czynnik indukujący apoptozę (AIF; ang. apop-

tosis inducing factor) (Sanges i in., 2006).

1.2.3. Etap trzeci – faza destrukcyjna apoptozy

Szybkość progresji procesu apoptozy komórek w fazę ich zniszczenia

zależy m.in. od typu komórek, rodzaju i siły bodźca apoptotycznego, które to

czynniki z kolei determinują tempo aktywacji oraz wewnątrzkomórkowe stęże-

nie zaktywowanych kaspaz wykonawczych, katalizujących proteolityczne

rozszczepianie strukturalnych, enzymatycznych i innych regulatorowych białek

cytoplazmatycznych oraz jądrowych (Dynlacht i in., 2000; Hengartner, 2000;

Huppertz i in., 1999; Kidd i in., 2000). Substratami kaspaz wykonawczych

w fazie destrukcyjnej apoptozy są m.in. takie białka strukturalne jak: β-katenina,

α-fodryna, aktyna, cytokeratyna-18, gelsolina, laminy jądrowe oraz białka

regulacyjne, do których należą: kinaza Fak (ang. focal adhesion kinase), cyto-

plazmatyczna fosfolipaza A2, białko Mdm2 (ang. mouse double minute 2) –

hamujące aktywność białka supresora transformacji nowotworowej p53

i decydujące o jego proteolitycznej degradacji w proteasomie 26S, kinaza PAK

(ang. p21-activated kinase), czyli kinaza z rodziny MAPKKK/MKKK aktywo-

wana małym białkiem G o masie cząsteczkowej 21 kDa (p21), antyapoptotyczne

białka z rodziny Bcl-2 (takie jak: Bcl-2, Bcl-XL), a także enzymy związane

z topologią, stabilizacją struktury przestrzennej, metabolizmem i naprawą kwa-

sów nukleinowych (m.in. PARP, topoizomerazy) (Jänicke i in., 1998; Kim i in.,

1999, 2000; Scovassi i Poirier, 1999; Wen i in., 1997). Powszechnie akceptowa-

ny jest pogląd, że aktywowana za pośrednictwem kaspaz efektorowych (głównie

kaspazy-3 i -7) topoizomeraza II uczestniczy we wstępnej fragmentacji DNA do


18

odcinków HMW i wiąże się z chromatyną w odstępach około 300 kpz. Z kolei,

lamin B – substrat kaspazy-6 – wiąże się wybiórczo z motywami DNA opisy-

wanymi jako regiony zasocjowane z macierzą jądrową (MAR; ang. matrix

attachment regions) w odstępach około 20-50 kpz. Natomiast histon H1, kolejny

substrat proteaz cysteinozależnych (kaspaz) i/lub serynowych, jest rozmieszczo-

ny w odstępach odpowiadających odcinkom o długości rzędu 180-220 pz (Ro-

bertson i in., 2000). Rozszczepienie proteolityczne topoizomerazy I i II pod

wpływem działania kaspaz wykonawczych przyczynia się do wstępnej fragmen-

tacji DNA jądrowego do odcinków o długości około 300 kpz. Postępująca

w późnej fazie zniszczenia komórki apoptotycznej degradacja DNA do odcin-

ków zawierających 20-50 kpz, które podlegają dalszej nukleolizie do fragmen-

tów będących wielokrotnością około 180-200 pz – tzw. LMW DNA, jest ściśle

uzależniona od biokatalitycznej funkcji endonukleaz jądrowych (m.in.

DFF40/CAD), uwarunkowanej aktywnością kaspaz efektorowych (Liu i in.,

1997; Robertson i in., 2000; Zhivotovsky i in., 1994). Fragmentacja DNA do-

prowadza do zmian struktury kompleksu chromatynowego, które mogą zwięk-

szać dostępność odcinków DNA na atak nukleolityczny. Cięcie wiązań fosfodie-

strowych jest dokonywane w ten sposób, że reszta fosforanowa pozostaje po

stronie 5’, zaś grupa hydroksylowa po stronie 3’ łańcucha DNA. Uwolnione

fragmenty DNA zakończone 3’-OH można łatwo zidentyfikować metodą

TUNEL (ang. terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end

labeling), w której stosuje się terminalną deoksynukleotydylotransferazę (TdT).

Ten unikatowy enzym nie wymaga do działania matrycy i wykazuje zdolność

wbudowywania znakowanych (np. barwnikiem fluoresceiną/izotiocyjanianem

fluoresceiny) nukleotydów (najczęściej dUTP; deoksyurydyno-5’-trifosforanu)

w miejscu pęknięcia DNA (Gavrieli i in., 1992; Otsuki, 2000). W kolejnym

etapie fazy destrukcyjnej apoptozy ma miejsce proces niezależnej bądź zależnej

od enzymatycznej funkcji kaspaz kondensacji sfragmentowanej chromatyny

jądrowej, za który odpowiedzialne są odpowiednio: białka AIF oraz Acinus.

W wyniku działania białka Acinus, chromatyna przyjmuje postać zbitych grudek

na obrzeżach jądra komórkowego (acinus − łac. winogrono, jagoda). Ostatnio

udowodniono, że kondensacja chromatyny jądrowej w komórkach apoptotycz-

nych zachodzi niezależnie bądź wyprzedza cięcie nukleolityczne DNA (Allera

i in., 1997; Huppertz i in., 1999; Robertson i in., 2000). Hendzel i in. (1998)

uzyskali wyniki wskazujące, że apoptotyczna kondensacja chromatyny jest

wynikiem utraty strukturalnej integralności jej samej oraz szkieletu jądrowego,

co umożliwia następczą agregację heterochromatyny i jej nukleolizę. Ostatecz-

nie dochodzi do przerwania ciągłości wewnętrznej i zewnętrznej błony otoczki

jądrowej i tworzenia ugrupowań porów jądrowych (ang. clustering), czemu

towarzyszy dezintegracja nukleo- i cytoszkieletu powodująca zmiany kształtu

jądra i komórki z ich następczym rozpadem (Kerr i in., 1995; Morishima, 1999).

W fazie zniszczenia komórki ulegają ogólnemu obkurczaniu w wyniku przeor-

ganizowania nukleo- i cytoszkieletu oraz przez wypompowywanie jonów (K+,

Cl-, organicznych osmolitów), co ułatwia ich pochłanianie przez sąsiadujące


19

komórki czy fagocyty (Bortner i Cidlowski, 1999; Huang i in., 1997). Pofałdo-

wana powierzchnia błony plazmatycznej komórek późnoapoptotycznych, która

tworzy liczne uwypuklenia, ulega w wielu miejscach przerwaniu, otaczając

fragmenty cytoplazmy i zagęszczonej chromatyny, a także prawie niezmienione

organelle (lizosomy, mitochondria). W ten sposób formowane są ciałka apopto-

tyczne. Struktury te są otoczone silnie utkaną błoną komórkową stabilizowaną

dzięki osłonie utworzonej przez aktywną transglutaminazę II (Fesus i in., 1996).

Uważa się, że czynnikiem „rozpoznawczym” umierających komórek jest m.in.

fosfatydyloseryna, eksponowana na ich powierzchni i rozpoznawana przez

receptor PSR (ang. phosphatidylserine receptor) makrofagów czy innych komó-

rek fagocytujących, przyczyniając się do szybkiego ich usuwania (Fadok i in.,

2000; Savill, 1998).

1.3. Strategie wykrywania symptomów śmierci apoptotycznej i ne-

krotycznej w komórkach

Spośród dostępnych obecnie metod analizy śmierci apoptotycznej i ne-

krotycznej na szczególną uwagę zasługują techniki mikroskopowe i cytome-

tryczne. Metody te są oparte na wykrywaniu zmian morfologii komórki, zmian

struktury chromatyny, procesów degradacji DNA, a także na detekcji zmian

struktury i funkcji transportowej błony komórkowej, zmian w aktywności orga-

nelli komórkowych, zmian w ekspresji genów, zmian w poziomie stężenia

białek strukturalnych, regulatorowych i biokatalitycznych oraz w aktywności

enzymów odgrywających zasadniczą rolę w szlakach metabolicznych apoptozy

i nekrozy (Darzynkiewicz i Traganos, 1998; Darzynkiewicz i in., 2001a). Zmia-

ny zachodzące w komórkach ulegających śmierci można analizować albo przy-

życiowo, albo po odpowiednim utrwaleniu. Przyżyciowo określa się zazwyczaj

integralność błony plazmatycznej, asymetryczne zmiany fosfolipidów zachodzą-

ce w błonie plazmatycznej, wewnątrzkomórkowe pH, poziom Ca2+

i innych

jonów, transbłonowy potencjał mitochondrialny (ΔΨm). Po utrwaleniu komórek

oznacza się m.in. zawartość DNA genomowego i fazę komórek w cyklu mito-

tycznym, fragmentację DNA i obecność pęknięć nici DNA, kondensację chro-

matyny, ekspresję protoonkogenów (bcl-2, bax, czy c-myc), czy genów supreso-

rów transformacji nowotworowej (p53), aktywację kaspaz wykrywanych immu-

nocytochemicznie, proteolityczne rozszczepianie cząsteczki PARP, a także

zmiany w morfologii jądra komórkowego (stopień jego fragmentacji) (McCarthy

i Evan, 1998; Otsuki, 2000; Stadelmann i Lassmann, 2000).

Rosnące zainteresowanie apoptozą komórek i mechanizmami regulacji

tego procesu sprawiło, że powstają coraz to nowsze metody wykrywania apop-

tozy, wśród których znaczącą większość stanowią metody fluorescencyjne. Brak

skutecznych procedur detekcji symptomów charakterystycznych dla fazy inicja-

torowej oraz wczesnej fazy efektorowej apoptozy stał się bodźcem do opraco-

wania nowych, alternatywnych metod pozwalających na stosunkowo wczesną


20

diagnostykę śmierci fizjologicznej. Cechą charakterystyczną wczesnych stadiów

apoptozy jest niewielka zmiana w przepuszczalności błony komórkowej. Mikro-

pory powstające w zewnętrznej warstwie plazmolemmy można identyfikować

przy wykorzystaniu fluorochromu YO-PRO-1 (Idziorek i in., 1995; Samiec

i Skrzyszowska, 2012a, 2013). Metodą pozwalającą również na relatywnie

wczesną diagnostykę apoptozy jest wykrywanie reszt fosfatydyloseryny na

powierzchni błony cytoplazmatycznej za pomocą aneksyny V sprzężonej

z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC, ang. fluorescein isothiocyanate; metoda

z reguły nieprzyżyciowa, często wymagająca utrwalania komórek) lub z biał-

kiem intensywnej zieleni fluorescencyjnej (eGFP, ang. enhanced green fluore-

scent protein; metoda przyżyciowa) (Martin i in., 1995a; Darzynkiewicz i in.,

2001b; Martínez i Freyssinet, 2001; Samiec i Skrzyszowska, 2013, 2014; Samiec

i in., 2013a; Skrzyszowska i in., 2006).

W czasie apoptozy zachodzi translokacja fosfatydyloseryny z po-

wierzchni wewnątrzkomórkowej na powierzchnię zewnątrzkomórkową. Anty-

koagulacyjne, niskocząsteczkowe białko amfitropowe – aneksyna V (o masie

molekularnej 35,8 kDa), w obecności jonów Ca2+

, łączy się preferencyjnie

z ujemnie naładowanymi fosfolipidami, takimi jak: fosfatydyloseryna, dzięki

czemu stosuje się ją jako marker apoptozy. Podczas apoptozy komórki reagują

z aneksyną V zaraz po rozpoczęciu kondensacji chromatyny, ale jeszcze przed

utratą zdolności błony do „wykluczania” jodku propidyny (PI; ang. propidium

iodide) (Blankenberg i in., 1999; Martin i in., 1996; Tait i in., 2006). Oznaczanie

eksponowanych na powierzchni plazmolemmy komórek reszt PS przy użyciu

aneksyny V sprzężonej np. z izotiocyjanianem fluoresceiny (ang. annexin V-

fluorescein isothiocyanate/FITC) oraz weryfikacja stopnia przepuszczalności

błony plazmatycznej dla PI, barwiącego DNA i RNA komórek o zaburzonej

integralności błony, umożliwia odróżnienie komórek żywych, nieapoptotycz-

nych (aneksyna V-FITC-/PI

-) od komórek wczesnoapoptotycznych (aneksyna V-

FITC+/PI

-) oraz komórek późnoapoptotycznych i nekrotycznych (aneksyna V-

FITC+/PI

+), a także od komórek martwych (aneksyna V-FITC

-/PI

+), uszkodzo-

nych w trakcie przygotowywania zawiesiny komórkowej do analizy. Wyznako-

wane koniugatem aneksyny V-FITC komórki, które emitują zieloną fluorescen-

cję i/lub komórki barwiące się jodkiem propidyny, które emitują czerwoną

fluorescencję, można analizować w cytometrze przepływowym i obserwować

w mikroskopie fluorescencyjnym (Fadok i in., 1993; Griffith i in., 1995; Martin

i in., 1996).

Analizując apoptozę i nekrozę, należy wziąć pod uwagę, iż czas trwania

śmierci komórkowej, począwszy od momentu zainicjowania do całkowitej

dezintegracji i „zniknięcia” komórki, może być różny. Również liczba obser-

wowanych komórek apoptotycznych i nekrotycznych może się różnić

w zależności od zastosowanej metody badawczej oraz przedziału czasowego

upływającego pomiędzy zainicjowaniem śmierci i jej analizą. Ogólnie przyjmuje

się, że apoptoza trwa krótko, najczęściej krócej niż mitoza. Wczesne etapy

apoptozy zachodzą zwykle między trzecią a ósmą godziną po wzbudzeniu


21

autodestrukcyjnej śmierci komórki. Identyfikacja komórek apoptotycznych

polega na określaniu pewnych charakterystycznych cech apoptozy, należy więc

brać pod uwagę moment pojawienia się i czas trwania pewnych zmian, niektóre

z nich są krótkotrwałe i przejściowe, a inne trwają dłużej (Denecker i in., 2001;

Kitanaka i Kuchino, 1999).

Jedną z cech umożliwiających odróżnienie komórek umierających od

komórek żywych jest stopniowa utrata funkcji transportowych i przerwanie

ciągłości monowarstw lipidowych błony komórkowej. Niezmieniona struktural-

nie i właściwie funkcjonująca błona plazmatyczna normalnych, żywych komó-

rek i błona komórek wczesnoapoptotycznych wykazują zdolność „wykluczania”

lub, innymi słowy, są nieprzepuszczalne dla dodatnio naładowanych cząsteczek

barwników, takich jak: błękit trypanu, jodek propidyny, jodek lub bromek

etydyny, monoazydek etydyny, czy D-7-aminoaktynomycyna. Z kolei, komórki

późnoapoptotyczne i komórki nekrotyczne w różnym stopniu wybarwiają się

tymi fluorochromami na skutek zahamowania zjawiska selektywnej przepusz-

czalności plazmolemmy dla wielu niskocząsteczkowych związków organicz-

nych (Baskić i in., 2006; Darzynkiewicz i Traganos, 1998).

Do monitorowania procesu apoptozy można wykorzystywać wiele me-

tod, które obejmują techniki umożliwiające diagnozowanie zarówno przebiegu

śmierci fizjologicznej w obrębie populacji komórek, jak i jej przebiegu

w obrębie pojedynczych komórek. Apoptozę można również analizować

w zależności od stadium procesu, przy czym badania związane z detekcją zmian

biochemicznych DNA są charakterystyczne dla późniejszych etapów (faza

efektorowa po przekroczeniu punktu nieodwracalności przez molekularne szlaki

przekaźnictwa sygnałów proapoptotycznych oraz faza destrukcyjna) (Otsuki,

2000; Stadelmann i Lassmann, 2000).

Analiza TUNEL, stosowana do identyfikacji międzynukleosomowych

pęknięć nici DNA w wyniku reakcji enzymatycznej z użyciem terminalnej

transferazy deoksynukleotydowej (TdT), katalizującej łączenie znakowanych

izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) nukleotydów z wolnymi końcami 3’-OH,

pozwala na wyróżnienie komórek późnoapoptotycznych w mikroskopie fluore-

scencyjnym. Z kolei, w wariancie immunofluorescencyjnym tej metody wyko-

rzystuje się terminalną deoksynukleotydową transferazę do przyłączania np.

trifosforanu bromodeoksyurydyny Br-dUTP do wolnego końca 3’-OH w miej-

scu pęknięcia nici DNA oraz przeciwciało anty-BrdU znakowane fluorochro-

mem FITC. Do określenia całkowitej zawartości komórkowego DNA używa się

jodku propidyny (Darzynkiewicz i in., 2001a; McCarthy i Evan, 1998).


22

2. CEL, UZASADNIENIE PODJĘCIA ORAZ ZAKRES BADAŃ

Celem przeprowadzonych badań było określenie częstości występowa-

nia biochemicznych i biofizycznych zmian apoptotycznych w błonie plazma-

tycznej komórek blastocyst świni rozwijających się z oocytów rekonstytuowa-

nych różnymi technikami klonowania somatycznego. Stosowane w procedurze

klonowania somatycznego inwazyjne metody rekonstrukcji oraz sztucznej

aktywacji oocytów mogą indukować procesy apoptozy w komórkach zarodków.

W przypadku rekonstrukcji oocytów przy wykorzystaniu metod elektrofuzji

kompleksów ooplast-komórka somatyczna lub doooplazmatycznej iniekcji

karioplastów lub całych komórek – dawców jąder, przyczyną śmierci apopto-

tycznej może być przejściowe naruszenie integralności błony plazmatycznej

i dezorganizacja sieci mikrofilamentów aktynowych membranoszkieletu oraz

cytoszkieletu strefy kortykalnej. Apoptoza może być również inicjowana

w wyniku transmisji przedwczesnego sygnału aktywacyjnego podczas zabiegu

wprowadzania jądra komórki somatycznej do środowiska cytoplazmatycznego

oocytu-biorcy. Natomiast w przypadku aktywacji rekonstytuowanych oocytów

przy użyciu czynników fizycznych (impulsy elektryczne) lub chemicznych

(antybiotyki jonoforowe takie jak: jonofor wapnia A23187/kalcymycyna lub

jonomycyna wapnia), bezpośrednim powodem uruchomienia programowanej

śmierci komórkowej może być drastyczne naruszenie homeostazy wapniowej

(izokalcemii) oocytu pod wpływem zjawiska ekscytotoksyczności jonów wap-

nia, indukowanego wszelkimi odchyleniami od oscylacyjnego sposobu wynu-

rzania się fal przyrostu jonów Ca2+

w cytoplazmie.

Dlatego też podjęto badania zmierzające do wyjaśnienia roli potencjal-

nie apoptogennych czynników, jakimi mogą być zarówno metody rekonstrukcji,

jak i sztucznej aktywacji oocytów, w inicjowaniu śmierci apoptotycznej

w komórkach blastocyst klonalnych świni.

Określenie roli metod rekonstrukcji i sztucznej aktywacji oocytów

w uruchomieniu procesów apoptozy w komórkach zarodków klonalnych świni

ma zatem decydujące znaczenie dla oceny ich potencjału rozwojowego zarówno

w przed-, jak i poimplantacyjnej fazie embriogenezy, a następnie fetogenezy.

Oszacowanie częstości występowania proapoptotycznych transformacji w błonie

plazmatycznej komórek węzła zarodkowego i/lub trofoblastu blastocyst klonal-

nych jest z kolei pośrednim wskaźnikiem kondycji strukturalno-funkcjonalnej

(jakości biochemicznej i biofizycznej) przedimplantacyjnych zarodków. Zasto-

sowane metody przyżyciowego wykrywania biochemicznych i biofizycznych


23

symptomów śmierci apoptotycznej komórek w blastocystach klonalnych,

z użyciem markerów testowych: aneksyny V sprzężonej z białkiem eGFP oraz

YO-PRO-1, zostały po raz pierwszy wykorzystane w badaniach nad klonowa-

niem somatycznym świń. Te metody diagnostyczne pozwalają na oznaczanie

takich objawów apoptozy, jak: 1. eksternalizacja reszt fosfatydyloseryny na

powierzchni plazmolemmy, 2. utrata asymetrii składu aminofosfolipidowego

i formowanie mikroporów/mikrokanałów w dwuwarstwie lipidowej błony

plazmatycznej oraz 3. powstawanie megakanałów („dziur lipidowych”)

w błonach mitochondrialnych. Niski stopień inwazyjności przyżyciowych metod

analizy fluorycytochemicznej komórek blastocyst klonalnych zwiększa ich

wartość aplikacyjną w ocenie jakości morfologicznej, biochemicznej i biofi-

zycznej zarodków w tej fazie rozwoju przedimplantacyjnego. Metody te mogą

mieć więc duże znaczenie dla prognozowania poimplantacyjnych zdolności

rozwojowych zarodków klonalnych świni, ze względu na możliwość dokonywa-

nia selekcji blastocyst o wysokiej kondycji strukturalno-funkcjonalnej, która

wynika z braku obecności komórek apoptotycznych lub z ich niewielkiego

udziału w całkowitej liczbie komórek zarodkowych (tj. niskiej wartości indeksu

apoptotycznego).

Zmiany proapoptotyczne w komórkach hodowanych in vitro zarodków

ssaków prowadzą do obniżenia ich jakości i przedimplantacyjnego potencjału

rozwojowego. Efektem końcowym podjętego kierunku badań było zatem wska-

zanie powodów niskiej efektywności klonowania somatycznego świń i innych

gatunków ssaków. To z kolei wymusiło potrzebę poszukiwania sposobów opty-

malizacji metod rekonstrukcji i sztucznej aktywacji oocytów, co przyczyniło się

do zwiększenia zarówno jakości, jak i zdolności rozwojowych zarodków klonal-

nych.

W ramach realizacji badań wyprowadzone zostały linie klonalne (szcze-

py komórkowe) fibroblastów z fragmentów tkanki skórno-powłokowej doro-

słych osobników (loch i knurów), a także płodów. Przed wykorzystaniem

w procedurze klonowania somatycznego, linie komórek fibroblastycznych, które

hodowano in vitro do osiągnięcia stanu pełnej konfluencji, poddawane były

synchronizacji cyklu mitotycznego w fazach G1/G0 metodą inhibicji kontakto-

wej migracji i proliferacyjnego wzrostu. Oocyty pozyskiwane z jajników loszek

lub loch rzeźnych hodowane były in vitro na potrzeby klonowania somatyczne-

go, aż do osiągnięcia stanu dojrzałości jądrowej i cytoplazmatycznej w stadium

metafazy II podziału mejotycznego. Schemat pierwszej serii doświadczeń obej-

mował uzyskiwanie zarodków klonalnych świni z dojrzałych in vitro oocytów

zrekonstruowanych metodą elektrofuzji kompleksów ooplast-komórka soma-

tyczna. Z kolei, do stymulacji zarodkowego programu rozwojowego zrekonsty-

tuowanych w wyniku elektrofuzji oocytów (cybryd klonalnych) zastosowano

trzy protokoły sztucznej aktywacji: 1. jednoczesnej fuzji i aktywacji fizycznej

(elektrycznej), 2. sekwencyjnej aktywacji fizykochemicznej oraz 3. pseudofizjo-

logicznej/biologicznej post-aktywacji transkomplementarnej (transcytoplazma-

tycznej; oryginalna, nowatorska strategia) (Samiec i Skrzyszowska, 2014; Sa-


24

miec i in., 2012). W kolejnej serii doświadczeń, do rekonstrukcji enukleowanych

oocytów wykorzystano metodę docytoplazmatycznej iniekcji karioplastów lub

całych komórek-dawców jąder. Sztuczna stymulacja rozwoju zarodkowego

cybryd klonalnych, które zrekonstytuowano w następstwie bezpośredniej mikro-

iniekcji całych komórek fibroblastycznych lub wyizolowanych z nich kariopla-

stów, przeprowadzona była w wyniku użycia trzech protokołów doświadczal-

nych: 1. opóźnionej aktywacji (post-aktywacji) ele-ktrycznej, 2. sekwencyjnej

aktywacji fizykochemicznej oraz 3. pseudofizjologicznej post-aktywacji tran-

skomplementarnej (Samiec i Skrzyszowska, 2014; Samiec i in., 2012). Ponadto,

uzyskane w wyniku hodowli in vitro zarodków klonalnych blastocysty oceniane

były przyżyciowo w kierunku wykrywania symptomów śmierci apoptotycznej

przy wykorzystaniu metod analizy fluorycytochemicznej (za pośrednictwem

koniugatu diagnostycznego aneksyny V-eGFP oraz fluorochromu YO-PRO-1).

Równocześnie, przeprowadzana była przyżyciowo ilościowa analiza kondycji

strukturalnej (jakości morfologicznej) uzyskanych blastocyst klonalnych na

podstawie całkowitej liczby komórek zarodkowych (sumarycznej liczby komó-

rek węzła zarodkowego i komórek trofoektodermalnych).


25

3. METODYKA BADAŃ

3.1. Uzyskiwanie zarodków świni technikami klonowania somatycznego

3.1.1. Pozyskiwanie i dojrzewanie mejotyczne in vitro oocytów-biorców

egzogennych jąder komórkowych

Źródłem oocytów były jajniki loszek i loch uzyskiwane w lokalnej rzeź-

ni. Niedojrzałe oocyty świni (w stadium pęcherzyka zarodkowego/GV; ang.

germinal vesicle, czyli diktiotenu profazy I podziału mejotycznego) pozyskiwa-

ne były metodą aspiracji z antralnych pęcherzyków jajnikowych o średnicy 2−6

mm. Ocena jakości oocytów dokonywana była na podstawie obecności i wyglą-

du otaczających je komórek wzgórka jajonośnego oraz stanu morfologicznego

cytoplazmy. Do oocytów morfologicznie prawidłowych, tj. przydatnych do

hodowli in vitro, były zaliczane oocyty otoczone dużym kompleksem komórek

wzgórka jajonośnego, złożonym minimum z trzech zwartych warstw, przylega-

jących ściśle zarówno do siebie, jak i do wieńca promienistego oraz posiadające

ciemno zabarwioną, jednolicie granulowaną cytoplazmę, niewykazującą zmian

degeneracyjnych (nekrotycznych lub apoptotycznych). Wyselekcjonowane do

dojrzewania mejotycznego (IVM; ang. in vitro maturation) oocyty hodowane

były w 500 µL pożywki, która sporządzona była na bazie zbuforowanej 25 mM

L-1

kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N’-2-etanosulfonowego (HEPES)

i 26,2 mM L-1

NaHCO3 pożywki TCM-199 (ang. Tissue Culture Medium-199;

Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis; MO, USA). Hodowla oocytów prze-

prowadzana była w inkubatorze o ściśle określonych warunkach termiczno-

atmosferycznych (39C, 5% CO2 w powietrzu, maksymalna wilgotność względ-

na). Pożywka do IVM, którą nawarstwiono lekkim olejem mineralnym, uzupeł-

niona była 1 mM L-1

cyklicznego dibutyryloadenozynomonofosforanu (dwuma-

ślan cAMP/bukladezyna; db-cAMP; Sigma-Aldrich) oraz mieszaniną 10 IU

mL-1

gonadotropiny kosmówkowej źrebnych klaczy (eCG/PMSG; Sigma-

Aldrich) i 10 IU mL-1

ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG; Sigma-

Aldrich). Ponadto pożywka hodowlana wzbogacona była dodatkiem 4 mg mL-1

frakcji V albuminy surowicy bydlęcej (BSA-V; Sigma-Aldrich), 10% płynu

wyizolowanego z antralnych pęcherzyków jajnikowych świni (pFF), 0,6 mM L-1

L-cysteiny (Sigma-Aldrich) oraz 10 ng mL-1

rekombinowanego epidermalnego

czynnika wzrostowego człowieka (rhEGF; Sigma-Aldrich). Po około 20 godzi-

nach hodowli oocyty były przenoszone do tej samej pożywki, lecz pozbawionej


26

db-cAMP oraz liofilizowanych dodatków hormonalnych (eCG/PMSG i hCG).

W tych warunkach fizykochemicznych oocyty były hodowane in vitro przez

kolejne 22−24 godziny, aż do czasu osiągnięcia dojrzałości jądrowej i cytopla-

zmatycznej. Dojrzałe in vitro oocyty z wyraźnie wyodrębnionymi ciałkami

kierunkowymi (polocytami) I rzędu i jednolicie granulowaną cytoplazmą, nie-

wykazującą symptomów pronekrotycznych lub proapoptotycznych, stanowiły

źródło biorców dla jąder komórek somatycznych (fibroblastycznych) (Samiec

i Skrzyszowska, 2010a, 2014).

3.1.2. Wyprowadzenie linii komórek fibroblastycznych z tkanki skórno-

powłokowej dorosłych osobników lub płodów

Źródłem dawców jąder komórkowych w procedurze klonowania soma-

tycznego były fibroblasty pochodzenia skórnego dorosłych osobników lub

płodów (Samiec i Skrzyszowska, 2012a; Samiec i in., 2013a, b; Skrzyszowska

i in., 2008). Pierwotne hodowle komórkowe wyprowadzane były z izolowanych

fragmentów dermalnej tkanki usznej dojrzałych płciowo loszek/loch i knurów,

a także z bioptatów tkankowych układu skórno-powłokowego płodów. Eksplan-

ty tkankowe poddawane były dezagregacji mechanicznej, a następnie drobne

skrawki tkanki skórno-powłokowej były trypsynizowane w celu rozproszenia

komórek. Hodowle komórkowe prowadzone były w podstawowej pożywce

Eagle’a w modyfikacji Dulbecco (DMEM; ang. Dulbecco’s Modified Eagle’s

Medium; Sigma-Aldrich). Pożywka DMEM wzbogacona była dodatkiem 10%

surowicy płodów bydlęcych (FBS; ang. foetal bovine serum; Sigma-Aldrich),

5 ng mL-1

rekombinowanego zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów czło-

wieka (rh-bFGF; Sigma-Aldrich) i 2 mM L-1

mieszaniny aminokwasów endo-

gennych (NEAA; Sigma-Aldrich). Ponadto, uzupełniona ona była 2 mM L-1

L-

glutaminy (Sigma-Aldrich), 0,4 mM L-1

pirogronianu sodu (Sigma-Aldrich) oraz

1% mieszaniny antybiotyków i mykostatyków (AAS; Sigma-Aldrich). Hodowa-

ne komórki były pasażowane po zagęszczeniu do stanu pełnej konfluencji.

Wyprowadzone linie klonalne (szczepy) komórek były zamrażane w ciekłym

azocie. Po rozmrożeniu komórki danej subpopulacji były hodowane in vitro do

osiągnięcia stanu pełnej konfluencji. W stanie 100% konfluencji szczepy ko-

mórkowe podlegały 24−72-godzinnej inhibicji kontaktowej migracji i prolifera-

cyjnego wzrostu, w celu synchronizacji cyklu mitotycznego fibroblastów

w fazach G1/G0 przed wykorzystaniem ich jako dawców jąder w procedurze

klonowania. Do klonowania somatycznego użyte były linie nieapoptotycz-

nych/nienekrotycznych (tj. YO-PRO-1-negatywnych i/lub aneksynoujemnych)

komórek fibroblastycznych, pochodzące z wczesnych (2-6) pasaży (Samiec

i Skrzyszowska, 2012a, 2013; Samiec i in., 2013a; Skrzyszowska i in., 2006). Na

potrzeby zabiegu klonowania poszczególne subpopulacje komórkowe fibrobla-

stów były trypsynizowane i wirowane, w celu uzyskania zawiesiny pojedyn-

czych komórek.


27

3.1.3. Przyżyciowa diagnostyka fluorescencyjna komórek-dawców ją-

der pod kątem zmian wczesnoapoptotycznych

3.1.3.1. Przygotowanie komórek somatycznych do analizy w kierunku

apoptozy

Około 40−50 minut przed zabiegiem klonowania somatycznego, subpo-

pulacje hodowanych do stanu pełnej konfluencji fibroblastów, których cykl

komórkowy został zsynchronizowany w stadiach G1/G0 w wyniku inhibicji

kontaktowej migracji i proliferacyjnego wzrostu, poddawano standardowej

trypsynizacji. Następnie uzyskane po energicznym pipetowaniu zawiesiny

komórkowe w roztworze TCM-199/HEPES (Sigma-Aldrich) uzupełnionym

10% FBS były przenoszone do konikalnych probówek wirówkowych i wirowa-

ne w temperaturze pokojowej, ze względnym przyśpieszeniem odśrodkowym

300 × g (odpowiadającym prędkości kołowej ω rzędu 246 obrotów/minutę)

przez 10 minut. Po odwirowaniu próbek fibroblastów supernatant był zdekanto-

wany. Natomiast w celu sporządzenia zawiesiny pojedynczych komórek przez

wielokrotne pipetowanie i jej rozcieńczenia do uzyskania gęstości rzędu 1 × 105

do 1 × 106 komórek w przeliczeniu na 1 mL objętości płynu, zsedymentowany

na dnie probówki wirówkowej osad komórkowy był przemywany 1 mL medium

do manipulacji komórek somatycznych w warunkach atmosferycznych TCM-

199/HEPES/BSA-V lub 1 mL diagnostycznego roztworu buforującego (Becton,

Dickinson and Co., BD Biosciences; CLONTECH Laboratories, Inc., East

Meadow Circle, Palo Alto, CA, USA).

W celu rozpoznania ultrastrukturalnych i cytobiochemicznych sympto-

mów wczesnej apoptozy, komórki fibroblastyczne, które stanowiły źródło daw-

ców jąder komórkowych w procedurze klonowania somatycznego, poddawane

były przyżyciowej diagnostyce fluorescencyjnej z wykorzystaniem jednego

z dwóch markerów testowych:

1) żółto-zielonego fluorochromu DNA YO-PRO-1 w rozpuszczalniku organicz-

nym DMSO – w stosunku objętościowym 1 μL roztworu diagnostycz-

nego (VybrantTM

Apoptosis Assay Kit 4; Molecular Probes, Eugene,

Oregon, USA), o stężeniu 100 μM L-1

DMSO, do 1 mL zawiesiny ko-

mórek w pożywce TCM-199/HEPES/BSA-V;

2) aneksyny V sprzężonej z białkiem intensywnej zieleni fluorescencyjnej

(eGFP; białko fluorygeniczne wyizolowane z meduzy stułbiopława

Aequorea victoria) – w stosunku objętościowym 5 μL koniugatu diagno-

stycznego (ApoAlertTM

Annexin V-EGFP Apoptosis Kit; Becton, Dic-

kinson and Co., BD Biosciences; CLONTECH Laboratories, Inc., East

Meadow Circle, Palo Alto, CA, USA) [ApoAlertTM

Apo 2.7/Annexin V-

EGFP Kit; CLONTECHniques], o stężeniu 40 μg mL-1

roztworu PBS, do

200 μL 1 × stężonego buforu wiążącego nadmiar nieprzyłączonych pre-

ferencyjnie do ujemnie naładowanych reszt fosfatydyloseryny (PS) czą-

steczek reagentu aneksyny V-eGFP. Diagnostyczny roztwór buforujący

(bufor reakcyjny) o słabym odczynie alkalicznym (pH 7,4) stanowił


28

mieszaninę 10 mM L-1

hydroksysoli sodowej kwasu N-2-hydroksy-

etylopiperazyno-N’-2-etanosulfonowego (N-2-hydroksyetylopiperazy-

no-N’-2-etanohydroksysulfonian sodu; HEPES/NaOH; C16H35N4NaO8S2),

140 mM L-1

chlorku sodu (NaCl), 2 mM L-1

chlorku wapnia (CaCl2), 5

mM L-1

chlorku potasu (KCl) oraz 1 mM L-1

chlorku magnezu (MgCl2).

W przypadku znakowania DNA genomowego komórek fluorochromem

YO-PRO-1, fibroblasty płodowe lub fibroblasty tkanki skórnej dorosłych osob-

ników były inkubowane w roztworze barwiącym przez 15−20 minut, w warun-

kach atmosferycznych, w temperaturze pokojowej, przy całkowitym braku

światła dziennego/białego (sztucznego i/lub naturalnego) (Samiec i Skrzyszow-

ska, 2012a, 2013). Z kolei, w przypadku znakowania reszt PS błony cytoplazma-

tycznej komórek koniugatem aneksyny V oraz fluorygenicznego białka eGFP,

fibroblasty były inkubowane w roztworze barwiącym przez 5−15 minut,

w warunkach atmosferycznych, w temperaturze pokojowej (Samiec i Skrzy-

szowska, 2013, Samiec i in., 2013a; Skrzyszowska i in., 2006). Od momentu

umieszczenia komórek w roztworze barwiącym wszystkie czynności należy

wykonywać w ciemności.

3.1.3.2. Fluorescencyjna detekcja apoptozy w komórkach fibrobla-

stycznych

Po wzbudzeniu (ekscytancji) kompleksów YO-PRO-1-DNA (fot. 1B,

2B) lub aneksyną V-eGFP-PS (fot. 3B, 4B) spolaryzowanym niebieskim pa-

smem falowym światła białego (o maksymalnej długości fali absorpcyjnej, czyli

wzbudzającej λab/max=488 nm) w mikroskopie epi-fluorescencyjnym, analizowa-

no 60 reprezentatywnych próbek losowych z różnych subpopulacji wybarwio-

nych komórek fibroblastycznych, obserwując i oceniając poziom emitowanej

przez apoptotyczne lub nekrotyczne komórki żółto-zielonej lub zielonej bioche-

miluminescencji (przy maksymalnym zakresie długości wysyłanej fali świetlnej

λem/max=530 nm).

3.1.4. Ocena morfologiczna komórek-dawców jąder na podstawie cech

charakterystycznych dla późnej apoptozy lub nekrozy (martwicy)

Pozytywna selekcja nieapoptotycznych/nienekrotycznych komórek

przeznaczonych na dawców jąder komórkowych w procedurze klonowania

(ryc. 2) była prowadzona w komorze do mikromanipulacji nie tylko w oparciu

o cytochemiczne metody fluorescencyjnego wykrywania oznak wczesnoapopto-

tycznych lub nekrotycznych w błonie cytoplazmatycznej, lecz także w oparciu

o przyjęte kryteria morfologiczne, umożliwiające detekcję zewnętrznych zmian

strukturalnych błony cytoplazmatycznej oraz zmian biofizycznych cytoplazmy

towarzyszących molekularnemu scenariuszowi apoptozy lub nekrozy. Elimino-

wane były zatem komórki martwe, czyli uszkodzone w trakcie ich trypsynizacji

i/lub późniejszego przygotowywania do analizy fluorescencyjnej, a także ko-


29

mórki wykazujące: 1) martwicze lub 2) późnoapoptotyczne symptomy morfolo-

giczne, a wśród nich, odpowiednio: 1) komórki wykazujące takie zmiany dege-

neracyjne w obrębie cytoplazmy jak np. wakuolizacja, brak homogenności

cytozolu, niejednolite lecz spolaryzowane rozmieszczenie ziarnistości cytopla-

zmatycznych, komórki pyknotyczne, czyli z objawami osmotycznego pęcznienia

cytoplazmy i organelli wewnątrzkomórkowych lub 2) komórki obkurczone,

niemające kształtu sferycznego i posiadające pofałdowaną powierzchnię pla-

zmolemmy, pokrytą licznymi strukturami pęcherzyko-podobnymi (ang. bleb-

bing), powstającymi w wyniku biodegradacji membranoszkieletu i cytoszkieletu

oraz komórki ulegające fragmentacji na tzw. ciałka apoptotyczne (fot. 1A, 2A,

3A, 4A)

Fot. 1A. Ocena morfologiczna znakowanych fluorochromem YO-PRO-1, konfluentnych

fibroblastów płodowych świni – dawców jąder w procedurze klonowania somatycznego pod

kątem detekcji symptomów apoptozy lub nekrozy. 1 – komórka późnoapoptotyczna

(obkurczona, z pofałdowaną powierzchnią plazmolemmy); 2 – komórka nekrotyczna

(pyknotyczna, z objawami osmotycznego pęcznienia i wakuolizacji cytoplazmy). Obraz

rzeczywisty, odwrócony w mikroskopie epi-fluorescencyjnym, w świetle białym

(powiększenie: ×200)


30

Fot. 1B. Przyżyciowa analiza fluorescencyjna fibroblastów płodowych, poddanych barwieniu

fluorochromem YO-PRO-1. YO-PRO-1-pozytywne komórki apoptotyczne lub nekrotyczne

emitują zółto-zieloną chemiluminescencję po wzbudzeniu kompleksów YO-PRO-1-DNA

niebieskim pasmem falowym światła białego (powiększenie: ×200)

Fot. 2A. Ocena morfologiczna barwionych fluorochromem YO-PRO-1, konfluentnych

fibroblastów tkanki skórnej ucha dojrzałej płciowo loszki pod kątem detekcji oznak

proapoptotycznych lub pronekrotycznych. 1 – komórka późnoapoptotyczna (obkurczona,

z pofałdowaną powierzchnią plazmolemmy); 2 – komórka nekrotyczna (pyknotyczna,

z objawami osmotycznego pęcznienia i wakuolizacji cytoplazmy). Obraz rzeczywisty,

odwrócony w mikroskopie epi-fluorescencyjnym, w świetle białym (powiększenie: ×200)


31

Fot. 2B. Analiza fluorycytochemiczna fibroblastów skóry loszki, poddanych barwieniu

fluorochromem YO-PRO-1. YO-PRO-1-pozytywne komórki apoptotyczne lub nekrotyczne

fluoryzują na żółto-zielono po absorpcji przez kompleksy YO-PRO-1-DNA światła niebie-

skiego (powiększenie: ×200)

Fot. 3A. Ocena morfologiczna znakowanych aneksyną V-eGFP, konfluentnych fibroblastów

płodowych świni – dawców jąder w procedurze klonowania somatycznego pod kątem

wykrywania symptomów śmierci apoptotycznej lub śmierci nekrotycznej (martwiczej). 1 –

komórka późnoapoptotyczna (obkurczona, z pofałdowaną powierzchnią oraz pęcherzykowa-

tością plazmolemmy); 2 – komórka nekrotyczna (pyknotyczna, z objawami osmotycznego

pęcznienia i wakuolizacji cytoplazmy). Obraz rzeczywisty, odwrócony w mikroskopie epi-

fluorescencyjnym, w świetle białym (powiększenie: ×200)


32

Fot. 3B. Przyżyciowa analiza fluorescencyjna fibroblastów płodowych, poddanych

znakowaniu aneksyną V-eGFP. Aneksynododatnie komórki apoptotyczne lub nekrotyczne

emitują zieloną chemiluminescencję po wzbudzeniu kompleksów eGFP-aneksyna V-PS

spolaryzowanym pasmem niebieskim światła białego (powiększenie: ×200)

Fot. 4A. Ocena morfologiczna znakowanych aneksyną V-eGFP, konfluentnych fibroblastów

tkanki skórnej ucha lochy pod kątem detekcji proapoptotycznych lub pronekrotycznych

zmian w błonie plazmatycznej i cytozolu. 1 – komórka późnoapoptotyczna (obkurczona,

z pofałdowaną powierzchnią plazmolemmy); w analizowanej próbce losowej nie stwierdzono

obecności komórek nekrotycznych. Obraz rzeczywisty, odwrócony w mikroskopie epi-

fluorescencyjnym, w świetle białym (powiększenie: ×200)


33

Fot. 4B. Analiza fluorycytochemiczna fibroblastów skóry lochy, poddanych znakowaniu

koniugatem aneksyny V-eGFP. Aneksynododatnie komórki apoptotyczne (na podstawie

oceny morfologicznej stwierdzono brak obecności komórek nekrotycznych) fluoryzują na

zielono po absorpcji niebieskiego widma światła widzialnego (powiększenie: ×200)

3.1.5. Enukleacja (wyjądrzanie) oocytów

Wyselekcjonowane do procedury klonowania somatycznego oocyty

poddawano zabiegowi usunięcia DNA genomowego (ryc. 2) przy wykorzystaniu

dwóch metod enukleacji: mikrochirurgicznej „ślepej” (mechaniczna eliminacja

chromosomów matecznych bez ich fluorescencyjnego wybarwiania) (fot. 6A)

lub mikrochirurgicznej wspomaganej chemicznie (ryc. 1, fot. 5A, B, C).

3.1.5.1. Enukleacja mikrochirurgiczna „ślepa”

Bezpośrednio przed zabiegiem enukleacji dojrzałe in vitro oocyty były

inkubowane w temperaturze 39C, przez 15−20 minut, w pożywce TCM-

199/HEPES z dodatkiem 4 mg mL-1

BSA-V, uzupełnionej 7,5 μg mL-1

cytocha-

lazyny B (CB; Sigma-Aldrich). Cytochalazyna B jest mykotoksyną wyizolowa-

ną z Helminthosporium dermatoideum o wysokim współczynniku przenikalności

przez błonę plazmatyczną komórek Eucaryota, która stosowana jest powszech-

nie jako odwracalny inhibitor polimeryzacji monomerycznej (globularnej) formy

aktyny do postaci fibrylarnej, formującej mikrofilamenty cytoszkieletu i mem-

branoszkieletu. Dlatego też stanowi ona czynnik indukujący przejściową relak-

sację cyto- i membranoszkieletu operowanego oocytu, która prowadzi z kolei do

zwiększenia stopnia elastyczności plazmolemmy komórki-biorcy egzogennego

DNA jądrowego oraz stopnia jej oporności na odkształcenia mechaniczne,


34

spowodowane penetracją ooplazmy przez szklane mikroinstrumenty. Po wstęp-

nej ekspozycji na działanie cytochalazyny B, oocyty były przenoszone do komo-

ry wypełnionej roztworem TCM-199/HEPES z dodatkiem 4 mg mL-1

BSA-V

oraz 7,5 g mL-1

CB, w której dokonywane były mikromanipulacje. Wszystkie

zabiegi z zakresu genetycznej inżynierii embrionalnej przeprowadzane były przy

wykorzystaniu zestawu mikromanipulatorów firmy Leitz (Ernst Leitz Wetzlar

GmbH, Niemcy), sprzężonego z epi-fluorescencyjnym mikroskopem odwróco-

nym firmy Olympus IMT-2 (Tokyo, Japonia). Wyposażenie mikroskopu obej-

mowało: 1. płytkę grzejną (temp. 39C); 2. kontrastowo-fazowy system optycz-

ny Nomarskiego (tzw. kontrast dyferencyjno-interferencyjny; DIC, ang. diffe-

rential interference contrast); 3. przystawkę fluorescencyjną ze zwierciadłem

dichroicznym/dychromatycznym oraz 4. układ szeregowy/blok filtrów optycz-

nych UV-2A dla widma nadfioletowego światła widzialnego (zakres długości

fali wzbudzającej/absorpcyjnej wahający się od λmin=330 nm do λmax=380 nm)

i dla niebieskiego pasma falowego światła białego (zakres długości fali wzbu-

dzającej od λmin=420 nm do λmax=488 nm). Na prawym ramieniu mikromanipu-

latora zamontowana była pipeta przytrzymująca oocyty (ang. holding pipette),

w której wielkość podciśnienia lub ciśnienia dodatniego regulowana była stru-

mieniem powietrza, generowanym przez manualną mikropompkę pneumatyczną

(CellTram Air System; Eppendorf, Molecular Technologies; Vision Park, Hi-

ston, Cambridge, Wielka Brytania). Na przeciwnym ramieniu mikromanipulato-

ra umocowana była dwufunkcyjna pipeta manipulacyjna (enukleacyjna oraz

iniekcyjna), w której poziom ciśnienia ujemnego lub dodatniego kontrolowany

był strumieniem cieczy (lekkiego oleju mineralnego), generowanym przez

ręczną mikropompkę hydrauliczną (CellTram Oil System; Eppendorf, Molecular

Technologies; Vision Park, Histon, Cambridge, Wielka Brytania). W mikrosko-

pie odwróconym weryfikowany był ostatecznie stan dojrzałości jądrowej

i cytoplazmatycznej wyselekcjonowanych uprzednio oocytów (wstępna selekcja

w mikroskopie stereoskopowym) i usuwane były obserwowane sporadycznie

oocyty z prześwitującym przez ziarnistości cytoplazmatyczne pęcherzykiem

zarodkowym (GV; ang. germinal vesicle). Unieruchomione przy pomocy pipety

przytrzymującej oocyty poddawane były mikrochirurgicznemu zabiegowi elimi-

nacji chromosomów ułożonych w płytce metafazowej wrzeciona II podziału

mejotycznego. Pipeta enukleacyjna wprowadzana była pod osłonkę przejrzystą

oocytu, a następnie metodą aspiracji usuwane było ciałko kierunkowe I rzędu

wraz z fragmentem przylegającej cytoplazmy (maksymalnie do ok. 10–20%

objętości oocytu), zawierającym chromosomy metafazowe (fot. 6A, B).

3.1.5.2. Wspomagana chemicznie enukleacja mikrochirurgiczna oocytów

Przed zabiegiem eliminacji chromosomów matczynych (enukleacji),

uwolnione z komórek wzgórka jajonośnego, dojrzałe in vitro oocyty były inku-

bowane przez 1 godzinę w wolnej od jonów Ca2+

pożywce TCM-199/HEPES

uzupełnionej 4 mg mL-1

BSA-V oraz mieszaniną 0,4 µg mL-1

demekolcy-

ny/kolcemidu (DMCC; inhibitor polimeryzacji mikrotubuli wrzeciona kariokine-


35

tycznego; Sigma-Aldrich) oraz 0,05 M L-1

sacharozy (osmotycznie czynny

disacharyd indukujący wzrost objętości przestrzeni okołożółtkowej; Sigma-

Aldrich). Następnie oocyty z wyraźnie widocznym w przejściowo powiększonej

przestrzeni okołożółtkowej stożkowatym uwypukleniem plazmolemmy, które

zostało uformowane w pobliżu I ciałka kierunkowego w następstwie oddziały-

wania DMCC i sacharozy (fot. 5A, B), były przenoszone z roztworu hiperosmo-

tycznego do komory mikromanipulacyjnej, wypełnionej izotonicznym roztwo-

rem pożywki TCM-199/HEPES z dodatkiem 4 mg mL-1

BSA-V oraz 7,5 µg mL-

1 CB. Niewielki fragment cytoplazmy oocytu (charakterystyczny „stożek” oopla-

zmatyczny), do którego nastąpiło indukowane chemicznie (za pośrednictwem

DMCC) przemieszczenie płytki metafazowej wrzeciona II podziału mejotyczne-

go, był usuwany mikrochirurgicznie wraz z polocytem I rzędu za pomocą pipety

enukleacyjnej (mechaniczne oderwanie mostka cytoplazmatycznego pod wpły-

wem indukowanego podciśnienia) (Samiec i Skrzyszowska, 2012b; Samiec i in.,

2012; Samiec i in., 2015) (ryc. 1, fot. 5C).

Ryc. 1. Schemat enukleacji dojrzałego mejotycznie oocytu (w stadium metafazy II; MII) przy

zastosowaniu wspomaganej chemicznie metody mikrochirurgicznej. Zabieg eliminacji

powstałego w wyniku działania demekolcyny i sacharozy stożka ooplazmatycznego, zawiera-

jącego zespół silnie skondensowanych chromosomów metafazowych, przy użyciu pipety

enukleacyjnej

3.1.6. Rekonstrukcja enukleowanych oocytów (transplantacja jąder

komórek somatycznych do enukleowanych oocytów)

Przygotowana wcześniej zawiesina pojedynczych komórek fibrobla-

stycznych umieszczana była w komorze do mikromanipulacji, wypełnionej

pożywką TCM-199/HEPES z dodatkiem 4 mg mL-1

BSA-V i 7,5 µg mL-1

CB.

Do zabiegu transplantacji jąder komórkowych wybierane były nieapoptotycz-

ne/nienekrotyczne (tj. YO-PRO-1-negatywne i/lub aneksynoujemne) komórki


36

fibroblastyczne o średnicy wahającej się od 10 do 20 m, posiadające sferyczny

kształt oraz gładką, niepofałdowaną błonę cytoplazmatyczną (fot. 7).

W doświadczeniach zastosowane były dwie metody rekonstrukcji oocy-

tów z jąder nieapoptotycznych/nienekrotycznych komórek fibroblastycznych.

W pierwszej metodzie enukleowane oocyty (ooplasty) świni rekonstruowane

były przy wykorzystaniu techniki fuzji indukowanej impulsami prądu stałego

(elektrofuzja). Wyselekcjonowane, pojedyncze komórki fibroblastyczne wpro-

wadzane były do przestrzeni okołożółtkowej ooplastów (przez tę samą szczelinę

w osłonce przejrzystej, którą wydrążono w czasie enukleacji oraz przy wykorzy-

staniu tej samej pipety manipulacyjnej, jak w przypadku enukleacji) (ryc. 2, fot.

8A, B). W czasie zabiegu iniekcji komórki somatycznej pod osłonkę przejrzystą

enukleowanego oocytu zwracano szczególną uwagę na to, aby zdeponowana

w przestrzeni okołożółtkowej komórka fibroblastyczna, zaklinowana między

osłonką przejrzystą a oolemmą, ściśle przylegała do zewnętrznej powierzchni

błony cytoplazmatycznej ooplastu (fot. 8C).

Uzyskane kompleksy cytoplastów/ooplastów oraz komórek-dawców ją-

der były przemywane w 500 μL mieszaniny pożywki TCM-199/HEPES/BSA-V

oraz izotonicznego roztworu dielektryku w stosunku objętościowym 1:1,

a następnie ekwilibrowane w temperaturze 39C, przez 1−2 minuty, w czystym

roztworze dielektryku, stanowiącym właściwe medium do elektrofuzji. Różnice

w czasie przeprowadzania aktywacji zrekonstruowanych oocytów względem

zabiegu fuzji elektrycznej ooplastów i komórek-dawców jąder determinowały

skład chemiczny tego medium. W przypadku eksperymentalnego protokołu

jednoczesnej fuzji i aktywacji elektrycznej (FE/AE) roztwór o wysokim współ-

czynniku przenikalności dielektrycznej był sporządzany na bazie 0,3 M D-

mannitolu (osmolarność rzędu 280 mOsm; Sigma-Aldrich) uzupełnionego 1,0

mM L-1

chlorku wapnia (CaCl2; Sigma-Aldrich), 0,1 mM L-1

siarczanu (VI)

magnezu (MgSO4; Sigma-Aldrich) oraz 0,2 mg mL-1

wolnej od kwasów tłusz-

czowych frakcji albuminy surowicy bydlęcej (FAF-BSA; ang. fatty acid-free

bovine serum albumin; Sigma-Aldrich). W przypadku zaś protokołu sekwencyj-

nej aktywacji fizykochemicznej (SAF-C), złożonego z dwóch etapów: FE/AE oraz

opóźnionej reaktywacji chemicznej, roztwór ten był przygotowywany na bazie

0,3 M D-mannitolu z dodatkiem 50 µM L-1

CaCl2, 0,1 mM L-1

MgSO4 i 0,2 mg

mL-1

FAF-BSA. Wyselekcjonowane do zabiegu elektrofuzji kompleksy ooplast-

komórka somatyczna były umieszczane w komorze do elektropora-

cji/elektropermeabilizacji błon cytoplazmatycznych, wypełnionej 2−3 mL roz-

tworu tego samego dielektryku, między dwiema równoległymi w stosunku do

siebie elektrodami. Odległość między elektrodami wynosiła 500 μm. Po manu-

alnym ustawieniu kompleksów komórkowych w taki sposób, aby płaszczyzna

styczności (adhezji) błon cytoplazmatycznych ooplastu i komórki fibroblastycz-

nej była zorientowana jednocześnie w kierunku równoległym do przebiegu

elektrod, natomiast prostopadłym do wektora linii sił pola elektrostatycznego,

przy użyciu elektromanipulatora komórkowego (BTX Electro-cell Manipulator

200; San Diego, CA, USA) generowane były dwa następujące bezpośrednio po


37

sobie impulsy prądu stałego o natężeniu pola elektrostatycznego rzędu 1,2 kV

cm-1

odległości między elektrodami (ryc. 2). Czas trwania każdego z dwóch

impulsów elektrycznych wynosił 60 μsek (Samiec i Skrzyszowska, 2012a,b;

Samiec i in., 2013b, 2015; Skrzyszowska i in., 2008). Po fuzjogennej stymulacji

elektrycznej, adherentne kompleksy enukleowanych oocytów i komórek fibro-

blastycznych były pozostawiane jeszcze na okres 30 sekund do 1 minuty

w roztworze dielektryku, a następnie przemywane w pożywce TCM-199/HEPES

z dodatkiem 0,4% BSA-V.

W kolejnym etapie rekonstytuowane oocyty były przenoszone na okres

trwający od 30 minut do 1 godziny do ekwilibrowanych w inkubatorze CO2

(nawarstwionych lekkim olejem mineralnym) 50-μL kropli wolnej od jonów

Ca2+

pożywki NCSU-23 (ang. North Carolina State University-23) uzupełnionej

4 mg mL-1

BSA-V, w celu stopniowego wchłonięcia struktury cytoszkieletu

i membranoszkieletu komórki-dawcy jądra wraz z pozostałymi jej organellami

do mikrośrodowiska cytoplazmatycznego oocytu. Po tym czasie w mikroskopie

stereoskopowym weryfikowana była skuteczność procesu elektrofuzji komórek.

Prawidłowo zrekonstruowane oocyty były hodowane in vitro (protokół jedno-

czesnej fuzji i aktywacji elektrycznej) lub poddawane działaniu chemicznych

czynników aktywujących, a następnie hodowane in vitro (protokół dwustopnio-

wej aktywacji fizykochemicznej), natomiast niezintegrowane pary cytoplastów

i komórek-dawców jąder były albo eliminowane, albo re-fuzjowane i inkubowa-

ne ponownie około 0,5 godziny w pożywce NCSU-23/BSA-V, w celu powtórnej

kontroli efektywności fuzjogennego zabiegu elektroporacji błon plazmatycz-

nych.

W drugiej metodzie rekonstrukcji oocytów z jąder komórek somatycz-

nych wykorzystana była mikrochirurgiczna technika doooplazmatycznej iniekcji

karioplastów wyizolowanych z dużych komórek somatycznych (o średnicy 15-

20 μm) (ryc. 2, fot. 9A, B) lub iniekcji małych komórek somatycznych (o śred-

nicy 10-15 μm) (ryc.2), która polegała na wprowadzeniu materiału genetycznego

całej komórki somatycznej bezpośrednio do cytoplazmy enukleowanych oocy-

tów (Samiec i Skrzyszowska, 2005a, b, 2010a, 2013, 2014; Samiec i in., 2012).

3.1.7. Sztuczna aktywacja zrekonstruowanych oocytów

Do aktywacji oocytów zrekonstytuowanych z jąder komórek fibrobla-

stycznych (cybryd klonalnych/hybryd jądrowo-ooplazmatycznych) (ryc. 2)

zastosowane były cztery protokoły eksperymentalne: 1) jednoczesnej fuzji

i aktywacji fizycznej (elektrycznej); 2) opóźnionej aktywacji (post-aktywacji)

elektrycznej; 3) sekwencyjnej aktywacji fizykochemicznej oraz 4) pseudofizjo-

logicznej/biologicznej post-aktywacji transkomplementarnej (transcytoplazma-

tycznej).

Protokół jednoczesnej fuzji/aktywacji elektrycznej (FE/AE). Impulsy

elektryczne, indukujące fuzję kompleksów ooplast-komórka somatyczna, były

równocześnie bodźcami inicjującymi aktywację rekonstruowanych oocytów.


38

Kompleksy enukleowanych oocytów oraz komórek fibroblastycznych były

poddawane elektroporacji błon plazmatycznych przy użyciu 2 generowanych

bezpośrednio po sobie impulsów prądu stałego o natężeniu pola elektrostatycz-

nego 1,2 kV cm-1

i czasie trwania 60 μsek każdy. Zabieg przeprowadzany był

w roztworze izotonicznego dielektryku (0,3 M D-mannitolu) o podwyższonym

do 1 mM L-1

stężeniu CaCl2 (Samiec i Skrzyszowska, 2012b; Samiec i in.,

2013a, b, 2015).

Protokół post-aktywacji elektrycznej (AE). Zrekonstytuowane oocyty

podlegały działaniu impulsów prądu stałego (o takich samych parametrach

technicznych jak wcześniej), w obecności 1 mM L-1

CaCl2, 1−1,5 godziny po

docytoplazmatycznej mikroiniekcji karioplastów lub całych komórek somatycz-

nych (Samiec i Skrzyszowska, 2010a, 2013).

Protokół sekwencyjnej aktywacji fizykochemicznej (SAF-C). Zrekon-

struowane oocyty poddawane były FE/AE lub AE w roztworze izotonicznego

dielektryku (0,3 M D-mannitolu) uzupełnionym 50 µM L-1

CaCl2. Dwustopnio-

wa aktywacja chemiczna de novo cybryd klonalnych inicjowana była z 1,5−2-

godzinnym opóźnieniem czasowym w stosunku do pierwszego etapu FE/AE lub

AE rekonstytuowanych oocytów. Po 5−7-minutowej inkubacji w roztworze

jonomycyny wapnia (Sigma-Aldrich; antybiotyk jonoforowy) o stężeniu 15 µM

L-1

, hybrydy jądrowo-cytoplazmatyczne umieszczane były na okres 2 godzin

w pożywce z dodatkiem 10 µg mL-1

cykloheksimidu (CHXM; Sigma-Aldrich;

niespecyficzny inhibitor syntezy białek/translacji hamujący m.in. resyntezę

cykliny B, podjednostki regulatorowej czynnika dojrzewania mejotyczne-

go/MPF) (Samiec i Skrzyszowska, 2010b, 2012a; Skrzyszowska i in., 2008).

Protokół pseudofizjologicznej (biologicznej) post-aktywacji transkom-

plementarnej/transcytoplazmatycznej (PFATK). Założeniem systemu PFATK

było wykorzystanie zakumulowanych w cytoplazmie zygoty hipotetycznych

czynników białkowych pochodzenia plemnikowego lub oocytarnego, wywołują-

cych oscylacje wapniowe, które leżą u podstaw mechanizmu stymulacji zarod-

kowego programu rozwojowego. Komplementarne białka oscylogenne wprowa-

dzane były do ooplazmy cybryd klonalnych świni w następstwie ich elektrofuzji

z fragmentami obłonionej cytoplazmy (ksenogenicznymi cytoplastami, tzw.

zygoplastami), wyizolowanymi z zygot królika uzyskanych w wyniku zapłod-

nienia in vivo. Fuzja cybryd klonalnych świni z zygoplastami królika inicjowana

była 2 generowanymi bezpośrednio po sobie impulsami prądu stałego o natęże-

niu pola elektrostatycznego 1,2 kV cm-1

i czasie trwania 60 μsek każdy. Zarów-

no elektrofuzja kompleksów ooplast-komórka somatyczna, jak i elektrofuzja

uzyskanych cybryd klonalnych z zygoplastami, która miała miejsce 1,5−2 go-

dziny po zabiegu rekonstrukcji enukleowanych oocytów (metodami fuzji

z komórkami-dawcami jąder lub docytoplazmatycznej iniekcji kariopla-

stów/całych komórek-dawców jąder), przeprowadzane były w wolnym od jonów

Ca2+

medium do elektroporacji błon plazmatycznych (0,3 M D-mannitolu)

(Samiec i in., 2012; Samiec i Skrzyszowska, 2014).


39

3.1.8. Hodowla in vitro zarodków klonalnych

Cybrydy klonalne zrekonstruowane z jąder nieapoptotycz-

nych/nienekrotycznych (YO-PRO-1-negatywnych i/lub aneksynoujemnych)

fibroblastów tkanki skórno-powłokowej dorosłych osobników lub płodów

hodowane były w grupach liczących po 15−20 sztuk, w nawarstwionych steryl-

nym olejem mineralnym 50-μL kroplach pożywki NCSU-23 z dodatkiem 0,4%

BSA-V, w temperaturze 39oC, w atmosferze 5% CO2 i 100% H2O(g) w powie-

trzu. Po 3−4-dniowej inkubacji, dzielące się zarodki przenoszone były do po-

żywki uzupełnionej 10% FBS. W tych warunkach biochemicznych, zarodki

klonalne hodowane były przez kolejne 3 dni, aż do osiągnięcia stadium moruli

oraz blastocysty (Samiec i Skrzyszowska, 2012b, 2013; Skrzyszowska i in.,

2008) (ryc. 2).

Hodowane in vitro komórki

fibroblastyczne -dawcy jąder

Oocyt w stadium metafazy II uzyskany w wyniku

mejotycznego dojrzewania in vitro -

biorca jądra komórki somatycznej

Iniekcja komórki-dawcy jądra do

przestrzeni okołożółtkowejenukleowanego oocytu

(ooplastu)

Blastocysta

klonalna

Hodowla in vitro zarodka klonalnego

Enukleacja oocytu

Elektrofuzja kompleksu ooplast–komórka-dawca jądra

i sztuczna aktywacja zrekonstruowanego oocytu

Doooplazmatyczna iniekcja karioplastulub całej komórki somatycznej

Zrekonstruowany i aktywowany oocyt (cybryda klonalna)

Selekcja nieapoptotycznej lub nienekrotycznej komórki-dawcy jądra do zabiegu rekonstrukcji

enukleowanego oocytu

Wyprowadzenie hodowli pierwotnych i stabilnych linii komórek somatycznych z eksplantów tkanki skórno-powłokowej

świni

Ryc. 2. Schemat klonowania świń metodą transplantacji jąder komórek somatycznych

do enukleowanych oocytów (ang. somatic cell cloning/somatic cell nuclear transfer)


40

Fot. 5A. Unieruchomiony przy pomocy pipety przytrzymującej oocyt MII świni po inkubacji

w roztworze demekolcyny i sacharozy. W przestrzeni okołożółtkowej oocytu widoczny jest

charakterystyczny stożek cytoplazmatyczny, uwypuklający się na powierzchni oolemmy

w pobliżu ciałka kierunkowego I rzędu (I c.k.). Obraz rzeczywisty, odwrócony w mikrosko-

pie epi-fluorescencyjnym, w świetle białym (powiększenie: ×200).

Fot. 5B. Wizualizacja wybarwionej fluorochromem Hoechst 33342 płytki metafazowej

w obrębie stożkowatego uwypuklenia błony komórkowej oocytu oraz poronnego wrzeciona

mejotycznego ciałka kierunkowego. Po wzbudzeniu kompleksów DNA-fluorochom światłem

nadfioletowym w mikroskopie odwróconym obserwowano niebieską fluorescencję, emito-

waną zarówno przez silnie skondensowany zespół chromosomów, znajdujący się w stożku

ooplazmatycznym, jak i przez I c.k. (powiększenie: ×200)


41

Fot. 5C. Weryfikacja zabiegu enukleacji oocytu metodą mikrochirugiczną, wspomaganą

chemicznie. Usunięty przy użyciu pipety enukleacyjnej stożek ooplazmatyczny oraz I c.k.

emitują niebieską chemiluminescencję po absorpcji przez kompleksy DNA-fluorochrom

nadfioletowego pasma falowego (powiększenie: ×200)

Fot. 6A. Enukleacja oocytu świni. Mikrochirurgiczny zabieg usunięcia ciałka kierunkowego

I rzędu (I c.k.) wraz z fragmentem przylegającej ooplazmy zawierającym płytkę metafazową

(powiększenie: ×200)


42

Fot. 6B. Weryfikacja zabiegu enukleacji w mikroskopie epi-fluorescencyjnym. Wizualizacja

wybarwionej fluorochromem Hoechst 33342 płytki metafazowej (słabsza fluorescencja) oraz

poronnego wrzeciona kariokinetycznego I c.k. (silniejsza fluorescencja) (powiększenie:

×200)

Fot. 7. Populacja fibroblastów płodowych świni w postaci zawiesiny pojedynczych komórek

wewnątrz komory do mikromanipulacji, wypełnionej pożywką TCM-199/HEPES z dodat-

kiem 4 mg mL-1

BSA-V oraz 7,5 µg mL-1

cytochalazyny B. Selekcja komórki-dawcy jądra do

zabiegu klonowania somatycznego (powiększenie: ×200)


43

Fot. 8A. Rekonstrukcja enukleowanego oocytu świni. Mikroniekcja komórki fibroblastycznej

do przestrzeni okołożółtkowej wyjądrzonego oocytu (etap pierwszy) (powiększenie: ×200)

Fot. 8B. Rekonstrukcja enukleowanego oocytu świni. Mikroiniekcja komórki fibroblastycz-

nej do przestrzeni okołożółtkowej wyjądrzonego oocytu (etap drugi) (powiększenie: ×200)


44

Fot. 8C. Rekonstrukcja enukleowanego oocytu świni. Mikrochirurgiczne zdeponowanie całej komórki-dawcy jądra pod osłonką przejrzystą oocytu-biorcy jądra, z którego uprzednio usunięto matczyne chromosomy skonfigurowane w płytkę metafazową wrzeciona kariokine-tycznego II podziału mejotycznego, prowadzi do utworzenia kompleksu ooplast-komórka somatyczna (powiększenie: ×200)

Fot. 9A. Karioplast wyizolowany z wyselekcjonowanej komórki fibroblastycznej w następ-stwie fizycznie sprowokowanej cytolizy wewnątrz pipety iniekcyjnej, której średnica jest o połowę mniejsza niż średnica komórki-dawcy jądra. Karioplast, uzyskany wskutek mecha-nicznie indukowanej lizy całej komórki somatycznej, stanowi żywą, obłonioną strukturę, zawierającą interfazowe jądro komórkowe lub chromosomy metafazowe, które otoczone są cienką warstewką resztkowej cytoplazmy wokółjądrowej (perinuklearnej) określanej mianem perikarionu (powiększenie: ×200)


45

Fot. 9B. Rekonstrukcja enukleowanego oocytu (ooplastu) metodą docytoplazmatycznej

mikroiniekcji karioplastu wyizolowanego z komórki-dawcy jądra. Wprowadzenie pipety

iniekcyjnej do przestrzeni okołożółtkowej przez szczelinę uprzednio powstałą w osłonce

przejrzystej w wyniku enukleacji oocytu. Po tym etapie następuje mikroperforacja oolemmy

i mikrochirurgiczne zdeponowanie karioplastu bezpośrednio w cytoplazmie ooplastu (po-

większenie: ×200)

3.2. Cytologiczna ocena jakości morfologicznej blastocyst

Po 6−7 dniach hodowli in vitro uzyskane blastocysty klonalne poddawa-

ne były ilościowej analizie kondycji strukturalnej (jakości morfologicznej)

w oparciu o całkowitą liczbę komórek, tj. sumaryczną liczbę komórek węzła

zarodkowego/embrioblastu (ICM; ang. inner cell mass) oraz komórek trofobla-

stycznych. Ocena jakości morfologicznej blastocyst dokonywana była w epi-

fluorescencyjnym mikroskopie odwróconym Olympus IMT-2, po uprzednim

wybarwieniu blastocyst fluorochromem Hoechst 33342 (bisbenzimid), specy-

ficznie wiążącym się z DNA. W tym celu blastocysty umieszczane były na

10−15 minut w roztworze barwnika Hoechst 33342 o stężeniu 5 μg mL-1

po-

żywki TCM-199/HEPES z dodatkiem 10% FBS, w temperaturze 39oC, a na-

stępnie przenoszone były w 50−70-μlitrowej kropli tej pożywki na szkiełko

podstawowe (na kroplę nakładane było szkiełko nakrywkowe). Przyżyciowo

wykonane preparaty delikatnie rozpłaszczonych pod ciężarem nacisku szkiełka

nakrywkowego blastocyst klonalnych obserwowane były następnie w mikrosko-

pie, po wzbudzeniu kompleksów DNA-fluorochrom spolaryzowanym pasmem

nadfioletowym światła białego (o maksymalnym zakresie długości fali absorp-

cyjnej λab/max=340 nm). Liczba interfazowych jąder komórkowych i/lub metafa-

zowych oraz anafazowych zespołów chromosomowych w okresie podziałowym


46

cyklu mitotycznego była weryfikowana w każdej blastocyście dwukrotnie

w oparciu o emisję przez kompleksy DNA-bisbenzimid niebieskiej fluorescencji

(przy maksymalnej długości wysyłanej fali świetlnej λem/max=488 nm). Na tej

podstawie szacowane były wartości średnie całkowitej liczby komórek w anali-

zowanych zarodkach (fot.10).

Fot. 10. Fluorescencyjna ocena jakości morfologicznej blastocysty na podstawie całkowitej

liczby komórek zarodkowych. Wybarwione fluorochromem Hoechst 33342 interfazowe jądra

komórkowe oraz płytki metafazowe i anafazowe zespoły chromosomów emitują niebieską

chemiluminescencję po absorpcji nadfioletowego pasma falowego (powiększenie: ×200)

3.3. Przyżyciowa analiza fluorycytochemiczna blastocyst klonalnych

w kierunku wykrywania objawów śmierci apoptotycznej komórek

Uzyskane w 6.−7. dniu hodowli in vitro blastocysty klonalne poddawane

były fluorescencyjnej diagnostyce w kierunku wykrywania biochemicznych

i biofizycznych zmian w plazmolemmie wczesno- i późnoapoptotycznych ko-

mórek węzła zarodkowego i/lub trofoblastu. Oznaczanie symptomów towarzy-

szących wczesnym fazom apoptozy takich jak: 1) eksternalizacja reszt fosfaty-

dyloseryny (PS) na powierzchni zewnątrzkomórkowej błony plazmatycznej, 2)

utrata asymetrii składu aminofosfolipidowego w dwuwarstwie lipidowej błony

oraz symptomów towarzyszących późnym fazom apoptozy, takich jak: 3) po-

wstawanie tzw. dziur lipidowych w plazmolemmie i błonach mitochondrialnych,

przeprowadzane było po 50−60-minutowej inkubacji blastocyst w roztworze

jednego z dwóch markerów testowych. Markerami tymi były odpowiednio:

aneksyna V skoniugowana z fluorygenicznym białkiem eGFP (oznaczanie


47

symptomów 1 i 2) oraz fluorochrom YO-PRO-1 (oznaczanie symptomu 3). Oba

markery testowe (aneksyna V-eGFP oraz YO-PRO-1) są zdolne do niespecy-

ficznego znakowania, tj. nieróżnicowego barwienia, zarówno apoptotycznych

komórek węzła zarodkowego, jak i komórek trofoektodermy blastocyst klonal-

nych świni. Roztwór barwiący stanowiły: 1) mieszanina reakcyjna złożona

z dwóch składników o następującym stosunku objętościowym: 200 μL 1 ×

stężonego buforu wiążącego nadmiar nieprzyłączonych preferencyjnie do ujem-

nie naładowanych reszt PS cząsteczek koniugatu aneksyny V-eGFP do 5 μL

koniugatu diagnostycznego (ApoAlertTM

Annexin V-EGFP Apoptosis Kit;

Becton, Dickinson and Co., BD Biosciences; CLONTECH Laboratories)

o stężeniu 40 μg mL-1

roztworu PBS lub 2) mieszanina fluorochromu DNA YO-

PRO-1 w rozpuszczalniku organicznym DMSO (dimetylosulfotlenek) –

w stosunku objętościowym 1 μL roztworu diagnostycznego (VybrantTM

Apopto-

sis Assay Kit 4; Molecular Probes), o stężeniu 100 μM L-1

DMSO, do 1 mL

pożywki TCM-199/HEPES. W obu przypadkach mieszanina reakcyjna uzupeł-

niona była 10% FBS. Inkubacja blastocyst klonalnych w roztworze barwiącym

aneksyny V sprzężonej z białkiem eGFP lub YO-PRO-1 przeprowadzana była

w temperaturze 39oC, w warunkach atmosferycznych, przy braku oświetlenia

dziennego. Po okresie inkubacji blastocysty przenoszone były indywidualnie

w 70−100-μlitrowej kropli mieszaniny reakcyjnej na wilgotne szkiełka mikro-

skopowe z dołkowatym zagłębieniem (tzw. szkiełka podstawowe z „łezką”),

które umieszczane były wcześniej na wilgotnej bibule. Jednodołkowe szkiełka

podstawowe z mikrokroplami przykrywane były delikatnie szkiełkami nakryw-

kowymi. Przyżyciowo wykonane preparaty blastocyst klonalnych analizowane

były następnie w epi-fluorescencyjnym mikroskopie odwróconym Olympus

IMT-2, po absorpcji przez kompleksy eGFP-aneksyna V-PS lub kompleksy YO-

PRO-1-DNA niebieskiego widma światła widzialnego (o maksymalnej długości

fali wzbudzającej λab/max=488 nm). Blastocysty, w których wykryto aneksynodo-

datnie lub YO-PRO-1-pozytywne komórki węzła zarodkowego i/lub trofoekto-

dermy emitujące zieloną lub żółto-zieloną biochemiluminescencję (przy mak-

symalnym zakresie długości wysyłanej fali świetlnej λem/max=530 nm), oceniane

były jako zarodki ze zmonitorowanymi zmianami proapoptotycznymi i prone-

krotycznymi komórek.

3.4. Schemat doświadczeń

W pierwszej serii eksperymentów badany był wpływ warunków fizyko-

chemicznych hodowli in vitro pozyskiwanych poubojowo oocytów loch lub

loszek na efektywność dojrzewania mejotycznego (tj. częstość osiągania dojrza-

łości jądrowo-cytoplazmatycznej przez komórki-biorców egzogennej informacji

genetycznej w procedurze klonowania somatycznego).

W drugiej serii doświadczeń oceniany był wpływ technik rekonstrukcji

enukleowanych oocytów świni (metod transplantacji jąder komórek somatycz-


48

nych do ooplastów) na przedimplantacyjny potencjał rozwojowy zarodków

klonalnych oraz na kondycję strukturalną (jakość morfologiczną) uzyskanych

w warunkach hodowli in vitro blastocyst. Wpływ tego czynnika eksperymental-

nego był weryfikowany w zależności od zastosowanego protokołu sztucznej

aktywacji zrekonstruowanych oocytów (jednoczesnej fuzji i aktywacji elek-

trycznej, postaktywacji elektrycznej, sekwencyjnej aktywacji fizykochemicznej

oraz pseudofizjologicznej/biologicznej postaktywacji transkomplementarnej).

Zrekonstytuowane oocyty podzielone były na dwie grupy doświadczalne, ze

względu na metodę transplantacji jąder nieapoptotycznych/nienekrotycznych

komórek fibroblastycznych wykorzystaną w procedurze klonowania somatycz-

nego. W jednej z grup zabieg rekonstrukcji oocytu przeprowadzany był techniką

elektrofuzji kompleksów ooplastu i komórki-dawcy jądra. W kolejnej grupie

zabieg rekonstrukcji oocytu przeprowadzany był techniką docytoplazmatycznej

mikroiniekcji karioplastów lub całych komórek somatycznych. Kryteriami

oceny kompetencji rozwojowych hodowanych in vitro zarodków były ich ak-

tywność podziałowa oraz odsetek uzyskanych morul i blastocyst. Z kolei jakość

morfologiczna blastocyst klonalnych weryfikowana była w oparciu o wartość

średniej arytmetycznej z sumarycznej liczby komórek węzła zarodkowego oraz

komórek trofoblastycznych.

W trzeciej serii eksperymentów porównywana była kondycja struktural-

no-funkcjonalna (jakość biochemiczna i biofizyczna) blastocyst rozwijających

się z hodowanych zarodków, które zrekonstruowane zostały z jąder nieapopto-

tycznych/nienekrotycznych komórek fibroblastycznych metodą elektrofuzji lub

doooplazmatycznej iniekcji karioplastów/całych komórek somatycznych. Anali-

za porównawcza kondycji strukturalno-funkcjonalnej blastocyst między dwiema

grupami zrekonstruowanych zarodków dokonywana była w zależności od zasto-

sowania różnych systemów sztucznej aktywacji cybryd klonalnych. Jakość

biochemiczna i biofizyczna przedimplantacyjnych zarodków w stadium blasto-

cysty była oceniana na podstawie przyżyciowych metod fluorescencyjnego

wykrywania zmian proapoptotycznych, które zachodziły w błonie plazmatycznej

komórek węzła zarodkowego i/lub trofoblastu. Przyżyciowa diagnostyka fluory-

cytochemiczna symptomów towarzyszących wczesnym i późnym fazom śmierci

apoptotycznej komórek zarodkowych przeprowadzana była przy wykorzystaniu

koniugatu diagnostycznego aneksyny V-eGFP lub barwnika YO-PRO-1.

W czwartej serii doświadczeń badany był wpływ protokołów sztucznej

aktywacji hybryd jądrowo-ooplazmatycznych na pozaustrojowe kompetencje

rozwojowe klonalnych zarodków zrekonstruowanych przy wykorzystaniu róż-

nych technik transplantacji jąder nieapoptotycznych/nienekrotycznych komórek

fibroblastycznych (elektrofuzji kompleksów ooplastu i komórki-dawcy jądra lub

doooplazmatycznej iniekcji karioplastów/całych komórek somatycznych). Po

6−7 dniach hodowli in vitro porównywana była jakość morfologiczna uzyska-

nych w poszczególnych grupach eksperymentalnych blastocyst, przyjmując za

kryterium oceny całkowitą liczbę komórek w blastocystach (komórek węzła

zarodkowego/ICM oraz komórek trofoektodermalnych). Cybrydy klonalne


49

podzielone były na cztery grupy doświadczalne, ze względu na zastosowany

w procedurze klonowania somatycznego protokół sztucznej aktywacji rekon-

struowanych oocytów (oraz rodzaj czynników aktywujących). W jednej z grup

badanym czynnikiem eksperymentalnym była jednoczesna fuzja i aktywacja

fizyczna (FE/AE) przy użyciu impulsów elektrycznych. W kolejnych grupach

czynnikami tymi były: opóźniona aktywacja (postaktywacja) elektryczna (AE)

oraz sekwencyjna aktywacja fizykochemiczna (SAF-C), złożona z dwóch etapów

− FE/AE lub AE (przy wykorzystaniu impulsów elektrycznych) i opóźnionej

reaktywacji chemicznej (przy wykorzystaniu jonomycyny wapnia i cykloheksi-

midu). W ostatniej grupie czynnikiem doświadczalnym była pseudofizjologiczna

postaktywacja transkomplementarna/transcytoplazmatyczna (PFATK) cybryd

klonalnych za pośrednictwem cytoplastów wyizolowanych z zygot królika (tzw.

zygoplastów).

W piątej serii eksperymentów oceniany był wpływ różnych protoko-

łów/metod sztucznej stymulacji zarodkowego programu rozwojowego cybryd

klonalnych świni na jakość biochemiczną i biofizyczną uzyskanych blastocyst,

w zależności od zastosowanej techniki rekonstrukcji enukleowanych oocytów.

Kondycja strukturalno-funkcjonalna rozwijających się w 6.−7. dniu hodowli in

vitro blastocyst klonalnych weryfikowana była w oparciu o przyżyciową detek-

cję symptomów charakterystycznych dla wczesnych i późnych faz apoptozy

w plazmolemmie komórek ICM i/lub trofoblastu przy użyciu markerów testo-

wych aneksyny V-eGFP lub YO-PRO-1.

3.5. Analiza statystyczna

W celu porównania liczby dzielących się zarodków, liczby zarodków

w stadium moruli oraz blastocysty, a także liczby zdiagnozowanych apoptotycz-

nych/nekrotycznych blastocyst między różnymi grupami cybryd klonalnych

świni, utworzonymi w zależności od badanego czynnika eksperymentalnego:

metody rekonstrukcji enukleowanych oocytów oraz protokołu sztucznej aktywa-

cji rekonstytuowanych oocytów, zastosowana była procedura analityczna przy

użyciu testu niezależności zmiennych losowych (cech) χ2.

Natomiast w celu porównania średniej liczby komórek w blastocystach

między różnymi grupami cybryd klonalnych świni, utworzonymi w zależności

od badanego czynnika doświadczalnego: metody rekonstrukcji enukleowanych

oocytów oraz protokołu sztucznej aktywacji rekonstytuowanych oocytów,

zastosowana była jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) przy wykorzy-

staniu testu t-Studenta dla grup niezależnych (czyli dla zmiennych niepowiąza-

nych).


50

4. WYNIKI

W ramach realizacji badań wyprowadzono i zamrożono w ciekłym azo-

cie 8 linii klonalnych (szczepów komórkowych) fibroblastów pochodzących

z eksplantów układu skórno-powłokowego 5 dojrzałych płciowo osobników (3

loszek/loch i 2 knurów) oraz 3 płodów świń. Rozmrożone i hodowane in vitro

komórki fibroblastyczne poddawano inhibicji kontaktowej migracji i prolifera-

cyjnego wzrostu przez 24−72 godziny od momentu osiągnięcia stanu pełnej

konfluencji, w celu synchronizacji cyklu mitotycznego w fazach G1/G0 przed

wykorzystaniem ich jako dawców jąder do zabiegu klonowania somatycznego.

Źródłem komórek-biorców dla somatogenicznego genomu jądrowego

w procedurze klonowania były oocyty, które osiągnęły dojrzałość mejotyczną

(jądrową) i cytoplazmatyczną w warunkach hodowli pozaustrojowej. Łączna

liczba oocytów świni wyselekcjonowanych do dojrzewania mejotycznego in

vitro wynosiła 7630. W opracowanych warunkach fizykochemicznych hodowli

in vitro stan dojrzałości jądrowo-cytoplazmatycznej osiągnęło 7157 oocytów

(93,8%).

W procedurze klonowania somatycznego wykorzystano łącznie 7157

dojrzałych in vitro oocytów świni. Na drodze elektrofuzji do 2210/7157 (30,9%)

enukleowanych oocytów wprowadzono jądra nieapoptotycznych/nienekro-

tycznych (aneksynoujemnych i/lub YO-PRO-1-negatywnych) fibroblastów

tkanki skórnej dorosłych osobników (grupa I), a do 1615/7157 (22,6%) − jądra

fibroblastów płodowych (grupa II). Z kolei na drodze doooplazmazmatycznej

mikroiniekcji całych komórek somatycznych lub wyizolowanych z nich kario-

plastów uzyskano 1859/7157 (25,9%) oraz 1473/7157 (20,6%) cybryd klonal-

nych zrekonstytuowanych odpowiednio: z jąder nieapoptotycznych/nienekro-

tycznych fibroblastów tkanki skórno-powłokowej dorosłych osobników (grupa

III) lub płodów (grupa IV). Do sztucznej aktywacji rekonstytuowanych oocytów

(cybryd klonalnych) zastosowano protokół jednoczesnej fuzji i aktywacji fi-

zycznej (elektrycznej) – FE/AE (grupy IA oraz IIA), protokół sekwencyjnej

aktywacji fizykochemicznej – SAF-C (grupy IB oraz IIB) lub protokół pseudofi-

zjologicznej/biologicznej postaktywacji transkomplementarnej (transcytopla-

zmatycznej) – PFATK (grupy IC oraz IIC). Z kolei w grupach IIIA, IIIB i IIIC

oraz IVA, IVB i IVC zarodkowy program rozwojowy cybryd klonalnych stymu-

lowano odpowiednio: w wyniku postaktywacji elektrycznej (AE), sekwencyjnej

postaktywacji fizykochemicznej (SAF-C) lub w wyniku pseudofizjologicznej

postaktywacji transkomplementarnej (PFATK). W zależności od zastosowanego


51

protokołu sztucznej aktywacji zrekonstruowanych oocytów − FE/AE (grupy IA,

IIA), AE (IIIA, IVA), SAF-C (IB, IIB, IIIB, IVB) lub PFATK (IC, IIC, IIIC, IVC) –

oceniano potencjał rozwojowy zarodków klonalnych w oparciu o aktywność

podziałową oraz odsetek morul i blastocyst uzyskanych w warunkach hodowli in

vitro. Ponadto oceniano kondycję strukturalno-funkcjonalną (jakość bioche-

miczną i biofizyczną) uzyskanych blastocyst klonalnych w oparciu o częstość

występowania wśród zarodków zmian proapoptotycznych i pronekrotycznych

w błonie plazmatycznej komórek oraz kondycję strukturalną (jakość morfolo-

giczną) blastocyst w oparciu o średnią liczbę komórek.

Szczegółową analizę wpływu technik rekonstrukcji enukleowanych

oocytów świni na przedimplantacyjny potencjał rozwojowy zarodków klonal-

nych, w zależności od typu i pochodzenia/rodowodu komórek-dawców jąder

oraz od zastosowanych protokołów sztucznej aktywacji zrekonstruowanych

oocytów, przedstawiono w tabelach 1, 3, 5, 7, 9 i 11. Z kolei zestawienie wyni-

ków wpływu technik rekonstrukcji enukleowanych oocytów na kondycję struk-

turalno-funkcjonalną uzyskanych blastocyst klonalnych, monitorowaną w opar-

ciu o przyżyciową analizę fluorycytochemiczną symptomów apoptotycz-

nych/nekrotycznych w plazmolemmie komórek zarodkowych, znajduje się

w tabelach 2, 4, 6, 8, 10 i 12. W tabelach tych zamieszczone są również dokład-

ne dane dotyczące wyników ilościowej oceny jakości morfologicznej uzyska-

nych w warunkach 6−7-dniowej hodowli in vitro blastocyst klonalnych, którą

weryfikowano w oparciu o sumaryczną liczbę komórek węzła zarodkowego oraz

komórek trofoektodermalnych.

Natomiast wyniki dotyczące wpływu protokołów aktywacji cybryd klo-

nalnych świni (rodzaju czynników aktywujących) na pozaustrojowe kompeten-

cje rozwojowe zarodków zrekonstruowanych przy wykorzystaniu różnych

technik transplantacji jąder komórek fibroblastycznych (elektrofuzji komplek-

sów ooplastu i komórki-dawcy jądra lub doooplazmatycznej iniekcji kariopla-

stów/całych komórek somatycznych) przedstawiono w tabelach 13, 15, 17 i 19.

Z kolei tabele 14, 16, 18 i 20 przedstawiają wyniki dotyczące jakości bioche-

micznej i biofizycznej, a także morfologicznej zarodków klonalnych, w zależno-

ści od zastosowania różnych strategii sztucznej aktywacji (FE/AE, AE, SAF-C,

PFATK) oocytów zrekonstruowanych techniką elektrofuzji lub docytoplazma-

tycznej mikroiniekcji z jąder komórek fibroblastycznych tkanki skórnej doro-

słych osobników lub płodów.

Przedstawione w tabelach wyniki wskazują, że niezależnie od zastoso-

wanych technik rekonstrukcji enukleowanych oocytów (elektrofuzja komplek-

sów ooplast-komórka somatyczna i docytoplazmatyczna iniekcja kariopla-

stów/całych komórek somatycznych) oraz systemów sztucznej aktywacji cybryd

klonalnych (FE/AE, AE, SAF-C, PFATK) stwierdzono istotne różnice zarówno

w aktywności podziałowej, jak i w zdolnościach rozwojowych do stadium

moruli i blastocysty między hodowanymi in vitro zarodkami zrekonstruowanymi

z jąder fibroblastów płodowych a zarodkami zrekonstruowanymi z jąder fibro-

blastów tkanki skórnej dorosłych osobników. Dokładna analiza wyników zesta-


52

wionych w tabelach pozwoliła na zaobserwowanie wyraźnej tendencji wzrosto-

wej w odsetku dzielących się zarodków, a także w odsetku rozwijających się

morul oraz blastocyst wśród oocytów zrekonstytuowanych z jąder płodowych

komórek fibroblastycznych w stosunku do oocytów zrekonstytuowanych z jąder

fibroblastów skóry ucha dojrzałych płciowo loszek/loch i knurów.

Ponadto znaczący wpływ zastosowanego protokołu/strategii sztucznej

stymulacji zarodkowego programu rozwojowego cybryd klonalnych na zmien-

ność międzygrupową w zakresie aktywności podziałowej zarodków oraz

w zdolnościach rozwojowych do stadium moruli i blastocysty, a także w jakości

morfologicznej uzyskanych blastocyst (wszystkie wymienione wskaźni-

ki/mierniki istotnie wyższe) odnotowano w przypadku oryginalnej, nowatorskiej

metody pseudofizjologicznej postaktywacji transkomplementarnej oraz aktywa-

cji elektrycznej oocytów jednocześnie rekonstruowanych techniką elektrofuzji

w porównaniu z postaktywacją elektryczną oocytów zrekonstruowanych techni-

ką mikroiniekcji karioplastów/całych komórek somatycznych, jak również

z sekwencyjną aktywacją fizykochemiczną oocytów zrekonstruowanych obiema

technikami.

Statystyczna istotność różnic międzygrupowych w odsetkach apopto-

tycznych/nekrotycznych blastocyst oszacowanych w stosunku do całkowitej

liczby uzyskanych blastocyst klonalnych analizowanych przyżyciowo przy

użyciu markerów testowych aneksyny V-eGFP oraz YO-PRO-1 wskazuje na

znaczną przewagę techniki elektrofuzji kompleksów ooplast-komórka soma-

tyczna nad metodą docytoplazmatycznej iniekcji całych komórek somatycznych

lub wyizolowanych z nich karioplastów. Przewagę tę dostrzeżono zarówno

w subpopulacjach oocytów zrekonstruowanych z jąder fibroblastów skóry ucha

dorosłych osobników, jak i w subpopulacjach oocytów zrekonstruowanych

z jąder fibroblastów płodowych. Potwierdza to wyraźnie wyższa częstość wy-

stępowania zarodków, w których wykryto obecność aneksynododatnich i YO-

PRO-1-pozytywnych komórek, w grupie cybryd klonalnych uzyskanych

w następstwie bezpośredniej mikroiniekcji karioplastów/całych komórek fibro-

blastycznych do ooplazmy w porównaniu z cybrydami klonalnymi uzyskanymi

w wyniku elektrofuzji enukleowanych oocytów z komórkami-dawcami jąder.

Niemniej jednak, bez względu na rodzaj/rodowód fibroblastów użytych

jako źródło dawców jąder w zabiegach rekonstrukcji enukleowanych oocytów,

istotnie niższy odsetek blastocyst klonalnych ze zdiagnozowanymi przyżyciowo

zmianami proapoptotycznymi i pronekrotycznymi w błonie plazmatycznej

komórek zaobserwowano wśród zarodków uzyskanych w wyniku sztucznej

stymulacji rozwoju cybryd klonalnych metodami pseudofizjologicznej postak-

tywacji transkomplementarnej (PFATK) oraz jednoczesnej fuzji i aktywacji

elektrycznej (FE/AE) niż wśród zarodków rozwijających się z cybryd klonalnych

poddanych działaniu sekwencyjnej aktywacji fizykochemicznej (SAF-C) oraz

postaktywacji elektrycznej (AE). W odniesieniu do metod FE/AE oraz AE, wpływ

sztucznej aktywacji cybryd klonalnych na uruchomienie procesów apoptozy

i/lub nekrozy w blastocystach klonalnych świni był zależny od techniki zasto-


53

sowanej do rekonstrukcji enukleowanych oocytów. Stwierdzono bowiem istotne

obniżenie odsetka apoptotycznych/nekrotycznych zarodków z komórkami

aneksynododatnimi i YO-PRO-1-pozytywnymi w grupie blastocyst rozwijają-

cych się w wyniku jednoczesnej fuzji i aktywacji elektrycznej rekonstytuowa-

nych oocytów w stosunku do grupy blastocyst rozwijających się w następstwie

postaktywacji elektrycznej cybryd klonalnych uzyskanych techniką docytopla-

zmatycznej mikroiniekcji karioplastów/całych komórek somatycznych.

Natomiast w przypadku metod SAF-C oraz PFATK wpływ sztucznej sty-

mulacji zarodkowego programu rozwojowego cybryd klonalnych na częstość

występowania komórek aneksynododatnich i YO-PRO-1-pozytywnych w bla-

stocystach był niezależny od zastosowanej techniki rekonstrukcji enukleowa-

nych oocytów (elektrofuzji kompleksów ooplast-komórka somatyczna oraz

doooplazmatycznej iniekcji karioplastów/całych komórek somatycznych).

Przyżyciowa diagnostyka fluorescencyjna symptomów śmierci apoptotycznej

i/lub nekrotycznej w blastocystach świni rozwijających się z aktywowanych

oocytów zrekonstruowanych obiema technikami wykazała bowiem, że procen-

towy udział zarodków, w których potwierdzono obecność komórek aneksynodo-

datnich i YO-PRO-1-pozytywnych, był istotnie wyższy w subpopulacjach

cybryd klonalnych poddanych działaniu sekwencyjnej aktywacji fizykoche-

micznej niż w subpopulacjach cybryd klonalnych stymulowanych metodą pseu-

dofizjologicznej aktywacji transkomplementarnej.

Na szczególną uwagę zasługuje także fakt, iż analiza fluorycytoche-

miczna blastocyst klonalnych świni z użyciem koniugatu diagnostycznego

aneksyny V-eGFP wykazywała wyższą częstość występowania wśród zarodków

symptomów apoptotycznych i/lub nekrotycznych w komórkach ICM oraz trofo-

blastu niż analiza z użyciem fluorochromu YO-PRO-1. Bezpośrednią tego

przyczyną jest zdolność aneksyny V-eGFP do wykrywania zmian biochemicz-

nych i biofizycznych pojawiających się w plazmolemmie komórek zarodkowych

już we wczesnych fazach apoptozy, w przeciwieństwie do barwnika YO-PRO-1,

który umożliwia detekcję jedynie ultrastrukturalnych (biofizycznych) sympto-

mów późnoapoptotycznych w błonie komórkowej. Dlatego też liczebność su-

bpopulacji blastocyst pozytywnie wyznakowanych aneksyną V-eGFP, która

obejmuje łączną pulę zarodków wczesno- i/lub późnoapoptotycznych oraz

nekrotycznych była wyższa niż liczebność subpopulacji blastocyst YO-PRO-1-

pozytywnych, która z kolei obejmuje tylko zarodki z objawami towarzyszącymi

późnym fazom apoptozy i/lub z objawami pronekrotycznymi w komórkach.


54

Tabela 1. Wpływ metod rekonstrukcji oocytów z jąder fibroblastów tkanki skórnej

dorosłych osobników na potencjał rozwojowy in vitro klonalnych zarodków świni

uzyskanych w następstwie aktywacji elektrycznej (FE/AE lub AE) [test χ2]

Metoda rekonstrukcji

enukleowanych

oocytów

Liczba

hodowanych

zarodków

Liczba

dzielących się

zarodków (%)

Liczba

morul

(%)

Liczba

blastocyst

(%)

Elektrofuzja kompleksów

ooplast-komórka

somatyczna

(grupa IA)

759

513/759

(67,6%)a

400/759

(52,7%)a

147/759

(19,4%)a

Docytoplazmatyczna

mikroiniekcja kariopla-

stów/całych komórek

somatycznych

(grupa IIIA)

691

406/691

(58,8%)b

298/691

(43,1%)b

77/691

(11,1%)b

a, b − niejednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych

w obrębie kolumn oznaczają statystycznie istotne różnice między grupami doświadczalnymi,

z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,01<P≤0,05.


dorosłych osobników na procesy apoptozy/nekrozy i średnią liczbę komórek w klonal-

nych blastocystach uzyskanych w wyniku zastosowania aktywacji elektrycznej (FE/AE

lub AE) [*test χ2; **ANOVA – test t-Studenta]

Metoda

rekonstrukcji

enukleowanych

oocytów

Liczba

uzyskanych

blastocyst

Liczba

apoptotycz-

nych/nekro-

tycznych

blastocyst

(aneksyna

V-eGFP)

(%)*

Liczba

apoptotycz-

nych/nekro-

tycznych

blastocyst

(YO-PRO-1)

(%)*

Średnia

( )** liczba

komórek

w blastocy-

stach

(n)

Elektrofuzja komplek-

sów ooplast-komórka

somatyczna

(grupa IA)

147

21/74

(28,4%)A

12/73

(16,4%)A

= 30,6C

(n = 74)

Docytoplazmatyczna



somatycznych

(grupa IIIA)

77

16/39

(41,0%)B

11/38

(28,9%)B

= 26,7D

(n = 39)

A, B − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie bardzo wysoko

istotne różnice między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu

losowego P≤0,001. C, D − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie wysoko istotne

różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,001<P≤0,01.


55

Tabela 3. Wpływ metod rekonstrukcji oocytów z jąder fibroblastów płodowych na

potencjał rozwojowy in vitro klonalnych zarodków świni uzyskanych w następstwie

aktywacji elektrycznej (FE/AE lub AE) [test χ2]

Metoda

rekonstrukcji

enukleowanych

oocytów

Liczba

hodowanych

zarodków

Liczba

dzielących się

zarodków

(%)

Liczba

morul

(%)

Liczba

blastocyst

(%)



somatyczna

(grupa IIA)

530

451/530

(85,1%)A

330/530

(62,3%)a

175/530

(33,0%)a

Docytoplazmatyczna



somatycznych

(grupa IVA)

452

329/452

(72,8%)B

240/452

(53,1%)b

103/452

(22,8%)b

a, b − niejednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn oznaczają statystycznie istotne różnice między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,01<P≤0,05. A, B − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie wysoko istotne różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,001<P≤0,01.

Tabela 4. Wpływ metod rekonstrukcji oocytów z jąder fibroblastów płodowych na

procesy apoptozy/nekrozy i średnią liczbę komórek w klonalnych blastocystach uzyska-

nych w wyniku zastosowania aktywacji elektrycznej (FE/AE lub AE) [*test χ2;

**ANOVA – test t-Studenta]

Metoda

rekonstrukcji

enukleowanych

oocytów

Liczba

uzyska-

nych

blastocyst

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(aneksyna V-eGFP)

(%)*

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(YO-PRO-1)

(%)*

Średnia ( )**

liczba

komórek w

blastocystach

(n)

Elektrofuzja kom-

pleksów ooplast-

komórka somatyczna

(grupa IIA)

175

28/88

(31,8%)A

18/87

(20,7%)C

= 34,8A

(n = 88)

Docytoplazmatyczna

mikroiniekcja kario-

plastów/całych

komórek somatycz-

nych

(grupa IVA)

103

25/52

(48,1%)B

16/51

(31,4%)D

= 28,4B

(n = 52)

A, B − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie bardzo wysoko istotne różnice między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P≤0,001. C, D − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie wysoko istotne różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,001<P≤0,01.


56



uzyskanych w następstwie sekwencyjnej aktywacji fizykochemicznej (SAF-C) [test χ2]

Metoda

rekonstrukcji

enukleowanych

oocytów

Liczba

hodowanych

zarodków

Liczba

dzielących się

zarodków

(%)

Liczba

morul

(%)

Liczba

blastocyst

(%)



somatyczna

(grupa IB)

679

399/679

(58,8%)A

301/679

(44,3%)a

90/679

(13,3%)a

Docytoplazmatyczna



somatycznych

(grupa IIIB)

654

309/654

(47,2%)B

222/654

(33,9%)b

28/654

(4,3%)b

a, b − niejednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn oznaczają statystycznie istotne różnice między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,01<P≤0,05. A, B − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie wysoko istotne różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,001<P≤0,01.



nych blastocystach uzyskanych w wyniku zastosowania sekwencyjnej aktywacji fizyko-

chemicznej (SAF-C) [*test χ2; **ANOVA – test t-Studenta]

Metoda

rekonstrukcji

enukleowanych

oocytów

Liczba

uzyska-

nych

blastocyst

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(aneksyna V-eGFP)

(%)*

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(YO-PRO-1)

(%)*

Średnia ( )**

liczba

komórek w

blastocystach

(n)

Elektrofuzja kom-

pleksów ooplast-

komórka somatyczna

(grupa IB)

90

16/45

(35,6%)A

10/45

(22,2%)A

= 25,9C

(n = 45)

Docytoplazmatyczna


plastów/całych

komórek somatycz-

nych

(grupa IIIB)

28

7/14

(50,0%)B

5/14

(35,7%)B

= 21,6D

(n = 14)



57

Tabela 7. Wpływ metod rekonstrukcji oocytów z jąder fibroblastów płodowych na potencjał rozwojowy in vitro klonalnych zarodków świni uzyskanych w następstwie sekwencyjnej aktywacji fizykochemicznej (SAF-C) [test χ

2]

Metoda

rekonstrukcji

enukleowanych

oocytów

Liczba

hodowanych

zarodków

Liczba

dzielących się

zarodków

(%)

Liczba

morul

(%)

Liczba

blastocyst

(%)



somatyczna

(grupa IIB)

496

377/496

(76,0%)A

275/496

(55,4%)C

121/496

(24,4%)a

Docytoplazmatyczna



somatycznych

(grupa IVB)

437

261/437

(59,7%)B

195/437

(44,6%)D

64/437

(14,6%)b

a, b − niejednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn oznaczają statystycznie istotne różnice między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,01<P≤0,05. A, B − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie bardzo wysoko istotne różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P≤0,001. C, D − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie wysoko istotne różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,001<P≤0,01.

Tabela 8. Wpływ metod rekonstrukcji oocytów z jąder fibroblastów płodowych na procesy apoptozy/nekrozy i średnią liczbę komórek w klonalnych blastocystach uzyska-nych w wyniku zastosowania sekwencyjnej aktywacji fizykochemicznej (SAF-C) [*test χ

2; **ANOVA – test t-Studenta]

Metoda

rekonstrukcji

enukleowanych

oocytów

Liczba

uzyska-

nych

blastocyst

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(aneksyna V-eGFP)

(%)*

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(YO-PRO-1)

(%)*

Średnia ( )**

liczba

komórek w

blastocystach

(n)

Elektrofuzja kom-

pleksów ooplast-

komórka somatyczna

(grupa IIB)

121

25/61

(41,0%)A

16/60

(26,7%)A

= 27,5C

(n = 61)

Docytoplazmatyczna


plastów/całych

komórek somatycz-

nych

(grupa IVB)

64

20/32

(62,5%)B

14/32

(43,8%)B

= 23,4D

(n = 32)



58



uzyskanych w następstwie pseudofizjologicznej aktywacji transkomplementarnej

(PFATK) [test χ2]

Metoda

rekonstrukcji

enukleowanych

oocytów

Liczba

hodowanych

zarodków

Liczba

dzielących się

zarodków

(%)

Liczba

morul

(%)

Liczba

blastocyst

(%)



somatyczna

(grupa IC)

595

464/595

(78,0%)a

384/595

(64,5%)a

167/595

(28,1%)a

Docytoplazmatyczna



somatycznych

(grupa IIIC)

253

174/253

(68,8%)b

138/253

(54,5%)b

51/253

(20,2%)b

a, b − niejednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn oznaczają statystycznie istotne różnice między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,01<P≤0,05.



nych blastocystach uzyskanych w wyniku zastosowania pseudofizjologicznej aktywacji

transkomplementarnej (PFATK) [*test χ2; **ANOVA – test t-Studenta]

Metoda

rekonstrukcji

enukleowanych

oocytów

Liczba

uzyskanych

blastocyst

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(aneksyna

V-eGFP) (%)*

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(YO-PRO-1)

(%)*

Średnia ( )**

liczba

komórek w

blastocystach

(n)

Elektrofuzja kom-

pleksów ooplast-

komórka somatyczna

(grupa IC)

167

16/84

(19,0%)A

8/83

(9,6%)a

= 36,6A

(n = 84)

Docytoplazmatyczna


plastów/całych

komórek somatycz-

nych

(grupa IIIC)

51

8/26

(30,8%)B

4/25

(16,0%)a

= 31,2B

(n = 26)

a, a − jednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn oznaczają brak statystycznie istotnych różnic między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P>0,05. A, B − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie wysoko istotne różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,001<P≤0,01.


59

Tabela 11. Wpływ metod rekonstrukcji oocytów z jąder fibroblastów płodowych na potencjał rozwojowy in vitro klonalnych zarodków świni uzyskanych w następstwie pseudofizjologicznej aktywacji transkomplementarnej (PFATK) [test χ

2]

Metoda

rekonstrukcji

enukleowanych

oocytów

Liczba

hodowanych

zarodków

Liczba

dzielących się

zarodków

(%)

Liczba

morul

(%)

Liczba

blastocyst

(%)



somatyczna

(Grupa IIC)

476

442/476

(92,9%)a

356/476

(74,8%)a

203/476

(42,6%)a

Docytoplazmatyczna



somatycznych

(Grupa IVC)

359

300/359

(83,6%)b

244/359

(68,0%)a

116/359

(32,3%)b

a, a − jednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn oznaczają brak statystycznie istotnych różnic między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P>0,05. a, b − niejednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn oznaczają statystycznie istotne różnice między grupami, z prawdopodobień-stwem popełnienia błędu losowego 0,01<P≤0,05.

Tabela 12. Wpływ metod rekonstrukcji oocytów z jąder fibroblastów płodowych na procesy apoptozy/nekrozy i średnią liczbę komórek w klonalnych blastocystach uzyska-nych w wyniku zastosowania pseudofizjologicznej aktywacji transkomplementarnej (PFATK) [*test χ


Metoda

rekonstrukcji

enukleowanych

oocytów

Liczba

uzyska-

nych

blastocyst

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(aneksyna V-eGFP)

(%)*

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(YO-PRO-1)

(%)*

Średnia ( )**

liczba

komórek w

blastocystach

(n)

Elektrofuzja kom-

pleksów ooplast-

komórka somatyczna

(grupa IIC)

203

23/102

(22,5%)a

13/101

(12,9%)a

= 49,8A

(n = 102)

Docytoplazmatyczna


plastów/całych

komórek somatycz-

nych

(grupa IVC)

116

19/58

(32,8%)b

13/58

(22,4%)b

= 41,6B

(n = 58)

a, b − niejednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn oznaczają statystycznie istotne różnice między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,01<P≤0,05. A, B − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie bardzo wysoko istotne różnice między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P≤0,001.


60

Tabela 13. Wpływ metod aktywacji oocytów zrekonstruowanych techniką elektrofuzji z jąder fibroblastów tkanki skórnej dorosłych osobników na potencjał rozwojowy in vitro klonalnych zarodków świni [test χ

2]

Metoda aktywacji zrekonstruowanych

oocytów

Liczba hodowanych

zarodków

Liczba dzielących się zarodków (%)

Liczba morul (%)

Liczba blastocyst

(%)

FE/AE

(impulsy elektryczne) (grupa IA)

759 513/759 (67,6%)a

400/759 (52,7%)aC

147/759 (19,4%)a

SAF-C

(impulsy elektryczne + jonomycyna wap-

nia/cykloheksimid) (grupa IB)

679

399/679 (58,8%)bA

301/679

(44,3%)bA

90/679

(13,3%)aA

PFATK

(cytoplasty zygot królika) (grupa IC)

595 464/595

(78,0%)cB 384/595 (64,5%)B

167/595 (28,1%)bB

a, b; a, c − niejednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie

kolumn oznaczają statystycznie istotne różnice między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem

popełnienia błędu losowego 0,01<P≤0,05. A, B − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie bardzo wysoko istotne

różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P≤0,001. B, C − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie wysoko istotne różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,001<P≤0,01.

Tabela 14. Wpływ metod aktywacji oocytów zrekonstruowanych techniką elektrofuzji z jąder fibroblastów tkanki skórnej dorosłych osobników na procesy apoptozy/nekrozy i średnią liczbę komórek w blastocystach klonalnych [*test χ

2; **ANOVA – test

t-Studenta]

Metoda aktywacji zrekonstruowanych

oocytów

Liczba uzyskanych blastocyst

Liczba apoptotycznych/ nekrotycznych

blastocyst (aneksyna

V-eGFP) (%)*

Liczba apoptotycznych/ nekrotycznych

blastocyst (YO-PRO-1)

(%)*

Średnia ( )** liczba

komórek w blastocystach

(n)

FE/AE

(impulsy elektryczne) (grupa IA)

147 21/74

(28,4%)a 12/73

(16,4%)a = 30,6C

(n = 74)

SAF-C

(impulsy elektryczne + jonomycyna wap-

nia/cykloheksimid) (grupa IB)

90 16/45

(35,6%)aA 10/45

(22,2%)aA = 25,9A

(n = 45)

PFATK

(cytoplasty zygot królika)

(grupa IC)

167 16/84

(19,0%)bB 8/83

(9,6%)aB = 36,6B

(n = 84)

a, b − niejednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn

oznaczają statystycznie istotne różnice między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem popełnie-nia błędu losowego 0,01<P≤0,05. A, B − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie bardzo wysoko istotne

różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P≤0,001. A, C; B, C − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie wysoko istotne różnice

między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,001<P≤0,01.


61

Tabela 15. Wpływ metod aktywacji oocytów zrekonstruowanych techniką elektrofuzji z jąder fibroblastów płodowych na potencjał rozwojowy in vitro klonalnych zarodków świni [test χ

2]

Metoda aktywacji

zrekonstruowanych

oocytów

Liczba

hodowanych

zarodków

Liczba

dzielących się

zarodków

(%)

Liczba

morul

(%)

Liczba

blastocyst

(%)

FE/AE

(impulsy elektryczne)

(grupa IIA)

530 451/530

(85,1%)a 330/530

(62,3%)aC 175/530

(33,0%)a

SAF-C

(impulsy elektryczne +

jonomycyna wap-

nia/cykloheksimid)

(grupa IIB)

496 377/496

(76,0%)bA 275/496

(55,4%)aA 121/496

(24,4%)bA

PFATK


(grupa IIC)

476 442/476

(92,9%)cB 356/476

(74,8%)B 203/476

(42,6%)cB



popełnienia błędu losowego 0,01<P≤0,05. A, B − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie bardzo wysoko istotne różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P≤0,001. B, C − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie wysoko istotne różnice


Tabela 16. Wpływ metod aktywacji oocytów zrekonstruowanych techniką elektrofuzji z jąder fibroblastów płodowych na procesy apoptozy/nekrozy i średnią liczbę komórek w blastocystach klonalnych [*test χ


Metoda aktywacji

zrekonstruowanych

oocytów

Liczba

uzyskanych

blastocyst

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(aneksyna V-eGFP)

(%)*

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(YO-PRO-1)

(%)*

Średnia ( )**

liczba

komórek

w blastocystach

(n)

FE/AE


(grupa IIA)

175 28/88

(31,8%)a 18/87

(20,7%)a = 34,8C

(n = 88)

SAF-C


jonomycyna wap-

nia/cykloheksimid)

(grupa IIB)

121 25/61

(41,0%)bA 16/60

(26,7%)aA = 27,5A

(n = 61)

PFATK


(grupa IIC)

203 23/102

(22,5%)cB 13/101

(12,9%)bB = 49,8B

(n = 102)



popełnienia błędu losowego 0,01<P≤0,05. A, B; A, C; B, C − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie bardzo wysoko

istotne różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P≤0,001.


62

Tabela 17. Wpływ metod aktywacji oocytów zrekonstruowanych techniką docytopla-

zmatycznej mikroiniekcji z jąder fibroblastów tkanki skórnej dorosłych osobników na

potencjał rozwojowy in vitro klonalnych zarodków świni [test χ2]

Metoda aktywacji

zrekonstruowanych

oocytów

Liczba

hodowanych

zarodków

Liczba

dzielących się

zarodków (%)

Liczba

morul

(%)

Liczba

blastocyst

(%)

AE


(grupa IIIA)

691 406/691

(58,8%)aA 298/691

(43,1%)aD 77/691

(11,1%)a

SAF-C

(impulsy elektryczne + jonomy-

cyna wapnia/cykloheksimid)

(grupa IIIB)

654 309/654

(47,2%)B 222/654

(33,9%)bB 28/654

(4,3%)aB

PFATK


(grupa IIIC)

253 174/253

(68,8%)bC 138/253

(54,5%)C 51/253

(20,2%)bC

a, b − niejednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn

oznaczają statystycznie istotne różnice między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem popełnie-nia błędu losowego 0,01<P≤0,05. A, B; C, D − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie wysoko istotne różnice

między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,001<P≤0,01. B, C − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie bardzo wysoko istotne

różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P≤0,001.

Tabela 18. Wpływ metod aktywacji oocytów zrekonstruowanych techniką docytopla-zmatycznej mikroiniekcji z jąder fibroblastów tkanki skórnej dorosłych osobników na procesy apoptozy/nekrozy i średnią liczbę komórek w blastocystach klonalnych [*test χ

2;

**ANOVA – test t-Studenta]

Metoda aktywacji

zrekonstruowanych

oocytów

Liczba

uzyskanych

blastocyst

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(aneksyna V-eGFP)

(%)*

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(YO-PRO-1)

(%)*

Średnia

( )** liczba

komórek

w blastocy-

stach (n)

AE


(grupa IIIA)

77 16/39

(41,0%)a 11/38

(28,9%)aC = 26,7D

(n = 39)

SAF-C


jonomycyna wap-

nia/cykloheksimid)

(grupa IIIB)

28 7/14

(50,0%)bA 5/14

(35,7%)aA = 21,6A

(n = 14)

PFATK


(grupa IIIC)

51 8/26

(30,8%)cB 4/25

(16,0%)B = 31,2B

(n = 26)

a, b; a, c − niejednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn oznaczają statystycznie istotne różnice między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem

popełnienia błędu losowego 0,01<P≤0,05. A, B; B, C − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie bardzo wysoko istotne różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P≤0,001. A, D; B, D − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie wysoko istotne różnice



63

Tabela 19. Wpływ metod aktywacji oocytów zrekonstruowanych techniką docytopla-

zmatycznej mikroiniekcji z jąder fibroblastów płodowych na potencjał rozwojowy in

vitro klonalnych zarodków świni [test χ2]

Metoda aktywacji

zrekonstruowanych

oocytów

Liczba

hodowanych

zarodków

Liczba

dzielących się

zarodków (%)

Liczba

morul

(%)

Liczba

blastocyst

(%)

AE


(grupa IVA)

452 329/452

(72,8%)A 240/452

(53,1%)aD 103/452

(22,8%)a

SAF-C

(impulsy elektryczne + jonomycyna

wapnia/cykloheksimid)

(grupa IVB)

437 261/437

(59,7%)B 195/437

(44,6%)bB 64/437

(14,6%)bB

PFATK


(grupa IVC)

359 300/359

(83,6%)C 244/359

(68,0%)C 116/359

(32,3%)cC

a, b; a, c − niejednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn oznaczają statystycznie istotne różnice między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,01<P≤0,05. A, B; B, C; C, D − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie bardzo wysoko istotne różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P≤0,001. A, C − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie wysoko istotne różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,001<P≤0,01.

Tabela 20. Wpływ metod aktywacji oocytów zrekonstruowanych techniką docytopla-zmatycznej mikroiniekcji z jąder fibroblastów płodowych na procesy apoptozy/nekrozy i średnią liczbę komórek w blastocystach klonalnych [*test χ

2; **ANOVA – test

t-Studenta]

Metoda aktywacji

zrekonstruowanych

oocytów

Liczba

uzyska-

nych

blastocyst

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(aneksyna V-eGFP)

(%)*

Liczba

apoptotycznych/

nekrotycznych

blastocyst

(YO-PRO-1)

(%)*

Średnia ( )**

liczba

komórek

w blastocystach

(n)

AE


(grupa IVA)

103 25/52

(48,1%)A 16/51

(31,4%)aD = 28,4E

(n = 52)

SAF-C


jonomycyna wap-

nia/cykloheksimid)

(grupa IVB)

64 20/32

(62,5%)B 14/32

(43,8%)B = 23,4B

(n = 32)

PFATK


(grupa IVC)

116 19/58

(32,8%)C 13/58

(22,4%)bC = 41,6C

(n = 58)

a, b − niejednakowe wskaźniki górne (małe litery alfabetu) przy wartościach umieszczonych w obrębie kolumn oznaczają statystycznie istotne różnice między grupami doświadczalnymi, z prawdopodobieństwem popełnie-nia błędu losowego 0,01<P≤0,05. A, B; A, C; B, C; C, E − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie bardzo wysoko istotne różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego P≤0,001. B, D; B, E − niejednakowe wskaźniki górne (duże litery alfabetu) oznaczają statystycznie wysoko istotne różnice między grupami, z prawdopodobieństwem popełnienia błędu losowego 0,001<P≤0,01.


64

5. OMÓWIENIE WYNIKÓW

Niska wydajność klonowania somatycznego świń (2−5%) wymusza po-

trzebę podejmowania działań zmierzających do poprawy skuteczności tej tech-

nologii, a także do rozpoznania możliwych konsekwencji jej zastosowania.

Osiągnięcie tego celu możliwe jest poprzez optymalizację zarówno procedury

klonowania, jak i warunków dojrzewania mejotycznego in vitro oocytów-

biorców jąder oraz hodowli somatycznych komórek-dawców jąder. To z kolei

ma wpływ na obniżenie częstości występowania symptomów śmierci apopto-

tycznej komórek przedimplantacyjnych zarodków klonalnych, a tym samym na

poprawę ich jakości morfologicznej, biochemicznej i biofizycznej.

W procedurze klonowania somatycznego czynnikami indukującymi pro-

cesy apoptozy w komórkach zarodków mogą być zarówno metody rekonstruk-

cji, jak i sztucznej aktywacji oocytów.

Rekonstrukcja enukleowanego oocytu (cytoplastu/ooplastu) polega na

wprowadzeniu w miejsce usuniętego materiału genetycznego genomu jądrowego

komórki somatycznej. Konsekwencją tego jest utworzenie klonalnej hybrydy

jądrowo-cytoplazmatycznej (tj. cybrydy klonalnej). W klonowaniu świń stoso-

wane są dwie metody rekonstrukcji enukleowanych (wyjądrzonych) oocytów.

Powszechnie wykorzystywaną metodą jest procedura niechirurgicznego transfe-

ru jądra komórkowego w oparciu o fuzję cytoplastu z komórką somatyczną,

indukowaną impulsem/impulsami elektrycznymi. Alternatywną techniką rekon-

strukcji jest procedura mikrochirurgiczna obejmująca iniekcję karioplastów lub

całych komórek somatycznych bezpośrednio do cytoplazmy wyjądrzonych

oocytów. Technika rekonstrukcji oocytów może w dużym stopniu wpływać na

molekularne mechanizmy rearanżacji chromatyny jądrowej, obejmujące zarów-

no strukturalne przemodelowanie, jak i epigenetyczne przeprogramowanie DNA

genomowego komórki somatycznej. Połączenie środowisk cytoplazmatycznych

dwóch komórek znajdujących się w różnych stadiach cyklu podziałowego

(somatycznej komórki – dawcy jądra w fazie G1/G0 cyklu mitotycznego oraz

oocytu – biorcy jądra, którego cykl mejotyczny został zablokowany w stadium

metafazy II) powoduje bowiem zakłócenie mechanizmów kontrolujących prze-

bieg cyklu, a w konsekwencji anomalie w dalszym rozwoju zygoty klonalnej.

Jedną z tych anomalii jest zainicjowanie procesu śmierci apoptotycznej w ko-


65

mórkach zarodków klonalnych w następstwie przejściowego naruszenia inte-

gralności błony plazmatycznej i dezorganizacji sieci mikrofilamentów aktyno-

wych membranoszkieletu oraz cytoszkieletu strefy kortykalnej oocytów rekon-

stytuowanych z jąder komórek somatycznych. Apoptoza może być również

indukowana w wyniku transmisji przedwczesnego sygnału aktywacyjnego

podczas zabiegu wprowadzania jądra komórki somatycznej do środowiska

cytoplazmatycznego oocytu-biorcy.

Nieprawidłowo zainicjowany przez sztuczne aktywatory mechanizm

transdukcji sygnału wapniowego w cytozolu zrekonstytuowanych oocytów świni

może prowadzić nie tylko do stymulacji programu rozwojowego zarodków

klonalnych na skutek niekontrolowanego przyrostu wewnątrzkomórkowego

stężenia kationów wapnia (Hao i in., 2004; Liu i Keefe, 2000; Liu i in., 2002,

2005; Kidson i in., 2004; Rubio Pomar i in., 2004a) (tab. 21), lecz także może

powodować stopniowe uruchomienie programowanej śmierci (apoptozy) komó-

rek zarodkowych (Petr i in., 2002; Jellerette i in., 2006; Assefa i in., 2004; He

i in., 1997a, b, 1999) (tab. 21). W błonach retikulum endoplazmatycznego (ER)

oraz w zewnętrznej błonie mitochondrialnej komórek dzielących się zarodków

uruchamiany jest wówczas mechanizm nadekspresji białek Bad i Bax, które są

przedstawicielami klasy stymulatorów/promotorów apoptozy z rodziny białek

Bcl-2 regulujących proces samobójczej śmierci fizjologicznej (Pinton i Rizzuto,

2006; Sanges i Marigo, 2006; Shimizu i Tsujimoto, 2000). Wzrost stężenia

i poziomu aktywności proapoptotycznych białek Bad i Bax w błonach różnych

organelli komórkowych przyczynia się do przyśpieszenia akumulacji jonów Ca2+

w cysternach i kanalikach siateczki śródplazmatycznej przez pompy wapniowe,

co z kolei zwiększa natężenie wewnątrzkomórkowego przepływu wolnych

kationów wapnia z ER do mitochondriów (Capano i Crompton, 2002; Donovan

i Cotter, 2004; Exley i in., 1999; Jurisicova i in., 1998, 2003). Ponadto stymula-

cja aktywności translacyjnej cząsteczek mRNA, będących produktami tran-

skrypcji protoonkogenów bad oraz bax, indukuje wzrost częstotliwości oraz

amplitudy falowych wyrzutów jonów Ca2+

zmagazynowanych w retikulum

endoplazmatycznym, w następstwie podwyższenia poziomu gęstości oraz ak-

tywności kanałów wapniowych zależnych od 1,4,5-trisfosforanu myo-inozytolu

(InsP3) (Lindenboim i in., 2000; Liu i in., 2000). Kolejnym efektem oddziaływa-

nia białek Bad oraz Bax, które jednocześnie pełnią funkcję inhibitorów aktyw-

ności antyapoptotycznych białek z podrodziny Bcl-2, jest nasilenie transportu

aktywnego kationów wapniowych do otoczki jądrowej i nukleoplazmy jąder

komórkowych przez ATPazy zależne od jonów Ca2+

(Jürgensmeier i in., 1998;

Mahaney i in., 2005; Nutt i in., 2002a, Scorrano i in., 2003).


66

Tabela 21. Rola sztucznej aktywacji oocytów zrekonstruowanych z jąder komórek

somatycznych w przedimplantacyjnym rozwoju zarodków klonalnych

Wapń jest przekaźnikiem sygnałów inicjujących wiele procesów komór-

kowych. W warunkach cytofizjopatologicznych może również indukować

apoptozę (ryc. 3). Proapoptotyczne działanie jonów Ca2+

ma bezpośredni zwią-

zek z występowaniem w komórkach zarodkowych Ca2+

-zależnych enzymów

w błonie plazmatycznej, cytozolu, jądrze oraz w mitochondriach (Acton i in.,

2004; Chi i in., 2000; Metcalfe i in., 2004; Pampfer i in., 2001). W komórkach

apoptotycznych obserwowany jest wyciek wapnia z retikulum endoplazmatycz-

nego oraz wzrost jego zawartości w cytozolu i mitochondriach (Pinton i in.,

2002; Grebinyk i in., 2005; Distelhorst i Roderick, 2003; Oakes i in., 2005).

Wpływ aktywacji na: Inicjacja i regulacja procesów:

wznowienie i ukończe-

nie cyklu mejotycznego zre-

konstytuowanego oocytu

(cybrydy klonalnej)

przekroczenie punktu kontrolnego metafaza II/

anafaza II podziału mejotycznego (wyrównawcze-

go/ekwacyjnego)

spadek poziomu i aktywności czynników MPF

oraz CSF (kaskady enzymatycznej kinaz

ERK/MAPK) poprzez degradację proteasomową

cyklin B i A w anafazie II

uruchomienie programu

rozwojowego zarodka klonal-

nego

przejście z mejotycznej do mitotycznej kontroli

cyklu komórkowego

strukturalne oraz epigenetyczne przemodelowa-

nie chromatyny komórki-dawcy jądra oraz uformo-

wanie pseudoprzedjądrzy

determinacja genetycznej/epigenetycznej kontroli

przed- i poimplantacyjnych kompetencji rozwojo-

wych zarodków i płodów klonalnych:

• wpływ na stopień ekspresji genów kluczo-

wych dla rozwoju przedimplantacyjnego np. Oct-

3/Oct-4 lub regulacji procesów apoptozy embrio-

nalnej np. bad

• wpływ na przeprogramowanie pamięci epige-

netycznej DNA jądrowego komórki somatycznej:

uwarunkowana epigenetycznie kontrola

aktywności transkrypcyjnej genów oraz pro-

cesów związanych ze zjawiskiem rodziciel-

skiego piętna gametycznego (imprintingu ge-

nomowego)

wpływ na ooplazmatyczny wzorzec dziedziczenia

genomu mitochondrialnego:

• ograniczenie zjawiska heteroplazmii mtDNA

oraz zaburzeń w komunikacji między genomem

jądrowym i mitochondrialnym


67

Wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia wywiera istotny wpływ na

zmiany aktywności proteaz cysteinowych (np. kalpain) i proteaz serynowych

(np. granzymu B, apoptotycznej proteazy AP24) oraz endonukleaz zależnych od

jonów Ca2+

i Mg2+

(NUC18, NUC70, DNaza I, DNaza γ) (Goetz i Nabi, 2006;

Leite i in., 2003; Marin i in., 1996; Nicotera i Rossi, 1994) (ryc. 3). Transgluta-

minazy to grupa enzymów, których aktywność również zależy od jonów Ca2+

(ryc. 3). Enzymy te katalizują posttranslacyjne włączanie się amin do łańcuchów

polipeptydowych oraz powodują sieciowanie białek. Sugeruje się, że transglu-

taminazy biorą udział w stabilizacji struktury komórki apoptotycznej oraz po-

wstających z niej ciałek apoptotycznych (Fesus i in., 1996). W mitochondriach

jony Ca2+

stymulują produkcję reaktywnych form tlenu, przyspieszają depolary-

zację oraz otwarcie megakanałów. W błonie mitochondrialnej procesy z udzia-

łem wapnia regulowane są przez białka rodziny Bcl-2 (ryc. 3). Z kolei w błonie

plazmatycznej jony Ca2+

uczestniczą w regulacji asymetrii fosfolipidów, pełniąc

funkcje aktywatorów skramblazy oraz inhibitorów translokazy aminofosfolipi-

dów (Martínez i Freyssinet, 2001; Frasch i in., 2004; Fadeel i in., 1999b) (ryc.

3). W wyniku zmian zachodzących w blastomerach z udziałem wapnia dochodzi

do uwolnienia z mitochondriów proapoptotycznych białek, aktywacji kaspaz,

fragmentacji DNA, zmiany asymetrii fosfatydyloseryny i apoptotycznej śmierci

części komórek w hodowanych in vitro zarodkach klonalnych (Du i in., 2000;

Ferraro-Peyret i in., 2002; Liu i in., 1999; Nouraini i in., 2000).


68

Ca - i Mg -zależne

endonukleazy

NUC18, NUC70, DNaza I, DNaza

2+ 2+

γ

Proteazy cysteinowe

Kalpainy

Proteazy serynowe

Granzym B, AP 24

Ca2+

Białka rodziny Bcl-2Transglutaminazy

Skramblazy i translokazy

aminofosfolipidów

Ryc. 3. Kationy wapnia jako czynniki regulatorowe w szlakach transdukcji wewnątrzkomór-

kowych sygnałów inicjujących aktywność białek proapoptotycznych i antyapoptotycznych

Uruchomienie molekularnego scenariusza apoptozy w hodowanych in

vitro zarodkach świni i innych gatunków ssaków jest kluczowym elementem

mechanizmu regulatorowego przedimplantacyjnej fazy embriogenezy oraz

śmiertelności zarodków w stadium blastocysty (Hao i in., 2004; Gjørret i in.,

2002, 2003, 2005; Levy i in., 2001; Long i in., 1998). W badaniach przeprowa-


69

dzonych przez Hao i in. (2003) udowodniono, że natężenie/częstość procesu

programowanej śmierci, która była diagnozowana w oparciu o detekcję mono-

i/lub oligonukleosomowej fragmentacji DNA jądrowego techniką TUNEL,

wzrasta w komórkach węzła zarodkowego (ICM) i trofoblastu blastocyst wraz

z wydłużeniem czasu hodowli in vitro zarodków klonalnych zrekonstruowanych

z jąder postnatalnych fibroblastów tkanki skórnej. Pierwsze symptomy późno-

apoptotycznego trawienia nukleolitycznego DNA genomowego są diagnozowa-

ne w komórkach blastocyst klonalnych uzyskanych w 5. dniu hodowli in vitro,

a nasilenie tego procesu jest obserwowane w okresie od 5. do 8. dnia hodowli

pozaustrojowej. Zwiększenie frekwencji objawów fragmentacji genomu jądro-

wego, które towarzyszą późnym fazom samobójczej śmierci fizjologicznej

komórek w blastocystach klonalnych, może być spowodowane zaburzeniami

w stopniu ploidalności komórek zarodkowych, uzależnionymi od metod sztucz-

nej aktywacji zrekonstruowanych oocytów (Campbell i Alberio, 2003; Shi i in.,

2004). Te ostatnie są wynikiem mutacji genomowych, czyli liczbowych aberra-

cji chromosomowych typu euplodii i/lub aneuploidii w blastomerach zarodków

klonalnych. Nukleoliza DNA w komórkach blastocyst klonalnych może być

także indukowana wskutek wystąpienia i akumulacji błędów w strukturalnym

przemodelowaniu chromatyny jądrowej oraz w funkcjonalnym przeprogramo-

waniu epigenetycznie uwarunkowanej aktywności transkrypcyjnej genomu

jądrowego w przedimplantacyjnej fazie rozwoju zarodkowego. Wady te określa-

ne są łącznie mianem mutacji epigenomowych (Beaujean i in., 2004; Dean i in.,

2003; Kang i in., 2001; Samiec, 2004). Stopień zaawansowania procesu późno-

apoptotycznej fragmentacji mono- oraz oligonukleosomowej DNA genomowego

w komórkach blastocyst klonalnych może być również pozytywnie skorelowany

z częstotliwością występowania nieprawidłowych interakcji jądrowo-

cytoplazmatycznych w zrekonstytuowanych oocytach świni, poddanych sztucz-

nej aktywacji fizycznej i/lub chemicznej (Campbell i Alberio, 2003; Samiec,

2005a, b; Samiec i Skrzyszowska, 2005a). Wzorzec akompatybilnej komunikacji

między genomem jądrowym a genomem mitochondrialnym uzależniony od

stopnia współwystępowania (hybrydyzacji) heteroplazmatycznych kopii mtDNA

(pochodzenia matczynego oraz somatogenicznego) w blastomerach przedim-

plantacyjnych zarodków klonalnych (Samiec, 2005b) może także przyczyniać

się do nasilenia objawów śmierci apoptotycznej komórek ICM oraz trofoekto-

dermy blastocyst na poziomie genetycznym, biochemicznym oraz ultrastruktu-

ralnym i morfologicznym (Hao i in., 2003; Fahrudin i in., 2002; Jang i in., 2004;

Liu i in., 2005). Charakterystycznym wskaźnikiem korelującym dodatnio ze

słabą jakością morfologiczną blastocyst klonalnych jest stosunkowo wysokie

natężenie takich symptomów towarzyszących późnym fazom apoptozy komórek

zarodkowych jak: 1. obkurczanie cytoplazmy wskutek postępującej dehydratacji

(odwodnienia) cytozolu (Hardy i in., 2001; Pierce i in., 1989); 2. postępująca

fragmentacja cytoplazmy (Brison i Schultz, 1998; Hardy, 1997, 1999; Jurisicova

i in., 1995; Matwee i in., 2000); 3. kondensacja chromatyny jądrowej oraz jej

marginalizacja i agregacja w postaci grudkowatych skupisk pod otoczką jądrową


70

(Hao i in., 2003; Hinck i in., 2001; Mateusen i in., 2005); 4. pofałdowanie (re-

trakcja) ultrastruktury powierzchniowej błony komórkowej i otoczki jądrowej

oraz akumulacja obłonionych struktur pęcherzykopodobnych (ang. blebbing),

zawierających fragmenty cytoplazmy na zewnętrznej dwuwarstwie białkowo-

fosfolipidowej plazmolemmy (Long i in., 1998; Spanos i in., 2002; Pampfer

i in., 1997); 5. kontrolowana degradacja zagęszczonej chromatyny, wypełniają-

cej pyknotyczne jądro do wielkocząsteczkowych odcinków genomu o dużej

długości (300 kpz-1 Mpz oraz 200-300 kpz) i średniej długości (20-50 kpz)

(Long i in., 1998; Van Blerkom i in., 2001; Warner i in., 1998; Zhang i in.,

2003); 6. internukleosomowe cięcie enzymatyczne DNA jądrowego do nisko-

cząsteczkowych fragmentów genomu odpowiadających długości mononukle-

osomowego DNA (180-200 pz) lub jego wielokrotności (odcinki oligonukle-

osomowe) (Byrne i in., 1999; Gavrieli i in., 1992; Gjørret i in., 2005; Neuber

i in., 2002; Rubio Pomar i in., 2005); 7. kariolityczny rozpad struktur aparatu

jądrowego (otoczki jądrowej, jąderek) oraz destrukcja proteolityczna składników

kariolimfy (macierzy jądrowej) i lamin jądrowych (Hao i in., 2004; Hinck i in.,

2003; Mateusen i in., 2005), a także 8. powstawanie ciałek apoptotycznych,

czyli obłonionych fragmentów komórki będących nośnikami organelli komór-

kowych oraz resztkowej (szczątkowej) chromatyny i cytoplazmy (Hao i in.,

2003; Jurisicova i in., 1996; Pampfer i Donnay, 1999). Cytologiczna ocena

jakości morfologicznej blastocyst obejmuje różne stopnie kondycji strukturalno-

funkcjonalnej zarodka i jest z reguły szacowana w oparciu o całkowitą liczbę

komórek, stosunek liczbowy komórek węzła zarodkowego do komórek trofoek-

todermy, stosunek procentowy komórek ICM do całkowitej liczby komórek oraz

objętość blastocelu (stopień zaawansowania procesu kawitacji) (Jurisicova

i Acton, 2004; Mateusen i in., 2005).

W diagnostyce symptomów ultrastrukturalnych oraz biochemicznych,

towarzyszących późnym fazom apoptozy w komórkach zarodków świni, stoso-

wano dotąd rutynowo metody nieprzyżyciowej (tj. wymagającej utrwalania i/lub

permeabilizacji plazmolemmy) detekcji procesu zaprogramowanej genetycznie

śmierci komórkowej (Hao i in., 2003, 2004; Long i in., 1998; Rubio Pomar i in.,

2004b; Yang i Rajamahendran, 2002). Metoda TUNEL, powszechnie wykorzy-

stywana w analizie fluorescencyjnej komórek zarodków świni i innych gatun-

ków ssaków, znajdujących się w stadium destrukcyjnym apoptozy, służy do

wykrywania międzynukleosomowych pęknięć polinukleotydowych łańcuchów

DNA jądrowego. Jedyna metoda przyżyciowego oznaczania zmian wczesno-

i późnoapoptotycznych oraz nekrotycznych była zastosowana po raz pierwszy

przez Mateusena i in. (2005) w embriologii eksperymentalnej świń. Posłużyła

ona do fluorescencyjnej oceny kondycji strukturalno-funkcjonalnej, skorelowa-

nej z jakością morfologiczną hodowanych in vitro zarodków, które rozwijały się

z zapłodnionych in vivo oocytów. Istotą tej kompleksowej diagnostyki jakości

biochemicznej i biofizycznej zarodków świni było z jednej strony wykrywanie

obecności reszt fosfatydyloseryny (PS) w zewnętrznej dwuwarstwie lipidowej

błon plazmatycznych wczesno- i późnoapoptotycznych komórek zarodkowych


71

poprzez preferencyjne wiązanie tego fosfolipidu za pośrednictwem aneksyny V

sprzężonej z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). Z drugiej zaś strony, jej

istotą było oszacowanie stopnia integralności plazmolemmy poprzez detekcję jej

zwiększonej przepuszczalności dla fluorochromu wiążącego się niespecyficznie

z DNA i RNA – jodku propidyny (PI) w komórkach nekrotycznych, późnoapop-

totycznych oraz wykazujących wtórną nekrozę. Z kolei nieprzepuszczalność

plazmolemmy dla niskocząsteczkowego barwnika PI, która była monitorowana

w komórkach wczesnoapopoptotycznych oraz żywych, określana jest mianem

zdolności „wykluczania” przez błonę plazmatyczną jodku propidyny (Mateusen

i in., 2005). Niemniej jednak kondycja strukturalno-funkcjonalna blastocyst

rozwijających się z zapłodnionych in vivo oocytów, wyrażana jakością morfo-

logiczną ocenianą w oparciu o całkowitą liczbę komórek oraz jakością bioche-

miczną i biofizyczną, ocenianą na podstawie detekcji zmian apoptotycznych

w komórkach węzła zarodkowego i/lub trofoblastu, jest znacznie wyższa niż

w przypadku blastocyst uzyskiwanych na drodze klonowania somatycznego lub

pozaustrojowego zapłodnienia oocytów (IVF; ang. in vitro fertilization).

Stosowanie przyżyciowych metod fluorescencyjnej detekcji zmian pro-

apoptotycznych jest warunkiem koniecznym w kompleksowej ocenie przedim-

plantacyjnego potencjału rozwojowego oraz jakości morfologicznej, biofizycz-

nej (ultrastrukturalnej) i biochemicznej zarodków klonalnych. Niezbędnym

elementem tej oceny wydaje się także nieinwazyjna lub nisko inwazyjna diagno-

styka molekularna niektórych symptomów charakterystycznych dla wczesnych

stadiów apoptozy (przełom fazy inicjatorowej oraz wykonawczej) (Feugang

i in., 2002; Gjørret i in., 2005; Liu i in., 2005; Rubio Pomar i in., 2005). Ocena

kondycji strukturalno-funkcjonalnej blastocyst klonalnych pod kątem detekcji

cech znamiennych dla stosunkowo wczesnych etapów samobójczej śmierci

fizjologicznej komórek, kiedy proces ten nie przekroczył jeszcze punktu nieod-

wracalności w fazie wykonawczej (efektorowej), może być także wysoce przy-

datna w klinicznych metodach szacowania poimplantacyjnego stopnia przeży-

walności blastocyst transplantowanych do narządów układu rozrodczego matek

zastępczych (Hao i in., 2003; Hardarson i in., 2001; Jang i in., 2004; Liu i in.,

2005). Na podstawie takiej oceny można by zatem przewidywać w sposób

bardziej kontrolowany kompetencje rozwojowe blastocyst klonalnych świni po

ich transferze do dróg płciowych (jajowodów lub rogów macicy) loch- lub

loszek-biorczyń, co skutkowałoby radykalnym obniżeniem wskaźnika śmiertel-

ności okołoimplantacyjnej zarodków (Antczak i Van Blerkom, 1999; Brison

i Schultz, 1998; Hao i in., 2004; Jang i in., 2004; Pampfer i Donnay, 1999). To

z kolei mogłoby się przyczynić do zwiększenia efektywności klonowania soma-

tycznego świń, mierzonej odsetkiem rozwijających się do końca ciąży zarodków

klonalnych w stosunku do liczby skutecznie zrekonstruowanych oocytów (Ma-

teusen i in., 2005; Fahrudin i in., 2002; Ebner i in., 2001). Dlatego też, w ramach

realizacji badań własnych, do oceny kondycji strukturalno-funkcjonalnej blasto-

cyst klonalnych zastosowano metodę przyżyciowej (a zarazem mało inwazyjnej)

analizy fluorescencyjnej jednego z najwcześniejszych symptomów biochemicz-


72

nych śmierci apoptotycznej. Jest nim eksternalizacja reszt fosfatydyloseryny

(PS) na powierzchni zewnątrzkomórkowej błony plazmatycznej komórek węzła

zarodkowego i/lub trofoblastycznych. Z kolei proces trwałej translokacji reszt

PS z monomolekularnej warstwy wewnętrznej do zewnętrznej w obrębie dwu-

warstwy (matrycy) fosfo- i glikolipidowej plazmolemmy prowadzi do zainicjo-

wania transformacji biofizycznych obejmujących postępującą utratę asymetrii

(anizotropii), czyli różnic w sposobie rozmieszczenia oraz w składzie bioche-

micznym lipidów obu monowarstw plazmolemmy. W tej diagnostyce fluorycy-

tochemicznej zarodków wykorzystano aneksynę V – amfitropowe białko nisko-

cząsteczkowe (o masie molekularnej 35,8 kDa), które wykazuje nie tylko zdol-

ność do odwracalnego wiązania się zarówno z jonami Ca2+

, jak i z błonowymi

aminofosfolipidami, lecz także szczególnie wysokie powinowactwo do cząste-

czek fosfatydyloseryny (van den Eijnde i in., 1997; Martin i in., 1995a; Samiec

i Skrzyszowska, 2014; Samiec i in., 2013a). Aby jednak aneksyna V mogła mieć

praktyczne zastosowanie w detekcji i/lub oznaczaniu stopnia ekspozycji reszt PS

na powierzchni zewnątrzkomórkowej błony plazmatycznej za pośrednictwem

epi-fluorescencyjnych metod mikroskopowych, musi być sprzężona z odpo-

wiednim fluorochromem, charakteryzującym się widmem absorpcyjnym

z maksymalną długością fali wzbudzającej chemiluminescencję λAb(max) rzędu

488 nm, co odpowiada niebieskiemu pasmu falowemu polichromatycznego

światła białego. Wówczas widmo emisyjne takiego barwnika fluorescencyjnego

przypada na zielone pasmo falowe, czyli maksymalny stan wzbudzenia (ekscy-

tancji) chemiluminescencji wysyłanej przez fluorochrom będzie indukowany

przy długości fali λEm(max) rzędu 530 nm (Levy i in., 1998; Mateusen i in., 2005;

Samiec i Skrzyszowska, 2013). W badaniach własnych rdzeń koniugatu diagno-

stycznego apoptozy stanowi aneksyna V, która wyznakowana jest markerowym

białkiem intensywnej zieleni fluorescencyjnej (eGFP; ang. enhanced green

fluorescent protein) o fizjologicznych właściwościach biochemiluminescencyj-

nych, dodatkowo wzmocnionych poprzez jego rekombinację metodami inżynie-

rii genetycznej (Samiec i Skrzyszowska, 2013, 2014; Samiec i in., 2013a). To

reporterowe białko eGFP jest bowiem wyizolowaną z meduzy stułbiopława

Aequorea victoria fluorochromoproteiną, tzn. białkiem zawierającym fluoryzu-

jący chromofor zwany znacznikiem/indykatorem fluorescencyjnym. Analiza

procesu wczesnoapoptotycznej i nieodwracalnej ruchliwości translacyjnej (dyfu-

zji transwersalnej) części cząsteczek PS z wewnętrznej do zewnętrznej mono-

warstwy w obrębie matrycy lipidowej błon cytoplazmatycznych komórek bla-

stocyst klonalnych wykazała stosunkowo wysoki odsetek apoptotycznych za-

rodków, wahający się od 19,0% do 62,5%. Wyniki tej diagnostyki potwierdziły

zatem istnienie towarzyszącego procesowi apoptozy mechanizmu eliminacji nie

tylko asymetrycznego ułożenia fosfatydyloseryny w dwuwarstwie fosfolipido-

wej, lecz także zjawiska anizotropii opierającego się na istnieniu różnic w cał-

kowitym składzie lipidów między obiema monomolekularnymi warstwami

kompleksu lipoglikoproteinowego plazmolemmy komórek zarodkowych.

W oparciu o analizę porównawczą częstości pojawiania się wczesnoapoptotycz-


73

nych zmian biochemicznych w błonie cytoplazmatycznej komórek ICM oraz

trofoektodermy blastocyst klonalnych można wnioskować, że protokoły dwu-

stopniowej aktywacji fizykochemicznej (SAF-C) oraz postaktywacji fizycznej

(elektrycznej; AE) hybryd jądrowo-ooplazmatycznych miały bardziej nieko-

rzystny wpływ na potencjał przeżywalności zarodków rozwijających się do

stadium blastocysty niż protokoły pseudofizjologicznej/biologicznej postakty-

wacji transkomplementarnej (transcytoplazmatycznej; PFATK) oraz jednoczesnej

fuzji i aktywacji fizycznej (elektrycznej; FE/AE) rekonstytuowanych oocytów.

Potwierdzeniem tego jest wyższy wskaźnik przedimplantacyjnej śmiertelności

zarodków klonalnych, wyrażony odsetkiem apoptotycznych blastocyst w grupie

cybryd klonalnych poddawanych sekwencyjnej aktywacji fizykochemicznej (od

35,6% do 62,5%) lub postaktywacji elektrycznej (od 41,0% do 48,1%) w sto-

sunku do tych podlegających pseudofizjologicznej postaktywacji transkomple-

mentarnej (od 19,0% do 32,8%) lub tych aktywowanych elektrycznie w momen-

cie fuzji z komórkami fibroblastycznymi (od 28,4% do 31,8%). W oparciu

o wyniki przyżyciowej analizy fluorescencyjnej blastocyst klonalnych z użyciem

aneksyny V sprzężonej z białkiem eGFP, odnotowano także niższy odsetek

zarodków z potwierdzoną eksternalizacją reszt PS na powierzchni plazmolemmy

komórek węzła zarodkowego i/lub trofoblastu wśród wszystkich blastocyst

rozwijających się z cybryd klonalnych zrekonstruowanych z jąder fibroblastów

skóry ucha dorosłych osobników (od 19,0% do 50,0%) w stosunku do grupy

blastocyst uzyskanych z hybryd jądrowo-ooplazmatycznych zrekonstruowanych

z jąder fibroblastów płodowych (od 22,5% do 62,5%).

Zmiany biofizyczne (ultrastrukturalne), które dotyczą formowania przez

białka z grupy perforyn mikrokanałów lub mikroporów w błonach plazmatycz-

nych komórek hodowanych in vitro zarodków klonalnych, znajdujących się

prawdopodobnie we wczesnych fazach śmierci apoptotycznej (stadium wzbu-

dzenia oraz stadium efektorowe prawdopodobnie przed przekroczeniem kontrol-

nego punktu nieodwracalności apoptozy) wykrywano przy zastosowaniu drugiej,

z zaplanowanych w badaniach własnych, przyżyciowych metod fluorycytoche-

micznych z użyciem małocząsteczkowego barwnika specyficznie wiążącego się

z DNA – YO-PRO-1. Fluorochrom ten, podobnie jak mediatory procesu apopto-

zy − jony Ca2+

oraz cząsteczki granzymu B, wykazuje zdolność do dyfuzji

prostej przez powstałe w plazmolemmie mikrokanały (Daly i in., 1997; Estaqu-

ier i in., 1995). Niewielki wzrost przepuszczalności plazmolemmy dla drobno-

cząsteczkowych związków chromoforowych np. barwnika DNA jądrowego

i mitochondrialnego YO-PRO-1 nie jest zatem związany z utratą integralności

ultrastrukturalnej błony, lecz jest spowodowany powstawaniem mikroporów

w jej dwuwarstwie lipidowej (tzw. „dziur lipidowych”). Fluorochrom YO-PRO-

1 o wysokim stopniu labilności nie tylko z łatwością dyfunduje przez mikropory

w plazmolemmie, lecz także szybko następuje jego inkorporacja między pary

nukleotydów podwójnego α-heliksu DNA jądrowego (nDNA; ang. nuclear

DNA) oraz mitochondrialnego (mtDNA) w następstwie rozpadu wiązań wodo-

rowych między komplementarnymi parami zasad purynowych i pirymidyno-


74

wych adenina-tymina (A/T) i cytozyna-guanina (C/G). Początkowo sądzono, że

formowanie w błonie cytoplazmatycznej mikroporów, przez które przenika

fluorochrom YO-PRO-1, stanowi jeden z symptomów ultrastrukturalnych cha-

rakterystycznych dla wczesnych faz samobójczej śmierci fizjologicznej komórek

(Estaquier i in., 1996; Idziorek i in., 1995). Jednak obecnie uważa się, że barw-

nik YO-PRO-1 jest zdolny raczej do detekcji zjawisk biofizycznych, towarzy-

szących późnym stadiom apoptozy po przekroczeniu przez ten proces etapu

nieodwracalności szlaków molekularnych, które obejmują aktywację enzyma-

tycznej kaskady kaspaz wykonawczych oraz klasy białek proapoptotycznych,

należących do rodziny Bcl-2 (Samiec i Skrzyszowska, 2012a, Skrzyszowska

i in., 2006). Fluorochrom ten może bowiem ulec inkorporacji do dwuniciowych,

kolistych cząsteczek mtDNA tylko w takich przypadkach, kiedy w miejscach

styku zewnętrznej i wewnętrznej błony mitochondrialnej, w obrębie których

zostały otwarte pory odpowiedzialne za destabilizację ultrastrukturalną i zwięk-

szoną przepuszczalność transbłonową mitochondriów, zostaną utworzone tzw.

megakanały (PTPs; ang. permeability transition pores), określane również jako

„dziury lipidowe” (Shoshan-Barmatz i in., 2006; Shimizu i in., 1999; Shimizu

i Tsujimoto, 2000). Przenikalność YO-PRO-1 przez błony mitochondrialne jest

możliwa tylko w momencie ich dezintegracji strukturalno-funkcjonalnej pod

wpływem tworzenia megakanałów, a te specyficzne kompleksy porowe

w obrębie pofałdowanych zewnętrznych i wewnętrznych błon mitochondrial-

nych są formowane dopiero w późnych stadiach apoptozy, dla których znamien-

na jest całkowita utrata odwracalności biochemicznej/molekularnej tego procesu

(Daly i in., 1997; Lincz, 1998; Samiec i Skrzyszowska, 2012a, 2013; Skrzy-

szowska i in., 2006). Po 50−60-minutowej inkubacji blastocyst klonalnych

w mieszaninie fluorochromów: YO-PRO-1 (barwnik specyficznie wiążący się

z nDNA i mtDNA) oraz jodku propidyny (PI; ang. propidium iodide, barwnik

niespecyficznie wiążący się z DNA i RNA) i wzbudzeniu za pośrednictwem

absorpcji światła niebieskiego, chemiluminescencji wysyłanej przez diagnozo-

wane komórki, można wyróżnić trzy subpopulacje komórek zarodkowych.

Pierwszą z nich stanowią komórki żywe, które nie emitują żadnej fluorescencji,

drugą – YO-PRO-1-pozytywne oraz PI-negatywne komórki późnoapoptotyczne

po przekroczeniu punktu nieodwracalności przez fazę efektorową procesu sa-

mobójczej śmierci fizjologicznej, które fluoryzują na zielono. W komórkach

takich uformowane zostały megakanały w błonach mitochondrialnych oraz

mikropory w plazmolemmie, a sama błona plazmatyczna ma jeszcze zachowaną

ultrastrukturalną integralność (Shimizu i Tsujimoto, 2000) oraz stabilność funk-

cjonalną, której potwierdzeniem jest zdolność tzw. „wykluczania” przez błonę

jodku propidyny, tj. jej nieprzepuszczalność dla PI (Estaquier i in., 1996).

W tych komórkach mogą jednak już pojawić się pewne późnoapoptotyczne

symptomy morfologiczne w obrębie plazmolemmy, takie jak silne pofałdowania

na jej powierzchni zewnątrzkomórkowej oraz uwypuklające się z niej obłonione

pęcherzyki zawierające fragmenty cytoplazmy oraz proteolitycznie zdegradowa-

ne białka cytoszkieletu i membranoszkieletu – aktynę i fodrynę (tzw. pęcherzy-


75

kowatość błon; ang. blebbing) (Jänicke i in., 1998; Samiec i Skrzyszowska,

2012a, 2013; Samiec i in., 2013a). Trzecią frakcję analizowanych komórek

stanowią YO-PRO-1- oraz PI-pozytywne komórki, które po wzbudzeniu niebie-

skim widmem światła widzialnego, emitują zarówno zieloną, jak i czerwoną

fluorescencję. Do subpopulacji tej należą zatem komórki późnoapoptotyczne,

w których proces samobójczej śmierci fizjologicznej osiągnął fazę destrukcyjną

oraz komórki nekrotyczne. W obu typach komórek błona cytoplazmatyczna

utraciła już bezpowrotnie swoją integralność ultrastrukturalną, czego dowodem

jest jej przepuszczalność zarówno dla YO-PRO-1, jak i dla jodku propidyny

(Estaquier i in., 1995; Idziorek i in., 1995). Czynnikiem odróżniającym oba typy

YO-PRO-1- i PI-dodatnich komórek są kryteria morfologiczne. Komórki nekro-

tyczne charakteryzują się pyknotycznym jądrem komórkowym ulegającym

dezintegracji oraz osmotycznym pęcznieniem i wakuolizacją cytoplazmy,

a także rozpadem organelli komórkowych i wreszcie lizą całej struktury, nato-

miast komórki późnoapoptotyczne cechuje osmotyczne kurczenie się i fragmen-

tacja cytoplazmy, zjawisko pęcherzykowatości błony cytoplazmatycznej oraz

powstawanie półautonomicznych struktur komórkowych w formie ciałek apop-

totycznych zawierających resztkową cytoplazmę, fragmenty jądra komórkowego

oraz nienaruszone pozostałe organelle wewnątrzkomórkowe (Kroemer i in.,

1995; Samiec i Skrzyszowska, 2012a; Samiec i in., 2013a; Skrzyszowska i in.,

2006).

W odsetkach blastocyst z potwierdzonymi zmianami późnoapoptotycz-

nymi na podstawie YO-PRO-1-zależnej detekcji „dziur lipidowych”, czyli

mikrokanałów/mikroporów w błonie cytoplazmatycznej oraz megakanałów

w błonach mitochondrialnych komórek, zaobserwowano tendencję spadkową

w subpopulacjach zarodków klonalnych zrekonstruowanych z oocytów stymu-

lowanych przy użyciu protokołu PFATK (od 9,6% do 22,4%) lub protokołu

FE/AE (od 16,4% do 20,7%) w porównaniu z subpopulacjami zarodków zrekon-

struowanych z oocytów stymulowanych przy użyciu protokołu SAF-C (od 22,2%

do 43,8%) lub protokołu AE (od 28,9% do 31,4%). Ponadto, częstość występo-

wania charakterystycznych dla późnej apoptozy symptomów biofizycznych

w plazmolemmie komórek blastocyst klonalnych była niższa w przypadku

zarodków zrekonstytuowanych z jąder fibroblastów tkanki skórnej ucha doro-

słych osobników (od 9,6% do 35,7%) niż w przypadku zarodków zrekonstytu-

owanych z jąder płodowych komórek fibroblastycznych (od 12,9% do 43,8%).

Niski stopień inwazyjności zastosowanych w badaniach własnych metod

przyżyciowej analizy biochemicznych zmian zachodzących w błonie plazma-

tycznej apoptotycznych komórek blastocyst klonalnych wynika z faktu, że do

oceny kondycji strukturalno-funkcjonalnej hodowanych in vitro zarodków

wykorzystano technikę znakowania fluorescencyjnego komórek z użyciem tylko

jednego markera testowego – aneksyny V sprzężonej z białkiem intensywnej

zieleni fluorescencyjnej lub YO-PRO-1. Barwienie różnicowe komórek zarod-

kowych przy użyciu markera diagnostycznego zmian wczesnoapoptotycznych –

aneksyny V sprzężonej z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) oraz fluoro-


76

chromatycznego detektora komórek nekrotycznych i późnoapoptotycznych –

jodku propidyny (PI), nie wydaje się bowiem korzystnym rozwiązaniem

w kompleksowej ocenie kondycji strukturalno-funkcjonalnej hodowanych in

vitro zarodków, ponieważ jodek propidyny wykazuje silne właściwości cyto-

i genotoksyczne wobec komórek zarodkowych i somatycznych. Ponadto, fluoro-

chrom ten jest czynnikiem mutagennym, kancerogennym oraz teratogennym dla

komórek zarodkowych, dlatego też może on mieć szkodliwy wpływ na dalszy

rozwój in vitro i/lub in vivo zarodków świni poprzez zmniejszenie potencjału ich

przed- i poimplantacyjnej przeżywalności. Natomiast zwiększenie śmiertelności

zarodków, indukowane za pośrednictwem PI może w znacznym stopniu znie-

kształcać prawidłowy obraz przyżyciowej oceny morfologicznej oraz diagnosty-

ki biochemicznej (molekularnej) komórek zarodków w wyniku indukcji procesu

apoptozy przez samo zastosowanie fluorescencyjnego mediatora chemicznego

oraz pojawienie się fałszywie/pozornie pozytywnych wyników w wyniku reakcji

TUNEL. Wyniki te mogą dotyczyć wzrostu średniej wartości indeksu komórek

późnoapoptotycznych w hodowanych in vitro zarodkach w stosunku do warto-

ści, jaka powinna być w rzeczywistości (Mateusen i in., 2005; Levy i in., 1998;

van den Eijnde i in., 1997). W przeciwieństwie do stosowanego powszechnie

w barwieniu różnicowym komórek zarodkowych pod kątem detekcji ultrastruk-

turalno-funkcjonalnych symptomów wczesnej lub późnej apoptozy oraz śmierci

martwiczej – jodku propidyny, koniugat diagnostyczny aneksyna V-eGFP lub

fluorochrom YO-PRO-1 nie wykazują właściwości cytotoksycznych. Należy

zatem pamiętać, że mimo iż wyniki metody oceny jakości biochemicz-

nej/biofizycznej blastocyst klonalnych przy użyciu samej aneksyny V skoniu-

gowanej z fluorochromoproteiną eGFP lub samego tylko barwnika fluorescen-

cyjnego YO-PRO-1 umożliwiają oszacowanie całkowitego odsetka zarodków,

których komórki wykazują cechy charakterystyczne dla apoptozy, to nie pozwa-

lają one na precyzyjne rozróżnienie w analizowanej populacji blastocyst,

w komórkach których wykryto symptomy eksternalizacji reszt fosfatydyloseryny

na powierzchni plazmolemmy lub mikrokanały/mikropory błonowe, komórek

wczesnoapoptotycznych od komórek późnoapoptotycznych oraz komórek apop-

totycznych od nekrotycznych. Z drugiej jednak strony, uproszczenie techniki

diagnostyki molekularnej blastocyst klonalnych, w celu ograniczenia efektu

indukcji śmierci apoptotycznej w komórkach zarodkowych przez stosowane

w barwieniu fluorescencyjnym egzogenne mediatory chemiczne takie jak np.

jodek propidyny, nie przyczynia się do obniżenia wskaźnika przeżywalności

zarodków analizowanych in vitro w kierunku detekcji procesu apoptozy. Ten

kierunek fluorescencyjnej analizy przyżyciowej zapobiega bowiem uzyskiwaniu

wyników fałszywie pozytywnych poprzez zwiększenie rzeczywistego odsetka

zarodków wykazujących zmiany biochemiczne/biofizyczne, charakterystyczne

dla procesu programowanej śmierci komórkowej. Z kolei eliminacja ubocznego

wpływu szkodliwych czynników zewnątrzpochodnych, które są związane

z wyborem nieodpowiedniego znacznika fluorochromatycznego o potencjalnej

zdolności do inicjowania procesu apoptozy i/lub nekrozy w analizowanych


77

blastocystach, na wyniki diagnostyki molekularnej w kierunku wykrywania

objawów śmierci fizjologicznej w komórkach zarodkowych, umożliwiła prawi-

dłowe, tj. pozbawione statystycznych błędów losowych, określenie efektu od-

działywania czynników eksperymentalnych wskazanych w celu badawczym na

procesy apoptozy/nekrozy w blastocystach klonalnych świni. Wspomniane

czynniki eksperymentalne dotyczyły metod rekonstrukcji enukleowanych oocy-

tów lub metod sztucznej aktywacji już zrekonstytuowanych oocytów. Ponadto

zastosowanie takiej mało inwazyjnej metody przyżyciowej detekcji proapopto-

tycznych zmian funkcjonalnych w komórkach ICM i/lub trofoblastu blastocyst

zwiększa jej potencjał praktycznych możliwości aplikacyjnych. Takie techniki

diagnostyczne nie przyczyniają się bowiem dodatkowo do zmniejszenia odsetka

hodowanych in vitro zarodków o wysokiej jakości morfologiczno-

biochemicznej, które mogłyby być wyselekcjonowane na potrzeby zabiegu

transplantacji do narządów układu rozrodczego matek zastępczych, a tym sa-

mym nie stanowią one czynnika limitującego zdolności rozwojowe in vivo

blastocyst klonalnych w okresie okołoimplantacyjnym.

Odnotowany w badaniach własnych w wyniku analizy przyżyciowej od-

setek apoptotycznych blastocyst klonalnych świni jest znacznie niższy niż

odsetek świńskich i bydlęcych blastocyst klonalnych, jaki został oszacowany

w eksperymentach przeprowadzonych odpowiednio: przez Hao i in. (2003) oraz

Janga i in. (2004) w następstwie diagnostyki molekularnej utrwalonych i perme-

abilizowanych komórek późnoapoptotycznych z wykorzystaniem reakcji

TUNEL w celu detekcji internukleosomowej fragmentacji DNA genomowego.

Podczas gdy w badaniach własnych odsetek wykazujących symptomy wczesno-

i/lub późnoapoptotyczne blastocyst klonalnych, uzyskanych z zarodków zrekon-

struowanych z jąder fibroblastów skóry dorosłych osobników lub fibroblastów

płodowych, wahał się w granicach od 9,6% do 62,5%, w doświadczeniach Hao

i in. (2003) pozytywne w reakcji TUNEL zmiany późnoapoptotyczne DNA

genomowego wykryto w 100,0% uzyskanych blastocyst klonalnych rozwijają-

cych się z zarodków zrekonstytuowanych z jąder postnatalnych fibroblastów

tkanki skórnej. Podobnie, 100-procentowy odsetek późnoapoptotycznych blasto-

cyst klonalnych wykazała analiza TUNEL w przypadku zarodków zrekonstru-

owanych z jąder fibroblastów płodowych lub fibroblastów skóry ucha dojrzałej

somatycznie i rozpłodowo krowy (Jang i in., 2004). Na podstawie analizy po-

równawczej wyników badań własnych oraz przeprowadzonych przez Hao i in.

(2003) oraz Janga i in. (2004) nie można wykluczyć faktu, że oszacowany

w eksperymentach własnych odsetek blastocyst klonalnych świni ze zmianami

apoptotycznymi komórek ICM i/lub trofoektodermy utrzymywał się na znacząco

niższym poziomie, ponieważ źródłem dawców genomu jądrowego w procedurze

klonowania somatycznego były komórki fibroblastyczne, które przed selekcją do

zabiegu rekonstrukcji enukleowanych oocytów były analizowane w kierunku

detekcji zmian wczesnoapoptotycznych w obrębie błony cytoplazmatycznej.

Wydaje się, że przyżyciowa diagnostyka molekularna procesu apoptozy wyko-

rzystana do oceny kondycji strukturalno-funkcjonalnej komórek-dawców jąder


78

w procedurze klonowania somatycznego eliminuje możliwość generowania

statystycznych błędów losowych, które wynikają z transmisji sygnałów apopto-

tycznych z cytozolu lub kariolimfy hodowanych do stanu pełnej konfluencji

komórek fibroblastycznych do środowiska cytoplazmatycznego zrekonstruowa-

nych oocytów. Zapobieganie popełnianiu błędów losowych obniża do minimum

prawdopodobieństwo wpływu na procesy apoptozy w blastocystach klonalnych

czynników badawczych innych niż stosowane w klonowaniu somatycznym

protokoły/metody sztucznej aktywacji hybryd jądrowo-ooplazmatycznych.

Dlatego też wykorzystanie w procedurze klonowania świń tylko komórek fibro-

blastycznych, które klasyfikowane były uprzednio jako nieapoptotyczne

w wyniku selekcji negatywnej, mogło przyczynić się do tak drastycznego zredu-

kowania liczby blastocyst klonalnych z potwierdzonymi zmianami apoptotycz-

nymi w komórkach ICM i/lub trofoektodermy, a tym samym do znacznego

podwyższenia wartości procentowego wskaźnika ich przeżywalności w warun-

kach hodowli in vitro. Natomiast w badaniach przeprowadzonych przez Hao i in.

(2003) oraz Janga i in. (2004), do zabiegu klonowania somatycznego świń oraz

bydła mogły zostać wyselekcjonowane wczesnoapoptotyczne komórki fibrobla-

styczne o prawidłowym wyglądzie morfologicznym, w których jednak zainicjo-

wane zostały już zmiany biochemiczne i biofizyczne, m.in. takie jak: transloka-

cja reszt fosfatydyloseryny z wewnętrznej do zewnętrznej monowarstwy matry-

cy lipidowej plazmolemmy lub postępujące zwiększenie przepuszczalności

błony plazmatycznej dla niektórych związków drobnocząsteczkowych na skutek

formowania się w dwuwarstwie lipidowej mikrokanałów/mikroporów bez utraty

integralności plazmolemmy. Te zjawiska i procesy o podłożu molekularnym

mogą nie znajdować jeszcze odzwierciedlenia w stopniu zaawansowania de-

strukcyjnych zmian strukturalnych, czyli, innymi słowy, nie pokrywają się

jeszcze z transformacjami obrazu morfologicznego komórki somatycznej.

Z kolei transdukcja sygnałów apoptotycznych z komórek-dawców egzogennej

informacji genetycznej do cytoplazmy oocytów pozbawionych własnego geno-

mu jądrowego mogła doprowadzić do indukcji i/lub progresji molekularnego

scenariusza apoptozy również w hodowanych in vitro zarodkach klonalnych

rozwijających się ze zrekonstytuowanych oocytów, które poddawane były

działaniu różnych czynników aktywujących. W dalszej perspektywie czasowej

efektem zainicjowania zmian proapoptotycznych w przedimplantacyjnych

zarodkach rozwijających się z cybryd klonalnych zrekonstruowanych z jąder

wczesnoapoptotycznych komórek somatycznych mógł być wzrost odsetka

blastocyst, których komórki wykazują wykrywalne w wyniku reakcji TUNEL

symptomy późnej fazy destrukcyjnej apoptozy, do poziomu 100%. Ponadto,

w badaniach Janga i in. (2004) udowodniono, że indeks komórek późnoapopto-

tycznych, pozytywnych w reakcji TUNEL, istotnie wzrasta w bydlęcych blasto-

cystach rozwijających się z hodowanych zarodków klonalnych zrekonstruowa-

nych z jąder starzejących się replikacyjnie fibroblastów płodowych lub fibrobla-

stów skóry dorosłego osobnika, które poddawano procedurze głodzenia po

długoterminowej hodowli in vitro, obejmującej od 52 do 56 podwojeń populacji.


79

W porównaniu do wskaźnika komórek późnoapoptotycznych wynoszącego

odpowiednio: około 6,0% oraz 7,0% w blastocystach klonalnych uzyskanych

z zarodków zrekonstytuowanych z jąder głodzonych fibroblastów płodowych

lub tkanki skórnej dojrzałej somatycznie i rozpłodowo krowy, które poddawano

krótkotrwałej hodowli in vitro złożonej z 8−12 pasaży, odsetek komórek apopto-

tycznych w stosunku do całkowitej liczby komórek w blastocystach rozwijają-

cych się z zarodków zrekonstruowanych z jąder komórek fibroblastycznych

pochodzących z późnych pasaży (ponad 50 podwojeń populacji) osiągał poziom

rzędu odpowiednio: 8,8% oraz 8,9%. Wydaje się, że poddawane długotrwałej

hodowli in vitro komórki-dawcy jąder podlegają procesowi starzenia replikacyj-

nego, indukowanego postępującym skracaniem się długości telomerów oraz są

znacznie bardziej podatne na mutacje genowe i chromosomowe niż komórki

pochodzące z wczesnych pasaży (Cui i in., 2003; Dahse i in., 1997; Kato i in.,

2000b; Xu i Yang, 2001). Ponadto, w komórkach fibroblastycznych, które

przeszły wiele cykli podziałowych, akumulowane są liczne zaburzenia w epige-

netycznych modyfikacjach DNA genomowego (tzw. mutacje epigenomowe),

obejmujące zaawansowane zmiany w stopniu metylacji reszt cytozyny DNA

oraz zwiększenie częstości procesów deacetylacji reszt lizyny i argininy histo-

nów rdzenia nukleosomowego chromatyny jądrowej (Beaujean i in., 2004;

Campbell i Alberio, 2003; Dean i in., 2003; Kang i in., 2001; Samiec i Skrzy-

szowska, 2005a). Mutacje genomowe, nieprawidłowe dziedziczenie pamięci

epigenetycznej oraz stopniowa redukcja końcowych odcinków chromosomów

mogą łącznie prowadzić do uruchomienia w hodowanych komórkach somatycz-

nych, stanowiących źródło dawców jąder w procedurze klonowania, molekular-

nego scenariusza apoptozy (Tian i in., 2000; Jiang i in., 2004; Samiec, 2004,

2005b; Shi i in., 2004). Z uwagi na fakt, że biochemiczne czy biofizyczne zmia-

ny wczesnoapoptotyczne nie były monitorowane przed selekcją komórek fibro-

blastycznych do zabiegu rekonstrukcji enukleowanych oocytów, wysoce praw-

dopodobnym zjawiskiem mogła być transmisja sygnałów apoptotycznych

z cytozolu lub nukleoplazmy komórek-dawców jąder do ooplastów (Jang i in.,

2004). Nie można zatem wyeliminować możliwości wpływu długotrwałej ho-

dowli in vitro komórek fibroblastycznych na obniżenie żywotności oraz kondy-

cji strukturalno-funkcjonalnej bydlęcych blastocyst klonalnych poprzez wzrost

wartości indeksu pozytywnych w reakcji TUNEL jąder komórek późnoapopto-

tycznych, w których doszło do zaawansowanej fragmentacji chromatyny do

małocząsteczkowych odcinków genomu odpowiadających długości mononukle-

osomowego DNA (180-200 pz) lub jego wielokrotności (Jang i in., 2004).

Przyczyny uzyskanego w badaniach własnych istotnie niższego, w po-

równaniu z wynikami eksperymentów Hao i in. (2003) oraz Janga i in. (2004),

odsetka blastocyst klonalnych z potwierdzonymi modyfikacjami proapoptotycz-

nymi w rozmieszczeniu glicerofosfolipidów aminowych w błonie plazmatycznej

komórek ICM i/lub trofoblastycznych można interpretować jeszcze w inny, choć

raczej mniej prawdopodobny sposób. Przyżyciowa diagnostyka molekularna

procesu programowanej śmierci komórek zarodkowych, oparta na detekcji reszt


80

fosfatydyloseryny eksponowanych na zewnątrzkomórkowej powierzchni pla-

zmolemmy, może nie stanowić wystarczająco czułej metody pozwalającej na

szybkie związanie markerowego reagenta, jakim jest aneksyna V skoniugowana

z białkiem eGFP, przez wszystkie cząsteczki PS, ulegające nieodwracalnej

dyfuzji transwersalnej do zewnętrznej monowarstwy fosfolipidowej błony

komórkowej, zanim zostaną one poddane lipolitycznemu rozkładowi i usunięciu

z plazmolemmy. Nie można wykluczyć także możliwości, że translokacja części

reszt fosfatydyloseryny z wewnętrznej do zewnętrznej warstwy monomolekular-

nej w obrębie hydrofobowej matrycy lipidowej jest związana z gwałtownie

postępującą ich enzymatyczną modyfikacją do cząsteczek lizofosfatydyloseryny.

Reakcja ta jest katalizowana przez fosfolipazę A2 (PLA2) – specyficzną fosfo-

diesterazę zlokalizowaną w obrębie zewnętrznej (niecytoplazmatycznej) po-

wierzchni dwuwarstwy lipidowej plazmolemmy. Konwersja fosfatydyloseryny

do lizofosfatydyloseryny (Lizo-PS) polega na hydrolitycznym odszczepieniu

reszty kwasu tłuszczowego w pozycji β tego fosfoglicerydu. Rozpad lipolityczny

cząsteczki PS, który obejmuje wiązanie fosfodiestrowe łączące hydroksylową

grupę przy atomie węgla w pozycji C-2 cząsteczki 1,2-diacylo-3-fosfoglicerolu

(kwasu fosfatydowego) z grupą karboksylową nienasyconego kwasu tłuszczo-

wego, prowadzi ostatecznie do eliminacji jednego z niepolarnych łańcuchów

węglowodorowych przymocowanych do polarnej „główki” w postaci 3-

fosfoglicerolu, a tym samym osłabienia właściwości hydrofobowych powstałej

cząsteczki Lizo-PS, warunkujących ich nierozpuszczalność w wodzie (Tait i in.,

2006; Blankenberg i in., 1999). Z drugiej jednak strony, spowodowana zależnym

od kationów wapnia wysokim powinowactwem aneksyny V do cząsteczek PS

zdolność stabilizacji strukturalno-funkcjonalnej fosfatydyloseryny jest uwarun-

kowana dodatkowo hamowaniem współzawodniczym (inhibicją kompetycyjną)

aktywności fosfolipazy A2 przez aneksynę V, a tym samym odwracalnym zablo-

kowaniem konwersji reszt fosfatydyloseryny do lizofosfatydyloseryny. Dlatego

też, takie procesy jak: 1. niedostatecznie szybkie przyłączenie cząsteczek koniu-

gatu diagnostycznego aneksyna V-eGFP w buforującym roztworze wiążącym,

zawierającym jony Ca2+

do jeszcze niezmodyfikowanych enzymatycznie reszt

PS; 2. spowolnienie reakcji zahamowania aktywności fosfolipazy A2 przez

aneksynę V, a także 3. przyśpieszona utrata integralności strukturalno-

funkcjonalnej przez eksponowane na powierzchni zewnątrzkomórkowej plazmo-

lemmmy cząsteczki fosfatydyloseryny wysoce podatne na atak lipolityczny ze

strony enzymu PLA2, mogą być łącznie lub osobno odpowiedzialne za swoiste

uniewrażliwienie (desensytyzację) apoptotycznych komórek pozostałej puli

diagnozowanych fluorescencyjnie blastocyst klonalnych na zależną od kationów

wapnia aktywność aneksyny V (Bratton i in., 1999; Frasch i in., 2004; Ferraro-

Peyret i in., 2002). Niemożliwa staje się wówczas detekcja charakterystycznego

dla wczesnych faz apoptozy zjawiska utraty asymetrii składu lipidowego pla-

zmolemmy w komórkach części analizowanych tą metodą blastocyst klonal-

nych. Cząsteczki aneksyny V mogą być bowiem niezdolne do wykrywania reszt

fosfatydyloseryny na powierzchni zewnątrzkomórkowej plazmolemmy ze


81

względu na całkowity brak lub jedynie bardzo słabe powinowactwo karboksy-

terminalnych domen wiążących w sposób zależny od jonów Ca2+

reszty PS

w stosunku do lizofosfatydyloseryny. Ponadto, takie reszty lizolipidowe mogą

być poddawane selektywnej eliminacji z niecytoplazmatycznej monowarstwy

fosfolipidowej błony apoptotycznych komórek zarodkowych poprzez ich stop-

niową akumulację w uwypuklających się na pofałdowanej powierzchni plazmo-

lemmy obłonionych strukturach pęcherzykopodobnych, które oprócz cząsteczek

lizofosfatydyloseryny i/lub innych lizolipidów są wypełnione resztkowym

cytozolem oraz wybiórczo zdegradowanymi białkami formującymi sieci mikro-

filamentów cytoszkieletu i membranoszkieletu (tj. produktami częściowego

rozkładu proteolitycznego głównie aktyny G i fodryny) (Martin i in., 1995b;

Vanags i in., 1996).

Takie wyjaśnienie przyczyn relatywnie niskiego odsetka blastocyst klo-

nalnych ze zmonitorowanymi przyżyciowo, biochemicznymi i biofizycznymi

oznakami apoptozy w błonie cytoplazmatycznej komórek należy jednak uznać

za czysto hipotetyczne, a postawiona hipoteza badawcza wymaga zweryfikowa-

nia, w celu eksperymentalnego potwierdzenia jej założeń.

Na szczególną uwagę zasługuje także fakt, że w badaniach przeprowa-

dzonych przez Mateusena i in. (2005) kompleksowa analiza fluorescencyjna

symptomów biochemicznych apoptozy przy wykorzystaniu aneksyny V-FITC

i jodku propidyny oraz metody TUNEL wykazała znacznie niższy odsetek

blastocyst świni ze zmianami proapoptotycznymi w obrębie DNA genomowego

i/lub plazmolemmy komórek (ok. 14%) w stosunku do oszacowanego w ekspe-

rymentach własnych odsetka blastocyst klonalnych z potwierdzonymi za pomo-

cą aneksyny V-eGFP modyfikacjami w rozmieszczeniu reszt PS w błonie pla-

zmatycznej komórek (19%−62,5%). Jednakże, w badaniach pod kierunkiem

Mateusena i in. (2005), uzyskane blastocysty rozwijały się z hodowanych in

vitro zarodków pochodzących z zapłodnienia in vivo oocytów, a kondycja struk-

turalno-funkcjonalna takich blastocyst wyrażana jakością morfologiczną, oce-

nianą w oparciu o całkowitą liczbę komórek, oraz jakością biochemiczną, oce-

nianą na podstawie detekcji zmian apoptotycznych w komórkach węzła zarod-

kowego i/lub trofoblastu, jest nieporównywalnie wyższa niż w przypadku bla-

stocyst uzyskiwanych na drodze klonowania somatycznego.

Reasumując, zastosowane w przeprowadzonych badaniach przyżyciowe

metody wykrywania biochemicznych i biofizycznych symptomów śmierci

apoptotycznej komórek w blastocystach klonalnych, z użyciem markerów testo-

wych: aneksyny V skoniugowanej z białkiem eGFP oraz YO-PRO-1, zostały po

raz pierwszy wykorzystane w badaniach nad klonowaniem somatycznym świń.

Niski stopień inwazyjności przyżyciowych metod analizy fluorycytochemicznej

komórek blastocyst klonalnych zwiększa ich wartość aplikacyjną w ocenie

jakości morfologicznej, biochemicznej i biofizycznej zarodków w tej fazie

rozwoju przedimplantacyjnego. Metody te pozwalają na prognozowanie poim-

plantacyjnych zdolności rozwojowych zarodków klonalnych świni w oparciu

o możliwość dokonywania selekcji blastocyst o wysokiej jakości strukturalno-


82

funkcjonalnej, wynikającej z braku obecności komórek apoptotycznych lub z ich

niewielkiego udziału w całkowitej liczbie komórek zarodkowych (tj. niskiej

wartości indeksu apoptotycznego).

Rezultatem tego nowego kierunku badań jest opracowanie komplekso-

wej technologii uzyskiwania zarodków świni metodami klonowania somatycz-

nego, która spełnia w wielu przypadkach warunki dla jej stosowania do realiza-

cji ograniczonych celów praktycznych, a wśród nich warunek stosunkowo

wysokiej efektywności. W przyszłości pozwoli on niewątpliwie na rutynowe

wykorzystanie techniki klonowania somatycznego do powielania identycznych

genetycznie osobników, szczególnie tych o wybitnych, wysokoodziedziczalnych

cechach wartości hodowlanej (genetycznej) i użytkowej, co przyczynić się może

do skrócenia odstępu międzypokoleniowego i przyśpieszenia tempa osiągania

postępu hodowlanego (Samiec, 2004). Największe jednak wyzwania związane

z techniką klonowania świń stanowi możliwość uzyskiwania zwierząt transge-

nicznych z jąder komórek somatycznych modyfikowanych genetycznie na

poziomie hodowli in vitro (Samiec i in., 2012; Skrzyszowska i in., 2008). Klo-

nowanie somatyczne może być także efektywnym sposobem multiplikacji

osobników transgenicznych, wyprodukowanych standardową metodą mikroin-

iekcji konstrukcji genowych do przedjądrzy zygot. Uzyskiwanie transformowa-

nych genetycznie loch i knurów techniką klonowania somatycznego wydaje się

być bowiem szczególnie atrakcyjną opcją, ze względu na ważne implikacje dla

biomedycyny, a także farmacji i hodowli zwierząt (Samiec i Skrzyszowska,

2011a, b).


83

6. PODSUMOWANIE I WNIOSKI

1. Kompetencje jąder komórkowych nieapoptotycznych/nienekrotycznych

(aneksynoujemnych i/lub YO-PRO-1-negatywnych) fibroblastów płodo-

wych do pokierowania rozwojem in vitro zarodków klonalnych świni do

stadium moruli/blastocysty były wyższe niż kompetencje jąder fibroblastów

tkanki skórnej dorosłych osobników, niezależnie od zastosowanych metod

rekonstrukcji oraz metod sztucznej aktywacji oocytów.

2. Oryginalna, nowatorska metoda pseudofizjologicznej/biologicznej postak-

tywacji transkomplementarnej (PFATK) oraz aktywacja elektryczna oocytów

równocześnie rekonstruowanych techniką elektrofuzji (FE/AE) skutkowały

wyższą aktywnością podziałową, przedimplantacyjnym potencjałem rozwo-

jowym i jakością morfologiczną zarodków klonalnych niż postaktywacja

elektryczna (AE) oocytów zrekonstruowanych techniką docytoplazmatycznej

mikroiniekcji karioplastów/całych komórek somatycznych, jak również se-

kwencyjna aktywacja fizykochemiczna (SAF-C) oocytów zrekonstruowanych

obiema technikami.

3. Bez względu na rodzaj/pochodzenie komórek-dawców jąder użytych do

rekonstrukcji enukleowanych oocytów oraz na zastosowaną metodę aktywa-

cji zrekonstruowanych oocytów, znacząco niższy odsetek blastocyst klonal-

nych z proapoptotycznymi i/lub pronekrotycznymi zmianami komórek, wy-

krytymi przy wykorzystaniu aneksyny V-eGFP lub YO-PRO-1, odnotowano

w następstwie elektrofuzji ooplastów z komórkami fibroblastycznymi niż

w następstwie doooplazmatycznej mikroiniekcji karioplastów/całych komó-

rek fibroblastycznych.

4. Przyżyciowa diagnostyka fluorescencyjna symptomów śmierci apoptotycz-

nej i/lub nekrotycznej w klonalnych blastocystach świni wykazała, że, nieza-

leżnie od rodzaju/rodowodu fibroblastów użytych jako źródło dawców jąder

w klonowaniu oraz od zastosowanej techniki rekonstrukcji enukleowanych

oocytów, częstość występowania komórek aneksynododatnich i YO-PRO-1-

pozytywnych w zarodkach uzyskanych w wyniku aktywacji cybryd klonal-

nych metodą SAF-C jest istotnie wyższa niż wśród zarodków uzyskanych me-

todą PFATK.

5. W odniesieniu do metod FE/AE oraz AE, wpływ sztucznej aktywacji cybryd

klonalnych na uruchomienie procesów apoptozy i/lub nekrozy w blastocy-

stach klonalnych świni był zależny od techniki zastosowanej do rekonstruk-

cji enukleowanych oocytów. Stwierdzono bowiem znaczne obniżenie odset-


84

ka apoptotycznych/nekrotycznych zarodków z komórkami aneksynododat-

nimi i YO-PRO-1-pozytywnymi w grupie blastocyst rozwijających się

w wyniku jednoczesnej fuzji i aktywacji elektrycznej rekonstytuowanych

oocytów w stosunku do grupy blastocyst rozwijających się w następstwie

post-aktywacji elektrycznej cybryd klonalnych uzyskanych techniką docyto-

plazmatycznej mikroiniekcji karioplastów/całych komórek somatycznych.

6. Ogólna analiza porównawcza wszystkich strategii sztucznej aktywacji

cybryd klonalnych świni potwierdziła, że procentowy udział apoptotycznych

i/lub nekrotycznych blastocyst, w których wykryto obecność komórek pozy-

tywnie wyznakowanych aneksyną V-eGFP lub YO-PRO-1, ulega istotnemu

podwyższeniu w subpopulacjach zarodków uzyskanych w wyniku zastoso-

wania metod SAF-C oraz AE w porównaniu do subpopulacji zarodków rozwi-

jających się ze zrekonstytuowanych oocytów poddanych działaniu PFATK

oraz FE/AE.


85

7. WYMIERNY, UDOKUMENTOWANY EFEKT

PODJĘTEGO PROBLEMU

Wymiernym, udokumentowanym efektem podjętego problemu ba-

dawczego było opracowanie oryginalnej, nowatorskiej metody pseudofizjolo-

gicznej/biologicznej aktywacji transkomplementarnej (transcytoplazmatycznej)

na potrzeby stymulacji zarodkowego programu rozwojowego oocytów świni

rekonstytuowanych technikami klonowania somatycznego (Samiec i in., 2012;

Samiec i Skrzyszowska, 2014). W przeprowadzonych badaniach zastosowano

także po raz pierwszy w klonowaniu świń (a także ssaków) nowe metody niein-

wazyjnej (nisko inwazyjnej) analizy fluorycytochemicznej do oceny kondycji

strukturalno-funkcjonalnej (jakości biochemicznej i biofizycznej) zarodków

klonalnych w stadium blastocysty. U podstaw tej przyżyciowej oceny jakości

blastocyst klonalnych leży wykrywanie symptomów towarzyszących wczesnym

i późnym fazom śmierci apoptotycznej w komórkach zarodkowych (ICM

i trofoblastu) za pośrednictwem koniugatu diagnostycznego aneksyny V-eGFP

oraz fluorochromu YO-PRO-1.


86

8. STRESZCZENIE MONOGRAFII

Celem przeprowadzonych badań było określenie częstości występowania

biochemicznych i biofizycznych zmian apoptotycznych w błonie plazmatycznej

komórek blastocyst świni, rozwijających się z oocytów rekonstytuowanych

różnymi technikami klonowania somatycznego. W klonowaniu somatycznym

czynnikami potencjalnie apoptogennymi mogą być zarówno metody rekonstruk-

cji, jak i sztucznej aktywacji oocytów. Dlatego też podjęto badania zmierzające

do wyjaśnienia roli wyżej wymienionych czynników w inicjowaniu śmierci

apoptotycznej w komórkach blastocyst klonalnych świni. Zgodnie z zaplanowa-

nym schematem badawczym zrealizowano doświadczenia obejmujące uzyski-

wanie zarodków klonalnych świni z oocytów zrekonstruowanych metodą elek-

trofuzji kompleksów ooplast-komórka somatyczna. W kolejnej serii doświad-

czeń, do rekonstrukcji enukleowanych oocytów wykorzystano metodę docyto-

plazmatycznej iniekcji karioplastów lub całych komórek-dawców jąder. Źró-

dłem biorców dla jąder komórek somatycznych w procedurze klonowania były

oocyty, które osiągnęły dojrzałość mejotyczną i cytoplazmatyczną w warunkach

hodowli in vitro. Chromosomy metafazowe dojrzałych in vitro oocytów były

usuwane techniką mikrochirurgiczną, wspomaganą chemicznie (przy użyciu

demekolcyny i cytochalazyny B). Rekonstrukcja enukleowanych oocytów

(ooplastów) z jąder nieapoptotycznych/nienekrotycznych (tj. aneksynoujemnych

i/lub YO-PRO-1-negatywnych) fibroblastów tkanki skórno-powłokowej doro-

słych osobników (grupa I) lub płodów (grupa II) przeprowadzona była w wyniku

elektrofuzji kompleksów ooplast-komórka somatyczna. W grupach III i IV

ooplasty rekonstytuowane były odpowiednio: z jąder nieapoptotycz-

nych/nienekrotycznych fibroblastów tkanki skórno-powłokowej dorosłych

osobników lub płodów, przy użyciu bezpośredniej mikroiniekcji kariopla-

stów/całych komórek somatycznych do cytoplazmy. Do sztucznej aktywacji

rekonstytuowanych oocytów (cybryd klonalnych) zastosowany był protokół

jednoczesnej fuzji i aktywacji fizycznej (elektrycznej) – FE/AE (grupy IA oraz

IIA), protokół sekwencyjnej aktywacji fizykochemicznej – SAF-C (grupy IB oraz

IIB) lub protokół pseudofizjologicznej/biologicznej postaktywacji transkomple-

mentarnej (transcytoplazmatycznej) – PFATK (grupy IC oraz IIC). Z kolei

w grupach IIIA, IIIB i IIIC oraz IVA, IVB i IVC zarodkowy program rozwojo-

wy cybryd klonalnych był stymulowany odpowiednio: w wyniku postaktywacji

elektrycznej (AE), sekwencyjnej postaktywacji fizykochemicznej (SAF-C) lub

w wyniku pseudofizjologicznej postaktywacji transkomplementarnej (PFATK).


87

W systemie FE/AE (grupy IA, IIA), impulsy elektryczne, indukujące fuzję kom-

pleksów ooplast-komórka somatyczna, były równocześnie bodźcami inicjujący-

mi aktywację rekonstruowanych oocytów. Kompleksy ooplastów oraz komórek

fibroblastycznych były poddawane elektroporacji błon plazmatycznych przy

użyciu 2 generowanych bezpośrednio po sobie impulsów prądu stałego o natę-

żeniu pola elektrostatycznego 1,2 kV/cm i czasie trwania 60 μsek każdy. Zabieg

przeprowadzany był w roztworze izotonicznego dielektryku (0,3 M mannitolu)

o podwyższonym do 1 mM/L stężeniu CaCl2. Z kolei w protokole AE (IIIA,

IVA), zrekonstytuowane oocyty podlegały działaniu impulsów prądu stałego

(o takich samych parametrach technicznych jak wcześniej), w obecności 1

mM/L CaCl2, 1−1,5 godziny po docytoplazmatycznej mikroiniekcji kariopla-

stów lub całych komórek somatycznych. W systemie SAF-C pierwszy etap sta-

nowiła FE/AE (IB, IIB) lub AE (IIIB, IVB), jednakże sam proces elektroporacji

błon komórkowych cybryd klonalnych przebiegał w roztworze dielektryku

uzupełnionym 50 μM/L CaCl2. Dwustopniowa aktywacja chemiczna de novo

cybryd klonalnych inicjowana była z 1,5−2-godzinnym opóźnieniem czasowym

w stosunku do pierwszego etapu FE/AE lub AE rekonstytuowanych oocytów. Po

5−7-minutowej inkubacji w roztworze jonomycyny wapnia o stężeniu 15 µM/L,

cybrydy klonalne umieszczane były na okres 2 godzin w pożywce z dodatkiem

10 µg/mL cykloheksimidu. Natomiast założeniem systemu PFATK (IC, IIC, IIIC,

IVC) było wykorzystanie zakumulowanych w cytoplazmie zygoty hipotetycz-

nych czynników białkowych pochodzenia plemnikowego lub oocytarnego,

wywołujących oscylacje wapniowe, które leżą u podstaw mechanizmu stymula-

cji zarodkowego programu rozwojowego. Komplementarne białka oscylogenne

wprowadzane były do ooplazmy cybryd klonalnych świni w następstwie ich

elektrofuzji z fragmentami obłonionej cytoplazmy (ksenogenicznymi cytopla-

stami, tzw. zygoplastami), wyizolowanymi z zygot królika uzyskanych w wyni-

ku zapłodnienia in vivo. Zarówno elektrofuzja kompleksów ooplast-komórka

somatyczna, jak i elektrofuzja uzyskanych cybryd klonalnych z zygoplastami,

która miała miejsce 1,5−2 godziny po zabiegu rekonstrukcji enukleowanych

oocytów (metodami fuzji z komórkami-dawcami jąder lub docytoplazmatycznej

iniekcji karioplastów/całych komórek-dawców jąder), przeprowadzane były

w wolnym od jonów Ca2+

medium do elektroporacji błon plazmatycznych.

Aktywowane cybrydy klonalne hodowane były in vitro w pożywce NCSU-

23/BSA/FBS przez 6−7 dni, aż do osiągnięcia stadium moruli oraz blastocysty.

Uzyskane zarodki w stadium blastocysty oceniane były przyżyciowo pod kątem

obecności biochemicznych i biofizycznych zmian apoptotycznych w błonie

plazmatycznej komórek węzła zarodkowego i/lub trofoblastu. Do wykrywania

symptomów apoptozy wykorzystane były: 1) sprzężona z białkiem intensywnej

zieleni fluorescencyjnej (eGFP) aneksyna V (wykazuje wysokie powinowactwo

do reszt fosfatydyloseryny ulegających translokacji do zewnętrznej monowar-

stwy fosfolipidowej w plazmolemmie) lub 2) zielony fluorochrom DNA YO-

PRO-1. W procedurze klonowania somatycznego wykorzystano łącznie 7157

dojrzałych in vitro oocytów świni. Na drodze elektrofuzji do 2210/7157 (30,9%)


88

enukleowanych oocytów wprowadzono jądra fibroblastów tkanki skórnej doro-

słych osobników (grupa I), a do 1615/7157 (22,6%) − jądra fibroblastów płodo-

wych (grupa II). Z kolei na drodze doooplazmazmatycznej mikroiniekcji całych

komórek somatycznych lub wyizolowanych z nich karioplastów uzyskano

1859/7157 (25,9%) oraz 1473/7157 (20,6%) cybryd klonalnych zrekonstytu-

owanych odpowiednio: z jąder fibroblastów tkanki skórno-powłokowej doro-

słych osobników (grupa III) lub płodów (grupa IV). W zależności od zastosowa-

nego protokołu sztucznej aktywacji zrekonstruowanych oocytów − FE/AE (grupy

IA, IIA), AE (IIIA, IVA), SAF-C (IB, IIB, IIIB, IVB) lub PFATK (IC, IIC, IIIC,

IVC) − oceniano potencjał rozwojowy zarodków klonalnych w oparciu o aktyw-

ność podziałową oraz odsetek morul i blastocyst uzyskanych w warunkach

hodowli in vitro. W grupach IA, IIA, IIIA oraz IVA, spośród 759, 530, 691 oraz

452 hodowanych zygot klonalnych, 513 (67,6%), 451 (85,1%), 406 (58,8%)

oraz 329 (72,8%) podlegało mitotycznym podziałom bruzdkowania, w tym do

stadium moruli i blastocysty rozwinęło się odpowiednio: 400/759 (52,7%)

i 147/759 (19,4%), 330/530 (62,3%) i 175/530 (33,0%), 298/691 (43,1%)

i 77/691 (11,1%) oraz 240/452 (53,1%) i 103/452 (22,8%) zrekonstruowanych

zarodków. W grupach IB, IIB, IIIB oraz IVB aktywność podziałową wykazywa-

ło 399/679 (58,8%), 377/496 (76,0%), 309/654 (47,2%) oraz 261/437 (59,7%)

hodowanych cybryd klonalnych, natomiast stadium moruli i blastocysty osiągnę-

ło odpowiednio: 301/679 (44,3%) i 90/679 (13,3%), 275/496 (55,4%) i 121/496

(24,4%), 222/654 (33,9%) i 28/654 (4,3%) oraz 195/437 (44,6%) i 64/437

(14,6%) zarodków. Z kolei w grupach IC i IIC oraz IIIC i IVC uzyskano odpo-

wiednio: 464/595 (78,0%) i 442/476 (92,9%) oraz 174/253 (68,8%) i 300/359

(83,6%) dzielących się zarodków, w tym do stadium moruli i blastocysty rozwi-

nęło się odpowiednio: 384/595 (64,5%) i 167/595 (28,1%), 356/476 (74,8%)

i 203/476 (42,6%) oraz 138/253 (54,5%) i 51/253 (20,2%), 244/359 (68,0%)

i 116/359 (32,3%) zarodków klonalnych. Odsetek zarodków, w których stwier-

dzono obecność wczesno- i późnoapoptotycznych lub nekrotycznych komórek

pozytywnie wyznakowanych aneksyną-V-eGFP, w całkowitej puli klonalnych

blastocyst analizowanych w kierunku fizjologicznej śmierci komórkowej wyno-

sił 28,4% (21/74), 31,8% (28/88), 41,0% (16/39) oraz 48,1% (25/52) odpowied-

nio: w grupach IA, IIA, IIIA oraz IVA. Z kolei udział zarodków ze zdiagnozo-

wanymi symptomami proapoptotycznymi i/lub pronekrotycznymi komórek

w populacji blastocyst klonalnych uzyskanych w grupach IB, IIB, IIIB i IVB

oraz w grupach IC, IIC, IIIC i IVC utrzymywał się na poziomie odpowiednio:

35,6% (16/45), 41,0% (25/61), 50,0% (7/14) i 62,5% (20/32) oraz 19,0%

(16/84), 22,5% (23/102), 30,8% (8/26) i 32,8% (19/58). Natomiast odsetek

blastocyst z wykrytymi YO-PRO-1-pozytywnymi zmianami późnoapoptotycz-

nymi i/lub nekrotycznymi w błonie plazmatycznej komórek osiągał poziom:

16,4% (12/73), 20,7% (18/87), 28,9% (11/38) i 31,4% (16/51); 22,2% (10/45),

26,7% (16/60), 35,7% (5/14) i 43,8% (14/32) oraz 9,6% (8/83), 12,9% (13/101),

16,0% (4/25) i 22,4% (13/58) odpowiednio w grupach IA, IIA, IIIA i IVA,

w grupach IB, IIB, IIIB i IVB oraz w grupach IC, IIC, IIIC i IVC. Reasumując,


89

kompetencje nieapoptotycznych/nienekrotycznych (aneksynoujemnych i/lub

YO-PRO-1-negatywnych) jąder komórkowych fibroblastów płodowych do

pokierowania rozwojem in vitro zarodków klonalnych świni do stadium moru-

li/blastocysty były wyższe niż kompetencje jąder fibroblastów tkanki skórnej

dorosłych osobników, niezależnie od zastosowanych metod rekonstrukcji enu-

kleowanych oocytów oraz metod sztucznej aktywacji zrekonstruowanych oocy-

tów. Stwierdzono także, że oryginalna, nowatorska metoda pseudofizjologicz-

nej/biologicznej postaktywacji transkomplementarnej (PFATK) oraz aktywacja

elektryczna oocytów równocześnie rekonstruowanych techniką elektrofuzji

(FE/AE) skutkują wyższą aktywnością podziałową i przedimplantacyjnym poten-

cjałem rozwojowym zarodków klonalnych niż post-aktywacja elektryczna (AE)

oocytów zrekonstruowanych techniką docytoplazmatycznej mikroiniekcji kario-

plastów/całych komórek somatycznych, jak również sekwencyjna aktywacja

fizykochemiczna (SAF-C) oocytów zrekonstruowanych obiema technikami.

Niższy odsetek blastocyst klonalnych z proapoptotycznymi i/lub pronekrotycz-

nymi zmianami komórek, wykrytymi przy wykorzystaniu aneksyny V-eGFP lub

YO-PRO-1, odnotowano w następstwie elektrofuzji ooplastów z komórkami

fibroblastycznymi niż w następstwie doooplazmatycznej mikroiniekcji kariopla-

stów/całych komórek fibroblastycznych. Ponadto przyżyciowa diagnostyka

fluorescencyjna symptomów śmierci apoptotycznej i/lub nekrotycznej w klonal-

nych blastocystach świni wykazała, że, bez względu na rodzaj/pochodzenie

fibroblastów użytych do rekonstrukcji enukleowanych oocytów, częstość wystę-

powania komórek aneksynododatnich i YO-PRO-1-pozytywnych w zarodkach

uzyskanych w wyniku aktywacji cybryd klonalnych metodami SAF-C oraz AE

jest wyższa niż wśród zarodków uzyskanych metodami PFATK oraz FE/AE.

Zastosowanie praktyczne uzyskanych wyników. Zastosowane

w eksperymentach własnych metody analizy fluorycytochemicznej w kierunku

oznaczania zmian apoptotycznych w komórkach blastocyst klonalnych zostały

po raz pierwszy wykorzystane w badaniach nad klonowaniem somatycznym

świń. Niski stopień inwazyjności tych metod zwiększa ich wartość aplikacyjną

w ocenie jakości morfologicznej, biochemicznej i biofizycznej zarodków.

Umożliwia to selekcję blastocyst o wysokiej jakości, wynikającej z braku obec-

ności komórek apoptotycznych lub z niskiej wartości indeksu apoptotycznego,

a na tej podstawie − prognozowanie poimplantacyjnych zdolności rozwojowych

zarodków klonalnych świni. Perspektywą racjonalnego wykorzystania tego

kierunku badań może być poprawa efektywności klonowania somatycznego

świń, a także innych gatunków zwierząt gospodarskich.


90

9. ABSTRACT OF MONOGRAPH

The objective of the current investigations was to determine the frequen-

cy of occurrence of biochemical and biophysical apoptotic changes in the plasma

membrane of the cells of porcine blastocysts developing from oocytes reconsti-

tuted by different techniques of somatic cell cloning.

The various methods of both reconstruction of enucleated oocytes and

activation of reconstructed oocytes can be the factors that seem to be potencially

apoptogenic in the procedure of somatic cell nuclear transfer (SCNT). Therefore,

there were undertaken such studies, the basic purpose of which was the explana-

tion of the role of the above-mentioned factors in the initiation of apoptotic cell

death processes within the cloned pig embryos reaching the blastocyst stage.


91

10. PIŚMIENNICTWO

Acton B.M., Jurisicova A., Jurisica I., Casper R.F. (2004). Alterations in mitochondrial

membrane potential during preimplantation stages of mouse and human embryo

development. Mol. Hum. Reprod., 10: 23−32.

Adams J.M., Cory S. (1998). The bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science,

28: 1322−1326.

Allera C., Lazzarini G., Patrone E., Alberti I., Barboro P., Sanna P., Melchiori A., Parodi

S., Balbi C. (1997). The condensation of chromatin in apoptotic thymocytes

shows a specific structural change. J. Biol. Chem., 272: 10817−10822.

Altairac S., Wright S.C., Courtois Y., Torriglia A. (2003). L-DNase II activation by the

24 kDa apoptotic protease (AP24) in TNFα-induced apoptosis. Cell Death Dif-

fer., 10: 1109−1111.

Antczak M., Van Blerkom J. (1999). Temporal and spatial aspects of fragmentation in

early human embryos: possible effects on developmental competence and asso-

ciation with the differential elimination of regulatory proteins from polarized

domains. Hum. Reprod., 14: 429−447.

Anto R.J., Mukhopadhyay A., Denning K., Aggarwal B.B. (2002). Curcumin

(diferuloylmethane) induces apoptosis through activation of caspase-8, BID

cleavage and cytochrome c release: its suppression by ectopic expression of

Bcl-2 and Bcl-XL. Carcinogenesis, 23: 143−150.

Arroyo A., Modriansky M., Serinkan F.B., Bello R.I., Matsura T., Jiang J., Tyurin V.A.,

Tyurina Y.Y., Fadeel B., Kagan V.E. (2002). NADPH oxidase-dependent oxi-

dation and externalization of phosphatidylserine during apoptosis in Me2SO-

differentiated HL-60 cells. Role in phagocytic clearance. J. Biol. Chem., 277:

49965−49975.

Assefa Z., Bultynck G., Szlufcik K., Nadif Kasri N., Vermassen E., Goris J., Missiaen

L., Callewaert G., Parys J.B., De Smedt H. (2004). Caspase-3-induced trunca-

tion of type 1 inositol trisphosphate receptor accelerates apoptotic cell death and

induces inositol trisphosphate-independent calcium release during apoptosis. J.

Biol. Chem., 279: 43227−43236.

Asumendi A., Andollo N., Boyano M.D., Hilario E., Perez-Yarza G., Atencia R.,

Arechaga J., García-Sanz M. (2000). The role of cleavage of cell structures dur-

ing apoptosis. Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand), 46: 1−11.

Baskić D., Popović S., Ristić P., Arsenijević N.N. (2006). Analysis of cycloheximide-

induced apoptosis in human leukocytes: fluorescence microscopy using annexin

V/propidium iodide versus acridin orange/ethidium bromide. Cell Biol. Int., 30:

924−932.


92

Beaujean N., Taylor J., Gardner J. Wilmut I., Meehan R., Young L. (2004). Effect of

limited DNA methylation reprogramming in the normal sheep embryo on so-

matic cell nuclear transfer. Biol. Reprod., 71: 185−193.

Bedner E., Smolewski P., Amstad P., Darzynkiewicz Z. (2000). Activation of caspases

measued in situ by binding of fluorochrome-labeled inhibitors of caspases

(FLICA): correlation with DNA fragmentation. Exp. Cell Res., 259: 308−313.

Blankenberg F.G., Katsikis P.D., Tait J.F., Davis R.E., Naumovski L., Ohtsuki K.,

Kopiwoda S., Abrams M.J., Strauss H.W. (1999). Imaging of apoptosis (pro-

grammed cell death) with 99mTc annexin V. J. Nucl. Med., 40: 184−191.

Blankenberg F.G., Tait J.F., Strauss H.W. (2000). Apoptotic cell death: its implications

for imaging in the next millennium. Eur. J. Nucl. Med., 27: 359−367.

Bortner C.D., Cidlowski J.A. (1999). Caspase independent/dependent regulation of K+,

cell shrinkage, and mitochondrial membrane potential during lymphocyte apop-

tosis. J. Biol. Chem., 274: 21953−21962.

Bratton D.L., Fadok V.A., Richter D.A., Kailey J.M., Guthrie L.A., Henson P.M. (1997).

Appearance of phosphatidylserine on apoptotic cells requires calcium-mediated

nonspecific flip-flop and is enhanced by loss of the aminophospholipid

translocase. J. Biol. Chem., 272: 26159−26165.

Bratton D.L., Fadok V.A., Richter D.A., Kailey J.M., Frasch S.C., Nakamura T., Henson

P.M. (1999). Polyamine regulation of plasma membrane phospholipid flip-flop

during apoptosis. J. Biol. Chem., 274: 28113−28120.

Brison D.R., Schultz R.M. (1998). Increased incidence of apoptosis in transforming

growth factor α-deficient mouse blastocysts. Biol. Reprod., 59: 136−144.

Brossas J.Y., Tanguy R., Brignole-Baudouin F., Courtois Y., Torriglia A., Tréton J.

(2004). L-DNase II associated with active process during ethanol induced cell

death in ARPE-19. Mol. Vis., 10: 65−73.

Byrne A.T., Southgate J., Brison D.R., Leese H.J. (1999). Analysis of apoptosis in the

preimplantation bovine embryo using TUNEL. J. Reprod. Fertil., 117: 97−105.

Cain K., Bratton S.B., Langlais C., Walker G., Brown D.G., Sun X.M. (2000). Apaf-1

oligomerizes into biologically active approximately 700-kDa and inactive ap-

proximately 1.4-MDa apoptosome complex. J. Biol. Chem., 275: 6067−6070.

Campbell K.H., Alberio R. (2003). Reprogramming the genome: role of the cell cycle.

Reprod. Suppl., 61: 477−494.

Cao X., Deng X., May W.S. (2003). Cleavage of Bax to p18 Bax accelerates stress-

induced apoptosis, and a cathepsin-like protease may rapidly degrade p18 Bax.

Blood, 102: 2605−2614.

Capano M., Crompton M. (2002). Biphasic translocation of Bax to mitochondria.

Biochem. J., 367: 169−178.

Castedo M., Hirsch T., Susin S.A., Zamzami N., Marchetti P., Macho A., Kroemer G.

(1996). Sequential acquisition of mitochondrial and plasma membrane altera-

tions during early lymphocyte apoptosis. J. Immunol., 157: 512−521.

Chi M.M., Pingsterhaus J., Carayannopoulos M., Moley K.H. (2000). Decreased glucose

transporter expression triggers BAX-dependent apoptosis in the murine blasto-

cyst. J. Biol. Chem., 275: 40252−40257.

Choi W.S., Lee E.H., Chung C.W., Jung Y.K., Jin B.K., Kim S.U., Oh T.H., Saido T.C.,

Oh Y.J. (2001). Cleavage of Bax is mediated by caspase-dependent or -

independent calpain activation in dopaminergic neuronal cells: protective role

of Bcl-2. J. Neurochem., 77: 1531−1541.


93

Csordás G., Madesh M., Antonsson B., Hajnóczky G. (2002). tcBid promotes Ca2+

signal propagation to the mitochondria: control of Ca2+

permeation through the

outer mitochondrial membrane. EMBO J., 21: 2198−2206.

Cui W., Wylie D., Aslam S., Dinnyes A., King T., Wilmut I., Clark A.J. (2003). Te-

lomerase-immortalized sheep fibroblasts can be reprogrammed by nuclear

transfer to undergo early development. Biol. Reprod., 69: 15−21.

Dahlem Y.A., Wolf G., Siemen D., Horn T.F. (2006). Combined modulation of the

mitochondrial ATP-dependent potassium channel and the permeability transi-

tion pore causes prolongation of the biphasic calcium dynamics. Cell Calcium,

39: 387−400.

Dahse R., Fiedler W., Ernst G. (1997). Telomeres and telomerase: biological and clinical

importance. Clin. Chem., 43: 708−714.

Daly J.M., Jannot C.B., Beerli R.R., Graus-Porta D., Maurer F.G., Hynes N.E. (1997).

Neu differentiation factor induces ErbB2 down-regulation and apoptosis of

ErbB2-overexpressing breast tumor cells. Cancer Res., 57: 3804−3811.

Darzynkiewicz Z., Traganos F. (1998). Measurement of apoptosis. W: Advances in

Biochemical Engineering/Biotechnology, Th. Scheper (red.). Springer-Verlag,

Berlin, Heidelberg, Germany, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 62: 33−73.

Darzynkiewicz Z., Li X., Bedner E. (2001a). Use of flow and laser-scanning cytometry

in analysis of cell death. W: Methods in Cell Biology, L.M. Schwartz, J.D.

Ashwell (red.). Academic Press, San Diego CA, United States, Methods Cell

Biol., 66: 69−109.

Darzynkiewicz Z., Bedner E., Smolewski P. (2001b). Flow cytometry in analysis of cell

cycle and apoptosis. Semin. Hematol., 38: 179−193.

Dean W., Santos F., Reik W. (2003). Epigenetic reprogramming in early mammalian

development and following somatic nuclear transfer. Semin. Cell Dev. Biol.,

14: 93−100.

De Giorgi F., Lartigue L., Bauer M.K., Schubert A., Grimm S., Hanson G.T., Remington

S.J., Youle R.J., Ichas F. (2002). The permeability transition pore signals apop-

tosis by directing Bax translocation and multimerization. FASEB J., 16:

607−609.

Dejean L.M., Martinez-Caballero S., Guo L., Hughes C., Teijido O., Ducret T., Ichas F.,

Korsmeyer S.J., Antonsson B., Jonas E.A., Kinnally K.W. (2005). Oligomeric

Bax is a component of the putative cytochrome c release channel MAC, mito-

chondrial apoptosis-induced channel. Mol. Biol. Cell, 16: 2424−2432.

Denecker G., Vercammen D., Declercq W., Vandenabeele P. (2001). Apoptotic and

necrotic cell death induced by death domain receptors. Cell. Mol. Life Sci., 58:

356−370.

Desagher S., Martinou J.C. (2000). Mitochondria as the central control point of apopto-

sis. Trends Cell Biol., 10: 369−377.

Distelhorst C.W., Roderick H.L. (2003). Ins(1,4,5)P3-mediated calcium signals and

apoptosis: is there a role for Bcl-2? Biochem. Soc. Trans., 31: 958−959.

Donovan M., Cotter T.G. (2004). Control of mitochondrial integrity by Bcl-2 family

members and caspase-independent cell death. Biochim. Biophys. Acta, 1644:

133-147.

Du C., Fang M., Li Y., Li L., Wang X. (2000). Smac, a mitochondrial protein that

promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibi-

tion. Cell, 102: 33−42.


94

Dynlacht J.R., Earles M., Henthorn J., Seno J.D. (2000). Different patterns of DNA

fragmentation and degradation of nuclear matrix proteins during apoptosis in-

duced by radiation, hyperthermia or etoposide. Radiat. Res., 154: 515−530.

Earnshaw W.C. (1995). Nuclear changes in apoptosis. Curr. Opin. Cell Biol., 7:

337−343.

Ebner T., Yaman C., Moser M., Sommergruber M., Pölz W., Tews G. (2001). Embryo

fragmentation in vitro and its impact on treatment and pregnancy outcome.

Fertil. Steril., 76: 281−285.

Enari M., Sakahira H., Yokoyama H., Okawa K., Iwamatsu A., Nagata S. (1998). A

caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor

ICAD. Nature, 391: 43−50.

Estaquier J., Idziorek T., Zou W., Emilie D., Farber C.M., Bourez J.M., Ameisen J.C.

(1995). T helper type 1/T helper type 2 cytokines and T cell death: preventive

effect of interleukin 12 on activation-induced and CD95 (FAS/APO-1)-

mediated apoptosis of CD4+ T cells from human immunodeficiency virus-

infected persons. J. Exp. Med., 182: 1759−1767.

Estaquier J., Tanaka M., Suda T., Nagata S., Golstein P., Ameisen J.C. (1996). Fas-

mediated apoptosis of CD4+ and CD8

+ T cells from human immunodeficiency

virus-infected persons: differential in vitro preventive effect of cytokines and

protease antagonists. Blood, 87: 4959−4966.

Estébanez-Perpiñá E., Fuentes-Prior P., Belorgey D., Braun M., Kiefersauer R., Maskos

K., Hubert R., Rubin H., Bode W. (2000). Crystal structure of the caspase acti-

vator human granzyme B, a proteinase highly specific for an Asp-P1 residue.

Biol. Chem., 381: 1203−1214.

Exley G.E., Tang C., McElhinny A.S., Warner C.M. (1999). Expression of caspase and

BCL-2 apoptotic family members in mouse preimplantation embryos. Biol.

Reprod., 61: 231−239.

Fadeel B., Zhivotovsky B., Orrenius S. (1999a). All along the watchtower: on the regula-

tion of apoptosis regulators. FASEB J., 13: 1647−1657.

Fadeel B., Gleiss B., Högstrand K., Chandra J., Wiedmer T., Sims P.J., Henter J.I.,

Orrenius S., Samali A. (1999b). Phosphatidylserine exposure during apoptosis

is a cell-type-specific event and does not correlate with plasma membrane

phospholipid scramblase expression. Biochem. Biophys. Res. Commun., 266:

504−511.

Fadeel B., Orrenius S., Zhivotovsky B. (2000). The most unkindest cut of all: on the

multiple roles of mammalian caspases. Leukemia, 14: 1514−1525.

Fadok V.A., Voelker D.R., Campbell P.A., Cohen J.J., Bratton G.L., Henson P.M.

(1992a). Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lympho-

cytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J. Immunol.,

148: 2207−2216.

Fadok V.A., Savill J.S., Haslett D.L., Bratton G.L., Doherty P.A., Campbell P.A.,

Henson P.M. (1992b). Different populations of macrophages use either the

vitronectin receptor or the phosphatidylserine receptor to recognize and remove

apoptotic cells. J. Immunol., 149: 4029−4035.

Fadok V.A., Laszlo D.J., Noble P.W., Weinstein L., Riches D.W., Henson P.M. (1993).

Particle digestibility is required for induction of the phosphatidylserine recogni-

tion mechanism used by murine macrophages to phagocytose apoptotic cells. J.

Immunol., 151: 4274−4285.


95

Fadok V.A., Bratton D.L., Rose D.M., Pearson A., Ezekewitz R.A., Henson P.M.

(2000). A receptor for phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic cells.

Nature, 405: 85−90.

Fahrudin M., Otoi T., Karja N.W.K., Mori M., Murakami M., Suzuki T. (2002). Analy-

sis of DNA fragmentation in bovine somatic nuclear transfer embryos using

TUNEL. Reproduction, 124: 813−819.

Ferraro-Peyret C., Quemeneur L., Flacher M., Revillard J.P., Genestier L. (2002).

Caspase-independent phosphatidylserine exposure during apoptosis of primary

T lymphocytes. J. Immunol., 169: 4805−4810.

Fesus L., Madi A., Balajthy Z., Nemes Z., Szondy Z. (1996). Transglutaminase induc-

tion by various cell death and apoptosis pathways. Experientia, 52: 942−949.

Feugang J.M., Rover D.E., Leonard S., Dessy F., Donnay I. (2002). Kinetics of apopto-

sis in preimplantation embryos produced in vitro and in vivo. Theriogenology,

57, s. 494 (Abstr.).

Frasch S.C., Henson P.M., Nagaosa K., Fessler M.B., Borregaard N., Bratton D.L.

(2004). Phospholipid flip-flop and phospholipid scramblase 1 (PLSCR1) co-

localize to uropod rafts in formylated Met-Leu-Phe-stimulated neutrophils. J.

Biol. Chem., 279: 17625−17633.

Frazer A., Evan G. (1996). A license to kill. Cell, 85: 781−784.

Friedrich P., Tompa P., Jékely G., Farkas A., Schαd É. (2001). Calpains in cellular

signalling. W: Protein Modules in Cellular Signalling, L. Heilmeyer, P. Frie-

drich (red.). IOS Press, ss. 363−373.

Gao G., Dou Q.P. (2000). N-terminal cleavage of bax by calpain generates a potent

proapoptotic 18-kDa fragment that promotes bcl-2-independent cytochrome c

release and apoptotic cell death. J. Cell. Biochem., 80: 53−72.

Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A., 1992. Identification of programmed cell

death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol.,

119: 493−501.

Gjørret J.O., Wengle J., King W.A., Schellander K., Maddox-Hyttel P. (2002). Occur-

rence of apoptosis in bovine embryos reconstructed by nuclear transfer or de-

rived in vivo. Theriogenology, 57, p. 495 (Abstr.).

Gjørret J.O., Knijn H.M., Dieleman S.J., Avery B., Larsson L.I., Maddox-Hyttel P.

(2003). Chronology of apoptosis in bovine embryos produced in vivo and in

vitro. Biol. Reprod., 69: 1193−1200.

Gjørret J.O., Wengle J., Maddox-Hyttel P., King W.A. (2005). Chronological appear-

ance of apoptosis in bovine embryos reconstructed by somatic cell nuclear

transfer from quiescent granulosa cells. Reprod. Domest. Anim., 40: 210−216.

Goetz J.G., Nabi I.R. (2006). Interaction of the smooth endoplasmic reticulum and

mitochondria. Biochem. Soc. Trans., 34: 370−373.

Graves J., Yankee T., Draves K., Clark E., Krebs E. (2001). Caspases: A signal transduc-

tion perspective. W: Protein Modules in Cellular Signalling, L. Heilmeyer, P.

Friedrich (red.) IOS Press 2001, ss. 374−383.

Grebinyk D.M., Griniuk I.I., Matyshevskaia O.P. (2005). Calcium homeostasis in the

thymocyte apoptosis. II. Accumulation of calcium in mitochondria and endo-

plasmic reticulum (Article in Russian). Ukr. Biokhim. Zh. (1999) 77: 76−81.

Green D.R., Reed J.C. (1998). Mitochondria and apoptosis. Science, 281: 1309−1312.

Greenberg A.H. (1996). Activation of apoptosis pathways by granzyme B. Cell Death

Differ., 3: 269−274.


96

Griffith T.S., Brunner T., Fletcher S.M., Green D.R., Ferguson T.A. (1995). Fas ligand-

induced apoptosis as a mechanism of immune privilege. Science, 270:

1189−1192.

Gross A., McDonnell J.M., Korsmeyer S.J. (1999). Bcl-2 family members and the

mitochondria in apoptosis. Genes Dev., 13: 1899−1911.

Halenbeck R., MacDonald H., Roulston A., Chen T.T., Conroy L., Williams L.T. (1998).

CPAN, a human nuclease regulated by the caspase-sensitive inhibitor DFF45.

Curr. Biol., 8: 537−540.

Hao Y., Lai L., Mao J., Im G.S., Bonk A., Prather R.S. (2003). Apoptosis and in vitro

development of preimplantation porcine embryos derived in vitro or by nuclear

transfer. Biol. Reprod., 69: 501−507.

Hao Y., Lai L., Mao J., Im G.S., Bonk A., Prather R.S. (2004). Apoptosis in

parthenogenetic preimplantation porcine embryos. Biol. Reprod., 70:

1644−1649.

Hardarson T., Hanson C., Sjögren A., Lundin K. (2001). Human embryos with unevenly

sized blastomeres have lower pregnancy and implantation rates: indications for

aneuploidy and multinucleation. Hum. Reprod., 16: 313−318.

Hardy K. (1997). Cell death in the mammalian blastocyst. Mol. Hum. Reprod., 3:

919−925.

Hardy K. (1999). Apoptosis in the human embryo. Rev. Reprod., 4: 125−134.

Hardy K., Spanos S., Becker D., Iannelli P., Winston R.M., Stark J. (2001). From cell

death to embryo arrest: mathematical models of human preimplantation embryo

development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 98: 1655−1660.

Harris M.H., Thompson C.B. (2000). The role of the Bcl-2 family in the regulation of

outer mitochondrial membrane permeability. Cell Death Differ., 7: 1182−1191.

He C.L., Damiani P., Parys J.B., Fissore R.A. (1997a). Calcium, calcium release recep-

tors, and meiotic resumption in bovine oocytes. Biol. Reprod., 57: 1245−1255.

He H., Lam M., McCormick T.S., Distelhorst C.W. (1997b). Maintenance of calcium

homeostasis in the endoplasmic reticulum by Bcl-2. J. Cell Biol., 138:

1219−1228.

He C.L., Damiani P., Ducibella T., Takahashi M., Tanzawa K., Parys J.B., Fissore R.A.

(1999). Isoforms of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor are expressed in

bovine oocytes and ovaries: the type-1 isoform is down-regulated by fertiliza-

tion and by injection of adenophostin A. Biol. Reprod., 61: 935−943.

Hendzel M.J., Nishioka W.K., Raymond Y., Allis C.D., Bazett-Jones D.P., Th’ng J.P.H.

(1998). Chromatin condensation is not associated with apoptosis. J. Biol.

Chem., 273: 24470−24478.

Hengartner M.O. (2000). The biochemistry of apoptosis. Nature, 407: 770−776.

Hinck L., Van Der Smissen P., Heusterpreute M., Donnay I., De Hertogh R., Pampfer S.

(2001). Identification of caspase-3 and caspase-activated deoxyribonuclease in

rat blastocysts and their implication in the induction of chromatin degradation

(but not nuclear fragmentation) by high glucose. Biol. Reprod., 64: 555−562.

Hinck L., Thissen J.P., De Hertogh R. (2003). Identification of caspase-6 in rat blasto-

cysts and its implication in the induction of apoptosis by high glucose. Biol.

Reprod., 68: 1808−1812.

Huang P., Ballal K., Plunkett W. (1997). Biochemical characterization of the protein

activity responsible for high molecular weight DNA fragmentation during drug-

induced apoptosis. Cancer Res., 57: 3407−3414.


97

Huppertz B., Frank H.G., Kaufmann P. (1999). The apoptosis cascade – morphological

and immunohistochemical methods for its visualization. Anat. Embryol. (Berl)

200: 1−18.

Idziorek T., Estaquier J., De Bels F., Ameisen J.C. (1995). YOPRO-1 permits

cytofluorometric analysis of programmed cell death (apoptosis) without inter-

fering with cell viability. J. Immunol. Methods, 185: 249−258.

Jang G., Park E.S., Cho J.K., Bhuiyan M.M., Lee B.C., Kang S.K., Hwang W.S. (2004).

Preimplantational embryo development and incidence of blastomere apoptosis

in bovine somatic cell nuclear transfer embryos reconstructed with long-term

cultured donor cells. Theriogenology, 62: 512−521.

Jänicke R.U., Ng P., Sprengart M.L., Porter A.G. (1998). Caspase-3 is required for α-

fodrin cleavage but dispensable for cleavage of other death substrates in apop-

tosis. J. Biol. Chem., 273: 15540−15545.

Jellerette T., Melican D., Butler R., Nims S., Ziomek C., Fissore R., Gavin W. (2006).

Characterization of calcium oscillation patterns in caprine oocytes induced by

IVF or an activation technique used in nuclear transfer. Theriogenology, 65:

1575−1586.

Jiang L., Carter D.B., Xu J., Yang X., Prather R.S., Tian X.C. (2004). Telomere lengths

in cloned transgenic pigs. Biol. Reprod., 70: 1589−1593.

Jürgensmeier J.M., Xie Z., Deveraux Q., Ellerby L., Bredesen D., Reed J.C. (1998). Bax

directly induces release of cytochrome c from isolated mitochondria. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA., 95: 4997−5002.

Jurisicova A., Acton B.M. (2004). Deadly decisions: the role of genes regulating pro-

grammed cell death in human preimplantation embryo development. Reproduc-

tion, 128: 281−291.

Jurisicova A., Varmuza S,. Casper R.F. (1995). Involvement of programmed cell death

in preimplantation embryo demise. Hum. Reprod. Update, 1: 558−566.

Jurisicova A., Varmuza S., Casper R.F. (1996). Programmed cell death and human

embryo fragmentation. Mol. Hum. Reprod., 2: 93−98.

Jurisicova A., Latham K.E., Casper R.F., Varmuza S.L. (1998). Expression and regula-

tion of genes associated with cell death during murine preimplantation embryo

development. Mol. Reprod. Dev., 51: 243−253.

Jurisicova A., Antenos M., Varmuza S., Tilly J.L., Casper R.F. (2003). Expression of

apoptosis-related genes during human preimplantation embryo development:

potential roles for the Harakiri gene product and Caspase-3 in blastomere frag-

mentation. Mol. Hum. Reprod., 9: 133−141.

Kang Y.K., Koo D.B., Park J.S., Choi Y.H., Kim H.N., Chang W.K., Lee K.K., Han

Y.M. (2001). Typical demethylation events in cloned pig embryos. Clues on

species-specific differences in epigenetic reprogramming of a cloned donor ge-

nome. J. Biol. Chem., 276: 39980−39984.

Kato M., Nonaka T., Maki M., Kikuchi H., Imajoh-Ohmi S. (2000a). Caspases cleave

the amino-terminal calpain inhibitory unit of calpastatin during apoptosis in

human Jurkat T cells. J. Biochem., 127: 297−305.

Kato Y., Tani T., Tsunoda Y. (2000b). Cloning of calves from various somatic cell types

of male and female adult, newborn and fetal cows. J. Reprod. Fertil., 120:

231−237.

Katsen A.D., Vollmar B., Mestres-Ventura P., Menger M.D. (1998). Cell surface and

nuclear changes during TNF-α-induced apoptosis in WEHI 164 murine


98

fibrosarcoma cells. A correlative light, scanning, and transmission electron

microscopical study. Virchows Arch., 433: 75−83.

Kerr J.F., Gobé G.C., Winterford C.M., Harmon B.V. (1995). Anatomical methods in

cell death. Methods Cell Biol., 46: 1−27.

Kidd V.J., Lahti J.M., Teitz T. (2000). Proteolytic regulation of apoptosis. Semin. Cell

Dev. Biol., 11: 191−201.

Kidson A., Rubio-Pomar F.J., Van Knegsel A., Van Tol H.T., Hazeleger W., Ducro-

Steverink D.W., Colenbrander B., Dieleman S.J., Bevers M.M. (2004). Quality

of porcine blastocysts produced in vitro in the presence or absence of GH. Re-

production, 127: 165−177.

Kim J.E., Oh J.H., Choi W.S., Chang I.I., Sohn S., Krajewski S., Reed J.C., O'Malley

K.L., Oh Y.J. (1999). Sequential cleavage of poly(ADP-ribose)polymerase and

appearance of a small Bax-immunoreactive protein are blocked by Bcl-XL and

caspase inhibitors during staurosporine-induced dopaminergic neuronal apopto-

sis. J. Neurochem., 72: 2456−2463.

Kim W.H., Ghil K.C., Lee J.H., Yeo S.H., Chun Y.J., Choi K.H., Kim D.K., Kim M.Y.

(2000). Involvement of p27kip1

in ceramide-mediated apoptosis in HL-60 cells.

Cancer Lett., 151: 39−48.

Kitanaka C., Kuchino Y. (1999). Caspase-independent programmed cell death with

necrotic morphology. Cell Death Differ., 6: 508−515.

Kroemer G. (1997). The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis. Nat.

Med., 3: 614−620.

Kroemer G., Petit P., Zamzami N., Vayssière J.L., Mignotte B. (1995). The biochemistry

of programmed cell death. FASEB J., 9: 1277−1287.

Lam M., Dubyak G., Chen L., Nunez G., Miesfeld R.L., Distelhorst C.W. (1994).

Evidence that BCL-2 represses apoptosis by regulating endoplasmic reticulum-

associated Ca2+

fluxes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 6569−6573.

Leite M.F., Thrower E.C., Echevarria W., Koulen P., Hirata K., Bennett A.M., Ehrlich

B.E., Nathanson M.H. (2003). Nuclear and cytosolic calcium are regulated in-

dependently. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100: 2975−2980.

Levy R., Benchaib M., Cordonier H., Souchier C., Guerin J.F. (1998). Annexin V

labelling and terminal transferase-mediated DNA end labelling (TUNEL) assay

in human arrested embryos. Mol. Hum. Reprod., 4: 775−783.

Levy R.R., Cordonier H., Czyba J.C., Guerin J.F. (2001). Apoptosis in preimplantation

mammalian embryo and genetics. Ital. J. Anat. Embryol. 106 (2 Suppl. 2):

101−108.

Li L.Y., Luo X., Wang X. (2001). Endonuclease G is an apoptotic DNase when released

from mitochondria. Nature, 412: 95−99.

Lincz L.F. (1998). Deciphering the apoptotic pathway: all roads lead to death. Immunol.

Cell Biol., 76: 1−19.

Lindenboim L., Yuan J., Stein R. (2000). Bcl-XS and Bax induce different apoptotic

pathways in PC12 cells. Oncogene, 19: 1783−1793.

Liu H.C., He Z.Y., Mele C.A., Veeck L.L., Davis O., Rosenwaks Z. (2000). Expression

of apoptosis-related genes in human oocytes and embryos. J. Assist. Reprod.

Genet., 17: 521−533.

Liu L., Keefe D.L. (2000). Cytoplasm mediates both development and oxidation-induced

apoptotic cell death in mouse zygotes. Biol. Reprod., 62: 1828−1834.


99

Liu L., Trimarchi J.R., Keefe D.L. (2002). Haploidy but not parthenogenetic activation

leads to increased incidence of apoptosis in mouse embryos. Biol. Reprod., 66:

204−210.

Liu S.Z., Yao L.J., Jiang M.X., Lei Z.L., Zhang L.S., Zhang Y.L., Sun Q.Y., Zheng

Y.L., Song X.F., Chen D.Y. (2005). Apoptosis in rabbit embryos produced by

fertilization or nuclear transfer with fibroblasts and cumulus cells. Reproduc-

tion, 130: 359−366.

Liu X., Zou H., Slaughter C., Wang X. (1997). DFF, a heterodimeric protein that func-

tions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis.

Cell, 89: 175−184.

Liu X., Li P., Widlak P., Zou H., Luo X., Garrard W.T., Wang X. (1998). The 40-kDa

subunit of DNA fragmentation factor induces DNA fragmentation and chroma-

tin condensation during apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 8461−8466.

Liu X., Zou H., Widlak P., Garrard W., Wang X. (1999). Activation of the apoptotic

endonuclease DFF40 (caspase-activated DNase or nuclease). Oligomerization

and direct interaction with histone H1. J. Biol. Chem., 274: 13836−13840.

Long C.R., Dobrinsky J.R., Garrett W.M., Johnson L.A. (1998). Dual labeling of the

cytoskeleton and DNA strand breaks in porcine embryos produced in vivo and

in vitro. Mol. Reprod. Dev., 51: 59−65.

Mahaney J.E., Albers R.W., Waggoner J.R., Kutchai H.C., Froehlich J.P. (2005). Inter-

molecular conformational coupling and free energy exchange enhance the cata-

lytic efficiency of cardiac muscle SERCA2a following the relief of

phospholamban inhibition. Biochemistry, 44: 7713−7724.

Mandic A., Viktorsson K., Strandberg L., Heiden T., Hansson J., Linder S., Shoshan

M.C. (2002). Calpain-mediated Bid cleavage and calpain-independent Bak

modulation: two separate pathways in cisplatin-induced apoptosis. Mol. Cell.

Biol., 22: 3003−3013.

Marin M.C., Fernandez A., Bick R.J., Brisbay S., Buja L.M., Snuggs M., McConkey

D.J., von Eschenbach A.C., Keating M.J., McDonnell T.J. (1996). Apoptosis

suppression by bcl-2 is correlated with the regulation of nuclear and cytosolic

Ca2+

. Oncogene, 12: 2259−2266.

Martin S.J., Reutelingsperger C.P., McGahon A.J., Rader J.A., van Schie R.C., LaFace

D.M., Green D.R. (1995a). Early redistribution of plasma membrane

phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating

stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl. J. Exp. Med., 182:

1545−1556.

Martin S.J., O’Brien G.A., Nishioka W.K., McGahon A.J., Mahboubi A., Saido T.C.,

Green D.R. (1995b). Proteolyis of fodrin (non-erythroid spectrin) during apop-

tosis. J. Biol. Chem., 270: 6425−6428.

Martin S.J., Finucane D.M., Amarante-Mendes G.P., O'Brien G.A., Green D.R. (1996).

Phosphatidylserine externalization during CD95-induced apoptosis of cells and

cytoplasts requires ICE/CED-3 protease activity. J. Biol. Chem., 271:

28753−28756.

Martínez M.C., Freyssinet J.M. (2001). Deciphering the plasma membrane hallmarks of

apoptotic cells: phosphatidylserine transverse redistribution and calcium entry.

BMC Cell Biol., 2, s. 20.

Mateusen B., Van Soom A., Maes D.G., Donnay I., Duchateau L., Lequarre A.S. (2005).

Porcine embryo development and fragmentation and their relation to apoptotic


100

markers: a cinematographic and confocal laser scanning microscopic study. Re-

production, 129: 443−452.

Matwee C., Betts D.H., King W.A. (2000). Apoptosis in the early bovine embryo.

Zygote, 8: 57−68.

McCarthy N.J., Evan G.I. (1998). Methods for detecting and quantifying apoptosis. Curr.

Top. Dev. Biol., 36: 259−278.

McGinnis K.M., Whitton M.M., Gnegy M.E., Wang K.K. (1998). Calcium/calmodulin-

dependent protein kinase IV is cleaved by caspase-3 and calpain in SH-SY5Y

human neuroblastoma cells undergoing apoptosis. J. Biol. Chem., 273:

19993−20000.

Medema J.P., Scaffidi C., Kischkel F.C., Shevchenko A., Mann M., Krammer P.H.,

Peter M.E. (1997a). FLICE is activated by association with CD95 death-

inducing signaling complex (DISC). EMBO J., 16: 2794−2804.

Medema J.P., Toes R.E.M., Scaffidi C., Zheng T.S., Flavell R.A., Melief C.J.M., Peter

M.E., Offringa R., Krammer P.H. (1997b). Cleavage of FLICE (caspase-8) by

granzyme B during cytotoxic T lymphocyte-induced apoptosis. Eur. J.

Immunol., 27: 3492−3498.

Metcalfe A.D., Hunter H.R., Bloor D.J., Lieberman B.A., Picton H.M., Leese H.J.,

Kimber S.J., Brison D.R. (2004). Expression of 11 members of the BCL-2 fami-

ly of apoptosis regulatory molecules during human preimplantation embryo de-

velopment and fragmentation. Mol. Reprod. Dev., 68: 35−50.

Morishima N. (1999). Changes in nuclear morphology during apoptosis correlate with

vimentin cleavage by different caspases located either upstream or downstream

of Bcl-2 action. Genes Cells, 4: 401−414.

Murphy K.M., Ranganathan V., Farnsworth M.L., Kavallaris M., Lock R.B. (2000). Bcl-

2 inhibits Bax translocation from cytosol to mitochondria during drug-induced

apoptosis of human tumor cells. Cell Death Differ., 7: 102−111.

Nagata S. (2000). Apoptotic DNA fragmentation. Exp. Cell Res., 256: 12−18.

Neuber E., Luetjens C.M., Chan A.W., Schatten G.P. (2002). Analysis of DNA fragmen-

tation of in vitro cultured bovine blastocysts using TUNEL. Theriogenology,

57: 2193−2202.

Neumar R.W., Xu Y.A., Gada H., Guttmann R.P., Siman R. (2003). Cross-talk between

calpain and caspase proteolytic systems during neuronal apoptosis. J. Biol.

Chem., 278: 14162−14167.

Nicotera P., Rossi A.D. (1994). Nuclear Ca2+

: physiological regulation and role in

apoptosis. Mol. Cell. Biochem., 135: 89−98.

Nouraini S., Six E., Matsuyama S., Krajewski S., Reed J.C. (2000). The putative pore-

forming domain of Bax regulates mitochondrial localization and interaction

with Bcl-XL. Mol. Cell. Biol., 20: 1604−1615.

Nutt L.K., Pataer A., Pahler J., Fang B., Roth J., McConkey D.J., Swisher S.G. (2002a).

Bax and Bak promote apoptosis by modulating endoplasmic reticular and mito-

chondrial Ca2+

stores. J. Biol. Chem., 277: 9219−9225.

Nutt L.K., Chandra J., Pataer A., Fang B., Roth J.A. Swisher S.G., O'Neil R.G.,

McConkey D.J. (2002b). Bax-mediated Ca2+

mobilization promotes cytochrome

c release during apoptosis. J. Biol. Chem., 277: 20301−20308.

Oakes S.A., Scorrano L., Opferman J.T., Bassik M.C., Nishino M., Pozzan T.,

Korsmeyer S.J. (2005). Proapoptotic BAX and BAK regulate the type 1 inositol


101

trisphosphate receptor and calcium leak from the endoplasmic reticulum. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 102: 105−110.

Otsuki Y. (2000). Various methods of apoptosis detection. Acta Histochem. Cytochem.,

33: 235−241.

Pampfer S., Donnay I. (1999). Apoptosis at the time of embryo implantation in mouse

and rat. Cell Death Differ., 6: 533−545.

Pampfer S., Vanderheyden I., McCracken J.E., Vesela J., De Hertogh R. (1997). In-

creased cell death in rat blastocysts exposed to maternal diabetes in utero and to

high glucose or tumor necrosis factor-α in vitro. Development, 124: 4827−4836.

Pampfer S., Cordi S., Vanderheyden I., Van Der Smissen P., Courtoy P.J., Van

Cauwenberge A., Alexandre H., Donnay I., De Hertogh R. (2001). Expression

and role of Bcl-2 in rat blastocysts exposed to high D-glucose. Diabetes, 50:

143−149.

Petr J., Urbánková D., Tománek M., Rozinek J., Jílek F. (2002). Activation of in vitro

matured pig oocytes using activators of inositol triphosphate or ryanodine re-

ceptors. Anim. Reprod. Sci., 70: 235−249.

Pierce G.B., Lewellyn A.L., Parchment R.E. (1989). Mechanism of programmed cell

death in the blastocyst. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3654−3658.

Pinton P., Rizzuto R. (2006). Bcl-2 and Ca2+

homeostasis in the endoplasmic reticulum.

Cell Death Differ., 13: 1409−1418.

Pinton P., Ferrari D., Rapizzi E., Di Virgilio F., Pozzan T., Rizzuto R. (2002). A role for

calcium in Bcl-2 action? Biochimie, 84: 195−201.

Pörn-Ares M.I., Samali A., Orrenius S. (1998). Cleavage of the calpain inhibitor,

calpastatin, during apoptosis. Cell Death Differ., 5: 1028−1033.

Reed J.C. (1997). Double identity for proteins of the Bcl-2 family. Nature, 387:

773−776.

Renvoize C., Roger R., Moulian N., Bertoglio J., Breard J. (1997). Bcl-2 expression in

target cells leads to functional inhibition of caspase-3 protease family in human

NK cells and lymphokine-activated killer cell granule-mediated apoptosis. J.

Immunol., 159: 126−134.

Robertson J.D., Orrenius S., Zhivotovsky B. (2000). Review: nuclear events in apopto-

sis. J. Struct. Biol., 129: 346−358.

Rubio Pomar F.J., Roelen B.A., Slot K.A., van Tol H.T., Colenbrander B., Teerds K.J.,

(2004a). Role of Fas-mediated apoptosis and follicle-stimulating hormone on

the developmental capacity of bovine cumulus oocyte complexes in vitro. Biol.

Reprod., 71: 790−796.

Rubio Pomar F.J., Ducro-Steverink D.W.B., Hazeleger W., Teerds K.J., Colenbrander

B., Bevers M.M. (2004b). Development, DNA fragmentation and cell death in

porcine embryos after 24 h storage under different conditions. Theriogenology,

61: 147−158.

Rubio Pomar F.J., Teerds K.J., Kidson A., Colenbrander B., Tharasanit T., Aguilar B.,

Roelen B.A.J. (2005). Differences in the incidence of apoptosis between in vivo

and in vitro produced blastocysts of farm animal species: a comparative study.

Theriogenology, 63: 2254−2268.

Ruiz-Vela A., Opferman J.T., Cheng E.H.Y., Korsmeyer S.J. (2005). Proapoptotic BAX

and BAK control multiple initiator caspases. EMBO Rep. 6: 379−385.


102

Sahara S., Aoto M., Eguchi Y., Imamoto N., Yoneda Y., Tsujimoto Y. (1999). Acinus is

a caspase-3-activated protein required for apoptotic chromatin condensation.

Nature, 401: 168−173.

Sakahira H., Enari M., Nagata S. (1998). Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation

and DNA degradation during apoptosis. Nature, 391: 96−99.

Sakahira H., Enari M., Ohsawa Y., Uchiyama Y., Nagata S. (1999). Apoptotic nuclear

morphological change without DNA fragmentation. Curr. Biol., 9: 543−546.

Samiec M. (2004). Development of pig cloning studies: past, present and future. J.

Anim. Feed Sci., 13: 211−238.

Samiec M. (2005a). The role of mitochondrial genome (mtDNA) in somatic and embryo

cloning of mammals. A review. J. Anim. Feed Sci., 14: 213−233.

Samiec M. (2005b). The effect of mitochondrial genome on architectural remodeling and

epigenetic reprogramming of donor cell nuclei in mammalian nuclear transfer-

derived embryos. J. Anim. Feed Sci., 14: 393−422.

Samiec M., Skrzyszowska M. (2005a). Molecular conditions of the cell nucleus remod-

elling/reprogramming process and nuclear-transferred embryo development in

the intraooplasmic karyoplast injection technique: a review. Czech J. Anim.

Sci., 50: 185−195.

Samiec M., Skrzyszowska M. (2005b). Microsurgical nuclear transfer by intraooplasmic

karyoplast injection as an alternative embryo reconstruction method in somatic

cloning of pigs and other mammal species; application value of the method and

its technical advantages: a review. Czech J. Anim. Sci., 50: 235−242.

Samiec M., Skrzyszowska M. (2010a). Preimplantation developmental capability of

cloned pig embryos derived from different types of nuclear donor somatic cells.

Ann. Anim. Sci., 10: 385−398.

Samiec M., Skrzyszowska M. (2010b). The use of different methods of oocyte activation

for generation of porcine fibroblast cell nuclear-transferred embryos. Ann.

Anim. Sci., 10: 399−411.

Samiec M., Skrzyszowska M. (2011a). The possibilities of practical application of

transgenic mammalian species generated by somatic cell cloning in pharmacol-

ogy, veterinary medicine and xenotransplantology. Pol. J. Vet. Sci., 14:

329−340.

Samiec M., Skrzyszowska M. (2011b). Transgenic mammalian species, generated by

somatic cell cloning, in biomedicine, biopharmaceutical industry and human

nutrition/dietetics – recent achievements. Pol. J. Vet. Sci., 14: 317−328.

Samiec M., Skrzyszowska M. (2012a). Roscovitine is a novel agent that can be used for

the activation of porcine oocytes reconstructed with adult cutaneous or fetal fi-

broblast cell nuclei. Theriogenology, 78: 1855−1867.

Samiec M., Skrzyszowska M. (2012b). High developmental capability of porcine cloned

embryos following trichostatin A-dependent epigenomic transformation during

in vitro maturation of oocytes pre-exposed to R-roscovitine. Anim. Sci. Pap.

Rep., 30: 383−393.

Samiec M., Skrzyszowska M. (2013). Assessment of in vitro developmental capacity of

porcine nuclear-transferred embryos reconstituted with cumulus oophorus cells

undergoing vital diagnostics for apoptosis detection. Ann. Anim. Sci., 13:

513−529.


103

Samiec M., Skrzyszowska M. (2014). Biological transcomplementary activation as a

novel and effective strategy applied to the generation of porcine somatic cell

cloned embryos. Reprod. Biol. 14: 128-139.

Samiec M., Skrzyszowska M., Lipiński D. (2012). Pseudophysiological

transcomplementary activation of reconstructed oocytes as a highly efficient

method used for producing nuclear-transferred pig embryos originating from

transgenic foetal fibroblast cells. Pol. J. Vet. Sci., 15: 509−516.

Samiec M., Skrzyszowska M., Opiela J. (2013a). Creation of cloned pig embryos using

contact-inhibited or serum-starved fibroblast cells analysed intra vitam for

apoptosis occurrence. Ann. Anim. Sci., 13: 275−293.

Samiec M., Skrzyszowska M., Bochenek M. (2013b). In vitro development of porcine

nuclear-transferred embryos derived from fibroblast cells analysed

cytometrically for apoptosis incidence and accuracy of cell cycle synchroniza-

tion at the G0/G1 stages. Ann. Anim. Sci., 13: 735−752.

Samiec M., Opiela J., Lipiński D., Romanek J. (2015). Trichostatin A-mediated epige-

netic transformation of adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells bi-

ases the in vitro developmental capability, quality, and pluripotency extent of

porcine cloned embryos. Biomed Res. Int. (formerly titled: J. Biomed.

Biotechnol.), 2015: Article ID 814686, 13 pages.

Sanges D., Marigo V. (2006). Cross-talk between two apoptotic pathways activated by

endoplasmic reticulum stress: differential contribution of caspase-12 and AIF.

Apoptosis, 11: 1629−1641.

Sanges D., Comitato A., Tammaro R., Marigo V. (2006). Apoptosis in retinal degenera-

tion involves cross-talk between apoptosis-inducing factor (AIF) and caspase-

12 and is blocked by calpain inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:

17366−17371.

Savill J. (1998). Apoptosis: phagocytic docking without shocking. Nature, 392:

442−443.

Scharif-Askari E., Alam A., Rhéaume E., Beresford P.J., Scotto C., Sharma K., Lee D.,

DeWolf E., Nuttall M.E., Lieberman J., Sékaly R.P. (2001). Direct cleavage of

the human DNA fragmentation factor-45 by granzyme B induces caspase-

activated DNase release and DNA fragmentation. EMBO J., 20: 3101−3113.

Scorrano L., Oakes S.A., Opferman J.T., Cheng E.H., Sorcinelli M.D., Pozzan T.,

Korsmeyer S.J. (2003). BAX and BAK regulation of endoplasmic reticulum

Ca2+

: a control point for apoptosis. Science, 300: 135−139.

Scovassi A.I., Poirier G.G. (1999). Poly(ADP-ribosylation) and apoptosis. Mol. Cell.

Biochem., 199: 125−137.

Sharma A.K., Rohrer B. (2004). Calcium-induced calpain mediates apoptosis via

caspase-3 in a mouse photoreceptor cell line. J. Biol. Chem., 279:

35564−35572.

Shi W., Dirim F., Wolf E., Zakhartchenko V., Haaf T. (2004). Methylation reprogram-

ming and chromosomal aneuploidy in in vivo fertilized and cloned rabbit

preimplantation embryos. Biol. Reprod., 71: 340−347.

Shimizu S., Tsujimoto Y. (2000). Proapoptotic BH3-only Bcl-2 family members induce

cytochrome c release, but not mitochondrial membrane potential loss, and do

not directly modulate voltage-dependent anion channel activity. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA., 97: 577−582.


104

Shimizu S., Narita M., Tsujimoto Y. (1999). Bcl-2 family proteins regulate the release of

apoptogenic cytochrome c by the mitochondrial channel VDAC. Nature, 399:

483−487.

Shimizu S., Shinohara Y., Tsujimoto Y. (2000). Bax and Bcl-XL independently regulate

apoptotic changes of yeast mitochondria that require VDAC but not adenine

nucleotide translocator. Oncogene, 19: 4309−4318.

Shoshan-Barmatz V., Israelson A., Brdiczka D., Sheu S.S. (2006). The voltage-

dependent anion channel (VDAC): function in intracellular signalling, cell life

and cell death. Curr. Pharm. Des., 12: 2249−2270.

Skrzyszowska M., Karasiewicz J., Bednarczyk M., Samiec M., Smorąg Z., Waś B.,

Guszkiewicz A., Korwin-Kossakowski M., Górniewska M., Szablisty E.,

Modliński J.A., Łąkota P., Wawrzyńska M., Sechman A., Wojtysiak D., Hrabia

A., Mika M., Lisowski M., Czekalski P., Rząsa J., Kapkowska E. (2006). Gen-

eration of cloned and chimeric embryos/offspring using the new methods of an-

imal biotechnology. Reprod. Biol., 6 (Suppl 1): 119−135.

Skrzyszowska M., Samiec M., Słomski R., Lipiński D., Mały E. (2008). Development of

porcine transgenic nuclear-transferred embryos derived from fibroblast cells

transfected by the novel technique of nucleofection or standard lipofection.

Theriogenology, 70: 248−259.

Song Q., Lees-Miller S.P., Kumar S., Zhang Z., Chan D.W., Smith G.C.M., Jackson

S.P., Alnemri E.S., Litwack G., Khanna K.K., Lavin M.F. (1996). DNA-

dependent protein kinase catalytic subunit: a target for an ICE-like protease in

apoptosis. EMBO J., 15: 3238−3246.

Spanos S., Rice S., Karagiannis P., Taylor D., Becker D.L., Winston R.M., Hardy K.

(2002). Caspase activity and expression of cell death genes during development

of human preimplantation embryos. Reproduction, 124: 353−363.

Squier M.K. Cohen J.J. (1997). Calpain, an upstream regulator of thymocyte apoptosis.

J. Immunol., 158: 3690−3697.

Squier M.K., Miller A.C., Malkinson A.M., Cohen J.J. (1994). Calpain activation in

apoptosis. J. Cell Physiol., 159: 229−237.

Stadelmann C., Lassmann H. (2000). Detection of apoptosis in tissue sections. Cell

Tissue Res., 301: 19−31.

Stoka V., Turk B., Schendel S.L., Kim T.H., Cirman T., Snipas S.J., Ellerby L.M.,

Bredesen D., Freeze H., Abrahamson M., Brömme D., Krajewski S., Reed J.C.,

Yin X.M., Turk V., Salvesen G.S. (2001). Lysosomal protease pathways to

apoptosis. Cleavage of Bid, not pro-caspases, is the most likely route. J. Biol.

Chem., 276: 3149−3157.

Susin S.A., Lorenzo H.K., Zamzami N., Marzo I., Snow B.E., Brothers G.M., Mangion

J., Jacotot E., Costantini P., Loeffler M., Larochette N., Goodlett D.R.,

Aebersold R., Siderovski D.P., Penninger J.M., Kroemer G. (1999). Molecular

characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. Nature, 397:

441−446.

Tagliarino C., Pink J.J., Reinicke K.E., Simmers S.M., Wuerzberger-Davis S.M.,

Boothman D.A. (2003). μ-calpain activation in β-lapachone-mediated apoptosis.

Cancer Biol. Ther., 2: 141−152.

Tait J.F., Smith C., Levashova Z., Patel B., Blankenberg F.G., Vanderheyden J.L.

(2006). Improved detection of cell death in vivo with annexin V radiolabeled by

site-specific methods. J. Nucl. Med., 47: 1546−1553.


105

Thornberry N.A., Rosen A., Nicholson D.W. (1997). Control of apoptosis by proteases.

Adv. Pharmacol., 41: 155−177.

Tian X.C., Xu J., Yang X. (2000). Normal telomere lengths found in cloned cattle. Nat.

Genet., 26: 272−273.

Torriglia A., Perani P., Brossas J.Y., Altairac S., Zeggai S., Martin E., Tréton J.,

Courtois Y., Counis M.F. (2000). A caspase-independent cell clearance pro-

gram. The LEI/L-DNase II pathway. Ann. N. Y. Acad. Sci., 926: 192−203.

Tyurina Y.Y., Serinkan F.B., Tyurin V.A., Kini V., Yalowich J.C., Schroit A.J., Fadeel

B., Kagan V.E. (2004a). Lipid antioxidant, etoposide, inhibits

phosphatidylserine externalization and macrophage clearance of apoptotic cells

by preventing phosphatidylserine oxidation. J. Biol. Chem., 279: 6056−6064.

Tyurina Y.Y., Tyurin V.A., Zhao Q., Djukic M., Quinn P.J., Pitt B.R., Kagan V.E.

(2004b). Oxidation of phosphatidylserine: a mechanism for plasma membrane

phospholipid scrambling during apoptosis? Biochem. Biophys. Res. Commun.,

324: 1059−1064.

Vanags D.M., Pörn-Ares M.I., Coppola S., Burgess D.H., Orrenius S. (1996). Protease

involvement in fodrin cleavage and phosphatidylserine exposure in apoptosis. J.

Biol. Chem., 271: 31075−31085.

Van Blerkom J., Davis P., Alexander S. (2001). A microscopic and biochemical study of

fragmentation phenotypes in stage-appropriate human embryos. Hum. Reprod.,

16: 719−729.

van den Eijnde S.M., Luijsterburg A.J., Boshart L., De Zeeuw C.I., van Dierendonck

J.H., Reutelingsperger C.P., Vermeij-Keers C. (1997). In situ detection of apop-

tosis during embryogenesis with annexin V: from whole mount to ultrastruc-

ture. Cytometry, 29: 313−320.

Verhagen A.M., Ekert P.G., Pakusch M., Silke J., Connolly L.M., Reid G.E., Moritz

R.L., Simpson R.J., Vaux D.L. (2000). Identification of DIABLO, a mammalian

protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins.

Cell, 102: 43−53.

Verhoven B., Schlegel R.A., Williamson P. (1995). Mechanisms of phosphatidylserine

exposure, a phagocyte recognition signal, on apoptotic lymphocytes. J. Exp.

Med., 182: 1597−1601.

Walker P.R., Weaver V.M., Lach B., LeBlanc J., Sikorska M. (1994). Endonuclease

activities associated with high molecular weight and internucleosomal DNA

fragmentation in apoptosis. Exp. Cell Res., 213: 100−106.

Wang K.K., Posmantur R., Nadimpalli R., Nath R., Mohan P., Nixon R.A., Talanian

R.V., Keegan M., Herzog L., Allen H. (1998). Caspase-mediated fragmentation

of calpain inhibitor protein calpastatin during apoptosis. Arch. Biochem.

Biophys., 356: 187−196.

Wang K.K.W. (2000). Calpain and caspase: can you tell the difference? Trends

Neurosci., 23: 20−26.

Wang Y., Perchellet E.M., Ward M.M., Lou K., Hua D.H., Perchellet J.P. (2005). Rapid

collapse of mitochondrial transmembrane potential in HL-60 cells and isolated

mitochondria treated with anti-tumor 1,4-anthracenediones. Anticancer Drugs,

16: 953−967.

Warner C.M., McElhinny A.S., Wu L., Cieluch C., Ke X., Cao W., Tang C., Exley G.E.

(1998). Role of the Ped gene and apoptosis genes in control of preimplantation

development. J. Assist. Reprod. Genet., 15: 331−337.


106

Wen L.P., Fahrni J.A., Troie S., Guan J.L. Orth K., Rosen G.D. (1997). Cleavage of

focal adhesion kinase by caspases during apoptosis. J. Biol. Chem., 272:

26056−26061.

Widlak P., Li P., Wang X., Garrard W.T. (2000). Cleavage preferences of the apoptotic

endonuclease DFF40 (caspase-activated DNase or nuclease) on naked DNA and

chromatin substrates. J. Biol. Chem., 275: 8226−8232.

Wood D.E., Newcomb E.W. (1999). Caspase-dependent activation of calpain during

drug-induced apoptosis. J. Biol. Chem., 274: 8309−8315.

Wright S.C., Schelenberger U., Wang H., Kinder D.H., Talhouk J.W., Larrick J.W.

(1997). Activation of CPP32-like proteases is not sufficient to suppress activa-

tion of AP24, but not CPP32-like activity. J. Exp. Med., 186: 1107−1117.

Wright S.C., Wang H., Wei Q.S., Kinder D.H., Larrick J.W. (1998). Bcl-2-mediated

resistance to apoptosis is associated with glutathione-induced inhibition of

AP24 activation of nuclear DNA fragmentation. Cancer Res., 58: 5570−5576.

Xu J., Yang X. (2001). Telomerase activity in early bovine embryos derived from

parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biol. Reprod., 64: 770−774.

Yamashima T. (2000). Implication of cysteine proteases calpain, cathepsin and caspase

in ischemic neuronal death of primates. Prog. Neurobiol., 62: 273−295.

Yang M.Y., Rajamahendran R. (2002). Expression of Bcl-2 and Bax proteins in relation

to quality of bovine oocytes and embryos produced in vitro. Anim. Reprod.

Sci., 70: 159−169.

Yang X., Stennicke B., Wang B., Green D.R., Jänicke R.U., Srinivasan A., Seth P.,

Salvesen G.S., Froelich C.J. (1998). Granzyme B mimics apical caspases. De-

scription of a unified pathway for trans-activation of executioner caspase-3 and

-7. J. Biol. Chem., 273: 34278−34283.

Zalk R., Israelson A., Garty E.S., Azoulay-Zohar H., Shoshan-Barmatz V. (2005).

Oligomeric states of the voltage-dependent anion channel and cytochrome c re-

lease from mitochondria. Biochem. J., 386: 73−83.

Zamzami N., Marchetti P., Castedo M., Decaudin D., Macho A., Hirsch T., Susin S.A.,

Petit P.X., Mignotte B., Kroemer G. (1995). Sequential reduction of mitochon-

drial transmembrane potential and generation of reactive oxygen species in ear-

ly programmed cell death. J. Exp. Med., 182: 367−377.

Zamzami N., Susin S.A. Marchetti P., Hirsch T., Gómez-Monterrey I., Castedo M.,

Kroemer G. (1996). Mitochondrial control of nuclear apoptosis. J. Exp. Med.,

183: 1533−1544.

Zhang J., Dong M., Li L., Fan Y., Pathre P., Dong J., Lou D., Wells J.M., Olivares-

Villagómez D., Van Kaer L., Wang X., Xu M. (2003). Endonuclease G is re-

quired for early embryogenesis and normal apoptosis in mice. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 100: 15782−15787.

Zheng Y., Shi Y., Tian C., Jiang C., Jin H., Chen J., Almasan A., Tang H., Chen Q.

(2004). Essential role of the voltage-dependent anion channel (VDAC) in mito-

chondrial permeability transition pore opening and cytochrome c release in-

duced by arsenic trioxide. Oncogene, 23: 1239−1247.

Zhivotovsky B., Wade D., Nicotera P., Orrenius S. (1994). Role of nucleases in apopto-

sis. Int. Arch. Allergy Immunol., 105: 333−338.

Zhivotovsky B., Gahm A., Orrenius S. (1997). Two different proteases are involved in

the proteolysis of lamin during apoptosis. Biochem. Biophys. Res. Commun.,

233: 96−101.


107

Zou H., Li Y., Liu X., Wang X. (1999). An APAF-1∙cytochrome c multimeric complex

is functional apoptosome that activates procaspase-9. J. Biol. Chem., 274:

11549−11556.

Zwaal R.F.A., Schroit A.J. (1997). Pathophysiologic implications of membrane phos-

pholipid asymmetry in blood cells. Blond, 89: 1121−1132.


108

SPIS TREŚCI

1. WSTĘP ............................................................................................................. 5

1.1. Dwa „oblicza” śmierci komórek: aktywna śmierć fizjologiczna (apoptoza)

i pasywna śmierć patologiczna (nekroza) ........................................................ 5

1.1.1. Scenariusz śmierci apoptotycznej i nekrotycznej a różnice w komór-

kowym obrazie morfologicznym i ultrastrukturalnym, podłożu biochemicz-

nym i biofizycznym oraz mechanizmach molekularnych i genetycznych ... 5

1.2. Charakterystyka trzech etapów w scenariuszu śmierci apoptotycznej

komórek .............................................................................................................. 7

1.2.1. Etap pierwszy – faza inicjacji apoptozy .......................................... 7

1.2.2. Etap drugi – faza wykonawcza apoptozy i jej kontrolny punkt

nieodwracalności ....................................................................................... 9

1.2.2.1. Udział mitochondriów w scenariuszu śmierci apoptotycznej

– główne czynniki i kluczowe mechanizmy warunkujące przebieg

fazy wykonawczej apoptozy w wewnątrzmitochondrialnym i cyto-

plazmatycznym przedziale komórkowym ....................................... 13

1.2.2.2. Udział jądra komórkowego w scenariuszu śmierci apopto-

tycznej – główne czynniki i kluczowe mechanizmy determinujące

przebieg fazy wykonawczej apoptozy w wewnątrzjądrowym

przedziale komórkowym .................................................................. 15

1.2.3. Etap trzeci – faza destrukcyjna apoptozy ....................................... 17

1.3. Strategie wykrywania symptomów śmierci apoptotycznej

i nekrotycznej w komórkach ............................................................................ 19

2. CEL, UZASADNIENIE PODJĘCIA ORAZ ZAKRES BADAŃ .................. 22

3. METODYKA BADAŃ .................................................................................. 25

3.1. Uzyskiwanie zarodków świni technikami klonowania somatycznego ... 25

3.1.1. Pozyskiwanie i dojrzewanie mejotyczne in vitro oocytów-biorców

egzogennych jąder komórkowych ................................................................ 25

3.1.2. Wyprowadzenie linii komórek fibroblastycznych z tkanki skórno-

powłokowej dorosłych osobników lub płodów .......................................... 26

3.1.3. Przyżyciowa diagnostyka fluorescencyjna komórek-dawców jąder

pod kątem zmian wczesnoapoptotycznych .................................................. 27

3.1.3.1. Przygotowanie komórek somatycznych do analizy

w kierunku apoptozy ......................................................................... 27

3.1.3.2. Fluorescencyjna detekcja apoptozy w komórkach

fibroblastycznych ............................................................................. 28


109

3.1.4. Ocena morfologiczna komórek-dawców jąder na podstawie cech

charakterystycznych dla późnej apoptozy lub nekrozy (martwicy) ........... 28

3.1.5. Enukleacja (wyjądrzanie) oocytów ................................................ 33

3.1.5.1. Enukleacja mikrochirurgiczna „ślepa” ........................... 33

3.1.5.2. Wspomagana chemicznie enukleacja mikrochirurgiczna

oocytów ............................................................................................ 34

3.1.6. Rekonstrukcja enukleowanych oocytów (transplantacja jąder

komórek somatycznych do enukleowanych oocytów) ................................. 35

3.1.7. Sztuczna aktywacja zrekonstruowanych oocytów ............................ 37

3.1.8. Hodowla in vitro zarodków klonalnych ......................................... 39

3.2. Cytologiczna ocena jakości morfologicznej blastocyst ........................... 45

3.3. Przyżyciowa analiza fluorycytochemiczna blastocyst klonalnych

w kierunku wykrywania objawów śmierci apoptotycznej komórek ........... 46

3.4. Schemat doświadczeń ............................................................................... 47

3.5. Analiza statystyczna ................................................................................. 49

4. WYNIKI .................................................................................... ....................... 50

5. OMÓWIENIE WYNIKÓW .......................................................................... 64

6. PODSUMOWANIE I WNIOSKI .................................................................... 83

7. WYMIERNY, UDOKUMENTOWANY EFEKT PODJĘTEGO

PROBLEMU ......................................................................................................... 85

8. STRESZCZENIE MONOGRAFII ................................................................ 86

9. ABSTRACT OF MONOGRAPH .................................................................. 90

10. PIŚMIENNICTWO ......................................................................................... 91

Date post:	28-Feb-2019
Category:	Documents
Upload:	phungque
View:	222 times
Download:	0 times

MARCIN SAMIEC MARIA SKRZYSZOWSKA - izoo.krakow.pl · zmiany biochemiczne i molekularne, wskazują,...

Documents