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“PROBIOTICI: UNA VISIONE MOLECOLARE” Maria Luisa Callegari
“PROBIOTICI:UNA VISIONE MOLECOLARE”
“PROBIOTICI:UNA VISIONE MOLECOLARE”
Maria Luisa Callegari
Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk withLive Lactic Acid Bacteria
Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk withLive Lactic Acid Bacteria
Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food IncludingPowder Milk with Live Lactic Acid Bacteria
Córdoba, Argentina1-4 October 2001
www.fao.orgwww.who.int
Si raccomanda che.....Si raccomanda che.....
I ceppi considerati potenziali probiotici siano identificati con tecniche di biologia molecolare riconosciute
I nomi scientifici assegnati siano in accordo con l’International Code of Nomenclature.
I ceppi siano depositati in una collezione internazionale.
Biologia molecolare…Biologia molecolare…
… è la sola via da seguire per l’identificazione della specie di ceppi
probiotici; la caratterizzazione fenotipica non è sufficiente. Si
consideri l’esempio delle specie di lattobacilli appartenenti al gruppo
“acidophilus”.
L. acidophilusL. acidophilus
L. acidophilusL. amylovorusL. crispatusL. gallinarum
L. acidophilusL. amylovorusL. crispatusL. gallinarum
A
B L. gasseri L. johnsoniiL. gasseri L. johnsonii
Specie di Lactobacillus isolate in piastra e identificate mediante test genetici.
L. gasseri, L. salivarius, L. paracasei, L. crispatus
Song et al., 1999 and 2000
L. casei group of species, L. plantarumTannock et al., 2000
L. salivarius, L. paracaseiDunne et al., 1999
L. paracasei, "acidophilus" groupB of Johnson (L.gasseri and L.johnsonii)
Morelli et al., 1998
SpeciesReferences
La biologia molecolare come strumento per....
La biologia molecolare come strumento per....
l’identificazione tassonomica delle specie batteriche la caratterizzazione e il typing dei ceppi potenzialmente probioticila caratterizzazione della microflora intestinale “totale” senza ricorrere alla coltivazione dei batteri in piastra.
Il gene del 16S rRNA è alla base delle tecniche utilizzate per l’identificazione
Il gene del 16S rRNA è alla base delle tecniche utilizzate per l’identificazione
PCR specie-specifiche
ARDRA (AMPLIFIED RIBOSOMAL DNA RESTRICTION ANALYSIS)
Ventura, M., Casas,I. A., Morelli,L., Callegari,M.L. (2000).Rapid amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) of Lactobacillus spp. isolated from fecal and vaginal samples.Applied and Systematic Microbiology, 23,504-509.
Come ottenere una corretta identificazione
Come ottenere una corretta identificazione
ARDRA è stata messa a punto per identificare diverse specie of Lactobacillus isolate da feci e da vagina. Il gene del 16S rRNA amplificato mediante PCR è digerito con enzimi di restrizione. Quatto enzimi di restrizione consentono di identificare 14 specie di Lactobacillus.
Ceppi di L. rhamnosus identificati mediante ARDRA
Ceppi di L. rhamnosus identificati mediante ARDRA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Sau 3A Hinf I
La biologia molecolare come strumento per....
La biologia molecolare come strumento per....
l’identificazione tassonomica delle specie batteriche la caratterizzazione e il typing dei ceppi potenzialmente probioticila caratterizzazione della microflora intestinale “totale” senza ricorrere alla coltivazione dei batteri in piastra.
Necessari per seguire in vivo il comportamento del probiotico ingerito (permanenza, adesione ecc)
Si possono utilizzare tecniche come:• PCR ceppo-specifica• PCR basate sull’ uso di oligonucleotidi capaci di
produrre profili di bande (RAPD;REP ecc)
Metodi per il monitoraggio dei probiotici in vivo
Metodi per il monitoraggio dei probiotici in vivo
RAPD-PCRRAPD-PCR
Ctr 1 2 3 4 5
Il ceppo di L. gasseri 4B2 (6X108 CFU) è stato somministrato ai topi risospeso in 100 µl di una soluzione al 20% di glucosio.
Un esempio del monitoraggio di un probiotico mediante PCR ceppo-specifica
Un esempio del monitoraggio di un probiotico mediante PCR ceppo-specifica
Lucchini F, Kmet V, Cesena C, Coppi L, Bottazzi V, Morelli L.Specific detection of a probiotic Lactobacillus strain in faecalsamples by using multiplex PCR. FEMS Microbiol Lett.1998;158:273-278.
Dalle colonie isolate è stato estratto il DNA
Le feci sono state seminate in Rogosa
L’identificazione del 4B2 isolato da feci è stata eseguita mediante PCR. Per la reazione si è utilizzata una coppia di primer disegnati in base alla sequenza del gene dell’APF. Una seconda coppia di primer disegnati, invece, su una regione universale del gene del 16S rRNA è stata utilizzata come controllo per la reazione.
Un altro esempio di monitoringdi un ceppo probiotico
Un altro esempio di monitoringdi un ceppo probiotico
Il ceppo di Lactobacillus crispatus M247 èparticolarmente interessante da un punto di vista medico in quanto capace di contrastare la colite indotta in topi.
Castagliuolo I, Galeazzi F, Ferrari S, Elli M, Brun P, Cavaggioni A, Tormen D, Sturniolo GC, Morelli L, Palu G. Beneficial effect of auto-aggregating Lactobacillus crispatus on experimentally induced colitis in mice. FEMS Immunol Med Microbiol. 2005;43:197-204.
La biologia molecolare come strumento per....
La biologia molecolare come strumento per....
l’identificazione tassonomica delle specie batteriche la caratterizzazione e il typing dei ceppi potenzialmente probioticila caratterizzazione della microflora intestinale “totale” senza ricorrere alla coltivazione dei batteri in piastra.
Lane 1: T0, lane 2 : nutrizione esclusiva per 10 giorni; lane 3: nutrizione esclusiva per 10 settimane e lane 4 nutrizione parziale per 6 settimane.
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LIONETTI P, CALLEGARI ML, FERRARI S, CAVICCHI MC, POZZI E, DE MARTINO M, MORELLI L. (2005). Enteral nutrition and microflora in pediatric Crohn's disease. JPEN Journal ParenteralEnteral Nutrition, 29(4 Suppl):S173-175;
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) e TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis)
Permettono di confrontare nel tempo la microflora di un individuo.
B. dentium
B. longum
B. adolescentis
Grazie per l’attenzione!
