Post on 18-Nov-2023
transcript
iii
SEMARANG
2012
RINGKASAN
Kelompok IIIC. 2012 . Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi. (Asisten : Lia
Kusuma S.)
Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi, Medium, Larutan
Pengenceran, Metode Penghitungan Cawan dan Pewarnaan Gram dilaksanakan
pada hari Rabu tanggal 23 Mei 2012, pada pukul 15.00 - 19.00 WIB dan pada hari
Kamis tanggal 24 Mei 2012, pada pukul 16.00 - 18.00 WIB bertempat di
Laboratorium Fisiologi dan Biokimia Ternak Fakutas Peternakan, Universitas
Diponegoro, Semarang.
Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi, Medium, Larutan
Pengenceran, Metode Penghitungan Cawan dan Pewarnaan Gram alat-alat yang
digunakan adalah oven, autoclave, cawan petri, pipet hisap, erlenmeyer, kertas
pembungkus, alumunium foil, timbangan, waterbath, gelas beker, gelas ukur,
pisau, kain saring, jarum dan loop inokulasi, api bunsen, tabung reaksi, kaca
obyek, tisu, nampan, mikroskop. Bahan yang dibutuhkan dalam praktikum ini
adalah kapas, alkohol, Nutrient Broth (bubuk), kentang, Dextrose, agar, aquades,
asam tartarat 10%, Methylene blue (kristal violet), gram A (kristal violet), gram B
(yodium/lugol), gram C (alkohol), gram D (safranin).
Berdasarkan praktikum mikrobiologi dapat disimpulkan bahwa
sterilisasi kering digunakan untuk mensterilkan alat sedangkan sterilisasi basah
untuk mensterilkan medium. Medium biakan terdiri dari cair dan padat. Medium
yang baik memilki nutrien yang cukup bagi mikroba, tidak ada zat penghambat
dan harus steril. Pewarnaan gram dapat membedakan bakteri yang bersifat gram
positif dan gram negatif. Pewarnaan gram yang dapat disimpulkan yaitu adanya
bakteri yang berbentuk bulat dan warna yang nampak adalah ungu. Hal ini berarti
bakteri gram positif. Sedangkan bakteri yang berwarna merah muda, termasuk
bakteri gram negatif. Pertumbuhan bakteri terdiri dari tujuh fase yaitu fase
adaptasi, fase pertumbuhan awal, fase pertumbuhan logaritma, fase pertumbuhan
lambat, fase pertumbuhan statis (stasioner), fase menuju kematian dan fase
kematian.
Kata Kunci : NA, APDA, sterilisasi, hitungan cawan dan pewarnaan gram
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, yang telah melimpahkan
rahmat dan hidayah-Nya sehingga laporan praktikum Mikrobiologi ini dapat
selesai tepat waktu.
Laporan ini disusun berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan,
kemudian diaplikasikan dengan mata kuliah yang diajarkan ditunjang dengan
sumber yang penulis baca. Laporan ini diharapkan dapat berguna bagi kami
selaku praktikan dan segenap pihak yang membutuhkan.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Ir. Syaiful Anwar,
M.Si. selaku koordinator praktikum Mikrobiologi, Ganang Setyo Nugroho, selaku
koordinator Asisten praktikum Mikrobiologi, Lia Kusuma Setiasih. selaku asisten
pembimbing praktikum Mikrobiologi, serta semua pihak yang telah membantu
baik secara moril maupun materil dalam pelaksanaan dan pembuatan praktikum
ini.
Penulis mohon maaf jika terjadi kesalahan baik dari penulisan nama
ataupun pengetikan. Kritik dan saran penulis harapkan demi penyempurnaan
laporan ini.
Semarang , Juni 2012
Penulis
vi
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR .................................................................................... iv
DAFTAR ISI .................................................................................................... v
DAFTAR TABEL ............................................................................................ vii
DAFTAR ILUSTRASI .................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... ix
BAB I PENDAHULUAN ................................................................................ 1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 3
2.1. Sterilisasi ........................................................................................... 3
2.1.1. Sterilisasi Kering .................................................................... 4
2.1.2. Sterilisasi Basah..................................................................... 4
2.2. Medium ............................................................................................. 5
2.2.1. Nutrien Agar........................................................................... 6
2.2.2. Potato Dextrose Agar.............................................................. 7
2.2.3. Acidified Potato Dextrose Agar.............................................. 7
2.3. Metode Hitungan Cawan................................................................... 8
2.4. Pewarnaan Gram. .............................................................................. 9
BAB III MATERI DAN METODE ................................................................. 10
3.1. Materi ................................................................................................ 10
3.2. Metode .............................................................................................. 11
3.2.1 Sterilisasi................................................................................... 11
3.2.1.1. Sterilisasi kering.............................................................. 11
3.2.1.1. Sterilisasi basah................................................................ 11
3.2.2. Pembuatan Medium.................................................................. 12
3.2.2.1 Nutrien Agar..................................................................... . 12
3.2.2.2. Potato Dextrose agar dan acidified potato dextrose agar.. 12
3.2.3. Penghitungan Mikroorganisme................................................. 13
3.2.3.1 Agar Cawan ....................................................................... 13
3.2.3.2 Pewarnaan Gram................................................................ 13
BAB IV HASIL PEMBAHASAN ................................................................... 15
vii
4.1. Sterilisasi ....................................................................................... 15
4.2. Medium.......................................................................................... 16
4.2.1. Nutrien Agar ........................................................................ 16
4.2.2. Potato Dextrose Agar .......................................................... 16
4.2.3. Acidefied Potato Dextrose Agar ......................................... 17
4.3. Metode Hitungan Cawan ............................................................... 17
4.4. Pewarnaan Gram ........................................................................... 18
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................... 21
5.1. Simpulan ....................................................................................... 21
5.2. Saran .............................................................................................. 21
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 22
viii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1.Metode Hitungan Cawan Sampel Sosil................................... ........... 18
Tabel 2.Pewarnaan Gram Staphylococcus dan E. coli............... ...................... 19
ix
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Gambar dan Fungsi Alat ....................................................... 23
Lampiran 2. Menjawab Pertanyaan Praktikum Mikrobiologi................... 26
Lampiran 3. Foto Kopi Laporan Hasil Praktikum .................................... 33
Lampiran 4. Foto Kopi Literatur ............................................................... 34
RINGKASAN
KELOMPOK IIIC. 2012. Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi (Asisten : Lia
Kusuma Setiasih).
Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi, Medium, Larutan
Pengncer, Metode perhitungan Cawan dan Pewarnaan Gram dilaksanakan pada
hari Rabu tanggal 23 Mei 2012 pukul 15.00-19.00 WIB dan hari kamis tanggal 24
Mei 2012 pukul 16.00-18.00 WIB di Laboratorium Fisiologi dan Biokimia Ternak
Fakultas Peternakan dan Pertanian Universitas Diponegoro, Semarang.
Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi, Medium, Larutan
Pengencer, Metode perhitungan Cawan dan Pewarnaan Gram alat-alat yang
digunakan adalah oven, autoklaf, cawan petri, pipet hisap, erlenmeyer, kertas
pembungkus, aluminium foil, timbangan, gelas beker, gelas ukur, pisau, kain
saring, jarum dan loop inokulasi, api bunsen, tabung dan rak reaksi, kaca obyek,
tisu nampan dan mikroskop. Bahan yang dibutuhkan dalam praktikum ini adalah
sosis ayam, kapas, alkohol, kentang, dextrosa, agar, aquades, asam tartarat 10%,
gram A (kristal violet), gram B (iodium atau lugol), gram C (alkohol) dan gram D
(safranin).
Sebelum dilaksanankan praktikum ini dilakukan sterilisasi kering
digunakan untuk alat-alat dan sterilisasi basah digunakan untuk bahan. Kemudian
membuat medium, dalam pembuatan medium dapat dilakukan dengan
menimbang masing-masing komponen bahan-bahan secara teliti, melarutkan
dalam air, mengatur pHnya. Sebelum dilaksanakan proses pewarnaan terlebih
dahulu dilakukan penghitungan cawan. Setelah diketahui terdapat suatu koloni
pada medium Acidified Potato Dextrose Agar dan Nutrient Agar maka dilakukan
perhitungan dengan metode hitungan cawan. Pada medium Acidified Potato
Dextrose Agar setelah dilakukan pengenceran 10-3
– 10-5
didapatkan Standart
Plate Count sebanyak 3.0 x 107
sedangkan pada medium NA setelah dilakukan
pengenceran 10-3
– 10-5
CFU/ml didapatkan Standart Plate Count sebesar 1.5 x
106 CFU/ml. Selanjutnya dilakukan pewarnaan gram. Hasil yang didapat untuk
pewarnaan sederhana pada Staphylococcus aureus adalah bentuknya berupa
Cocus (bulat), berwarna ungu yang disebut bakteri gram positif karena sel-selnya
tidak dapat melepaskan violet kristal sehingga menjadi ungu kebiruan. Sedangkan
untuk Escherichia coli bentuknya berupa Bacil (batang), warnanya merah muda
dan merupakan bakteri gram negatif, bakteri ini bisa dikatakan sebagai bakteri
gram negatif karena sel-selnya dapat melepaskan violet kristal dan mengikat
safranin sehingga warna yang muncul adalah merah muda.
Kata kunci : Sterilisasi, Pembuatan Medium, Pengenceran, Pencawanan, Metode
Hitung Cawan dan Pewarnaan Gram
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ................................................................................ i
LEMBAR PENGESAHAN ..................................................................... ii
KATA PENGANTAR ............................................................................. iii
DAFTAR ISI ............................................................................................ iv
DAFTAR TABEL ..................................................................................... v
DAFTAR ILUSTRASI ............................................................................. vi
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. vii
BAB I. PENDAHULUAN ........................................................................ 1
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA .............................................................. 2
2.1. Sterilisasi ............................................................................... 2
2.1.1. Sterilisasi kering ....................................................... 3
2.1.2. Sterilisasi basah ........................................................ 3
2.2. Medium dan Larutan Pengencer ........................................... 4
2.2.1. Medium Nutrient Agar (NA) ................................... 5
2.2.2. Medium Acidified Potato Dextrose Agar (APDA) .. 6
2.3. Metode penghitungan cawan ............................................... 6
2.3.1. Pengenceran ............................................................ 7
2.3.2. Metode tuang ............................................................ 8
2.4. Morfologi bakteri .................................................................. 8
2.4.1. Staphylococcus aureus ............................................. 8
2.4.2. Escherichia coli ........................................................ 9
2.5. Pewarnaan Gram .................................................................. 9
BAB III. METODOLOGI ........................................................................ 11
3.1. Materi ................................................................................... 11
3.2. Metode ................................................................................ 12
3.2.1. Sterilisasi .................................................................. 12
3.2.2. Medium dan Larutan Pengencer .............................. 13
3.2.3. Metode Hitungan Cawan ......................................... 14
3.2.3.1. Metode Pengenceran .................................. 14
3.2.3.2. Cara menghitung Koloni ............................ 15
3.2.4. Pewarnaan Gram ...................................................... 15
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................ 17
4.1. Sterilisasi ............................................................................. 17
4.2. Medium dan Larutan Pengencer .......................................... 18
4.2.1. Nutrient Agar (NA) .................................................. 18
4.2.2. Acidified Potato Dextrose Agar (APDA) ................. 18
4.3. Metode Hitungan Cawan .................................................... 19
4.4. Pewarnaan Gram ................................................................. 21
BAB V. KESIMPULAN ........................................................................... 25
5.1. Kesimpulan ........................................................................... 25
5.2. Saran ....................................................................................... 25
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 26
LAMPIRAN .............................................................................................. 27
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Metode Hitungan Cawan Sampel Sosis ............................................. 18
2. Pewarnaan Gram Staphylococcus aureus ........................................... 19
3. Pewarnaan Gram Escherichia coli .................................................... 21
1
BAB I
PENDAHULUAN
Mikrobiologi adalah salah satu cabang biologi yang menelaah mengenai
organisme hidup berukuran mikroskopis yang meliputi virus, bakteri, archaea,
protozoa, algae, dan fungi. Mikroorganisme ada yang menguntungkan ada juga yang
merugikan. Mikroorganisme yang bersifat menguntungkan dapat membantu
menyelesaikan masalah manusia dalam mengolah sumber daya alam sedang
mikroorganisme yang bersifat merugikan dapat merusak bahan-bahan organik,
membuat hilangnya kenikmatan makanan dan dapat menimbulkan penyakit.
Sosis adalah suatu makanan yang terbuat dari daging cincang, lemak hewan,
terna dan rempah, serta bahan-bahan lain. Sosis umumnya dibungkus dalam suatu
pembungkus yang secara tradisional menggunakan usus hewan, tapi sekarang sering
kali menggunakan bahan sintetis, serta diawetkan dengan suatu cara, misalnya
dengan pengasapan.
Tujuan praktikum ini adalah untuk mengetahui proses sterilisasi, mengetahui
proses pembuatan medium, mengetahui metode hitungan cawan dan penghitungan
mikroba serta pewarnaan Gram. Manfaat praktikum ini adalah dapat mengetahui dan
melakukan proses sterilisasi, dapat membuat medium untuk biakan mikroba, dapat
melakukan metode hitungan cawan, dan dapat melakukan cara pewarnaan Gram.
2
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Sterilisasi
Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan-bahan
dari segala macam bentuk kehidupan, termasuk mikroorganisme. Sterilisasi dicapai
dengan menggunakan pemanasan basah, pemanasan kering, filtrasi, penyinaran atau
bahan-bahan kimia (Irianto, 2006). Medium dan alat-alat yang digunakan dalam
inokulasi jika tidak steril tidak akan mungkin memperoleh biakan bakteri yang
diinginkan. Langkah pertama yang harus diambil sebelum mengadakan inokulasi
adalah mensterilkan medium serta alat-alat perlengkapannya (Dwidjoseputro, 2005).
Selain itu juga, dalam sterilisasi harus menguasai teknik inokulasi agar mendapat
hasil pengamatan yang baik (Purwoko, 2007). Sterilisasi secara umum dapat
dilakukan dengan berbagai cara, yaitu sterilisasi secara fisik yang meliputi pemanasan
sinar ultraviolet, sinar X dan sebagainya. Sterilisasi dengan pemanasan terdapat
empat cara yaitu dengan cara pemijaran, sterilisasi dengan udara panas, sterilisasi
dengan menggunakan uap air panas, sterilisasi dengan menggunakan uap panas yang
bertekanan. Sterilisasi selanjutnya yakni secara kimia. Sterilisasi ini menggunakan
disinfektan, larutan alkohol, dan larutan formalin (Dwidjoseputro, 2005).
3
2.1.1. Sterilisasi kering
Sterilisasi kering dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu menggunakan api
dan oven. Spora bakteri oleh sterilisasi kering baru dapat dimatikan pada suhu yang
lebih tinggi dan memerlukan waktu perlakuan yang lebih lama daripada waktu yang
diperlukan pada sterilisasi basah. Peralatan kaca, serbuk, minyak dan sebagainya
yang tahan terhadap pemanasan, dimasukkan ke dalam oven pada temperatur 160oC
selama 2 jam atau 170
oC selama 1 jam, hal ini bergantung kepada banyak sedikitnya
muatan yang dimasukkan ke dalam oven (Dwidjoseputro, 2005). Alat-alat yang
belum bersih dan belum kering tidak boleh dimasukkan dalam oven kering.
Pensterilan alat-alat dapat pula dilakukan dengan gas etilen oksida. Pensterilan harus
dikerjakan dengan hati-hati, karena ada bahaya letusan (Purwoko, 2007).
2.1.2. Sterilisasi basah
Sterilisasi basah biasanya menggunakan alat autoklaf yaitu serupa tangki
minyak yang dapat diisi dengan uap. Autoklaf biasanya digunakan untuk
menyeterilkan medium baik yang berasal dari agar maupun dari air susu. Apabila
medium besar disterilkan maka waktu yang diperlukan akan lebih panjang karena
panas memerlukan waktu untuk menembus bahan tersebut. Medium yang disterilkan
ditempatkan di dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC dengan tekanan 2
atm. Medium yang disterilkan sebaiknya ditempatkan dalam beberapa botol yang
agak kecil. Biasanya autoklaf sudah diatur sedemikian rupa, sehingga pada suhu
4
tersebut tekanan ada sebesar sebesar 1 atm atau 15 lb/in2
pada suhu
121oC (Dwidjoseputro, 2005). Menggunakan sterilisasi basah, sel-sel bakteri atau
fungi sudah dimatikan pada suhu 60oC dalam waktu 5–10 menit. Spora ragi fungi
mati diatas suhu 80oC dan spora bakteri mati diatas suhu 120
oC selama 15 menit.
Semakin tinggi kontaminasi maka semakin banyak jumlah spora yang termos resisten
(kebal/tidak mati) sehingga diperlukan pemanasan yang semakin lama (Irianto, 2006).
Medium yang mengandung vitamin, gelatin, atau sebangsa gula, setelah sterilisasi
dalam autoklaf, medium tersebut harus segera didinginkan sesudah dikeluarkan dari
autoklaf. Hal ini untuk menghindari terurainya zat–zat. Medium yang sudah steril
dapat disimpan dalam lemari es (Purwoko, 2007).
2.2 Medium dan Larutan Pengencer
Medium adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrisi yang dipakai
untuk menumbuhkan mikroorganisme. Selain itu medium dapat pula digunakan
sebagai isolasi, perbanyakan, penguji sifat-sifat fisiologis dan sebagai media
penghitung jumlah mikroba (Irianto, 2006). Mikroba dapat tumbuh dengan baik di
dalam medium diperlukan persyaratan tertentu yaitu medium harus mengandung
semua nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroba, medium harus mempunyai
tekanan osmose, tegangan muka dan pH yang sesuai, medium tidak mengandung zat-
zat penghambat dan medium harus steril (Schlegl, 2000). Medium agar merupakan
salah satu teknik yang sangat baik untuk memisahkan mikroba. Dasar makanan yang
paling baik bagi pemeliharaan dan pembiakan bakteri adalah medium yang
5
mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa-sisa makanan
atau ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia (Schlegel, 2000). Media biakan yang
digunakan untuk menumbuhkan bakteri terdapat dalam bentuk padat, setengah padat
dan cair. Medium cair dapat digunakan untuk berbagai tujuan termasuk
menumbuhkan atau membiakkan mikroba, fermentasi dan uji-uji lainnya. Media
padat digunakan untuk menumbuhkan mikroba pada permukaan sehingga
membentuk koloni yang dapat dilihat, dihitung dan diisolasi misalnya nutrient agar,
plate count agar dan potato dextrose agar. Media padat diperoleh dengan
menambahkan agar. Agar berasal dari ganggang merah. Agar digunakan sebagai
bahan pemadat karena tidak diuraikan mikroorganisme dan membeku pada suhu di
atas 45°C. Kandungan agar sebagai bahan pemadat dalam media
adalah 1,5-2% (Dwidjoseputro, 2005).
2.2.1. Medium Nutrient Agar (NA)
Nutrient Agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga
digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif,
yaitu mikroorganisme heterotrof. Nutrient Agar merupakan salah satu media yang
umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage,
produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji
bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni (Schlegel, 2000).
Nutrient Agar (NA) adalah suatu medium yang mengandung sumber nitrogen dalam
6
jumlah cukup yaitu 0,3% ekstrak sapi dan 0,5% pepton, tetapi tidak mengandung
sumber karbohidrat (Irianto, 2006).
2.2.2. Medium Acidified Potato Dextrose Agar (APDA)
Pembuatan medium yang dilakukan oleh manusia dapat berupa medium cair
dan medium padat. Dahulu orang menggunakan kentang yang dipotong-potong untuk
medium (Dwidjoseputro, 2005). Suatu penemuan yang lebih baik sekali ialah
medium dari kaldu yang dicampur dengan sedikit agar-agar. Setelah medium
disterilisasikan, kemudian dibiarkan mendingin, diperoleh medium padat yang
dapat ditanami mikroorganisme (Dwiloka, 2000). Medium harus mengandung semua
nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroorganisme. APDA dibuat untuk
menumbuhkan jamur. Hal itu karena jamur membutuhkan medium yang mengandung
karbohidrat, dan pada medium APDA ini terdapat kentang (sumber karbohidrat)
sebagai media yang cocok untuk menumbuhkan jamur. APDA (Acidified Potato
Dextrose Agar) yaitu digunakan untuk kultivasi dan identifikasi jamur sehingga
mempermudah dalam morfologinya (Irianto, 2006).
2.3 Metode Hitungan Cawan
Metode hitungan cawan merupakan metode yang digunakan untuk
menghitung jumlah mikroba dalam bahan pangan karena hanya sel yang hidup yang
dapat dihitung. Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk
7
menghitung jumlah mikroba karena hanya sel yang hidup yang dapat dihitung,
beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus dan dapat digunakan untuk isolasi
serta identifikasi mikroba (Irianto, 2006). Prinsip metode hitungan cawan adalah jika
sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba
tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung
dengan mata tanpa mikroskop. Kelemahan metode hitungan cawan diantaranya hasil
perhitungan tidak menunjukkan jumlah mikroba yang sesungguhnya, medium dan
kondisi yang berbeda memungkinkan hasil yang berbeda, mikroba yang ditumbuhkan
harus dapat tumbuh pada medium padat dan memerlukan persiapan dan masa
inkubasi beberapa hari (Schlegel, 2000). Syarat penghitungan koloni yaitu cawan
yang dihitung adalah cawan yang mengandung jumlah koloni 30 – 300, beberapa
koloni yang bergabung menjadi satu dapat dihitung satu koloni dan suatu deretan
koloni sebagai suatu garis tebal dapat dihitung sebagai satu koloni (Puwoko, 2007).
2.3.1 Pengenceran
Pengenceran adalah mencampur larutan pekat (konsentrasi tinggi) dengan
cara menambahkan pelarut agar diperoleh volume akhir yang lebih besar. Contohnya
suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies
diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Enceran ini kemudian diambil barang 1ml
untuk diencerkan lagi ke tabung yang telah berisi pelarut. Enceran yang kedua ini di
ambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut (Dwidjoseputro, 1994). Jumlah terbaik yang
8
digunakan untuk perhitungan mikroba anatara 30-300 koloni. Pengenceran biasanya
dilakukan secara desimal (Puwoko, 2007).
2.3.2 Metode tuang
Teknik pour plate adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan
mikroorganisme di dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang
masih cair dengan stok kultur bakteri. Teknik ini biasa digunakan pada uji TPC (Total
Plate Count). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat
tersebar merata pada media agar. Metode tuang adalah proses mencampurkan bakteri
yang sudah diencerkan, dan sampel tersebut kemudian disebarkan di dalam suatu
medium dari kaldu dan gelatin encer (Dwidjoseputro, 1994). Pengenceran yang telah
dilakukan untuk medium, selanjutnya adalah menuangkan hasil pengenceran pada
cawan petri. Waktu yang baik untuk melakuakan penuangan antara dimulai
pengenceran sampai menuangkan ke cawan petri tidak lebih lama dari 30
menit (Schlegel, 2000).
2.4. Morfologi Bakteri
2.4.1. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus mempunyai bentuk coccus, berukuran besar, biasanya
Staphylococcus aureus terdapat pada rongga hidung manusia maupun pada beberapa
jenis hewan tertentu, juga terdapat pada kulit. Staphylococcus aureus merupakan
9
penyebab umum pada keracunan pangan (Schlegel, 2000). Staphylococcus aureus
mempunyai susunan yang menyerupai buah anggur, perkiraan diameternya 0,8 μ,
tumbuh pada media yang mempunyai temperatur 370C, tumbuh pada temperatur
optimal 35oC (Smith, 1960). Bentuk Staphylococcus bola sampai lonjong dengan
diameter 2 μm dan mudah tumbuh dalam medium yang sederhana (Pelczar, 2008).
2.4.2. Escherichia coli
Escherichia coli memiliki bentuk batang pendek dan habitat utamanya adalah
usus manusia dan hewan. Escherichia coli dipakai sebagai organisme indikator
karena Escherichia coli terdapat dalam jumlah yang banyak menunjukkan bahwa
pangan atau air telah mengalami pencemaran (Dwiloka, 2000). Morfologi
Escherichia coli antara lain berbentuk bacill pendek, mempunyai lebar antara 0,4
sampai 0,7 μ, panjang antara 1 sampai 4 μ. Pada medium agar cawan koloninya
mempunyai ukuran 2 sampai 3 mm dalam waktu 48 jam (Dwidjoseputro, 2005).
2.5. Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting
yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Cara pewarnaan ini paling sering
dilakukan dalam pekerjaan mikrobiologi. Pewarnaan gram merupakan salah satu
prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan dan atau mengidentifikasi
bakteri (Dwidjoseputro, 2005). Proses pewarnaan gram ini, olesan bakteri yang
10
terfiksasi dikenai larutan ungu kristal, larutan yodium, alkohol dan safranin. Bakteri
yang diwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua yaitu bakteri gram positif yang
mempertahankan zat pewarna ungu kristal dan karenanya tampak biru - ungu tua.
Kelompok yang lain yaitu bakteri gram negatif, yang kehilangan ungu kristal ketika
dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah
safranin atau tampak merah-merah muda (Pelczsar, 2006). Berdasarkan morfologinya
bentuk bakteri dapat dibagi atas tiga golongan yaitu basil, kokus dan spiril
(Dwidjoseputro, 2005). E. Coli merupakan bakteri negatif yang memiliki bentuk
batang, dan berwarna merah (Dwiloka, 2000). Sel Staphylococcus sp berbentuk
coccus atau bulat dengan ukuran 0,3 – 2,2 μm x 1,27 – 7,0 μm. Bakteri ini termasuk
bakteri yang mempunyai gram positif (Pelczar, 1986). Terdapat perbedaan stuktur
dinding sel pada bakteri gram positif dan bakteri gram negatif, bakteri gram negatif
mempunyai lapisan peptidoglikan tipis sehingga tidak dapat mengikat cat warna
utama dengan kuat (Dwiloka, 2000).
11
BAB III
METODOLOGI
Praktikum Mikrobiologi dengan materi Sterilisasi, Medium, Larutan
Pengenceran, Metode Penghitungan Cawan dan Pewarnaan Gram dilaksanakan pada
hari Rabu tanggal 23 Mei 2012, pada pukul 15.00 - 19.00 WIB dan pada hari Kamis
tanggal 24 Mei 2012, pada pukul 16.00 - 18.00 WIB bertempat di Laboratorium
Fisiologi dan Biokimia Ternak Fakutas Peternakan dan Pertanian, Universitas
Diponegoro, Semarang.
3.1. Materi
Alat yang digunakan pada praktikum adalah erlenmeyer berfungsi sebagai
tempat pembuatan medium, cawan petri berfungsi sebagai tempat pertumbuhan
bakteri, pipet volume berfungsi untuk mengambil larutan, oven yang berfungsi untuk
melakukan sterilisasi kering, autoklaf yang berfungsi untuk melakukan sterilisasi
basah, pipet volume berfungsi untuk mengambil larutan, bunsen yang digunakan
untuk melakukan sterilisasi, pisau digunakan untuk mengupas dan memotong
kentang, timbangan berfungsi untuk menimbang bahan, gelas ukur berfungsi sebagai
wadah larutan dalam jumlah yang sedikit, gelas beker sebagai wadah suatu larutan,
kertas saring digunakan untuk menyaring larutan, kaca objek digunakan untuk
membuat preparat, tabung reaksi dan raknya berfungsi sebagai wadah suatu sampel
larutan, dan mikroskop berfungsi untuk mengamati preparat. Sedangkan bahan yang
12
digunakan pada praktikum adalah kertas pembungkus, kapas, alkohol, aluminium
foil, kentang, sosis ayam, agar, aquades, dekstrosa, APDA, sampel (E. Coli dan
Staphylococcus) dan larutan gram A (ungu kristal 90%, etanol 95%, amonium oksalat
dan aquadest), gram B (kristal iodium, Kalium iodida dan aquadest), gram C (etanol
95%) serta gram D (larutan safranin 2,5% dalam etanol 95% dan aquadest).
3.2. Metode
3.2.1. Sterilisasi
3.2.1.1. Sterilisasi kering, metode yang dilakukan pada sterilisasi kering adalah
menyiapkan pipet, cawan petri, erlenmayer serta alat gelas lainnya sesuai dengan
kebutuhan. Membersihkan cawan petri dengan kapas yang telah dibasahi dengan
alkohol untuk membersihkan kotoran dan lemak yang menempel pada cawan
kemudian membungkus cawan petri dengan kertas pembungkus. Membersihkan pipet
hisap dan sumbat bagian pangkal pipet dengan kapas, kemudian bungkus pipet
dengan kertas pembungkus, jangan lupa memberi tanda pada bagian pangkal dan
ujung. Menutup mulut erlenmayer dengan menggunakan alumunium foil dengan
rapat. Memasukkan cawan petri ke dalam oven selama 1 jam pada suhu 170oC atau
selama 2 jam pada suhu 160oC, kemudian setelah selesai mengeluarkan cawan petri
dan pipet volume dari oven dan menunggu hingga dingin sebelum digunakan.
3.2.1.2. Sterilisasi basah, metode yang dilakukan pada sterilisasi basah adalah
memasukkan medium yang akan disterilkan ke dalam tabung reaksi, kemudian
13
menutup rapat dengan menggunakan kapas. Memasukkan tabung reaksi tersebut ke
dalam autoklaf, kemudian menutup autoklaf dengan rapat. Menyalakan autoklaf dan
menunggu hingga manometer serta termometer menunjukkan suhu 121o C dengan
tekanan 2 atm selama 15 menit. Membuka katup pengaman setelah selesai dan
biarkan hingga autoklaf tidak lagi bertekanan dan mengeluarkan mediumnya. Khusus
untuk medium agar, untuk menurunkan suhunya dan menjaga agar tidak membeku
maka memasukkan medium ke dalam inkubator bersuhu 55oC sebelum digunakan.
3.2.2. Medium dan Larutan pengencer
3.2.2.1. Nutrient Agar (NA), metode yang dilakukan pada pembuatan medium
Nutrient Agar (NA) adalah menyiapkan 2,3 gr Nutrient Agar (NA) dan 100 ml
aquadest kemudian memasukkan ke dalam gelas erlenmeyer campur kedua larutan
tersebut dan mengaduk dengan menggunakan pengaduk magnetik stirrer. Kemudian
melakukan sterilisasi menggunakan autoklaf.
3.2.2.2. Potato Dextrose Agar (PDA) dan Acidified Potato Dextrose Agar (APDA),
metode yang dilakukan pada pembuatan medium Potato Dextrose Agar (PDA) dan
Acidified Potato Dextrose Agar (APDA) adalah mengupas kentang dengan pisau
hingga bersih lalu membilas dengan air sampai bersih. Memotong dengan ukuran
1x1x1 cm. Menimbang kentang sebanyak 250 gr. Memasukkan kentang ke dalam
gelas beker dan menambahkan 500 ml aquades, kemudian menutup gelas beker
dengan aluminium foil. Memanaskan hingga mendidih, kemudian mendinginkan
14
rebusan kentang. Mengambil filtrat kentang dengan cara menyaringnya menggunakan
kain saring yang bersih. Membuat medium PDA dengan komposisi 100 ml filtrat
kentang, 2 gr dextrose dan 2 gr agar. Selanjutnya untuk membuat medium APDA
terlebih dahulu menyiapkan larutan asam tartarat 1 ml. Menyeterilkan medium PDA
dan melarutkan asam tartarat dalam autoclaf pada suhu 121oC, 2 atm, selama 10
menit. Setelah steril memasukkan medium PDA dan melarutkan asam tartarat 1 ml ke
dalam inkubator bersuhu 50oC. Setelah mencapai suhu 50
oC menambahkan dengan
pipet ukur steril larutan asam tartarat 1 ml ke dalam medium PDA secara aseptis.
Maka medium yang dihasilkan adalah medium APDA.
3.2.3. Metode Hitungan Cawan
3.2.3.1. Metode pengenceran, Metode yang digunakan yaitu menyiapkan dan
memberi label larutan pengencer dan cawan petri steril sesuai dengan pengenceran
yang ditetapkan, melakukan pengenceran sampai tingkat pengenceran yang
ditentukan (bahan yang busuk melakukan sampai tingkat pengenceran 10-5
).
Pengenceran dilakukan dengan menyiapkan lima tabung reaksi dan pipet volume dan
penghisap , mengisi tabung pertama dengan sampel, dan kelima tabung lain dengan
aquadest. Mengambil sampel dengan pipet volume diletakkan pada tabung pertama,
mengambil larutan pada tabung pertama diletakkan pada tabung kedua, dan
seterusnya sampai dengan tabung terakhir. Kemudian melakukan pencawanan pada
tiga tingkat pengenceran yang terakhir.
15
3.2.3.2. Metode tuang, Metode yang digunakan yaitu menuangkan ±10 ml medium
agar ke dalam cawan petri dan menggoyangkan membentuk angka 8 supaya semua
sampel merata, yang sebelumnya telah diberi larutan tape ketan yang telah diaduk
rata. Setelah medium membeku, menginkubasikan dengan posisi terbalik pada suhu
ruang selama 24 jam.
3.2.3.3. Cara menghitung koloni, Metode yang digunakan yaitu menyiapkan
medium agar yang telah ditumbuhi bakteri. Kemudian memulai menghitung bakteri
dengan menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada medium dengan tingkat
pengenceran yang berbeda. Mengitung koloni dapat menggunakan Quebecc Colony
Counter karena ketelitian lebih tinggi. Cara menghitung koloni yaitu beberapa koloni
yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana
jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni dan suatu deretan
atau rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni.
Mencatat hasil hitungan dan menghitung Standard Plate Count nya.
3.2.4. Pewarnaan Gram
Menggenangi objek dengan larutan gram A selama 1 menit. Kemudian
membilas objek dengan aquades. Menggenangi objek dengan larutan gram B selama
2 menit. Membuang sisa zat warna pada nampan, kemudian membilas objek dengan
aquades. Membilas objek dengan larutan gram C sampai warna biru tidak luntur lagi,
lalu membilas dengan aquades. Menggenangi objek dengan larutan safranin (gram D)
16
selama 30 detik. Membuang sisa zat warna pada nampan, kemudian membilas objek
dengan aquades. Membersihkan sisa aquades dengan tissue, lalu menggenangi
dengan minyak emersi. Kemudian mengamati dengan bantuan mikroskop dengan
perbesaran 100 kali.
17
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Sterilisasi
Berdasarkan hasil praktikum diperoleh hasil bahwa sterilisasi membutuhkan
kesabaran dan ketelitian. Alat–alat dan bahan yang akan digunakan dalam praktikum
harus benar – benar steril. Hal ini sesuai dengan pendapat Dwidjoseputro (2005) yang
menyatakan bahwa medium dan alat-alat yang akan dipergunakan dalam inokulasi
jika tidak steril, maka tidak akan mungkin memperoleh biakan bakteri yang
diinginkan. Sterilisasi kering dipergunakan untuk mensterilkan alat–alat praktikum
dengan menggunakan oven pada temperatur 170° C selama 1 jam. Hal ini sesuai
dengan pernyataan Dwidjoseputro (2005) yang menyatakan bahwa peralatan kaca,
serbuk, minyak dan sebagainya yang tahan terhadap pemanasan, dimasukkan ke
dalam oven pada temperatur 160oC
selama 2 jam
atau 170
oC selama 1 jam, hal ini
bergantung kepada banyak sedikitnya muatan yang dimasukkan ke dalam oven.
Sterilisasi basah menggunakan alat yang disebut dengan autoklaf yang dilengkapi
dengan manometer, termometer dan klep pengaman untuk mensetrilkan medium
sebagai media mikroba selama 15 menit tergantung banyaknya barang yang
disterilkan. Hal ini sesuai dengan pendapat Dwidjoseputro (2005) yang menyatakan
bahwa medium yang disterilkan ditempatakan di dalam autoklaf selama 15 menit, hal
ini tergantung kepada banyak sedikitnya barang yang disterilkan. Biasanya autoklaf
18
sudah diatur sedemikian rupa, sehingga pada suhu tersebut tekanan ada sebesar
sebesar 1 atm atau 15 lb/in2
pada suhu 121oC.
4.2. Medium dan Larutan Pengencer
4.2.1. Nutrient Agar (NA)
Medium yang digunakan untuk melakukan inokulasi pada bakteri E. coli dan
Staphylococcus yaitu medium yang dibuat dengan perbandingan aquades 100 ml dan
2,3 gram NA. NA yang digunakan dalam praktikum sudah dalam bentuk bahan jadi.
NA tersebut mengandung lipopepton dan agar. Penggunaan bahan tersebut untuk
memenuhi nutrisi yang dibutuhkan bakteri untuk berkembang biak. Pepton
mengandung protein yang sangat baik sebagai medium pembiakan mikroorganisme.
Hal ini sesuai dengan pendapat Irianto (2000) bahwa Nutrien Agar (NA) adalah suatu
medium yang mengandung sumber nitrogen dalam jumlah cukup yaitu 0,3% ekstrak
sapi dan 0,5% pepton, tetapi tidak mengandung sumber karbohidrat.
4.2.2. Acidified Potato Dextrose Agar (APDA)
Acidified Potato Dextrose Agar (APDA) yang dihasilkan dalam praktikum
mikrobiologi ini berbentuk padat sehingga mikroorganisme dapat tumbuh dan
berkembang, hal ini sesuai dengan pendapat Dwidjoseputro (2005) yang menyatakan
bahwa pembuatan medium yang dilakukan oleh manusia dapat berupa medium cair
dan medium padat, dulu orang menggunakan kentang yang dipotong-potong untuk
19
medium setelah medium itu disterilisasikan kemudian dibiarkan mendingin maka kita
peroleh medium padat yang dapat ditanami mikroorganisme. Penggunaan dekstrosa
pada medium ini karena jamur akan tumbuh pada médium yang mengandung
karbohidrat sebagai nutrisi yang mudah dicerna energi pertumbuhannya. Hal ini
sesuai dengan pendapat Irianto (2000) yang menyatakan bahwa mikroorganisme
dapat tumbuh dan berkembang dengan baik didalam medium, maka medium harus
mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroorganisme.
4.3. Metode Hitungan Cawan
Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan mengenai metode hitungan
cawan pada sampel sosis ayam diperoleh data sebagai berikut :
Tabel 1. Metode Hitungan Cawan Sampel Sosis Ayam
Medium Pengenceran SPC
(CFU/ml) 10-3
10-4
10-5
NA - 152 148 1,5 x 106
APDA - 364 296 3,0 X 107
Sumber : Data Primer Praktikum Mikrobiologi, 2012.
Berdasarkan data di atas didapatkan bahwa SPC Sosis Ayam dengan medium
NA sebesar 1,5 x 106
CFU/ml, sedangkan pada medium APDA sebesar 3,0 x 107
CFU/ml. Pengenceran pada sampel Sosis Ayam dilakukan sebanyak 5 kali. Namun
dalam penghitungan SPC sampel sosis ayam mengambil 3 pengenceran terakhir.
Semakin banyak dilakukan pengenceran maka semakin sedikit jumlah koloni yang
terhitung pada sampel sosis ayam. Hal ini sesuai dengan pendapat Purwoko (2007)
20
bahwa syarat penghitungan koloni yaitu cawan yang dihitung adalah cawan yang
mengandung jumlah koloni 30 – 300, beberapa koloni yang bergabung menjadi satu
dapat dihitung satu koloni dan suatu deretan koloni sebagai suatu garis tebal dapat
dihitung sebagai satu koloni. Dijelaskan lebih lanjut oleh Irianto (2000) bahwa
metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung
jumlah mikroba karena hanya sel yang hidup yang dapat dihitung, beberapa jenis
mikroba dapat dihitung sekaligus dan dapat digunakan untuk isolasi serta identifikasi
mikroba. Pada sampel sosis ayam dengan medium NA jumlah koloni yang
digunakan untuk menghitung SPC adalah 152 x 10-4
, hal ini dikarenakan
perbandingan antara jumlah koloni tertinggi dengan terendah hasilnya 9,73. Jika
pengenceran menghasilkan jumlah koloni antara 30-300 maka menggunakan
perbandingan antara hasil tertinggi dengan hasil terendah, bila hasilnya lebih kecil
atau sama dengan 2 penghitungan SPC dengan cara menghitung rata-rata dari jumlah
koloni sedangkan bila lebih dari 2 menggunakan jumlah koloni terendah. Hal ini
sesuai dengan pernyataan Irianto (2000) yang menyatakan bahwa jika cawan dari dua
tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah antara 30 dan 300, dan
perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut
lebih kecil atau sama dengan 2, tentukan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan
mempertimbangkan pengencerannya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan
terendah lebih besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil dari pengenceran terendah.
Pada medium APDA penghitungan SPC pada sampel sosis ayam jumlah koloni yang
digunakan untuk menghitung jumlah SPC adalah 296 x 10-5
, karena jumlah terbaik
21
perhitungan mikroba antara 30-300 koloni. Hal ini sesuai dengan pernyataan
Purwoko (2007) yang menyatakan bahwa jumlah terbaik yang digunakan untuk
perhitungan mikroba antara 30-300 koloni.
4.4. Pewarnaan Gram
4.4.1. Bakteri Staphylococcus aureus
Berdasarkan hasil pengamatan pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap
kultur cair Staphylococcus aureus dengan perbesaran 100x, diperoleh hasil sebagai
berikut :
Ilustrasi 1. Bakteri Gram Positif (Staphylococcus aureus)
Hasil Praktikum Pembanding
Keternagan :
Bakteri : Staphylococcus aureus
Bentuk : Bulat
Koloni : Menggumpal
Warna : Ungu
Gram : Positif
Keternagan :
Bakteri : Staphylococcus aureus
Bentuk : Bulat
Koloni : Memisah
Warna : Ungu
Gram : Positif
Sumber : Data Primer Praktikum Mikro Biologi, 2012
: Http://en.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus
22
Berdasarkan hasil praktikum pewarnaan gram pada Staphylococcus aureus
didapatkan warna ungu, berbentuk bulat, koloni menggumpal dan merupakan bakteri
gram positif. Hal ini sesuai dengan pendapat Dwidjoseputro (2005), yang menyatakan
bahwa bakteri berdasarkan morfologinya bentuk bakteri dapat dibagi atas tiga
golongan yaitu basil, kokus dan spiril. Disempurnakan oleh pendapat Pelczar (2006)
yang menyatakan sel Staphylococcus sp berbentuk coccus atau bulat dengan ukuran
0,3 – 2,2 μm x 1,27 – 7,0 μm.
23
4.4.2. Bakteri Escherichia coli
Berdasarkan hasil pengamatan pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap
kultur cair Escherichia Coli dengan perbesaran 100x, diperoleh sebagai berikut :
Gambar 2. Bakteri Gram Negatif (Escherichia Coli)
Hasil Praktikum Pembanding
Keternagan :
Bakteri : Escherichia Coli
Bentuk : Batang
Koloni : Menggerombol
Warna : Merah muda
Gram : Negatif
Keternagan :
Bakteri : Escherichia Coli
Bentuk : Batang
Koloni : Menggerombol
Warna : Merah muda
Gram : Negatif
Sumber : Data Primer Praktikum Mikro Biologi, 2012.
: www.google.com/Escherichia coli
Berdasarkan pengamatan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100x,
diketahui bahwa Escherichia coli didapatkan warna merah muda, berbentuk batang
dan merupakan bakteri gram negatif. Hal ini sesuai dengan pendapat Dwiloka (2000),
yang menyatakan bahwa bakteri E. Coli memiliki bentuk batang, dan berwarna
merah. Bakteri ini termasuk bakteri gram negatif, dan berwarna merah karena bakteri
ini mempunyai peptidoglikan tipis pada dinding selnya. Hal ini ditambahkan oleh
24
Dwiloka (2000), yang menyatakan bahwa terdapat perbedaan stuktur dinding sel
pada bakteri gram positif dan bakteri gram negatif, bakteri gram negatif mempunyai
lapisan peptidoglikan tipis sehingga tidak dapat mengikat cat warna utama dengan
kuat.
25
BAB V
KESIMPULAN
5.1. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum mikrobiologi dapat disimpulkan bahwa
sterilisasi kering digunakan untuk mensterilkan alat sedangkan sterilisasi basah untuk
mensterilkan medium. Medium biakan terdiri dari cair dan padat. Medium yang baik
memilki nutrien yang cukup bagi mikroba, tidak ada zat penghambat dan harus steril.
Hasil perhitungan Pewarnaan gram dapat membedakan bakteri yang bersifat gram
positif dan gram negatif. Jumlah bakteri pada sosis ayam dengan medium NA sebesar
1,5 x 106
CFU/ml, sedangkan pada medium APDA sebesar 3,0 x 107
CFU/ml.
Pewarnaan gram yang dapat disimpulkan yaitu adanya bakteri yang berbentuk bulat
dan warna yang nampak adalah ungu. Hal ini berarti bakteri gram positif. Sedangkan
bakteri yang berwarna merah muda, termasuk bakteri gram negatif.
5.2. Saran
Saran untuk praktikum Mikrobiologi adalah agar praktikan lebih hati-hati dan
teliti ketika melakukan sterilisasi alat dan bahan serta dalam memindahkan bakteri ke
dalam medium biakan agar tidak terjadi kontaminasi dengan mikroorganisme lain
yang tidak dikehendaki.
26
DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.
Dwijdoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.
Dwiloka, B. 2000. Pangan dan Gizi. Badan Penerbit Universitas Diponegoro,
Semarang.
Gaman, P. M., dan Sherrington, K. B. 1992. Ilmu Pangan: Pengantar Ilmu
Pangan, Nutrisi, dan Mikrobiologi Edisi Kedua. UGM Press, Yogyakarta.
Irianto, K. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme I. Yrama Widya,
Bandung
Pelczsar, M dan Chan, ECS. 2008. Dasar – Dasar Mikrobiologi 2. Universitas
Indonesia Press, Jakarta.
Purwoko, T. 2007. Fisiologi Mikroba. Bumi Aksara, Jakarta.
Schlegel, H. G. 2000. Mikrobiologi Umum Edisi keenam. Diterjemahkan oleh Tedjo
Baskoro. Universitas Gadjah Mada.Yogyakarta.
LAMPIRAN
27
Lampiran 1. Gambar Alat dan Fungsi
No. Nama Alat Gambar Fungsi
1. Erlenmeyer Untuk menampung
larutan,bahan atau
cairan.
2.
Magnetic
stirer
Untuk mengaduk
larutan supaya
menjadi homogen
3. Inkubator
Untuk menyesuaikan
suhu.
4. Pipet Tetes Untuk mengambil
larutan atau cairan n
dalam jumlah kecil.
Lampiran 1. (Lanjutan)
28
5. Gelas Ukur Untuk mengukur
cairan atau larutan.
6. Autoklaf
untuk mensterilisasi
(1210C, 15 lbs)
selama kurang lebih
15 menit
7. Beker Glass
Untuk
menempatkan
larutan
8. Mikroskop Sebagai alat bantu
untuk melihat benda
benda kecil
9. Cawan petri
Untuk tempat
medium
menumbuhan bakteri
Lampiran 1. (Lanjutan)
29
10. Pipet volume
Untuk mengambil
larutan dengan
volume tepat sesuai
dengan label.
11. Tabung reaksi Sebagai tempat
larutan.
12. Oven
Untuk membantu
mensterililasi alat-
alat sebelum
digunakan
13. Kaca objek Sebagai tempat
untuk meletakkan
sesuatu sebelum di
liat dengan
mikroskop.
Lampiran 2. Menjawab Pertanyaan
30
A. Medium dan Larutan Pengenceran
1. Jelaskan fungsi dari masing-masing komponen di bawah ini di dalam
medium:
a. Pepton c. Ekstrak sapi
b. Agar d. NaCl
Jawab :
a. Pepton: sebagai sumber utama nitrogen organik dan sumber nutrisi
b. Agar: untuk memadatkan medium PDA
c. Ekstrak sapi: sebagai salah satu komposisi nutri dalam medium NA
d. NaCl : merupakan suatu zat yang digunkan sebgai penghambat
pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang di
inginkan. Membunuh Streptococcus galactiae yang toleran terhadap
garam.
2. Jelaskan perbedaan masing-masing medium di bawah ini:
a. Nutrient Agar
b. Potato Dextrose Agar
c. Lactose Broth
d. Plate Count Agar
e. Briliant Green Lactose Bile Broth
Jawab :
31
a. Nutrient Agar : medium umum untuk uji air dan produk dari yang
juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang
tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof
Lampiran 2. (Lanjutan)
b. Potato Dextrose Agar : medium mikrobiologi umum yang dibuat dari
infus kentang dan dekstrosa atau gula jagung
c. Lactose Broth : medium yang digunakan untuk pendektesian
kehadiran bakteri coliform (Eschericia dan Enterobacter), sebagai pre-
enrichment untuk Salmonella dan studi fermentasi laktosa bakteri secara
umum
d. Plate Count Agar : media pertumbuhan umum yang digunakan untuk
menilai atau memantau pertumbuhan bakteri yang layak sampel
e. Briliant Green Lactose Bile Broth : medium yang digunakan untuk
mendeteksi bakteri coliform dalam air, makanan, dan produk susu
3. Sebut dan jelaskan klasifikasi medium!
Jawab :
A. Medium berdasarkan sifat fisik
a) Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah
dingin media menjadi padat.
32
b) Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4%
sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair.
c) Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah
NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).
Lampiran 2. (Lanjutan)
B. Medium berdasarkan komposisi
a) Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis
dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
b) Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui
secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung
agar, dekstrosa dan ekstrak kentang.
c) Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang
tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari
bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar,
Pancreatic Extract.
C. Medium berdasarkan tujuan
a) Media untuk isolasi
Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba,
misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
33
b) Media selektif/penghambat
Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu
sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan
merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Salt
Lampiran 2. (Lanjutan)
Broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae
yang toleran terhadap garam.
c) Media diperkaya (enrichment)
Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk
pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah,
serum, kuning telur. Misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar,
dll.
d) Media untuk peremajaan kultur
Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur.
e) Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
Media ini digunakan untuk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme
suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan
untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.
34
f) Media untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba.
Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.
Lampiran 2. (Lanjutan)
g) Media diferensial
Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya
berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya
TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria
berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di
sekeliling koloni.
B. Sterilisasi
1. Jelaskan perbedaan sterilisasi kering dan sterilisasi basah !
Jawab :
- Sterilisasi kering : suatu usaha untuk membebaskan alat – alat dari
segala macam mikroba. Sterilisasi kering dilakukan dengan berbagai
cara yaitu dengan pemijaran langsung serta dengan menggunakan
oven.
35
- Sterilisasi basah : suatu usaha untuk membebaskan bahan – bahan dari
segla macam mikroba. Biasanya sterilisasi basah menggunakan alat
yaitu autoklaf dan Arnold Steam Sterilzer.
Lampiran 2. (Lanjutan)
2. Jelaskan tujuan sterilisasi !
Jawab : untuk membebaskan alat – alat atau bahan – bahan dari segala
macam mikroba
C. Metode Hitungan Cawan
1. Bagaimana prosedur perhitungan total mikroba pada sempel susu bubuk
hingga pengenceran 10-5
. Hitung pula kebutuhan alat dan bahan!
Jawab :
Alat : tabung reaksi, cawan petri, pipet, penghisap, erlenmeyer, bunsen
Bahan : sampel yang akan di hitung (bakteri/jamur/mikroba), medium
Prosedur : menyiapkan dan memberi label pengencer dan cawan petri steril
sesuai dengan pengenceran dan pemupukan yang ditetapkan.
Melakukan pengenceran sampai tingkat pengenceran yang ditentukan
(melakukan sampai tingkat pengenceran 10-5
pada bahan yang
36
busuk). Melakukan pencawanan pada 4 tingkat pengenceran yang
terakhir dan memasukkan pada cawan petri.
Lampiran 2. (Lanjutan)
2. Laporkan ”Standard Plate Count” dari sampel di bawah ini:
Sampel Pengenceran
SPC 10
-2 10
-3 10
-4 10
-5
Kaldu
daging
280
262
45
28
3
1
-
-
Susu segar TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
708
782
158
302
Sosis TBUD 294 35 5
Dendeng 55 15 1 0
Jawab :
Laporan ”Standard Plate Count”
Sampel Pengenceran
SPC 10
-2 10
-3 10
-4 10
-5
Kaldu daging 280
262
45
28
3
1
-
-
2,8 x 104
2,6 x 104
Susu segar TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
708
782
158
302
1,6 x 107
3,0 x 107
Sosis TBUD 294 35 5 2,9 x 105
Dendeng 55 15 1 0 5,5 x 103
37
D. Pewarnaan Gram
1. Jelaskan perbedaan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif !
Jawab :
# Gram positif :
a) Tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu
kristal violet
Lampiran 2. (Lanjutan)
b) Pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin
c) Memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal
d) tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama
# Gram negatif :
a) Mengalami dekolorisasi oleh alcohol
b) Pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin
c) Memiliki 3 lapisan dinding sel
d) Tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek
38
Lampiran 2. (Lanjutan)
2. Sebutkan jenis dan bentuk koloni bakteri yang termasuk patogen !
Jawab :
# Bakteri penyebab penyakit pada manusia:
No. Nama bakteri Penyakit yang ditimbulkan
1. Salmonella typhosa Tifus
2. Shigella dysenteriae Disentri basiler
3. Vibrio comma Kolera
4. Haemophilus influenza Influensa
5. Diplococcus pneumoniae Pneumonia (radang paru-paru)
6. Mycobacterium tuberculosis TBC paru-paru
7. Clostridium tetani Tetanus
8. Neiseria meningitis Meningitis (radang selaput otak)
9. Neiseria gonorrhoeae Gonorrhaeae (kencing nanah)
10. Treponema pallidum Sifilis atau Lues atau raja singa
11. Mycobacterium leprae Lepra (kusta)
12. Treponema pertenue Puru atau patek
# Bakteri penyebab penyakit pada hewan:
No. Nama bakteri Penyakit yang ditimbulkan
1. Brucella abortus Brucellosis pada sapi
2. Streptococcus agalactia Mastitis pada sapi (radang payudara)
3. Bacillus anthracis Antraks
4. Actinomyces bovis Bengkak rahang pada sapi
5. Cytophaga columnaris Penyakit pada ikan
39
Lampiran 2. (Lanjutan)
# Bakteri penyebab penyakit pada tumbuhan:
No. Nama bakteri Penyakit yang ditimbulkan
1. Xanthomonas oryzae Menyerang pucuk batang padi
2. Xanthomonas campestris Menyerang tanaman kubis
3. Pseudomonas solanacaerum
Penyakit layu pada famili terung-
terungan
4. Erwinia amylovora Penyakit bonyok pada buah-buahan
Lampiran 3. Penghitungan SPC
40
Metode Hitungan Cawan Sampel Sosis Ayam
Medium Pengenceran SPC
CFU/ml 10
-3 10
-4 10
-5
NA - 152 148 1,5 X 106
APDA - 364 296 3,0 X 107
Jawab :
Menggunakan pengenceran terbesar
SPC NA = Jumlah koloni x 1 : faktor pengenceran
= 152 x 1 : 10-4
= 1,5 x 106
Menggunakan pengenceran terkecil
SPC APDA = Jumlah koloni x 1 : faktor pengenceran
= 296 x 1 : 10-5
= 2,96 x 10
7
= 3,0 x 10
7
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Gambar dan Fungsi Alat .................................................................. 27
2. Menjawab Pertanyaan Praktikum Mikrobiologi .............................. 30
3. Penghitungan SPC ........................................................................... 46
4. Foto Kopi Laporan Hasil Pengamatan ............................................. 38
5. Foto Kopi Literatur .......................................................................... 22