UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS (Universidad del Perú, Decana de América) FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL “CURVA DE RINGBOWN. DETERMINACIÓN DE LA ZONA DE TRABAJO. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN ÓPTIMA” PROFESORA: Mg. Norma Carlos Casas INTEGRANTES: Aguilar Puente, Antonio Martin Campos Salazar, Antony Brayan Cárdenas Toribio, Karen Regina Chávez Pacheco, Sair Máximo Colonio García, Katia Stephanie
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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS(Universidad del Perú, Decana de América)
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL
“CURVA DE RINGBOWN. DETERMINACIÓN DE LA ZONA DE TRABAJO. DETERMINACIÓN
Conocer la concentración óptima de un compuesto para que cumpla con la Ley de Lambert – Beer a través de la curva de Ringbom.
Conocer las limitaciones de la ley de Lambert – Beer.
INTRODUCCIÓN
En la primera práctica aprendimos la constitución, el manejo y el cuidado del espectrofotómetro UV-vis y la importancia que tenía dicho instrumento para el reconocimiento de una sustancia.
Para reconocer una sustancia hallamos su curva espectral la cual después era comparada con la curva espectral de una sustancia patrón, otra manera es que debe de cumplir con la Ley de Lambert – Beer pero debemos de saber que esta ley tiene sus limitaciones y que una de las limitaciones tiene que ver con la concentración del analito.
En esta práctica se aprenderá a hallar la concentración óptima para una mejor lectura en el espectrofotómetro UV-vis y para que el analito cumpla con la Ley de Lambert - Beer, esto lo lograremos con el uso de la Curva de Ringbom.
La curva de Ringbom relaciona la absortancia con la concentración del analito. Mediremos la absorbancia de diferentes concentraciones de un analito, hallaremos el porcentaje de transmitancia y con esto la absortancia, luego la relacionaremos sus concentraciones y de acuerdo a la curva reconoceremos la concentración óptima en la cual se cumpla con la Ley de Lambert – Beer.
FUNDAMENTO TEÓRICO
LEY DE LAMBERT Y BEER
Ocurre cuando en el caso de la radiación monocrómatica, la absorbancia es directamente proporcional a la longitud b de la trayectoria a través de un medio y la concentración c de la especie absorbente. Ésta relación se representa con la siguiente fórmula:
A= abca : constante de proporcionalidad llamada absortividadb : longitud (cm)c : concentración (g/L)
Cuando la concentración de la ecuación se expresa en moles por litro y el largo de la celda está en centímetros, la absortividad se llama absortividad molar, y se representa con el símbolo especial Ɛ. Por tanto, cuando b está en centímetros y c en moles por litro se tiene:
A = Ɛbc
Se han encontrado pocas excepciones a la generalización de que la absorbancia está relacionada en forma lineal con la longitud de la trayectoria. Por otra parte, se ha encontrado desviaciones frecuentes de la proporcionalidad directa entre la absorbancia medida y la concentración cuando b es constante. Para que no ocurran errores durante nuestro análisis y hacerlo demanera adecuada hacemos uso de la curva de ringbown.
GRÁFICA DE RINGBOW
Cuando se realiza un análisis espectroscópico se debe trabajar, en lo posible, se debe trabajar, en lo posible, con concentraciones que permitan que se cumpla la ley de Beer, con el fin de obtener una curva de calibración que tenga una relación lineal.
Para obtener el intervalo óptimo de concentraciones primero se construye la curva de Ringbom, que consiste en construir una gráfica de absorbancia (100- %T) vs. lg Concentración. Los datos se obtienen preparando una serie de soluciones patrón del analito, que cubran una variación de por lo menos dos órdenes de magnitud de concentración de este y se miden las transmitancias correspondientes a la longitud de onda analítica escogida. Para la mayoría de los sistemas la curva de Ringbown corresponde a una curva en forma de S. La parte lineal de esta gráfica permite obtener el intervalo de concentraciones óptimo o el intervalo que presentara una relación lineal entre absorbancia y concentración. En esta gráfica, los cruces de la parte recta (la intermedia), con la parte baja y con la parte alta, pueden servir para determinar un valor para los límites de detección mínimo y máximo, respectivamente.
A partir de esta gráfica podemos obtener otros datos como:
Límite de detección mínimo: Es la cantidad o concentración mínima de sustancia que puede ser detectada con fiabilidad por un método analítico determinado. Intuitivamente sería la concentración mínima obtenida a partir de la medida de una muestra (que contiene el analito) que seríamos capaces de discriminar de la concentración obtenida a partir de la medida de un blanco, es decir, de una muestra sin analito presente.
Sería la cantidad o concentración más pequeña del analito que produce una señal XL significativamente diferente de la señal del ruido de fondo Xb.
El criterio utilizado para que la concentración mínima detectable sea distinguible con certeza del ruido de fondo es que la diferencia entre la señal del analito, de concentración muy baja, y la señal de los blancos sea igual a tres veces la desviación estándar de la señal de los blancos, utilizados para medir el ruido de fondo. Es decir que:
En donde XL es la señal límite, obtenida para la concentración mínima detectable de analito, Xb es la señal promedio de los blancos, y sb es la desviación estándar de las lecturas del blanco.
Límite de detección máximo:
Vendría a ser la máxima concentración de un analito que se puede analizar. Esto se debe a que las soluciones se hacen tan concentradas, que en el caso de los métodos espectrofotométricos, toda la luz es atrapada por el analito y tenemos una situación
equivalente al ajuste del 0 % de transmitancia. En este caso, el detector no diferencia dos soluciones de concentraciones altas.La determinación queda limitada a concentraciones menores del valor de límite de detección máximo, pero en este caso, a diferencia del límite de detección mínimo, el problema se soluciona fácilmente mediante una dilución adecuada. En el caso del límite de detección mínimo, las soluciones deben concentrar la muestra o usar otra técnica con límite de detección menor.
El límite de detección máximo, se puede obtener de la parte superior de la curva de Ringbown.
TRANSICIONES ELECTRÓNICAS EN MOLÉCULAS ORGÁNICAS
Clasificación:
Las bandas de absorción en las regiones Ultravioleta y Visible que presentan los compuestos orgánicos se asocian con transiciones electrónicas en la capa de valencia. Los electrones involucrados en dichas transiciones corresponden a aquellos mas débilmente atraídos por el conjunto de núcleos atómicos que componen la molécula y cuyos estados pueden ser descritos a través de orbitales moleculares que se expresan como combinaciones lineales de orbitales atómicos de la capa de valencia. Las transiciones electrónicas a orbitales moleculares más externos dan lugar a las denominadas transiciones Rydberg presentes en el Ultravioleta de Vacío. Por otra parte las transiciones electrónicas que involucran a los electrones de las capas internas son muy energéticas y se presentan en la región de los rayos X del espectro electromagnético. Nuestro análisis se reducirá a las transiciones electrónicas en la capa de valencia. A estos efectos resulta conveniente recordar la clasificación convencional de los orbitales moleculares en la capa de valencia de los compuestos orgánicos.
Orbitales σ y σ*. Son orbitales moleculares localizados a lo largo del eje de unión de los átomos. Los orbitales σ generan una densidad electrónica elevada en la región internuclear teniendo un carácter fuertemente enlazante.
Los orbitales σ*, como todos los orbitales antienlazantes, presentan un plano nodal perpendicular al eje del enlace en la región internuclear y tienen un acentuado carácter antienlazante.
Orbitales π y π*. Estos orbitales se emplean en la descripción de los enlaces múltiples. Las regiones de mayor densidad electrónica correspondiente a los mismos son aquellas colaterales al eje del enlace. El carácter enlazante o antienlazante de estos orbitales es menos acentuado que el de los orbitales σ.
Orbitales n. Estos orbitales moleculares tienen un acentuado carácter local y describen pares electrónicos libres asociados con heteroátomos (O, S, N, Hal). Energéticamente tienen carácter no-enlazante.
Figura.1 se representan esquemáticamente la distribución energética de los orbitales moleculares antes tratados.
Las principales transiciones electrónicas que se consideran para muchas especies moleculares son: , n *, *, n *.
A continuación se presentan algunas de las transiciones más importantes en moléculas orgánicas:
a. La transición es la que requiere mayor energía para que se lleve a cabo, este tipo de transiciones generalmente ocurre en el ultravioleta al vacío en longitudes de onda menores que 150 nm. Entre los enlaces típicos que presentan esta transición se encuentran C-H con absorción cercana a 125 nm y el enlace C-C con absorción cercana a 135 nm. Así, compuestos orgánicos como los hidrocarburos saturados y cadenas saturadas - enlaces sigma- presentarán absorción solamente en el ultravioleta lejano y por tanto son transparentes en el UV cercano.
b. La transición n generalmente requiere menos energía que la transición s ® s * Estas transiciones generalmente se presentan entre 150 y 220 nm. Muchas de estas transiciones se observan en moléculas orgánicas que contienen un heteroátomo: N,O,S,Cl,Br,I, como haluros de alquilo, aminas, éteres, tioles, etc. Por ejemplo el CH3OH presenta una banda n * en 180 nm con e = 315 M-1cm-1. Se considera para este tipo de transición que un electrón que se encuentra en el orbital p del heteroátomo - u orbital n de la molécula – es excitado al orbital s de la molécula.
c. Las transiciones implican que el cromofóro debe poseer al menos una insaturación para proveer el orbital molecular pi antienlazante *, moléculas con dobles o triples enlaces frecuentemente presentan absorción entre 160 y 220 nm para cromóforos aislados es decir separados por más de un enlace sencillo. En el caso de moléculas con grupos cromofóros que entren en conjugación como
dienos, enonas, o con anillos aromáticos la absorción se encuentra generalmente entre 200 y 360 nm, en el UV cercano y puede presentarse en el visible 360-700 si el sistema conjugado es grande.Las transiciones * presentan coeficientes de absortividad e altos que oscilan entre 1000 y 15000 M-1cm-1
Las bandas atribuidas a las transiciones * de sistemas conjugados como el butadieno polienos, enonas, el benceno o moléculas aromáticas que poseen sustituyentes que a su vez son cromóforos (como el estireno, benzaldehido, o acetofenona) se denominan bandas K (del alemán konjugierte).
Estas transiciones p ® p *, bandas K, se caracterizan por absortividades molares altas e máx >104 y sufren desplazamiento batocromico cuando hay aumento en la polaridad del solvente.
d. Las transiciones n implican que el cromofóro debe poseer una insaturación (para proveer el orbital molecular *) con un heteroátomo que contenga un par de electrones no compartido, electrones n, por ejemplo cromóforos como C = O, N = N, NO, NO2, entre otros, presentan absorción entre 200 y 350nm para cromóforos aislados. Se considera que uno de los electrones del orbital molecular no enlazante, n, ( o que uno de los electrones de un orbital átomico no enlazante del heteroátomo ) es excitado al orbital antienlazante * asociado con el doble o triple enlace.
Las transiciones n *presentan coeficientes de absortividad e bajos, que oscilan entre 10 y 102 M-1cm-1, son prohibidas y estos valores permiten distinguirlas de las transiciones *.
Las transiciones n *también son llamadas bandas R (del alemán radikalartig). Se caracterizan además de sus bajos coeficientes de absortividad por el efecto hipsocrómico que se observa con el incremento en la polaridad del solvente.
CÁLCULO DE ERRORES: ERROR ABSOLUTO, ERROR RELATIVO
Bien sea una medida directa (la que da el aparato) o indirecta (utilizando una fórmula) existe un tratamiento de los errores de medida. Podemos distinguir dos tipos de errores que se utilizan en los cálculos:
Error absoluto. Es la diferencia entre el valor de la medida y el valor tomado como exacta. Puede ser positivo o negativo, según si la medida es superior al valor real o inferior (la resta sale positiva o negativa). Tiene unidades, las mismas que las de la medida.
Error relativo. Es el cociente (la división) entre el error absoluto y el valor exacto. Si se multiplica por 100 se obtiene el tanto por ciento (%) de error. Al igual que el error absoluto puede ser positivo o negativo (según lo sea el error absoluto) porque puede ser por exceso o por defecto. No tiene unidades.
Reactivos:- Aseptil Rojo (Azosulfamida 5%)- Permanganato de potasio- Anaranjado de metilo- Agua destilada
Espectrofotometría: Absorbancia y %T entre una sustancia inorgánica y una
orgánica
Tomaremos a continuación los datos leídos en el espectrofotómetro. Lo que buscamos es determinar la longitud óptima analítica y comparar la naturaleza de dos sustancias diferentes: Una es orgánica (heliantina) y la otra, inorgánica (permanganato de potasio).
Las curvas espectrales -Absorbancia vs Longitud de onda y %T vs Longitud de onda- serán graficadas al final del presente informe.
Permanganatode potasio (KMnO¿¿4)¿ Anaranjadode metilo(Heliantina)λ (nm) %T A λ (nm) %T A
Realizamos dos tipos de análisis:1. Determinación de la longitud óptima
de onda para poder graficar las curvas espectrales –Absorbancia vs Longitud de onda– respectivas del permanganato y la heliantina (Inorgánica vs Orgánica)
2. Determinación de la concentración óptima de la muestra (verificar del mismo modo la zona de trabajo). Permite graficar la curva de Ringbown.
Lectura del espectrofotómetro: Longitud óptima de la onda y % Transmitancia
Lectura del espectrofotómetro: % Transmitancia
1°Para poder comparar la forma de las curvas espectrales entre dos sustancias de naturaleza distinta: Inorgánica vs Orgánica. El procedimiento a seguir fue el desarrollado en la primera práctica:La sustancia es colocada, junto a un patrón –Agua–; en el espectrofotómetro medimos la transmitancia conforme aumentamos la longitud de onda. El punto en el cual la transmitancia sea la más baja posible será nuestra absorbancia más alta, es decir: La longitud óptima de la onda nos otorga la absorbancia más alta posible de la sustancia problema.2° Si deseamos graficar la curva de Ringbown (la que nos permite formar nuestra curva de calibración) primero debemos realizar las disolución. Prepararemos soluciones de una concentración (C) desde 0.1 ug/ml, 0.2 ug/ml, 1 ug/ml, 2 ug/ml, 5 ug/ml, 10 ug/ml, 15 ug/ml, 20 ug/ml, 30 ug/ml, 200 ug/ml hasta 500 ug/ml a partir de la solución estándar de aseptil rojo (Azosulfamida 5%).Con las diluciones ya hechas, procedemos a realizar las lecturas en el espectrofotómetro. Las lecturas serán del % Transmitancia,
Longitud Óptima de Azosulfamida:530 nmLongitud óptima de Anaranjado de metilo: 460 nmLongitud óptima de Permanganato:520 nm
nuestra labor consiste en determinar la absortancia: Absortanc ia=100−%T. Para luego graficar nuestra curva Absortancia vs Log (C).
Una vez que ya tenemos nuestras diluciones preparadas, podemos comenzar con las lecturas de la transmitancia. La longitud de onda a utilizar será: La longitud óptima de cada sustancia, 530nm para la azosulfamida y 460nm para la heliantina. Iremos añadiendo en las cubetas del espectrofotómetro cada dilución unitariamente. El análisis de la transmitancia será llevado a cabo en la longitud óptima. Nuestros datos serán acoplados en las posteriores tablas.
A partir de la transmitancia leída estaremos en la facultad de poder graficar la Curva de Ringbown (Absortancia vs Log [C]).
Preparamos cada concentración a partir de la muestra estándar de aseptil rojo. La forma en cómo se procedió con las diluciones está explicada en el presente informe.
Curva de Ringbown: Absortancia vs Concentración ~ Azosulfamida y
Heliantina
En esta parte desarrollaremos la curva de Ringbown, la cual nos permite encontrar la zona de trabajo y lo más importante: La concentración óptima de la muestra.
*Cabe resaltar que nuestro grupo trabajó con las diluciones de la azosulfamida
1. Tabla completa: Absortancia, Log C y % Transmitancia.
Azosulfamida
µg/mL mg/mL log C % T Absortancia
0.1 100 2 98.6 1.4
0.2 200 2.30103 97.8 2.2
0.1 100 2 96.7 3.3
0.6 600 2.7781513 96 4
0.8 800 2.90309 94.4 5.6
1 1000 3 93 7
1.5 1500 3.1760913 88.3 11.7
2 2000 3.30103 85.1 14.9
2.5 2500 3.39794 84.2 15.8
3.5 3500 3.544068 75.5 24.5
4 4000 3.60206 75.6 24.4
5 5000 3.69897 71.9 28.1
6 6000 3.7781513 66.1 33.9
8 8000 3.90309 57.7 42.3
10 10000 4 50.7 49.3
15 15000 4.1760913 38.7 61.3
20 20000 4.30103 27.5 72.5
30 30000 4.4771213 11.5 88.5
40 40000 4.60206 6.4 93.6
60 60000 4.7781513 0.001 99.999
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
CURVA DE RINGBOWN: AZOSULFAMIDA
1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 50
20
40
60
80
100
120
Series2
log C
Abso
rtan
cia
Para obtener el intervalo óptimo y adecuado de concentraciones con el menor error por lectura primero se construye la curva de Ringbown que consiste en construir una gráfica de absortancia (100%-T) vs la concentración.
La zona lineal corresponde al intervalo de concentraciones de mínimo error, C/C, por lectura y el punto de inflexión corresponde al valor de:
100%-%T= 49.3; T=50.7; que corresponde al valor de mínimo error.
Para la mayoría de los sistemas la curva de Ringbom corresponde a una curva en forma de S. La parte lineal de esta gráfica permite obtener el intervalo de concentraciones óptimo o el intervalo que presentara una relación lineal entre absorbancia y concentración.
En esta gráfica, los cruces de la parte recta (la intermedia), con la parte baja y con la parte alta, pueden servir para determinar un valor para los límites de detección mínimo y máximo, respectivamente.
En la curva de Ringboom para la azosulfamida resulto como concentración optima el valor de 6.4565 µg/mL así como la concentración mínima cuantificada a 3.715 µg/mL y la concentración máxima cuantificada a 11.2 µg/mL.
CURVA DE RINGBOWN: ANARANJADO DE METILO
La curva de Ringbom del Anaranjado de Metilo presenta una zona de trabajo de concentraciones 1 a 5 ug/ml con las absortancias respectivas de 26.8 y 94.5 respectivamente. Además la concentración óptima es de 2.2 ug/ml. No pudiendo comparar estos datos debido a que no encontramos información bibliográfica sobre el tema.
BIBLIOGRAFIA
Skoog Douglas, Principios de análisis instrumental. 6ta edición. 2007
Química analítica instrumental I Precisión en espectrofotometría. 2007. URL: http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/Documento_de_Apoyo:_Precision_en_espectrofotometria_2598.pdf
Universidad Nacional de Colombia. Establecimiento de un método espectrofotométrico.URL:http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2001184/lecciones/Cap10/01_01_01.htm
