GENETICA FUNCIONAL

Estudio de la expresión de genomas completos

GENETICA FUNCIONAL

Bibliografía: Nature Genetics January 1999 Vol. 21, SupplementThe Chipping Forecast

GENETICA FUNCIONAL1) El entendimiento de los sistemas biológicos constituidos por miles de genes requiere la organización de las partes según sus propiedades:

+ Similaridad de secuencia de DNA en las regiones codificantes y reguladoras+ Variaciones polimórficas entre especies y subgrupos+ Tiempo y lugar de expresión de los RNAs en el desarrollo, en respuesta a situaciones fisiológicas y/o patológicas.+ Localización subcelular de los productos génicos.

2) Este entendimiento precisa el desarrollo de técnicas de "visión global" de los procesos biológicos: estimación simultanea de todos los componentes.

+ DNA chips (o DNA microarrays)+ Serial Analysis of Gene Expresion (SAGE)+ Differential Display (Expresión diferencial).

3) Estas técnicas permiten estudiar en paralelo los niveles de expresión de muchos genes y generan información estática (donde se expresa un gen) y dinámica (como se relaciona la expresión de unos genes con otros).

DNA Chips o DNA Microarrays1) Evolución histórica:

+ Técnica de Shouthern: "Las moléculas de ácido nucleico marcadas de forma apropiada puede usarse para extraer información de muestras de de ácidos nucleicos fijadas a un soporte sólido": Técnicas de Shouthern, Northern, dot-blot, Slot-blot, etc.

+ Fijación de clones individuales de forma ordenada en filtros para localizar los clones deseados e investigar patrones de expresión de genes.

2) Innovaciones clave:A) Utilización de soportes sólidos no-porosos, que permiten la miniaturización y la detección fluorescente.

+ Pueden inmovilizarse de forma automática hasta 10.000 cDNAs en un soporte microscópico e hibridarlo con sondas marcadas.

B) Desarrollo de métodos de síntesis in situ y a alta densidad, de oligonucleótidos en dichas superficies. + Mediante técnicas fotolitográficas: matrices con 400.000 oligonucleótidos distintos cada uno confinado en una región de 20 µm2

+ Mediante la colocación in situ de los reactivos de síntesis por dispositivos similares los utilizados en las impresoras de chorro de tinta.

3) Usos propuestos:A) Análisis de niveles de expresión de RNAs.

+ cDNA arrays: Producidas por fijación de productos de PCR (0.6 a 2.4 Kb) que representan genes específicos.+Oligonucleotide arrays: Idem pero por síntesis in situ de oligonucleótidos

B) Análisis de variantes polimórficas en DNA y nuevas mutaciones (SNPs- Single Nucleotide Polymorfisms).+ Oligonucleotide arrays: Para secuenciación en paralelo.

Affymetrix

Chip de vidrio

cDNA microarray schema

Impresión o “espoteo”

• Oligos , cDNA o fragmentos de PCR depositados sobre una superficie de vidrio

Pen microarray robot

Pen microarray robot

Estación automátic

a de hibridación

Modelo de DNA array

Light directed oligonucleotide synthesis

Light directed oligonucleotide synthesis

Para ver esta película, debedisponer de QuickTime™ y deun descompresor Animation.Para ver esta película, debedisponer de QuickTime™ y deun descompresor Cinepak.

40,000 genes en una única matriz

Usos propuestos para los DNA Chips o DNA Microarrays

A) Análisis de niveles de expresión de RNAs.+ cDNA o oligonucleotide arrays: Producidas

por fijación de productos de PCR (0.6 a 2.4 Kb) que representan genes específicos.

B) Secuenciación+ Oligonucleotide arrays

C) Genotipado+ Oligonucleotide arrays

cDNA microarray

co-hybridization of cDNAs to DNA microarray

Blank-not expressed

Yellow- expressed inBoth, culture and infection

Green- expressed in infection only

Red- expressed in culture only

RNA binds to corresponding gene

Bacteria from sit of infection.Label cDNA from bacteria with green Cy5 dye

Bacteria grown in cultureLabel cDNA from bacteria with red Cy3 dye

Simulación de detección

Para ver esta película, debedisponer de QuickTime™ y deun descompresor Animation.

An hybridized microarray

cDNA Microarrays Quantitation

cDNA Microarrays Detection Limits

Estrategias de secuenciación con chips de DNA

Oligonucleótidos utilizados en secuenciación por ganancia de señal

Sequence analysis arrays

Secuenciación y genotipado

Secuenciación y genotipado

Genotipado

Matríz con 120.000 sondas diseñada para genotipar 3.000 loci bialélicos

SAGE

Serial Analysis of Gene Expression

SAGE

• Una secuencia de nucleótidos corta (tag) de 9 o 10 pares de bases contiene suficiente información para identificar un transcrito.

Ligate and amplify with primers A and B

GGATGCATGXXXXXXXXXCCTACGTACXXXXXXXXX

OOOOOOOOOCATGCATCCOOOOOOOOOGTACGTAGG

Primer BPrimer A

TE AE Ditag TEAE

CATGXXXXXXXXXGTACXXXXXXXXX

OOOOOOOOOCATGOOOOOOOOOGTAC

XXXXXXXXXXXXXXXXXX

OOOOOOOOOCATGOOOOOOOOOGTAC

AE

Ditag

AETag 1 Tag 2

Ditag

AETag 3 Tag 4

Isolate Ditags. Concatenate and clone

XXXXXXXXXGTACXXXXXXXXX

OOOOOOOOOCATGOOOOOOOOO Primer BCATCC

GTACGTAGGPrimer A CCTAC

GGATGCATG

Cleave with anchoring enzyme

GGATGCATGXXXXXXXXXCCTACGTACXXXXXXXXXPrimer A GGATGCATGOOOOOOOOO

CCTACGTACOOOOOOOOOPrimer B

TE AE Tag TE AE Tag

Cleave with tagging enzyme (TE). Blunt Ends

AAAAATTTTT

CATGGTAC

AAAAATTTTT

CATGGTAC

AAAAATTTTT

CATGGTAC

AAAAATTTTT

CATGGTAC

Divide in half Ligate to linkers (A+B)

AE is Nia IIITE is Fok I

AAAAATTTTT

AAAAATTTTT

AAAAATTTTTAAAAATTTTT

GTAC

GTAC

Cleave with anchoring enzyme (AE)Bind to streptavidin beads